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DISEÑO Y ELABORACION DE CONSTRUCCIONES CON LOS GENES crtW y Lcy-b PARA LA TRANSFORMACION GENETICA DE
CEMPAXUCHIL (Tagetes erecta)
INFORME TECNICO FINAL Avance reportado 100 %
PROYECTO DIRIGIDO POR: Dra. Alma Angélica del Villar Martínez.
PARTICIPANTES ARACELI SOLANO NAVARRO PABLO EMILIO VANEGAS ESPINOZA
Diciembre-2007.
CeProBi
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
CENTRO DE DESARROLLO DE PRODUCTOS BIÓTICOS
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RESUMEN
Los carotenoides son necesarios en nuestra dieta ya que son precursores de la
vitamina A y se ha reportado que tienen funciones importantes en la salud;
actualmente son considerados como compuestos nutraceuticos. Los vertebrados
no sintetizan carotenoides, por lo que es necesario adquirirlos de los alimentos
para la producción de retinoides; éstos, son compuestos que se derivan del beta
caroteno. Se han clonado y caracterizado los genes que codifican para las enzimas
que participan en esta ruta de diferentes fuentes; con lo cual se ha logrado la
obtención de las herramientas necesarias para llevar acabo la manipulación
genética de los sistemas en donde se producen y acumulan los carotenoides. Se ha
reportado la información de la susceptibilidad de la ruta para su manipulación
genética; con lo cual se demuestra que las plantas pueden ser utilizadas como una
fuente para la obtención de nuevos carotenoides como es la astaxantina; en este
sentido el cempaxúchil representa una opción interesante debido a que de manera
natural se acumulan una cantidad importante de carotenoides en sus flores,
aunque el principal carotenoide en este sistema es la luteína; hemos realizado el
análisis de la expresión de los genes de la ruta de biosíntesis en cempaxúchil; y los
resultados apuntan hacia la regulación transcripcional. También, los puntos clave
en la ruta se ubican en el sitio en donde ocurre la ciclación del licopeno. En este
proyecto se plantea el diseño de construcciones con los genes Lcy-b de
cempaxúchil mediante el análisis de las secuencias de nucleótidos de los genes
mencionados anteriormente.
INTRODUCCIÓN
El cempaxúchil (Tagetes erecta) es una fuente importante de luteína, el extracto
de estas flores se ha utilizado como aditivo en algunos productos alimenticios. El
cempaxúchil no tiene la capacidad de sintetizar algunos carotenoides rojos, debido
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a que carece de la enzima β-caroteno cetolasa. La posibilidad de modificar la ruta
de biosíntesis de los carotenoides en esta planta por técnicas de ingeniería
genética conducirá a incrementar su eficiencia como material pigmentante y lograr
que sobre-produzca carotenoides con alto valor agregado. En este proyecto se
pretende elaborar construcciones con los genes que codifican para las enzimas
beta caroteno ciclasa y una cetolasa; con el fin de utilizar estas construccione
spara sobreexpresar el gen que codifica para la enzima beta caroteno ciclasa y
transferir el gen bacteriano denominado crtW al genoma de la planta de
cempaxúchil; con esto, se plantea la posibilidad de que la planta sintetice y
acumule los pigmentos rojos, el mejoramiento en la producción de carotenoides y
la modificación de la ruta de biosíntesis de estos pigmentos en flores de
cempaxúchil (Tagetes erecta).
I. INTRODUCCIÓN
El color en los alimentos es una de las características más importantes en lo que a
la evaluación de la calidad se refiere, seguida por el sabor y la textura (Delgado-
Vargas, 1997; Granado y col., 1997). Se ha demostrado que el color en un
alimento es capaz de reemplazar al azúcar y mantener la sensación de dulzura de
ciertos alimentos (Clydesdale, 1993). La preferencia por la utilización de los
pigmentos naturales se debe a las grandes críticas que han recibido los colorantes
sintéticos ya que se les ha relacionado directamente con la aparición de
enfermedades en los consumidores de productos que utilizaron estos colorantes
sintéticos como materia prima, además de un sentimiento generalizado que se ha
desarrollado en la sociedad de volver hacia los productos naturales (Delgado-
Vargas, 1997). Por lo mismo, el mercado de los pigmentos naturales está en
constante incremento, basta decir que para 1994, el consumo de los pigmentos
fue de alrededor de 265 millones de dólares de los cuales un 65% representó a los
pigmentos de origen natural; para 1998, el consumo de pigmentos naturales se
estimó en unos 939 millones de dólares y la tendencia continúa en forma
ascendente (Pszczola, 1998).
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II. ANTECEDENTES
El cempaxúchil (Tagetes erecta) es una planta perteneciente a la clase
Magnoliopsidae (Angiospermae), la subclase Dicotiledoneae, al orden Asterales y a
la familia Asteraceae (Compositae). Es una planta anual, erecta, de hasta 1.8 m
de altura, muy aromática al estrujarse. Sus tallos estriados, que pueden ser
glabros o pubescentes; sus hojas llegan a medir 20 cm de longitud, son pinnadas y
tienen de 11 a 17 foliolos, lanceolados o linear-lanceolados, alcanzando hasta 5 cm
de largo por 1.5 cm de ancho. Sus inflorescencias son cabezuelas que se pueden
presentar solitarias o agrupadas, sobre pedúnculos de hasta 15 cm de largo,
provisto de brácteas; el invólucro es campanulado, de 13 a 20 mm de alto por 9 a
25 mm de ancho (Penagos-López y Díaz-orozco, 1995). Las inflorescencias por lo
general son numerosas y su coloración se debe a la presencia de carotenoides de
los cuales el principal es la luteína (Delgado-Vargas y Paredes López, 1996).
La especie Tagetes erecta es originaria de México y se cultiva principalmente en
los estados de Veracruz, México, Tabasco, Chiapas, Hidalgo, Guanajuato y Sinaloa
(Mendieta y Del Amo, 1981). Esta especie se cultiva desde tiempos ancestrales,
principalmente con fines ornamentales ya que es utilizada tradicionalmente en
ceremonias religiosas relacionadas con los muertos, por lo que se le conoce
también con el nombre de "flor de muerto". También son conocidas sus cualidades
en la farmacopea tradicional por lo que se le usa como antiparasítico,
antiespasmódico, en el combate de enfermedades del estómago, bazo e hígado
(Delgado-Vargas y Paredes-López, 1997a; Guzmán-Maldonado y Paredes-López,
1998). Además de lo anterior, el pigmento de la flor de cempaxúchil ha sido
utilizado en la pigmentación de mantequillas y quesos. En la actualidad está
permitido su uso en los Estados Unidos y México como complemento alimenticio en
la producción de aves de corral, ya que este producto incrementa la pigmentación
en la piel de las aves y la yema de los huevos, características muy importantes
para su aceptación por el consumidor (Fletcher y Halloran, 1983; Fletcher y col.,
1986; Tyczkowski y Hamilton, 1986; Henken, 1992; Delgado-Vargas y Paredes-
López, 1997 b,c).
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El sistema de producción en el cultivo de la flor de cempaxúchil es mediante
transplante. Las plántulas se desarrollan en almácigos para ser transplantadas al
campo cuando alcanzan alrededor de 10 cm de altura (20 a 45 días). Los
rendimientos son muy variables dependiendo del manejo del cultivo, obteniéndose
desde 12 hasta 30 ton de flor/Ha en un máximo de 7 cortes (Mendieta y Del Amo,
1981; Penagos-López y Díaz-orozco, 1995).
Los carotenoides son pigmentos liposolubles que presentan coloraciones roja,
anaranjada y amarilla, contribuyen aportando coloración a flores y frutos en
diferentes etapas de desarrollo de las plantas (Bartley y Scolnik, 1995). Estos
compuestos se componene básicamente de una cadena hidrocarbonada de 40
átomos de carbono que se forman por la condensación de ocho unidades de
isopreno (Goodwin, 1980) y pueden ser lineales o bien, pueden contener ciclos en
su estructura química. Las etapas finales en la biosíntesis de carotenoides;
después de llevarse a cabo la ciclación del licopeno, involucran la introducción de
moléculas de oxígeno y por lo tanto la formación de xantofilas, compuestos que
contienen grupos funcionales oxigenados. Estas etapas finales son diferentes entre
organismos y da como resultado la amplia gama de carotenoides presentes en la
naturaleza. (Goodwin, 1980).
Los carotenoides son necesarios en nuestra dieta ya que son precursores de la
vitamina A y se ha reportado que tienen funciones importantes en la salud
(Palozza y Krinski, 1992); actualmente son considerados como compuestos
“nutraceuticos”. Los vertebrados no sintetizan carotenoides, por lo que es
necesario adquirirlos de los alimentos para la producción de retinoides; éstos, son
compuestos que se derivan del β-caroteno, el cual es capaz de aportar dos anillos
β-ionona para su formación.
Por otra parte, se tienen reportes de la capacidad antioxidante de los carotenoides;
y se ha planteado que esta característica se debe a la estructura de la molécula.
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Específicamente hablando de la astaxantina se sabe que aporta la característica de
color al salmón, trucha y camarón; con relación a los efectos benéficos se ha
reportado que ayuda al buen funcionamiento del sistema inmune en humanos
(Jyonouchi, 1995), reduce la carcinogenesis oral en ratas (Tanaka, 1995) e inhibe
el crecimiento de tumores de mama en ratones (Chew, 1999); de la misma
manera se ha señalado que estas propiedades se deben a su poderosa capacidad
antioxidante.
Se han clonado y caracterizado los genes que codifican para las enzimas que
participan en esta ruta de diferentes fuentes; con lo cual se ha logrado la
obtención de las herramientas necesarias para llevar acabo la manipulación
genética de los sistemas en donde se producen y acumulan los carotenoides
(Cunningham y Gantt, 1998).
En estudios previos se ha logrado la expresión de crtI (fitoeno desaturasa) en
Nicotiana tabacumm para conferir resistencia a un herbicida; en este intento,
además se provocó un cambio cuantitativo en los carotenoides producidos en las
xantofilas de hojas (Misawa y col.,1993). Fray y col., (1995), reportaron la
expresión de psy (fitoeno sintasa) de jitomate; en las plantas transformadas se
observó enanismo en las plantas, debido a la redirección de la ruta con una
disminución en la síntesis de giberelinas. Se ha logrado elevar los niveles de β-
caroteno por la expresión constitutiva de crtI (fitoeno desaturasa de Erwinia
uredovora) y crtL (licopeno ciclasa de Arabidopsis thaliana) en los frutos de
jitomate (Roemer y col., 2000; Rosati y col., 2000). Recientemente se logró el
incremento de licopeno en los frutos del jitomate como resultado de la
manipulación de la ruta de biosíntesis de carotenoides mediante la expresión
tejido-específica de crtB (fitoeno sintasa) de Ewinia uredovora. Con estos trabajos
se tiene la información de la susceptibilidad de la ruta para su manipulación
genética.
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La ingeniería metabólica de los carotenoides se ha logrado recientemente en
algunas plantas como es el caso de las semillas de arroz y canola en donde se
logró el incremento de β-caroteno (Ye y col., 2000; Shewmaker, y col., 1999). En
el caso de arroz, se observó que psy y crtI fueron suficientes para lograr la síntesis
de licopeno, β-caroteno y zeaxantina, esto significa que tanto la β-ciclasa como la
hidroxilasa están presentes en el endospermo, lo cual simplifica la transformación.
En este trabajo se logró la formación de 200 µg de β-caroteno por cada 100 g de
arroz; este trabajo es un logro de alto impacto para los países en donde se tienen
graves problemas por deficiencia de vitamina A.
Con relación al trabajo realizado en canola se sabe que la expresión del gen crtB
fusionado a un péptido de transito plastídico, bajo el control de un promotor
específico de semilla fue suficiente para obtener β-caroteno en cantidades
similares a las encontradas en el aceite de palma (Shewmaker, y col., 1999).
En las flores de tabaco, se ha logrado la producción de carotenoides que no son
comunes en plantas (Mann y col., 2000). En este trabajo se observó que los
cromoplastos del néctar de las plantas transgénicas acumularon astaxantina y
otros cetocaroteniodes debido a la expresión de β-caroteno cetolasa de
Haematococcus pluvialis en los cromoplastos de néctar, en donde se sintetizan β-
caroteno y xantofilas. Cosecuentemente, se logró el cambio en la coloración del
néctar de amarillo a rojo (Mann y col., 2000). Con esto se demuestra que las
plantas pueden ser utilizadas como una fuente para la obtención de nuevos
carotenoides como es la astaxantina; en este sentido el cempaxúchil representa
una opción interesante debido a que de manera natural se acumulan una cantidad
importante de carotenoides en las flores de las plantas, aunque el principal
carotenoide en este sistema es la luteína; el análisis de la expresión de los genes
de la ruta de biosíntesis apunta hacia regulación transcripcional y los puntos clave
en la ruta se ubican en el sitio en donde ocurre la ciclación del licopeno (Del Villar
y col., 2003; Moehs y col., 2001).
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OBJETIVO
Manipular el material genético y obtener las construcciones necesarias para llevar
a cabo la transformación genética del cempaxúchil
MATERIALES Y MÉTODOS
Mantenimiento de cepas: Para el mantenimiento de las cepas de E. coli es
necesario llevar a cabo la preparación del medio LB adicionado con el antibiótico
de selección específico para cada plásmido. El vector que contiene el cDNA que
codifica para la beta ciclasa posee además, un gen que le confiere a la bacteria,
resistencia a la ampicilina. El medio de cultivo adicionado con ampicilina es el
adecuado para mantener a la bacteria y de esta manera conservar el material
genético que nos interesa.
Minipreparación de ADN plasmídico; método de lisis alcalina: La extracción de DNA
plasídico, es necesaria para tener el control del material genético clonado, de
manera que en cada resiembra es necesario llevar a cabo el monitoreo del DNA
de cada cepa. El procedimiento se maneja de la manera siguiente:
1.- Obtener el cultivo de colonias de bacterias.
2.- Usar un palillo estéril, picar solo una colonia y colocarla en un tubo estéril que
contenga 2.5 ml de medio de cultivo adicionado con el antibiótico de selección
adecuado.
2.- Incubar el tubo en agitación constante a 37ºC durante 12 a 16 h o toda la
noche.
3.- Para conservar una muestra de la minipreparación se mezclan 200 µl del cultivo
con 200 µl de una solución de glicerol al 30 % (v/v), congelar en nitrógeno líquido
y almacenar los tubos a –70 ºC.
4.- Transferir el cultivo restante a tubos eppendorf y centrifugar durante un min a
temperatura ambiente.
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5.- Desechar el sobrenadante y resuspender la pastilla en 100 µl de la solución I,
aplicar vórtex e incubar durante 5 min. A temperatura ambiente.
6.- Adicional 200 µl de la solución II, mezclar por inversión e incubar en hielo
durante 5 min.
7.- Adicionar 150 µl de la solución III, mezclar por inversión y centrifugar durante
30 min
8.- Transferir el sobrenadante a un tubo limpio y desechar la pastilla
9.- Adicionar 1000 µl de etanol, mezclar bien y centrifugar durante 15 min.
10.- Lavar la pastilla con etanol al 70 % y eliminar todo el etanol.
11.- Resuspender la pastilla en 50 µl de agua destilada estéril o buffer TE.
Electroforesis de DNA: Para visualizar el material genético extraído, se realizó la
electroforesis en gel de agarosa al 1%, la corrida se llevó a cabo a 70 V durante
40mmin.
Ensayos de restricción: Se realizaron ensayos con enzimas de restricción para
monitorear la presencia del DNA en las cepas bacterianas.
preparacion de particulas de oro: Las partículas se deben prepararon un día antes
del bombardeo. Se pesaron 60 mg de partículas de oro en un tubo eppendorf se
agrego 1 ml de etanol absoluto y se aplico vortex durante 3 minutos se
centrifugo de 2 a 5 minutos a 13000 rpm y descartamos el sobrenadante se
agrego 1ml de etanol al 70% aplicándole vortex durante 2 minutos , se incubo la
muestra durante 15 minutos a temperatura ambiente y se centrifugo a 13000
rpm durante 3 minutos y eliminamos el sobrenandante se agrego 1 ml de agua
destilada estéril dándole vortex durante 1 minuto se dejaron reposar las
partículas durante 1 minuto a temperatura ambiente y se centrifugo a velocidad
máxima durante 2 minutos, se realizaron nuevamente los lavados se agrego 50%
(v/v) de glicerol y se almacenaron a -20º C.
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particulas + dna : A las microparticulas se les dio vórtex durante 1 minuto y
posteriormente se sonicaron, se aagregaron 50 µl de la suspensión de partículas
(6 mg/ml) y se agrego 12 µl de DNA
(1 g por ml) se adicionaron 50 µl de cloruro de calcio 2 M y se aplico vórtex, se
adicionaron 20 µl de espermidina (5M) se aplico vórtex y se agito suavemente
durante 15 minutos vortex en el cuarto frio, posteriormente se ccentrífugo a
1000rpm durante 20 segundos, eliminamos el sobrenadante y lavamos con 50
microlitos de etanol al 70 por ciento, sonicamos durante 1 minuto Centrifugar a
10K durante 20 segundos y se elimina el sobrenadante Resuspender en 50µl de
etanol absoluto y se transfierio a hielo Agregamos 75 µl de a suspensión al filtro
para bombardear. Un tubo rinde 5 disparos
preparacion de muestras a bombardear: Se prepara medio MS-15 % maltosa y se
colocaron las muestras de callo y hoja en este medio durante un periodo de cuatro
horas antes de comenzar el bombardeo
uso de la pistola de bombardeo: Se limpió con alcohol la pistola y todo el
equipo, se sumergieron en alcohol absoluto los materiales (macro, micro carrier,
holders, mallas) se dejaron secar en cajas petri, se abrió el gas de helio verificando
que el manómetro de la derecha estuviera a 2000 y el de la izquierda a 1600, se
conecto y encendió la pistola, se encendió la bomba de vació verificamos que
entre el vació, se coloco la macro en el holder, y se coloco el DNA, se colocaron las
piezas y base de plastico a una distancia de 11 y se coloco la muestra a
bombardear, se cerro la pistola, se coloca vació (verificando que suba arriba de 20
hg) se dio el disparo, se ingreso aire se abrió la pistola, sacamos la muestra, para
apagar el equipo se ingreso vació para apagar la bomba de vació y cerrar la
bomba de helio y se dio un disparo para purgar
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RESULTADOS:
Mantenimiento de cepas: Se tienen en el CEPROBI-IPN las cepas que contienen los
plásmidos que portan los genes que codifican para las enzimas beta cilasa, épsilon
cilasa y crtW. Las cepas se han conservado y mantenido mediante resiembras
periódicas y se está trabajando en el análisis de las secuencias y los posibles
vectores para iniciar los ensayos de transformación en el CINVESTAV-IPN Unidad
Irapuato..
Las secuencias de cDNA que codifica para beta ciclasas y crtW se han analizado.
Con ellas se han realizado la extracción y purificación de los plásmidos y se ha
trabajado con los análisis de restricción.
Construcciones para la transferencia genética:
A continuación se presentan las construcciones que se tienen hasta el momento.
Ambas se han utilizado para llevar a cabo el establecimiento de las condiciones
para la introducción del material genético al genoma de cempaxúchil.
La construcción denominada pHKB, está diseñada para expresarse en cloroplasto,
de manera que al insertarse, la expresión se verá reflejada en el sitio de síntesis y
acumulación de los carotenoides. Adicionalmente se han realizado observaciones a
nivel ultraestructural de callo de cempaxúchil y hemos observado la presencia de
plastidos en diferentes etapas de desarrollo, lo cual, indica la posibilidad de éxito al
β-licopeno ciclasa Prrn TrbcL
pHKB
Rps12/
aadA
Xba I Xba I
Región homóloga
Región homóloga
trnV
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transformar callo con ésta construcción. Los resultados de estos estudios se
encuentran en etapa de análisis.
La construcción denominada pCB35S, está diseñada para lograr su expresión
constitutiva, es decir, a todos los niveles en una planta.
Además de estas construcciones se realizaron ensayos de transformación con el
plásmido pBI426, para validar la eficiencia de las condiciones de transformación.
Es importante señalar que en este proyecto no está comprometida la
transformación genética y se han realizado los experimentos que contribuyen
sustancialmente a lograr la introducción del gen en un sistema de células
desdiferenciadas.
MANTENIMIENTO DE CALLOS DE CEMPAXÚCHIL.
Los callos de cempaxúchil (fig 1), se mantuvieron en medio MS (Murashige y
Skoog, 1962), adicionado con BA (bencil aminopurina) y 2,4-D (ácido 2,4
diclorofenoxiacético) con una concentración de 2 mg/L, hasta su utilización en el
tratamiento de bombardeo.
ß-licopeno ciclasa 35S NOS
pCß35S
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Figura 1: Callo de cempaxúchil desarrollado en medio MS adicionado con
reguladores de crecimiento, a partir de explantes de hoja de
cempaxúchil.
Ensayos de transformación transitoria en callos de cempaxúchil.
En el caso de la transformación por biobalística, se uso el sistema de
bombardeo de alta presión (Finer y col., 1992). Para una recuperación máxima de
transformantes estables es necesario disminuir el daño al tejido para tener una
mayor viabilidad celular. Un precultivo en medio con altas concentraciones de algún
compuesto osmótico puede incrementar la supervivencia celular al reducir la presión
de turgencia, lo que permite disminuír el daño celular al evitar fugas del citoplasma
(Birch 1997; Christou 1996, Hunold et al, 1994). El número de foci después del
tratamiento del tejido con manitol a una concentración 0.2 M rindió solo el 50% del
número de foci obtenidos por bombardeo, después del tratamiento con sorbitol a una
concentración 0.2M. El medio con manitol y sorbitol dio como resultado sólo el 30%
del tratamiento con sorbitol. A partir de estos ensayos se determinó que el
tratamiento con sorbitol 0.2M era el más recomendado para la expresión en tejido
inducido de hojas (Figura 2).
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Expresión del gen
uidA Expresión del gen
uidA
Fig 2: Muestra de callo de cempaxúchil expuesta en medio osmótico
previo a los ensayos de biobalística.
En la Figura 3 se observan algunos de los resultados obtenidos tras los análisis de β-
glucuronidasa en tejido inducido. En las fotografías se resaltan los puntos azules
producto de la reacción química del gen gus A (B y C), que contrastan con la
ausencia de estas señales en el control negativo (A).
Figura 12 . Imagen de callos bombardeados en la cual se observa que en la combinación de 6201 Kpa y distancia de 9 cm (a) se obtuvo el mejor nivel de
expresión del gen uidA, en tanto que en la combinación de 6201 Kpa y distancia de 11 cm se mostró muy poco nivel de expresión
a b
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Los otros parámetros seleccionados fueron la presión utilizada para la aceleración de
partículas y la distancia entre el acelerador de partículas y el tejido blanco. Las
condiciones iniciales fueron 60, 80, 100 y 120 PSI (libras por pulgada cuadrada) de
presión y 7.5, 10.5, 13.5 y 16.5 cm de distancia. En la gráfica 2 se reportan los datos
del efecto de la presión de helio para la aceleración de las partículas de tungsteno-
DNA y la distancia al tejido blanco.
La expresión transitoria del gene GUS incrementa de una presión de 60 PSI a 80 PSI
y disminuye cuando la presión aumenta a 100 y 120 PSI. La combinación con
distancia nos indica que la mejor respuesta se logró con una distancia de 10.5 cm y
una presión de 80 PSI. Este resultado representa el equivalente a una y dos veces el
número de foci a 60 PSI y 13.5 cm y 120 PSI con 13.5 cm respectivamente. A una
mayor presión el número de foci disminuye. De esta forma se seleccionó una presión
de 80 PSI y 10.5 cm de distancia para los siguientes experimentos de bombardeo.
En reportes previos ya se han estudiado diferentes factores para la optimización del
bombardeo de partículas en diferentes especies vegetales, entre estos factores se
han estudiado la conformación y concentración de DNA, el tipo de partícula, así como
el tejido seleccionado para el bombardeo, entre otros (Cabrera-Ponce et al, 1995;
Finer et al, 1992; Hunold et al, 1994; Nandeva et al, 1999). El objetivo principal en
estos estudios fue establecer las condiciones en que se lograba una mayor expresión
de los genes marcadores con el mínimo de daño del tejido. En estos ensayos sólo
una pequeña proporción de las células del tejido blanco reciben las partículas de DNA
y sólo una porción de estas células sobrevive el tratamiento e integra el DNA de
manera estable (Birch 1997).
De los experimentos de expresión transitoria podemos desprender que las tres
variables probadas influyeron en el resultado registrado como número de foci en el
tejido. Finer y col.,(1992) y Hunold (1994) reportaron el efecto de la presión en la
expresión transitoria de células embriogénicas de maíz y hojas de tabaco utilizando la
pistola de baja presión. En estos reportes el número máximo de foci fue alcanzado
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con menos de 100 PSI. En el presente reporte el número máximo de foci se logró
con 80 PSI, cuya razón sea posiblemente el tipo de tejido; que es un factor también
a considerar cuando se establecen las condiciones de expresión transitoria. La
distancia al sitio blanco también mostró un efecto notorio en la expresión de gus,
donde la combinación, resultando la combinación de 10.5 cm con 80 PSI la mejor
opción.
La exposición a diferentes tratamientos osmóticos tuvo efecto en el rendimiento
reportado en número de foci. En otros sistemas se ha encontrado repetidas veces un
incremento en la expresión transitoria por efecto del efecto osmótico (Nandadeva et
al.,1999). Es notorio el efecto del tratamiento osmótico sobre la expresión
transitoria; la falta de este tratamiento se refeleja en una disminución cercana a cero
en la expresión transitoria (dato no mostrado). Se asume que la exposición del tejido
blanco al tratamiento osmótico aumentó las posibilidades de sobrevivir al bombardeo
a este tejido (Christou, 1996). De esta forma se optimizaron los parámetros para la
transformación genética estable.
IMPACTO: La generación de tecnologías que conduzcan a la transformación y
regeneración de cempaxúchil (Tagetes erecta), así como a la producción de
carotenoides altamente pigmentantes en cempaxúchil transgénico puede llegar a
producir grandes beneficios a las industrias de los alimentos, forrajes y
farmacéutica. Los mercados mundiales para la cantaxantina y la astaxantina se
estimaron en alrededor de 250 millones de dólares en 1996. Las flores de
cempaxúchil poseen ya de por si altos contenidos de luteína. Como resultado de la
introducción de genes determinantes en dicha planta, la ruta de carotenogénesis
será redirigida hacia la síntesis de cantaxantina y astaxantina, con lo cual se puede
esperar una alta sobreproducción de ambos carotenoides en cempaxúchil. Los
nuevos pigmentos obtenidos tendrían un fuerte impacto en la industria alimentaria
tanto para consumo humano como animal.
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VIII. BILIOGRAFIA
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