inokulum dalam proses fermentasi
DESCRIPTION
Inokulum Dalam Proses FermentasiTRANSCRIPT
11/04/2012
1
Tujuan Instruksional Khusus :
• Mahasiswa mampu menjelaskan pengembangan inokulum untuk proses fermentasi
Elisa Julianti - THP-FP USU
KRITERIA INOKULUM
kultur tersedia dalam keadaan aktif dan sehat fase lag minimal.
tersedia dalam jumlah cukup
bebas dari kontaminan
kemampuan membentuk produknya stabil
Elisa Julianti - THP-FP USU
Pada perkembangan inokulum diinginkan jumlah sel yang tinggi dan mempunyai kemampuan yang aktif untuk membentuk produk komposisi media untuk pengembangan inokulum ≠ media fermentasi.
Sumber karbon pada media untuk pengembangan inokulum < media untuk fermentasi kecuali pada produksi protein sel tunggal (PST).
Proporsi inokulum 3-10% dari volume total media.
Elisa Julianti - THP-FP USU
PENGEMBANGAN INOKULUM UNTUK KHAMIR
Contoh pengembangan inokulum untuk khamir pada pembuatan ragi roti (baker’s yeast) dilakukan dalam 5 tahap proses, yaitu 2 (dua) tahap secara aseptik dan 3 (tiga) tahap berikutnya dalam tangki yang bagian atasnya terbuka (Gambar 1)
Elisa Julianti - THP-FP USU
Tahap 1: 0.2 kg menjadi 190 selama 24 jam
Tahap 2: 190kg menjadi 1000 kg selama 9 jam
Tahap 3: 1000kg kg menjadi 5000 kg selama 11 jam
Tahap 4: 1000kg kg menjadi 5000 kg selama 11 jam (Diulangi 5 kali)
Tahap akhir 1000kg kg menjadi 5000 kg selama 11 jam (Diulangi 25 kali)
Waktu Fermentasi (jam)
Ber
at K
ham
ir (
103kg
)
0
60
20 30 40 50 60
20
40
10
70
80
100
Gambar 1. Proses pengembangan inokulum pada proses produksi
baker’s yeast komersial. Elisa Julianti - THP-FP USU
PENGEMBANGAN INOKULUM UNTUK BAKTERI
Tujuan Utama : memperoleh sejumlah massa sel aktif pada fase logartima.
Panjang fase log ditentukan oleh :
- keadaan fisiologis kultur inokulum
- umur inokulum (pada bakteri pembentuk spora)
Spora terbentuk pada akhir fase log
Inokulum dengan populasi spora fase log
Elisa Julianti - THP-FP USU
11/04/2012
2
Log jumlah mikrobia
yang hidup
A
B
C
D
E F
Waktu
Gambar 2. Grafik Pertumbuhan Mikrobia. Tahap A-B = tahap istirahat (lag
phase), ahap B-C = tahap tumbuh (accelerate phase), Tahap C-D
= fase log, Tahap D-E = tahap tumbuh reda (decelerate phase),
Tahap E-F = tahap stasioner, Tahap F = tahap kematian
Elisa Julianti - THP-FP USU
PENGEMBANGAN INOKULUM UNTUK BAKTERI ..........
Contoh :
1. Dalam produksi protease oleh Bacillus sp (thermofil) digunakan 5% inokulum kultur dalam fase logaritma.
2. Produksi oleh B.subtillis diawali dengan menumbuhkan kultur pada media padat atau cair 1-2 hari, dan tahap berikutnya sampai skala produksi dapat dilihat pada Tabel 1.
3. Produksi aseton butanol oleh Clostridium acetobutylicum juga dilakukan pada 5 tahap seperti terlihat pada Tabel 2.
Elisa Julianti - THP-FP USU
Tabel 1. Pengembangan inokulum pada proses produksi protease oleh B.subtillis
Tahap Kondisi Kultur Waktu Inkubasi
1 Media 4L, digojog, diinokulasi kultur stok 18-24 jam
2 Kultur tahap 1 diinokulasikan dalam 750 L media
6 jam
3 Kultur tahap 2 diinokulasikan dalam 6000 L media
6 jam
4 Kultur tahap 3 diinokulasikan dalam media produksi 120.000 L
Sampai produksi enzim optimal
Elisa Julianti - THP-FP USU
Tabel 4.2. Pengembangan inokulum pada produksi aseton butanol oleh Clostridium acetobutylicum.
Tahap Kultur Medium
1 Rekonstitusi sel kultur stok, 24 jam Potato glucose broth
2 Tahap 1, diinokulasikan dalam 600 ml media, 20-24 jam
4% glukosa, 5% amonium sulfat, 6% kalsium karbonat, 6.2% fosfor pentaoksida
3 90 ml tahap 2 diinokulasikan dalam 3000 ml media, 20-24 jam
Seperti tahap 2
4 3000 ml tahap 3 diinokulasikan dalam
25.000 L media
Seperti tahap 2, glukosa
6%
5 Kultur tahap 4 diinokulasikan (0.5-3% inokulum) ke dalam 300.000-2.500.000 L media untuk skala produksi
Seperti tahap 4 dengan amonia sebagai kontrol pH
Elisa Julianti - THP-FP USU
Pengembangan inokulum bakteri asam laktat dalam pembuatan minuman sari buah yang mengandung probiotik :
Kultur yang digunakan adalah kultur liofilisasi yaitu kultur bakteri asam laktat yang diisolasi dari berbagai bahan pangan yang mengalami fermentasi asam laktat seperti pikel sauerkraut, yoghurt, dadih, yakult atau tempoyak .
Kultur liofilisasi dipindahkan ke dalam tabung berisi media MRS broth (de Mann Rogosa Sharpe)
Kultur ini kemudian disimpan pada media MRS agar yang ditambah 0.1% (b/v) CaCO3 dengan menggunakan metode tusuk.
Elisa Julianti - THP-FP USU
Kultur diinkubasikan pada suhu 37oC selama 48 jam kultur stok (disimpan di dalam refrigerator suhu 4oC) , disegarkan kembali minimal sebulan sekali. Inokulum yang akan ditambahkan ke dalam minuman sari buah dibuat dalam bentuk kultur kerja.
Kultur kerja dibuat dengan menggunakan media sari buah dan susu skim.
Kultur induk sebanyak 0.1% di tumbuhkan pada media sari buah yang mengandung susu skim 10% dan diinkubasikan pada suhu 37oC selama 48 jam, sehingga dihasilkan koloni sebanyak 1.0-4.0 x 109 koloni/ml dengan kadar asam laktat kurang lebih 2.7%.
Selanjutnya kultur ditambahkan lagi sebanyak 0.5% dalam media sari buah yang ditambah susu skim 10% dan glukosa 3%, dan diinkubasikan selama 24 jam pada suhu 37oC.
Kultur induk perlu diperbaharui setiap minggu dengan cara menumbuhkannya ke dalam media sari buah dan susu skim 10%.
Elisa Julianti - THP-FP USU
11/04/2012
3
Kultur MRS Broth Agar MRS Liofilisasi (48-72 jam 37oC) Kultur stok
Sari buah + Susu skim 10% Kultur induk (48 jam, 37oC)
Sari buah + susu skim 10% Kultur antara (48 jam, 37oC)
Sari buah + susu skim 10% + 3% glukosa
Kultur kerja (24 jam, 37oC)
Gambar 3. Tahap-tahap persiapan inokulum bakteri dalam pembuatan minuman sari buah dengan probiotik. Elisa Julianti - THP-FP USU
PENGEMBANGAN INOKULUM UNTUK KAPANG
Inokulum berupa spora aseksual
Jamur dapat membentuk spora pada media yang sesuai dan luas permukaan yang cukup.
Penggunaan sel vegetatif dapat dilakukan, tetapi sulit karena populasi inokulum tidak seragam sehingga perlu pemotongan miselia (misalnya dengan warring blender). Teknik ini digunakan dalam produksi giberelin oleh Gibberella fujikuroi.
Elisa Julianti - THP-FP USU
Cara-cara pengembangan inokulum kapang :
1. Sistem roll bottle
Media berupa agar 3% yang disterilisasi dalam botol berbentuk silinder dengan ukuran 1 L hingga melekat di permukaan bagian dalam dari botol, kemudian diinokulasikan spora kapang dan diinkubasi pada suhu 24oC selama 6-7 hari diterapkan dalam produksi penisilin oleh Penicillum chrysogenum.
Elisa Julianti - THP-FP USU
Cara-cara pengembangan inokulum kapang : .....
2. Sporulasi pada media biji-bijian dan sekam
Media berupa biji-bijian dan sekam seperti biji barley dan sekam gandum disterilisasi, kemudian diinokulasikan dengan jamur dan diinkubasi pada suhu 28oC selama 6 hari sengan RH 98%.
Contoh: Aspergillus ochraceus dalam 2.8L gelas diisi dengan 100-200 g barley dan sekam, akan menghasilkan 5 x 1011 konidia.
Elisa Julianti - THP-FP USU
Cara-cara pengembangan inokulum kapang : .....
3. Sporulasi secara submerged culture
Misalnya pada persiapan inokulum untuk produksi gliserofulvin oleh Penucillum patulum dalam media whey dan corn step liquor dengan aerasi yang cukup.
Elisa Julianti - THP-FP USU
Tahap pengembangan inokulum untuk jamur benang sama dengan bakteri dan khamir.
Contoh produksi penicilin dilakukan dengan 5 (lima) tahap persiapan inokulum seperti terlihat pada Tabel 3
Elisa Julianti - THP-FP USU
11/04/2012
4
Tabel 3. Tahap pengembangan inokulum dalam proses produksi penisilin oleh Penicillum chrysogenum.
Tahap 1 Kultur stok-spora dalam pasir steril
Tahap 2 Kultur dipindah ke media agar
Tahap 3 Kultur dalam roll tube, kultur spora dalam 1L botol
Tahap 4 Miselia dan spora tumbuh dalam skala produksi pertama
Tahap 5 Tahap 4 digunakan untuk inokulasi skala produksi kedua,
produksi penisilin (volume inokulum 7-10%).
Elisa Julianti - THP-FP USU
INOKULASI SECARA ASEPTIK
Teknik inokulasi dalam industri fermentasi meliputi: pemindahan kultur mikroba dari suspensi spora pada skala laboratorium sampai skala produksi (pabrik) harus dilakukan secara aseptik.
Dasar teknik aseptik pada proses inokulasi adalah : Mempertahankan tekanan positif di dalam tanki
Tempat jalan masuk pemindahan kultur (port) harus dilengkapi dengan jalur persediaan uap panas.
Sistem klep (valve) dapat diatur sedemikian rupa hingga setiap jalur yang dilalui kultur dapat disterilkan terlebih dahulu.
Elisa Julianti - THP-FP USU
PENGGUNAAN SEL TERIMOBILISASI DALAM FERMENTASI
Inokulum yang digunakan dalam proses fermentasi dapat juga berupa sel-sel yang sudah diimobilisasi
Teknologi imobilisasi sel adalah lokalisasi sel selama proses perombakan berlangsung sehingga sel tersebut mudah dipisahkan dari substrat dan produk untuk digunakan kembali.
Keuntungan teknologi imobilisasi adalah : pemanfaatan sel dapat berulang-ulang
mempermudah pengendalian proses
meningkatkan stabilitas sel
diperoleh produk bebas sel/enzim
tahan lama dan kerusakannya dapat diperhitungkan
Elisa Julianti - THP-FP USU
Metode-metode untuk imobilisasi sel mikroba dibagi menjadi 3 (tiga) kelompok (Chibata et al., 1983) :
1. Metode Ikatan dengan pembawa (carrier)
2. Metode Ikatan melintang
3. Metode Penjeratan
Elisa Julianti - THP-FP USU
ad 1. Metode Ikatan dengan pembawa
Didasarkan pada pengikatan sel-sel mikroba langsung pada pembawa yang tidak larut air dengan 3 metode penyerapan yaitu fisik, ionik dan kovalen.
Carrier : polisakarida tidak larut air (sellulosa, dekstran dan turunan agarosa), protein (gelatin dan albumin), polimer sintetik (resin pertukaran ion dan polivinilklorida) dan oksida logam (zirkonium oksida dan titanium oksida), serta gelas berliang renik.
Elisa Julianti - THP-FP USU
ad.2. Metode Ikatan Melintang Didasarkan pada pembentukan ikatan melintang di
antara sel-sel dengan bantuan pereaksi-pereaksi bifungsional atau multifungsional.
Digunakan untuk imobilisasi sel-sel E.coli yang mempunyai aktivitas aspartase yang tinggi.
Sel-sel E.coli diimobilisasi dengan memperkuat dinding sel dan mengikat sel-sel secara melintang dengan pereaksi bifungsional seperti glutaraldehida atau toluendiisosianat.
Elisa Julianti - THP-FP USU
11/04/2012
5
CH═N-sel-N═CH(CH2)3CH═N-sel═CH │ N ║ CH │ OHC(CH2)3CHO + sel (CH2)3 glutaraldehida │ CH ║ N │ -CH═N-sel-N-CH-
Gambar 3. Imobilisasi sel dengan metode ikatan melintang antar sel menggunakan glutaraldehida
Elisa Julianti - THP-FP USU
ad.3. Metode Penjeratan
Metode yang menjerat sel secara langsung ke dalam matriks polimer.
Paling banyak digunakan untuk imobilisasi sel dalam keadaan hidup.
Jenis-jenis pembawa yang digunakan untuk menjerat sel dikelompokkan berdasarkan mekanisme pembentukan gel (Tabel 4).
Elisa Julianti - THP-FP USU
Tabel 4. Metode yang dapat diterapkan untuk imobilisasi sel utuh dengan metode penjeratan dalam gel.
Mekanisme pembentukan gel Polimer
Polimerisasi Poliakrilamida, polimetakrilat
Ikatan melintang Berbagai prapolimer protein
Polikondensasi Poliuretan, Resin epoksi
Pembentukan gel secara thermal Kolagen, gelatin, agar/agarose, -karagenan
Secara ionotropik Alginat, Kitosan
Presipitasi Selulosa, selulosa triasetat
Elisa Julianti - THP-FP USU
Tabel 5. Produksi senyawa-senyawa penting menggunakan sel-sel hidup terimobilisasi
Senyawa Sel-sel Mikroba Carrier untuk Imobilisasi
Bir Saccharomyces carlsbergensis
Saccharomyces cerevisae
Polivinil klorida, bata, berliang renik, Kalsium alginat
Etanol Saccharomyces cerevisae Kalsium alginat, k-karagenan,poliakrilamida, cincin Raschig berlapis, serpihan kayu
Saccharomyces carlsbergensis
Saccharomyces bayanus
Kluyveromyces fragilis
Pachysolen tannophilus
Zymomonas mobilis
k-karagenan, silika berliang renik
k-karagenan
kalsium alginat kalsium alginat kalsium alginat, k-karagenan, manik-manik polistiren, borosilikat, hambalan serat gelas.
Elisa Julianti - THP-FP USU
Senyawa Sel-sel Mikroba Carrier untuk Imobilisasi
Gliserol Saccharomyces cerevisae k-karagenan
Asam Asetat Acetobacter acetii Keramik berliang renik, Titanium hidrus
Asam Sitrat Aspergillus niger
Saccharomyces lipolytica
Kalsium alginat Serpihan kayu
Asam Glukonat Aspergillus niger Kalsium alginat
Asam laktat Lactobacillus lactis
Lactobacillus delbrueckii Kalsium alginat Kalsium alginat
Asam L-Glutamat
Brevibacterium flavum
Corynebacterium glutamicum
Kolagen
L-Isoleusin Serratia marcescens k-karagenan
Vitamin B12 Propionibacterium freudenreichii Poliuretan
Amilase Bacillus subtilis Poliakrilamida
Selulase Trichoderma raesei k-karagenan
Protease Streptomyces fradie Poliakrilamida
Elisa Julianti - THP-FP USU
PENGAWETAN DAN PEMELIHARAAN KULTUR
1. Suhu dingin, 5-10oC, dilakukan penyegaran dengan cara pergantian media setiap minggunya.
2. Pembekuan : Suhu -20oC atau lebih rendah. Perlu penambahan cryoprotective misalnya gliserol. Selama transportasi kultur harus dalam keadaan beku. Viabilitas 1-2 tahun
3. Pembekuan suhu ultra cold Suhu -50 sampai -80oC. Cryoprotective yang digunakan : gliserol 10% (v/v) dan dimetil
sulfoxida (DIMSO) 5% (v/v). Sel dipanen pada saat pertengahan atau akhir fase pertumbuhan
4. Pembekuan dengan Nitrogen cair dengan suhu -196oC. 5. Pengeringan kultur.
Elisa Julianti - THP-FP USU
11/04/2012
6
Pengeringan Kultur
a. Pengeringan Vakum b. Pengeringan Semprot (suhu 70oC)
Telah berhasil di USA dan Swedia Untuk mencegah kerusakan selama pengeringan
ditambahkan senyawa : - asam askorbat - Na-glutamat - Lisin
c. Pengeringan beku : - Asam L-glutamat - Skim - L-arginin - Gliserol - Lactosa - Kasiton - Malt ekstrak - Asetil Glisin - Sukrosa
Elisa Julianti - THP-FP USU
Pengawetan Spora Kapang
1. Pengeringan pada substrat tanah :
1 ml suspensi konidia + 5 g tanah kering steril kemudian dikeringkan pada suhu 25o C.
2. Pengeringan pada silika gel : Tabung reaksi (13 x 100 mm) diisi setengahnya dengan silika
gel 6-12 mesh grade 40.
Sterilisasi 180oC, 1.5 jam
Ditambahkan 0.5 ml suspensi spora
Tabung dikocok
Dikeringkan pada suhu 25oC
Contoh : untuk Neurospora
Elisa Julianti - THP-FP USU
3. Pengeringan pada pecahan porselen (untuk penyimpanan bakteri)
10-12 pecahan porselen dimasukkan ke dalam botol kecil (10 ml)
Disterilisasi 121o C selama 15 menit
Dipindahkan ke dalam cawan petri
Ditetesi dengan kultur yang berisi 20% sukrosa (b/v)
Dipindahkan kembali ke dalam tabung
Dikeringkan vakum 72-96 jam
Botol disimpan dalam wadah logam tertutup dan berisi penyerap udara
Elisa Julianti - THP-FP USU