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Informe Técnico Final(Enero de 2006 – Diciembre de 2007)
ProyectoEvaluación de la actividad estrogénica de extractos de tallos de orégano(Lippia graveolens HBK. var. berlandieri Schauer. y comparación de suxilema secundario
Clave CGPI: 20061537
Director del ProyectoM. en C. Martha Celina González Güereca
Colaboradores(C.) M. en C. Agustín Ángel Meré Rementería, Prof. Investigador de CIIDIR-IPN, UnidadDurango.Dra. Teresa Margarita Terrazas Salgado, Prof. Investigador del Colegio de Postgraduados.Dr. Marcos Soto Hernández, Prof. Investigador del Colegio de Postgraduados.Dra. Cristina Lemini Guzmán, Prof. Investigador de la Facultad de Química de laUniversidad Nacional Autónoma de México.
Estudiantes participantesTesis profesional: Iliana Espinoza Valles. Instituto Tecnológico de Durango.Tesis profesional: Faviola Gómez Romero. Instituto Tecnológico de Durango.Residencia profesional y Tesina: C. Jesús Olguín Soto. Instituto Tecnológico VillaMontemorelos, Dgo.Servicio social: Edgar Francisco Esparza Soto. Instituto Tecnológico de Durango.Servicio social: Erica Estela Córdova Gurrola. Instituto Tecnológico de Durango.Servicio social: Cinthya Araceli Hernández Hernández. Instituto Tecnológico de Durango.Tesista y prácticas profesionales en proceso: Yuridia Frayre. Facultad de CienciasQuímicas de la Universidad Juárez del Estado de Dgo.
2
Í N D I C E D E C O N T E N I D O
CARÁTULA 1
RESUMEN 8
1 INTRODUCCIÓN 9
2 ANTECEDENTES 11
3 OBJETIVOS 16
3 METAS 16
4 MATERIALES Y MÉTODOS 17
4A Anatomía del orégano 17
4B Ensayo de fitotoxicidad 18
4C Ensayos antimicrobianos 19
4D Ensayo de actividad estrogénica 20
4E Ensayo de actividad genotóxica 22
5 RESULTADOS 24
5A Anatomía del xilema secundario 24
5B Bioensayo: efecto fototóxico de extractos de tallo de orégano
en semillas
30
5C Ensayos antimicrobianos 39
5D Bioensayo de la actividad estrogénica 42
5E Bioensayo de actividad genotóxica 43
6 IMPACTO SOCIAL 48
7 LITERATURA CITADA 49
8 ANEXO 54
3
Í N D I C E D E C U A D R O S
Cuadro 1. Características cuantitativas de Lippia graveolens en tres sitios de
colecta
26
Cuadro 2. Datos estadísticos de Lippia graveolens en los tres sitios de colecta 26
Cuadro 3. Porcentaje de brotación en las semillas utilizadas 31
Cuadro 4. Datos estadísticos del ensayo con lechuga y extracto de metanol 35
Cuadro 5. Datos estadísticos del ensayo con lechuga y precipitado de acetato
de etilo
35
Cuadro 6. Datos estadísticos del ensayo con lechuga y extracto de acetato de
etilo
35
Cuadro 7. Datos estadísticos del ensayo con lechuga y extracto de hexano 36
Cuadro 8. Componentes detectados en el aceite esencial 39
Cuadro 9. Componentes efectividad antimicrobiana del aceite esencial de
orégano
39
Cuadro 10. EMN/10,000 ET de los grupos de trabajo en los diferentes tiempos
de muestreo
45
Cuadro 11. EPCMN/1000 EPC de los grupos de trabajo en los diferentes
tiempos de muestreo
46
Cuadro 12. EPC/1000 ET de los grupos de trabajo en los diferentes tiempos
de muestreo
47
4
Í N D I C E D E F I G U R A S
Figura 1. Estructuras anatómicas del tallo de orégano en el municipio de
Mapimí: A) Heterogeneidad de anillos de crecimiento; B) Radios multiseriados;
C) Vasos irregulares y en grupos; D) Traqueida vasicéntrica; E) Células de
floema; F) Material recolectado.
27
Figura 2. Estructuras anatómicas del tallo de orégano en el municipio de
Nombre de Dios: A) Anillos de crecimiento; B) Radios multiseriados; C) Vasos y
fibras y en grupos; D) Aceite esencial; E) Presencia de cristales; F) Material
recolectado.
28
Figura 3. Estructuras anatómicas del tallo de orégano en el municipio de El
Mezquital: A) .Anillos de crecimiento; B) Radios multiseriados; C) Vasos y fibras
y en grupos; D) Fibra; E) Ritidoma; F) Material recolectado.
29
Figura 4. Gráfica de los ensayos con semilla de lechuga 32
Figura 5. Gráfica de los ensayos con semilla de tomate verde 33
Figura 6. Gráfica de los ensayos con semilla de tomate rojo 34
Figura 7. Efecto de los extractos de ensayo en el hipocótilo de semillas de
lechuga
37
Figura 8. Efecto de los extractos de ensayo en la radícula de semillas de
lechuga
37
Figura 9. Efecto fitotóxico sobre la germinación de semillas de tomate rojo 38
Figura 10. Longitud de radículas de semillas de lechuga 38
Figura 11. Desarrollo de semillas de tomate rojo 38
Figura 12. Halos de inhibición de Salmonella sp. 40
Figura 13. Mesofílicos aeróbicos aislados de carne molida de cerdo 40
Figura 14. Ensayos del aceite con carne molida 41
Figura 15. Administración subcutánea de estradiol y compuestos de prueba 42
Figura 16. Toma de muestra de sangre de la vena caudal 44
Figura 17. Preparación de los frotis 44
Figura 18. Célula de eritrocito mononucleado y células policromáticos 44
5
D O C U M E N T O S D E L A N E X O
I Documentos de las tesistas de licenciatura que participaron en el proyecto:
Faviola Romero Gómez e Iliana Espinoza Valles:
Ia Copia de solicitud de tesis: Oficio D.I.Q. y B. 744/06 del 31 de marzo de
2006.
Ib Copia de carta de aceptación: Oficios CDDV/061/06 del 6 de abril de 2006 y
CDDV/062/06 del 6 de abril de 2006.
Ic Copia de la autorización del tema de tesis: PRO-1319-06 y PRO-1321-06 del
22 de agosto de 2006.
Id Copia de liberación de tesis: Constancia UPIS/050/07 y Constancia
UPIS/051/07.
Ie Copia de constancia de asesoría sin percepción económica: Oficio D.I.Q. y
B. 167/07.
If Copia de carátula del CD de la tesis correspondiente.
Ig Copia de carátula de la portada, hoja de la clave de registro, contenido,
índice de cuadros y figuras y resumen de la tesis correspondiente.
Ih Copias de las actas de examen profesional Libro 04, Fojas 134 y 135.
Ii Copias de integrantes de jurado para solicitud del acto de recepción
profesional profesional PRO-048-07 y PRO-050-07 del 23 de enero de 2007.
II Documentos de la tesista en proceso: Yuridia Rosalía Frayre Fernández:
IIa Copia de solicitud de tesis: Oficio SAC/086/07 del 22 de junio de 2006.
IIb Copia de carta de aceptación: Oficio UPIS/116/07 del 28 de junio de 2007.
III Documentos del tesista por titulación con residencia profesional: Jesús
Olguín Soto:
IIIa Copia de titulación por residencia profesional: Oficio GTV/158/07.
IIIb Copia de acta de examen.
IV Documentos de los prestadores de servicio social que participaron en el
proyecto: Erica Estela Córdova Gurrola, Cinthya Araceli Hernández
Hernández y Edgar Francisco Esparza Soto:
IVa Copia de solicitud de servicio social: Oficio O.S.S. 065/07; 066/07 y 067/07
6
del 06 de febrero de 2007.
IVb Copia de carta de aceptación: Oficios UPIS/032/07; UPIS/033/07 y
UPIS/034/07 del 7 de febrero de 2007.
IVc Copia de liberación de servicio social: UPIS/043/07; UPIS/044/07 y
UPIS/045/07 del 19 de octubre de 2007.
IVd Copia de asesoría O.S.S.908/07; O.S.S.907/07 y O.S.S.908/07 del 19 de
octubre de 2007.
V Documentos del alumno de residencia profesional que participó en el
proyecto: Jesús Olguín Soto:
Va Copia de solicitud de residencia profesional: Oficio PPP/94/06 del 29 de
junio de 2007.
Vb Copia de carta de aceptación: Oficio CDDV/111/06 del 1º de agosto de 2006.
Vc Copia de liberación de servicio social: UPIS/014/06 del 22 de enero de 2007.
Vd Copia de asesoría GTV/115/07 del 22 de noviembre de 2007.
VI Documentos de Prácticas profesionales en proceso: Yuridia Rosalía Frayre
Fernández:
VIa Copia de solicitud: Oficio DEPTO. VINC./SS/079/07.
VIb Copia de aceptación de prácticas: Oficio UPIS/160/07.
VII Grabación radiofónica con guión y CD en Radio Universidad: “El boom de los
productos elaborados con aceite esencial de orégano”, 17 de octubre de
2007.
VIII Copias del diploma, constancia de participación, carta de aceptación,
resumen corto y resumen en extenso del II Congreso Internacional sobre
perspectivas del desarrollo Rural Regional con el tema: Extracción de aceite
esencial de orégano (Lippia graveolens HBK) en pequeña escala el 30 de
agosto de 2007 en Zacatecas
IX Copias del diploma, carta de aceptación, resumen corto, copia de portada de
memoria, del XXVII Congreso Latinoamericano de Química, VI Congreso
Internacional de Química e Ingeniería Química con el tema: Composición
química del aceite esencial de orégano Lippia graveolens HBK var.
berlandieri Scahuer. de plantas silvestres y semidomesticadas, del 16-20 de
7
octubre de 2006 en La Habana, Cuba
X Copias del diploma, carta de aceptación, carátula del CD de los resúmenes,
resumen corto y resumen en extenso del VIII Congreso Mexicano de
Recursos Forestales con el tema: Anatomía comparativa de xilema
secundario de tallo de orégano Lippia graveolens HBK f. berlandieri
Scahuer.) Resultados preliminares, del 28-31 de octubre de 2007 en Morelia,
Mich.
XI Copias de los diplomas, cartas de aceptación, carátulas de la memoria y
resúmenes cortos de la 3ª Reunión Nacional sobre Orégano, con los temas:
Flavonoides contenidos en tallos de orégano (Lippia graveolens HBK f.
berlandieri Scahuer.) con propiedades antiinflamatorias; Artrópodos
asociados al orégano Lippia graveolens HBK. en el Estado de Durango y
Repelencia y letalidad con aceite de orégano (Lippia graveolens HBK var.
berlandieri Scahuer.) en Varroa destructor del 23-24 de agosto de 2007 en
Buenavista Saltillo, Coah.
8
R E S U M E N
La hoja de orégano mexicano, Lippia graveolens H. B. K. tiene gran demanda en el
mercado internacional, debido a las altas concentraciones de timol y carvacrol
encontradas en su aceite esencial, lo que ha despertado gran interés científico por
conocer la composición química de la planta y evaluar sus propiedades biológicas y
farmacológicas con posterior aplicación. Por lo cual, en este trabajo se estudió la anatomía
del tallo de orégano de diferentes sitios del Estado de Durango, para comparar las
estructuras de su xilema secundario, conocer su eficiencia en función del número y
variabilidad longitudinal de las mismas y correlacionar las condiciones de estrés de las
plantas en su hábitat natural para optimizar el aprovechamiento del recurso.
Se realizaron bioensayos con extractos orgánicos de tallo de orégano para evaluar el
efecto fitotóxico en semillas germinadas de lechuga, tomate rojo y verde. En algunos
casos se manifestaron alteraciones en la elongación de la radícula y del hipocótilo, o
retardo o inhibición de la germinación. Los extractos más tóxicos fueron el de acetato de
etilo y el de hexano.
Se evaluó la capacidad bactericida del aceite esencial de orégano en carne molida de
cerdo contaminada con Salmonella spp., Staphylococcus aureus y Escherichia coli. El
aceite esencial inhibió el desarrollo de estas bacterias en 48 %.
Para determinar la capacidad estrogénica, se utilizaron los mismos extractos anteriores
solubilizados en propilenglicol y se compararon simultáneamente con estradiol como
testigo positivo. Los extractos mostraron cierta capacidad estrogénica, pero es necesario
realizar ensayos a una mayor concentración para comparar estos resultados con la hoja
de la planta, por ser la que más se utiliza.
Con respecto al efecto genotóxico, se estudiaron tres diferentes dosis del extracto acuoso
liofilizado de hoja de orégano en eritrocitos de sangre periférica de ratón, para evaluar el
posible efecto genotóxico. No se encontró evidencia de daño al ADN como consecuencia
a la exposición del extracto acuoso de orégano en los animales de experimentación.
Los resultados anteriores amplían las evidencias del potencial que tiene la planta de
orégano para el aprovechamiento integral de la misma para continuar evaluando sus
propiedades, muchas de las cuales aún no han sido comprobadas.
9
I N T R O D U C C I Ó N
La distribución mundial del género Lippia es amplia, se encuentra en América desde el sur
de Estados Unidos hasta Costa Rica y América del Sur, así como en algunos territorios del
África Tropical, España, Francia, Grecia y Turquía. En México L. graveolens, conocida
como orégano mexicano se distribuye en casi todo el territorio nacional (González, 2005).
Esta especie compite entre el primero y segundo lugar junto con Turquía por su
exportación a nivel mundial con más de 4000 toneladas anuales y una participación en la
última década del 35 ó 40 % del total de la producción mundial del mercado internacional,
dentro de la cual el estado de Durango contribuye en gran medida con dicha exportación.
En Durango esta especie se distribuye en general en poblaciones cerradas, asociada a
bosques tropicales caducifolios y matorral xerófilo sobre todo en el noreste del estado en
regiones áridas y semiáridas de climas cálidos y semi-cálidos desde 1100 - 2015 m de
altitud. Asimismo se le encuentran en otras áreas en poblaciones de menor densidad,
como ocurre en el sureste del estado.
Para la realización de la primera parte de esta investigación, se comparó la anatomía del
xilema secundario (principal tejido conductor en plantas vasculares) en tres hábitats donde
se desarrolla el orégano con la finalidad de aportar información acerca de la respuesta de
las poblaciones con respecto al estrés y al rendimiento del aceite esencial en dichas
localidades y mejorar el aprovechamiento del recurso al seleccionar individuos de calidad
que garantizan su supervivencia y por ende, la conservación de la especie silvestre.
Asimismo, estas diferencias anatómicas pueden proporcionar datos que apoyen su
caracterización sistemática y diferenciar la posible existencia de otra especie de Lippia o
de subespecies de L. graveolens ésta dadas las controversias que actualmente se tienen
en la clasificación botánica de este género.
Con respecto a los ensayos biológicos, se efectuaron pruebas de fitotoxicidad de cinco
diferentes concentraciones de extractos del tallo en semillas de lechuga tomate rojo y
tomate verde, así como la capacidad de germinación de éstas bajo esas condiciones.
10
Igualmente se evaluó la efectividad del aceite esencial de orégano sobre bacterias
patógenas mesofílicas aeróbicas en carne de cerdo, las cuales pueden ser encontradas en
carne molida de cerdo.
En el segundo año de la realización de este proyecto, se trabajaron otros ensayos
biológicos, entre ellos, la determinación de la posible actividad genotóxica de un extracto
liofilizado de la hoja de orégano en linfocitos de sangre periférica de ratón. Asimismo se
llevó a cabo un ensayo preliminar para determinar la actividad estrogénica de diferentes
extractos y fracciones impuras obtenidas del tallo de orégano en ratones a los cuales se
les extirpó el útero para poder observar el efecto uterotrófico de los compuestos de
prueba.
De esta manera, los resultados anteriores a través de las diferentes pruebas biológicas
preliminares realizadas, permiten conocer más acerca de las propiedades farmacológicas
del orégano, y contribuir a incrementar el conocimiento que actualmente se tiene de esta
planta tan controvertida, que hoy en día tiene un “boom” en el campo de la Medicina en
sus diferentes ramas.
11
A N T E C E D E N T E S
El uso de las plantas en la medicina tiene una historia honorable, pues en otros tiempos
todos los medicamentos se obtenían de fuentes naturales, lo cual establecimiento de una
relación muy estrecha y productiva entre el hombre y su medio vegetal. Primero a través
de brujos, curanderos y herboristas y hoy en día de los médicos.
A pesar de los siglos, la fitoterapia ha ganado terreno en el tratamiento de enfermedades
por plantas frescas, secas o sus extractos y ha evolucionado y ganado prestigio y eficacia
y acercándose cada vez más a las normas que exige la medicina farmacéutica (Carballo et
al., 2005).
Por ejemplo en la búsqueda de fuentes de fitoestrógenos y estrógenos, así como en sus
efectos y actividad, se han publicado numerosas revisiones, en las cuales se discuten los
beneficios y los efectos adversos de estos compuestos en humanos, así como los
métodos para su detección (Albertazzi, 1995). Así, el término fitoestrógeno se utiliza para
definir una amplia variedad de compuestos no esteroides encontrados en las células
vegetales o provenientes del metabolismo in vivo de algunos precursores presentes en
muchas plantas comestibles; las cuales son importantes para el crecimiento normal y
desarrollo de las mismas.
Tal es el caso de las isoflavonas, las cuales representan una de las clases más
características de compuestos fitoestrogénicos encontrados en las plantas superiores
como agliconas y como glicósidos, malonilglicósidos y acetilglicósidos. Éstas juegan un
papel muy importante, no solamente para los vegetales, sino también para los animales,
entre los que se incluye al hombre. Este tipo de compuestos son muy abundantes, en
particular en la familia de las Leguminosas (Fabacae), y recientemente en muchas otras. A
la fecha se han realizado numerosos estudios y revisiones referentes a las propiedades en
la salud de de fitoestrógenos como hormonas substitutas con respecto al estradiol
(particularmente, la genisteína) y más recientemente, se ha reportado que la hormona de
12
terapia de reemplazamiento, no es tan segura y efectiva como se pensaba anteriormente
(Antonelli, et al., 2005).
En el caso del orégano, ésta planta se reporta que contiene numerosos flavonoides y
algunas flavanonas e isoflavonas (Erlung, 2002; Lin et al., 2007; González et al., 2007),
por lo que estos antecedentes fueron la justificación para realizar este ensayo.
Genotoxicidad
Generalmente la actividad farmacológica de las hierbas medicinales se asocia a la
toxicidad de las mismas y el efecto tóxico inducido depende de la dosis consumida. Por
eso resulta importante estudiar las plantas tóxicas como fuente de productos activos. Una
de las formas de evaluación de toxicidad está dada por su efecto sobre el patrimonio
genético, nivel de análisis propio de la genética toxicológica, la cual implementa ensayos y
métodos para la evaluación del riesgo producido por agentes que se encuentran en el
medio ambiente y cuya presencia puede alterar la integridad del patrimonio genético.
Asimismo, trata de elucidar la relación entre la genotoxicidad y la iniciación de un proceso
neoplásico a través de marcadores biológicos (biomarcadores) cuantificables en diversos
sistemas biológicos, que señalan la exposición de sustancias tóxicas en los planos
molecular y celular, efectos adversos en la salud o susceptibilidad a distintos agentes.
En los estudios genotóxicos actualmente han cobrado gran importancia, pues caracterizan
y describen la acción de diversas sustancias que, a nivel subtóxico, provocan algún tipo de
modificación en el material genético. Así que la acción de estos agentes genotóxicos
pueden dar lugar a la inducción de cambios en la secuencia del ADN, lo cual provoca la
aparición de mutaciones puntuales o a gran escala, de aberraciones cromosómicas
visibles. Las modificaciones en la cadena polinucleotídica a menudo producen la alteración
o eliminación de la función génica (Laffon et al., 2004).
De ahí que se realicen evaluaciones de la genotoxicidad de todos los agentes
mutagénicos que pudieran ser sobresalientes, por lo cual, constantemente se recurre a la
realización de una serie de ensayos tanto in vitro como in vivo en plantas medicinales,
13
cosméticos, fármacos, alimentos, etc., debido a que ninguno de estos ensayos, por sí solo,
puede ser capaz de detectar todos los posibles agentes mutagénicos. De tal manera que
estas técnicas deben de ser capaces de detectar tanto el daño como la reparación
consecuente al material genético en células individuales. Uno de los más frecuentes y que
cumple con esta premisa es el ensayo por electroforesis de una sola célula o ensayo
cometa; el cual evalúa los niveles de daño y reparación al ADN en poblaciones celulares
sin la necesidad de trabajar con células en proliferación. Una desventaja de este método
es su costo (Carballo et al., 2005).
La otra comúnmente utilizada también es la del ensayo de micronúcleos, la cual se utiliza
en la evaluación de la genotoxicidad de compuestos carcinógenos ambientales y
ocupacionales. Esta técnica es posible realizarla en diferentes especies, tales como
animales de laboratorio e incluso en el humano, así como en una gran variedad de tejidos
que se dividan continuamente (Rosas et al., 2006).
Estas técnicas son herramientas que proporcionan información acerca de la integridad del
material genético con la finalidad de prevenir la carcinogénesis, el desarrollo de
enfermedades hereditarias o el envejecimiento principalmente (Ramos et al., 2003). La
utilización del ensayo de micronúcleos en la evaluación de extractos, es de uso frecuente
en la medicina humana y permite detectar aberraciones cromosómicas, claramente
involucradas en el origen del cáncer, lo que proporciona una buena base para la
estimación del riesgo en humanos. La aplicación de este ensayo está en consonancia con
la estrategia adoptada internacionalmente en la evaluación del potencial mutagénico
(Montero et al., 2001).
Para las poblaciones que utilizan hierbas de manera tradicional, que se favorecen con el
uso de especies con acciones quimiopreventivas, podrían ser útiles como parte de las
estrategias de mejoramiento de la expectativa de vida.
Algunos estudios en plantas utilizadas como especias se han llevado a cabo, así como en
algunos ingredientes del orégano, como es el caso del carvacrol, el cual es uno de los
14
componentes mayoritarios, con fuerte actividad antibacteriana, antiviral, antifúngica y con
efectos antiparasitarios, en uno de los cuales por ejemplo, se evaluaron las propiedades
genotóxicas y antigenotóxicas del carvacrol mediante un intercambio de cromátidas
hermanas in vitro sister (SCE) en sangre periférica de linfocitos humanos, los cuales de
acuerdo a los datos obtenidos, todas las dosis del carvacrol no incrementaron la formación
de las cromátidas hermanas, mientras que si inhibieron la velocidad de las mismas
inducidas por la mitomicina C, por lo que el carvacrol exhibió una actividad antigenotoxica
en las células mamíferas indicando su potencial para uso como un agente antigenotóxico
(Evrim et al., 2003). En otro estudio con aceites esenciales de plantas de orégano
(Origanum vulgare subsp. hirtum), Coridothymus capitatus, y Satureja thymbra
encontraron que las pruebas de mutación somática y de la recombinación en Drosophila
mostraron que entre los compuestos estudiados, solamente el timol manifestó tener
actividad genotóxica (Karpouhtsis et al., 1998). El ácido rosmarínico aislado de
Rosmarinus officinalis L y de Origanum vulgare L., presentaron efectos antimutagénicos y
anticarcinogénicos (Milic, et al., 1998). En otros estudios con O. vulgare señalan que la
galangina y la quercetina son dos flavonoides con actividad desmutagénica específica
contra el carcinógeno dietético 3-amino-1-methyl-5H-pyrido[4,3-b]indole (Trp-P-2) (Kazuki
et al., 1995.
Contaminación microbiana en carnes
La contaminación en carne es muy frecuente y los microorganismos que se encuentran en
este producto son bacterias y hongos principalmente, por lo que las fuentes de
contaminación son muy variables; pero el manejo de este tipo de productos, es
indudablemente, el más contaminante.. Con frecuencia se encuentran Escherichia coli,
Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Salmonella spp. (Scanga et al., 2000),
además otros como Campylobacter spp; (Gibbons, 2005).
Con base a las diversas propiedades antimicrobianas que se le atribuyen al aceite
esencial de orégano (Lippia spp.), en diversos alimentos, se encuentran varios reportes en
los cuales se utiliza el aceite esencial de varias especies de este género como L. javanica
como un agente que evita la contaminación por estas bacterias (Manenzhe, et al., 2004) o
15
de otras plantas de otros géneros y familias como lo es el Origanum vulgare, Coriandrum
sativum, Rosmarinus officinalis, Cinnamomum ceylandicum, Salvia officinalis, Thymus
vulgaris, Zizygium aromaticum, entre otra muchas más (Buró, 2004). Así mismo, en Lippia
graveolens, también existen varios trabajos que comprueban esta actividad bactericida en
diversos tipos de carnes (Skandamis, 2002; Hernández et al., 2005).
En lo que se refiere a la anatomía de la planta de orégano, desde el punto de vista
anatómico, el género Lippia de la familia Verbenaceae, se ha estudiado poco (Bonzani et
al., 2003); autores como Record y Hess (1943) han contribuido a la anatomía básica de
algunas especies del género Lippia como L. nodiflora, L. citriodora y L. virgata. Asimismo,
Carlquist en 1985, estudió la relación de las traqueidas vasicéntricas y el hábitat de
muchos arbustos de zonas áridas como es el caso de Lippia wrightii, que contiene
traqueidas vasicéntricas reminiscentes. En Lippia junelliana (Mold.) Troncoso, se reportó la
presencia de estomas en pecíolos y tallos, muy característicos para esta especie (Bonzani
et al. (1997), en Lippia turbinata Grises encontraron estomas en criptas del hipófilo
acompañados de tricomas.
Por todo lo anterior, aunque existe mucha información acerca de la composición química
del aceite, es aún muy pobre la que se enfoca al estudio químico de la planta, así como a
la anatomía de la misma y por consecuencia al estudio de las propiedades biológicas que
se le atribuyen a esta planta, la cual tiene una gran demanda en el mercado internacional.
16
O B J E T I V O S
1. Describir la anatomía comparativa del xilema secundario de L. graveolens en tres
hábitats distintos del estado de Durango.
2. Evaluar la capacidad estrogénica de extractos crudos de tallo de orégano (Lippia
graveolens HBK. var. berlandieri Schauer.) en ratones.
3. Evaluar la actividad genotóxica del aceite esencial y extractos de orégano (Lippia
graveolens HBK. var. berlandieri Schauer.) por la prueba de inducción de micronúcleos en
sangre periférica de ratón.
M E T A 1. A Ñ O 1
Influencia del estrés en las estructuras anatómicas de plantas de orégano (70 %).
Realizar ensayos con extractos y aceite esencial de orégano en diversos materiales
biológicos (30 %).
M E T A 2. A Ñ O 2
1 Determinar el potencial estrogénico de extractos de tallo de orégano (Lippia
graveolens HBK. var. berlandieri Schauer.) en ratones.
2 Determinar el efecto genotóxico de extractos de aceite esencial y extractos de
orégano (Lippia graveolens HBK. var. berlandieri Schauer.) por conteo de micronúcleos en
sangre periférica de ratón.
17
M A T E R I A L E S Y M É T O D O S
A Anatomía del orégano
La colecta del material botánico se realizó en tres localidades de los municipios de
Mapimí, Mezquital y Nombre de Dios, Durango, en cada sitio se prensaron los ejemplares
de herbario correspondientes y se incluyeron en el Herbario CIIDIR para identificación
posterior. El procesamiento y preparación del material colectado se efectuó en el
laboratorio de Biotecnología, los ensayos de fitotoxicidad de los extractos del tallo de
orégano en semillas se desarrollaron en el laboratorio de la Central de Instrumentación. En
ambos casos, en el CIIDIR-IPN, Unidad Durango. La obtención de cortes en el microtomo,
la revisión y análisis de ejemplares en el analizador de imágenes, se llevaron a cabo en el
laboratorio de Anatomía del Instituto de Biología de la UNAM y en el Laboratorio de
Anatomía del Colegio de Postgraduados respectivamente.
Recolección del material botánico
En los tres sitios de colecta, se cortó el tallo principal de los ejemplares botánicos a 5 cm
de la base y de ahí se tomaron aproximadamente 5 cm de longitud por individuo.
Procesamiento del material recolectado
Inmediatamente del corte, el material se depositó en una mezcla de glicerina-etanol-agua
y se dejó ablandar durante 9-12 semanas, después de las cuales, se realizaron cortes
transversales, radiales y tangenciales de aproximadamente 20 μ con un microtomo de
deslizamiento.
Tínción y montaje
Los cortes de cada muestra se dividieron en dos partes. Un duplicado se decoloró con una
solución de cloro, luego se eliminó con lavados con agua. Enseguida se procedió a su
deshidratación con alcohol etílico a diferentes concentraciones. Posteriormente, los tejidos
se tiñeron con safranina y después con el colorante verde rápido. Los tejidos se lavan con
etanol absoluto y se sumergieron en xilol hasta su montaje en resina sintética. Durante el
18
secado, se colocaron pequeñas pesas sobre los portaobjetos hasta su secado completo.
Por último, se limpiaron para su observación microscópica.
Preparación de elementos traqueales disociados
Los elementos disociados se prepararon con astillas de madera de la región madura del
xilema y se colocaron en solución de Jeffrey. Después el material se lavó con agua y se
observó al microscopio en preparaciones temporales.
Cuantificación de estructuras
Se contabilizaron 25 mediciones para cada estructura en cada sitio de recolección de
diámetros de fibras, vasos y radios; se cuantificó el número de vasos y radios por mm2,
grosor de pared y lumen de 25 fibras. En los elementos traqueales disociados se
contabilizaron la longitud de fibras y elementos de vaso de 25 unidades por sitio de
colecta. Todas las mediciones se determinaron en un analizador de imágenes integrado a
una cámara digital.
Análisis estadístico
Se utilizó el paquete SAS para obtener el análisis de varianza con la finalidad de detectar
las diferencias significativas entre poblaciones y un análisis de correlación para conocer el
grado de asociación entre los caracteres de cada tipo celular.
B Ensayo de fitotoxicidad
Para evaluar el efecto fitotóxico de extractos orgánicos de tallo de orégano se probaron
para cada uno, cinco concentraciones a 50, 100, 300, 500 y 1000 μg/mL. Los extractos se
corrieron contra un control negativo y un testigo. Se utilizaron semillas de lechuga (Lactuca
sp., tomate rojo y tomate verde. El tiempo de exposición de los extractos fue de 120 horas
para determinar la germinación de las semillas y la elongación del hipocótilo y de la
radícula en todos los casos. Se obtuvo el promedio y desviación estándar de la elongación
de la radícula y del hipocótilo de las plántulas de cada repetición y para cada dilución
respecto del promedio de elongación del control negativo, se obtuvo el porcentaje de
inhibición en la germinación.
19
C Ensayos antimicrobianos
Obtención del material botánico
Se trabajó con material botánico recolectado previamente en 1998, el cual se mantuvo
almacenado en condiciones frescas y en un ambiente seco.
Extracción del aceite esencial
El aceite esencial de la planta de orégano se obtuvo a nivel laboratorio por extracción con
arrastre de vapor de hojas y flores secas. Se realizaron tres extracciones sucesivas de
aceite, para evaluar el rendimiento de éste en la planta después de 8 años de almacenaje.
Análisis químico del aceite esencial por cromatografía de gases
Su análisis químico se determinó en el Instituto de Química de la UNAM, con sede en
Querétaro en un cromatógrafo de gases Agilent 6890, en columna AT-WAX de 25 mm x
30 m y 0.25 μm de espesor, con detector de ionización de flama, helio como gas
acarreador a una velocidad de flujo de 1.0 mL/min y un split de 1:100. Las muestras se
inyectaron sin diluir. El tiempo de retención total de la muestra fue de 45 minutos.
Rotación especifica y densidad óptica
Esta determinación se determinó directamente en un refractómetro de Abbe Baush &
Lomb. La densidad óptica se efectuó con un picnómetro.
Pruebas de inhibición
Para evaluar la efectividad del aceite esencial, se probaron cepas proporcionadas por el
Laboratorio de Microbiología del Instituto Tecnológico de Durango, de Salmonella spp.
Staphylococcus aureus y Escherichia coli, por el método de difusión en placa. Las
bacterias se incubaron en caldo nutritivo por 24 h a 37 °C a una concentración de células
de 1X102 UFC/mL ajustando la turbidez en un espectrofotómetro a 540 nm.
Procesamiento del aceite
El aceite se diluyó en etanol y se preparó a tres diferentes concentraciones (10, 50 y 100
ppm).
20
Actividad antimicrobiana
Se prepararon cajas petri con agar nutritivo y se colocaron discos estériles de papel filtro
de 15 mm de diámetro impregnados con el aceite de cada una de las concentraciones. Al
mismo tiempo, se inocularon cajas petri con agar nutritivo por la técnica de extensión de
superficie con 0.1 mL de cada uno de los microorganismos de prueba. Todas las pruebas
se realizaron por triplicado y se corrieron contra un testigo y un control negativo. Las
placas se incubaron de la misma forma que en las pruebas de inhibición. En todos los
casos se midieron los halos de inhibición.
Efectividad del aceite esencial sobre la carga microbiana de carne de cerdo
Las muestras de carne se colectaron en tiendas de autoservicio de la ciudad de Durango
durante tres días consecutivos en los empaques para su venta al público. Se adicionaron
muestras de 100 g de carne molida y se les adicionó 1, 5, y 10 mL de la de la solución del
aceite esencial a la concentración mínima inhibitoria de 30 ppm, previamente determinada.
Se utilizó aceite comestible como diluyente y se dejó en contacto durante 10 minutos.
Luego se determinó el número de bacterias mesofílicas aeróbicas por la técnica de
vaciado de placa. Las siembras se realizaron por triplicado durante tres días consecutivos.
Las colonias se contabilizaron en un contador de colonias. La presencia de bacterias
mesofílicas anaerobias.
Los datos obtenidos en el experimento se analizaron estadísticamente por el método de
diseño de bloques. El análisis de varianza se obtuvo de dichos datos, seguido de una
prueba de intervalos múltiples de Duncan.
D Ensayo de actividad estrogénica
En esta fase del proyecto únicamente se realizó un ensayo preliminar debido a la falta de
presupuesto. Así mismo, dicho ensayo se efectuó en el departamento de Farmacología de
la Facultad de Medicina en la Universidad Nacional Autónoma de México.
Obtención de los extractos de prueba
Se probaron cinco extractos del tallo de orégano que fueron los siguientes:
21
Extractos de hexano, acetato de etilo y metanol. Éstos se prepararon por maceración del
tallo molido con extracciones sucesivas con hexano, acetato de etilo y metanol, a
temperatura ambiente. Así mismo, del extracto de acetato de etilo, se obtuvieron dos
residuos insolubles que también se probaron.
Los extractos fueron solubilizados en propilenglicol para su valoración estrogenica
utilizando un modelo in vivo comparando de forma simultanea con estradiol como control
positivo.
Animales de experimentación
Para todos los experimentos con animales utilizados en este proyecto, se trabajó
apegándose a la Norma Oficial Mexicana Proy-NOM-062-ZOO-1999. Se utilizaron ratones
(hembras) inmaduras de 21 días de edad de 10 – 15 g de peso de raton CD1. Los
animales se mantuvieron en un cuarto con temperatura controlada (20 – 22°C) con ciclos
de luz y oscuridad de 12 h cada uno. La dieta de los animales de experimentación fue
estándar, utilizando alimento de marca comercial para ratones y agua embotellada.
Se pesaron los ratones de experimentación y se distribuyeron en diferentes lotes, a los
cuales se les asignó el tratamiento correspondiente de manera aleatoria. Se utilizaron
siete grupos de animales de experimentación de tres ratones en cada grupo. Para la
realización del ensayo, se administro por vía subcutánea por tres días consecutivos cada
uno de los extractos a la dosis de 1000 μg/kg peso corporal, estradiol (5 μg/kg) un grupo
control que únicamente se le administró el vehiculo (3 mL/kg). Despues de 24 horas de
haber finalizado el tratamiento los animales se pesaron nuevamente, se sacrificaron por
dislocación cervical y los úteros fueron removidos de la cavidad abdominal y se pesaron
para determinar la actividad uterotrófica inducida por los compuestos de prueba y los
controles. Se determino el peso uterino húmedo. Posteriormente los úteros de los
animales bajo tratamiento se secaron en una estufa a 70°C durante 24 h y se pesaron de
nuevo.
Análisis de resultados
22
Para este trabajo, no se efectuó ninguna repetición, dada las circunstancias
presupuestales, así que únicamente se relacionó el peso corporal de los animales con el
del peso uterino, para el cual se calculó el peso uterino por 100g de animal. La
significancia estadística de las diferencias observadas se estimó de los datos obtenidos
aplicando un análisis de varianza (ANOVA) y pruebas de comparaciones multiples,
(Dunnet, y Dunn) utilizando el programa Sigma Stat, versión 3 (Jandel, Co.), que consistió
en comparar los pesos uterinos por 100g de animal de los diferentes grupos
experimentales con respecto al grupo control.
E Ensayos de actividad genotóxica
En esta última fase se utilizó material botánico (hoja) de reciente cosecha, procedente del
Municipio del Mezquital, Dgo. Para este ensayo se utilizó solo hoja de orégano, por ser el
órgano que la gente más consume.
Preparación de extracto de prueba
Se colectó material botánico en el Municipio de El Mezquital, Dgo. El material se secó bajo
sombra, se separó la hoja del tallo e inmediatamente se guardó en bolsa de plástico hasta
su uso. De las hojas se preparó un té de orégano a una concentración del 5 %, el cual se
liofilizó y se mantuvo en un desecador.
Animales
Se utilizaron 25 ratones macho de dos meses de edad de 20 – 25 g de peso y se
mantuvieron en un cuarto con temperatura controlada (20 – 22°C) con ciclos de luz y
oscuridad de 12 h cada uno. La dieta de los animales de experimentación fue estándar y
se utilizó alimento de marca comercial para ratones, así como agua embotellada para
beber.
Se utilizaron 25 ratones Balb-C, machos, de 5-6 semanas de edad, de 20 – 25 g de peso,
los cuales se mantuvieron en un cuarto con temperatura controlada (20 – 22°C) con ciclos
de luz y oscuridad de 12 h cada uno. La dieta de los animales de experimentación fue
23
estándar y se utilizó alimento de marca comercial para ratones, así como agua
embotellada para beber.
Se evaluó el efecto del orégano en la inducción de eritrocitos micronucleados (EMN), para
lo cual se formarán cinco grupos (5 ratones por grupo): Grupo 1 (testigo negativo); 200 µl
de agua inyectable; Grupo 2, 2mg/kg de orégano; Grupo 3, 4mg/kg de orégano; Grupo 4,
6mg/kg de oregano; Grupo 5 (testigo positivo), 60 mg/kg de ciclofosfamida. La
administración se realizó diariamente durante tres días vía oral. Se tomó una gota de
sangre periférica de la punta de la cola de cada ratón a las 0, 24, 48, 72, 96, 120 y 144h.
Se realizaron dos extendidos sobre portaobjetos limpios. Los frotis se procesaron y se
contaron el número de EMN, eritrocitos policromáticos micronucleados y la proporción de
eritrocitos policromáticos, en el microscopio de fluorescencia.
Los resultados se expresaron como promedios por grupo y las comparaciones se
realizaron entre cada grupo y su respectivo valor basal (0 hr), mediante análisis de
varianza (ANOVA) para medidas repetidas, empleando la prueba de ajuste Bonferroni
para múltiples comparaciones post hoc.
24
R E S U L T A D O S
A Anatomía del xilema secundario
Indudablemente hay una manifestación muy clara en los resultados obtenidos, de la
influencia directa de las condiciones climatológicas sobre las plantas de orégano, las
cuales se encuentran sometidas a diferentes grados de estrés hídrico.
Los caracteres anatómicas revisados de los ejemplares presentan variaciones en cuanto a
número y dimensiones en cada sitio de recolección (Cuadro 1). La madera en general es
de porosidad anular, con anillos de crecimiento heterogéneos e irregularidades en la zona
de Mapimí de mayor estrés hídrico (Figura 1). Los vasos son de paredes más gruesas,
solitarios y en grupos, de distribución tangencial y radial, cortos, ligulados, con placas de
perforación simples y punteaduras intervasculares alternas, el mayor número se encontró
en la misma zona. Se encontraron radios multiseriados de 1 a 3 series de ancho, no
estratificados, largos y cortos, perforados con altos contenidos de almidón y grandes
cantidades de taninos en el área desértica, los más angostos son los de la población de
Nombre de Dios de menor estrés. Las traqueidas vasicéntricas son típicas en los tres
sitios. Las fibras más largas están en la región desértica de Mapimí, donde la especie se
desarrolla a mayor altura. Su peridermis delgada, contiene cristales prismáticos solitarios y
depósitos de aceites o resinas (Figura 2).
En el área de El Mezquital (Figura 3) la madera también presenta porosidad anular, con
anillos de crecimiento muy conspicuos, angostos y más o menos homogéneos con
respecto a lo ancho. Sus vasos son de paredes gruesas, en su mayoría ovalados y
solitarios. Los elementos de vaso tienen punteaduras intervasculares alternas, con placas
de perforación simple. Su peridermis presenta las mismas peculiaridades que la de
Mapimí y se observan también cristales prismáticos solitarios y la presencia de depósitos
de aceites de coloración amarilla en la peridermis, lo cual puede ser una característica de
la especie en particular, dado que esta especie contiene gran cantidad de aceites
esenciales.
25
El análisis de varianza señala diferencias significativas entre las poblaciones, en la región
más húmeda y la más seca, su análisis de correlación indica mayor grado de asociación
positiva en número de vasos y longitud con el diámetro de fibras, y una correlación
negativa entre el número de radios y longitud de fibra. La selección de individuos
vigorosos con base en características anatómicas puede optimizar la explotación de
sustancias biológicamente activas que contiene (Cuadro 2).
Se ha considerado la hipótesis de que el orégano que se distribuye en el estado de
Durango, corresponde aparentemente a dos quimiotipos, uno de los cuales se le
encuentra en la zona desértica y el otro, en las regiones del Mezquital y Nombre de Dios
(González, 2000).
En general, se podría concluir que las estructuras anatómicas analizadas, son
correspondientes a los distintos sitios de colecta y las características particulares de cada
muestra analizada, representan las distintas condiciones ambientales en donde se
desarrollan los dos quimiotipos de la especie en las tres zonas colectadas.
Desde el punto de vista fitoquímico, se puede lograr una mayor optimización del orégano
que proviene de la región más desértica, pues además de la extracción del aceite esencial
que contiene la hoja, el alto contenido de taninos que se encuentran en estos tallos y que
se queman o se tiran, pudiera ser una fuente de materia prima, si su calidad lo permite,
para la extracción de compuestos fenólicos, que por su tipo de estructura, regeneran
tejidos, propiedad que es utilizada para el curtido de pieles, pero también se pudiera
aprovechar por la actividad antiséptica o antibiótica que podría tener.
26
Cuadro 1. Características cuantitativas de Lippia graveolens en tres sitios de colecta
Característica Mapimí Mezquital Nombre de Dios
Media
(μm)
Media
(μm)
Media
(μm)
NuVa 27.92 14.88 19.12
DiVa 42.45 50.65 37.84
LoVa 222.03 233.08 239.14
NuRa 11.88 13.08 25.96
AnRa 23.71 23.56 18.23
AlRa 285.00 332.85 254.24
Difi 13.85 10.64 10.17
Dilu 4.72 3.59 2.89
GrFi 4.54 3.52 3.65
Loti 555.81 286.79 270.90
NuVa = Número de vasos ; DiVa = Diámetro de vasos; LoVa = Longitud de vasos; NuRa = Número de radios: AnRa = Ancho de radios;
AlRa = Altura de radios; DiFi = Diámetro de fibras; DiLu = Diámetro de lumen de fibra; GrFi = Grosor de la pared de fibra;
LoFi = Longitud de fibra
Cuadro 2. Datos estadísticos de Lippia graveolens en los tres sitios de colecta
Característica Mapimí Mezquital Nombre de Dios
DV ES DV ES DV ES
NuVa 4.21 0.84 1.17 0.23 3.38 0.68
DiVa 7.29 1.46 9.60 1.92 7.65 1.53
LoVa 45.46 9.09 52.06 10.41 57.85 11.57
NuRa 2.32 0.46 2.48 0.50 3.78 0.76
AnRa 8.75 1.75 6.42 1.28 5.84 1.17
AlRa 87.80 17.56 141.07 28.21 87.61 17.52
Difi 3.68 0.74 1.69 0.34 1.83 0.37
Dilu 2.01 0.40 0.73 0.15 0.77 0.15
GrFi 1.12 0.22 0.74 0.15 0.91 0.18
Loti 79.53 15.91 35.35 7.07 39.2 7.84
DV = Desviación estándar; ES = Error estándar
27
A B C
D E F
Figura 1. Estructuras anatómicas del tallo de orégano en el municipio de Mapimí. A) Heterogeneidad de
anillos de crecimiento. B) Radios multiseriados. C) Vasos irregulares y en grupos. D) Traqueida vasicéntrica;
E) Células de floema; F) Material recolectado.
28
A B C
D E F
Figura 2. Estructuras anatómicas del tallo de orégano en el municipio de Nombre de Dios. A) Anillos de
crecimiento. B) Radios multiseriados. C) Vasos y fibras y en grupos. D) Aceite esencial; E) Presencia de
cristales; F) Material recolectado.
29
A B C
D E F
Figura 3. Estructuras anatómicas del tallo de orégano en el municipio de El Mezquital.A) .Anillos de
crecimiento. B) Radios multiseriados. C) Vasos y fibras y en grupos. D) Fibra; E) Ritidoma; F) Material
recolectado.
30
B Bioensayo: efecto fitotóxico de extractos de tallo de orégano en semillas
Los resultados observados demuestran el efecto de cada uno de los extractos sobre los
tres tipos de semilla según se puede observar en las figuras 4, 5 y 6 respectivamente. En
las semillas de lechuga, los extractos más tóxicos fueron los de acetato de etilo y de
hexano, particularmente en las concentraciones de 500 y 1000 ppm. Para el caso de las
semillas de tomate verde, éstas tuvieron un poder de germinación bajo en comparación
con los otros dos tipos de semilla, pues gran parte de las semillas germinadas, solo
desarrollaron una radícula o un hipocótilo normal, como se muestra en el cuadro 3. En su
lugar, únicamente se midió una pequeña estructura que asemeja a un inicio de raíz:
Igualmente, la germinación disminuyó de manera proporcional conforme se aumentaron
las concentraciones de cada uno de los extractos.
Las semillas de tomate rojo fueron tratadas químicamente por el productor antes de su
envasado, por lo cual, los resultados obtenidos no se tomaron como válidos. Sin embargo,
es importante destacar que los extractos probados en estas semillas, no interfirieron de
manera significativa con la capacidad de germinación de la misma, a excepción del
extracto de acetato de etilo, el cual resultó ser el más tóxico.
Las gráficas obtenidas del los promedios de longitud del hipocótilo y radícula, destacan
que las diferencias estadísticas más significativas se encuentran en los testigos negativos
(Figuras 7 y 8). En estas gráficas se observa en general que los extractos utilizados
actúan sobre el hipocótilo aumentando su longitud, principalmente por el precipitado de
acetato de etilo, el cual resultó ser más activo con respecto a los otros extractos. La
radícula en cambio, manifestó un acortamiento de ésta con respecto al control, al ponerse
en contacto con los extractos de prueba y aunque las concentraciones fueron variables, m
con una tendencia a la homogeneidad relativamente constante de su tamaño (Figuras 9,
10, 11).
Así mismo se observó un efecto negativo en las diversas semillas como enroscamiento de
los hipocótilos y ennegrecimiento de los mismos, por la absorción de ciertos compuestos,
contenidos en los extractos.
31
Cuadro 3. Porcentaje de brotación en las semillas utilizadas
Lechuga Tomate verde Tomate rojo
Extractos M PAE AE H M PAE AE H M PAE AE H
Testigo 93.3 93.3 93.3 93.3 70 72.5 72.5 72.5 90 90 90 90
Testigo negativo 70 80 80 25 80 80 80 50 75 75 80 80
50 ppm 90 71.7 83,3 73.3 61.7 53.3 60 56.7 83.3 93.3 90 78.3
100 ppm 86.7 90 80 78.3 48.3 35 55 59 80 81.7 85 91.7
300 ppm 85 86.7 80 85 38.3 41.7 56.7 40 85 86.7 85 85
500 ppm 91.7 85 16.7 70 53.3 55 33.3 38.3 78.3 80 68.3 76.7
1000 ppm 85 61.7 1.67 71.7 50 31.7 43.3 53.3 75 81.7 38.3 78.3
M = Extracto de metanol; PAE = Precipitado de acetato de etilo; AE = Extracto de Acetato de etilo; H = Extracto de hexano.
32
Lechuga
0102030405060708090
100
Testig
o
Testig
one
gativ
o
50pp
m
100
ppm
300
ppm
500
ppm
1000
ppm
Dilución
Po
rcen
taje
M
PAE
AE
H
Figura 4. Ensayos con semilla de lechuga
33
Tomate verde
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Testigo Testigonegativo
50 ppm 100 ppm 300 ppm 500 ppm 1000ppm
Dilución
Po
rcen
taje M
PAE
AE
H
Figura 5. Ensayos con semilla de tomate verde
34
Semilla de tomate rojo
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Testigo Testigo
negativo
50 ppm 100 ppm 300 ppm 500 ppm 1000
ppm
Dilución
Po
rce
nta
je
M
PAE
AE
H
Figura 6. Ensayos con semilla de tomate rojo
35
Cuadro 4. Datos estadísticos del ensayo con lechuga y extracto de metanol
Dilución Hipocótilo Radícula
(ppm) Media DE Media DE
50 13.95000 7.77529 13.10000 6.92992
100 15.48333 7.86214 13.35000 6.60720
T 23.45000 13.03506 31.16667 14.00746
TN 4.85000 5.66870 20.75000 35.27169
300 16.16667 10.32221 10.71667 6.47051
500 22.01667 25.22071 12.16667 6.96521
1000 18.55000 26.67979 9.28333 7.08565
DE = Desviación estándar; EE = error estándar
Cuadro 5. Datos estadísticos del ensayo con lechuga y precipitado de acetato de etilo
Dilución Hipocótilo Radícula
(ppm) Media DE Media DE
50 29.66667 39.91969 8.80000 10.57628
100 22.51667 28.07163 12.31667 8.60329
T 23.43333 12.93054 31.16667 14.00746
TN 13.50000 8.86448 15.90000 10.61231
300 21.63333 30.34042 10.03333 7.86748
500 14.13333 18.79187 12.68333 8.53208
1000 27.76667 42.54344 4.50000 7.17694
DE = Desviación estándar; EE = error estándar
Cuadro 6. Datos estadísticos del ensayo con lechuga y extracto de acetato de etilo
Dilución Hipocótilo Radícula
(ppm) Media DE Media DE
50 18.15000 18.82284 12.96667 8.91574
100 17.00000 21.30887 11.76667 9.60467
T 23.46667 13.14001 31.16667 14.00746
TN 13.50000 8.86448 15.90000 10.61231
300 18.43333 24.18107 10.40000 7.80091
500 14.15000 35.13790 0.50000 3.18098
1000 1.71667 13.29724 0.00000 0.00000
DE = Desviación estándar; EE = error estándar
36
Cuadro 7. Datos estadísticos del ensayo con lechuga y extracto de hexano
Dilución Hipocótilo Radícula
(ppm) Media DE Media DE
50 17.73333 24.30796 10.10000 8.53845
100 19.30000 24.14946 11.23333 9.67500
T 23.45000 13.03506 31.16667 14.00746
TN 26.15000 46.47498 0.00000 0.00000
300 17.46667 21.27740 12.38333 9.12826
500 14.66667 16.12417 12.20000 10.78260
1000 18.95000 24.99859 11.35000 10.43434
DE = Desviación estándar; EE = error estándar
37
Hipocótilo
0
5
10
15
20
25
30
35
T TN 50 ppm 100ppm 300ppm 500ppm 1000ppm
Lo
ng
itu
d(m
m)
MeOH
PAE
AE
H
Figura 7. Efecto de los extractos de ensayo en el hipocótilo de semillas de lechuga
0
5
10
15
20
25
30
35
Longitud (mm)
T TN 50 ppm 100ppm 300ppm 500ppm 1000ppm
Radícula
MeOH
PAE
AE
H
Figura 8. Efecto de los extractos de ensayo en la radícula de semillas de lechuga
38
Figura 9. Efecto fitotóxico sobre la germinación Figura 10. Longitud de radículas de semillas deDe semillas de tomate rojo. Lechuga.
Figura 11. Desarrollo de semillas de tomate rojo.
39
C Ensayos antimicrobianos
Los resultados obtenidos del rendimiento de aceite esencial en la planta, fueron bajos
(1.64-1.14 %), dadas las características de la edad de la muestra, por lo que se considera
relevante la cantidad de aceite extraído bajo esas condiciones. Con respecto a su
caracterización, se identificaron solamente 6 componentes de los 84 detectados por el
cromatógrafo de gases (Cuadro 8).
Cuadro 8. Componentes detectados en el aceite esencial
Compuesto Tr
(min)
Concentración
(%)
Carvacrol 28.8 46.3
P-cimeno 9.5 29.70
Timol 29.2 2.2
Cineol 7.9 1.8
Limoneno 7.7 0.5
Aldehído cinámico 26.9 0.06
Tr = Tiempo de retención
En los resultados obtenidos de los microorganismos de prueba, indican la bacteria más
sensible fue la de S. aureus (Cuadro 8, Figura 12).
Cuadro 9. Componentes efectividad antimicrobiana del aceite esencial de orégano
Concentraciones (ppm)
Halos de inhibición (mm)
10 50 100
Microorganismo de prueba
Escherichia coli 16.6 25.0 31.3
Staphyloccoccus aureus 18.3 22.6 37.0
Salmonella spp. 18.5 40.5 53.0
40
Los resultados en la cuenta total de carga microbiana en la carne molida de cerdo
señalaron que la carne molida sin tratamiento se encuentra dentro de los parámetros que
marca la norma de la Secretaría de Salud (NOM-SSA-1-1993), que permite hasta 5000000
UFC como máximo. Así mismo la cuenta total de mesófilos aérobios contenidos en la
muestra de carne fue irrelevante y el mejor tratamiento fue el que se sometió con 5 mL de
aceite con una disminución de los microorganismos hasta de 42 % y con 10 mL de aceite,
la carga microbiana disminuyó en 48 %. (Figuras 14).
Figura 12. Halos de inhibición de Salmonella sp. Figura 13. Mesofílicos aeróbicos aisladosde carne molida de cerdo.
Figura 14. Ensayos del aceite con carne molida.
41
D Bioensayo de la actividad estrogénica
Los resultados preliminares de la evaluación uterotrófica fueron insuficientes, y no
permiten inferir acerca de la actividad uterotrófica de los extractos, es necesario llevar a
cabo la repetición de los experimentos para poder conocer si estos extractos poseen la
actividad señalada, sin embargo, el análisis preliminar arrojó información importante que
permitirá realizar estudios más completos para evaluar la capacidad estrogénica del
orégano.
Todos los animales tratados con estradiol mostraron efectos uterotróficos importantes con
respecto al grupo control. El peso de los úteros de los ratones tratados con estradiol
aumentó de manera significativa en un 80 %. Los animales a los cuales se les
administraron los extractos de orégano, no mostraron diferencias estadísticamente
significativas, aunque si pudieron observarse cambios en el peso uterino. Este resultado
podría indicar que el efecto sobre el útero no fue significativo con las dosis probadas, por
lo tanto se requiere realizar una evaluación y realizar una curva de dosis-respuesta para
obtener la ED50 y la Emáx de todos los compuestos de prueba utilizados en el experimento,
así como probar en otra especie animal, como son las ratas.
Figura 15. Administración subcutánea de estradiol ycompuestos de prueba.
42
E Bioensayo de actividad genotóxica
Esta prueba arrojó los resultados reportados en los cuadros 10, 11 y12.
En el primer caso se muestra que no existe una variación muy significativa, de los
EMN/10,000 ET, de cada uno de los grupos de trabajo a los diferentes tiempos de
muestreo, a excepción del grupo IV, y obviamente del control positivo (Cuadro 10).
En el caso de la relación EPCMN/1000 EPC de los grupos de trabajo a los diferentes
tiempos de muestreo, se observó una respuesta similar a la anterior (Cuadro 11). Y en los
eritrocitos policromáticos (EPC/1000 ET), solo el grupo II tuvo una respuesta muy
significativa a las 144 h, lo cual no es congruente con los resultados que debían
esperarse, por lo que, es necesario repetir este ensayo con la misma dosis (Cuadro 12).
La información obtenida de este ensayo, indica que el extracto acuoso de la hoja de
orégano, no produce daño al ADN de los animales de prueba con las concentraciones
utilizadas.
Por lo cual, estos resultados amplían los conocimientos sobre las propiedades biológicas
de los extractos de orégano y contribuyen a la estimación del riesgo-beneficio que puede
derivarse del uso de esta planta como un fitoterapeútico.
43
Figura 16. Toma de muestra de sangre de la venacaudal.
Figura 17. Preparación de los frotis.
Figura 18. Célula de eritrocito mononucleado ycélulas policromáticos.
44
Cuadro 10. EMN/10,000 ET de los grupos de trabajo a los diferentes tiempos de muestreo
Tiempos de muestreo
Grupo n 0 h (Basal) 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h 144 h
Grupo I (control negativo) 2 29.3±5.4 28.5±3.7 40.3±10.0 46.0±17.1 68.8±15.5 74.3±29.2 55.0±17.1
Grupo II 2 43.8±10.1 47.5±19.1 43.0±6.6 61.8±13.0 59.3±15.9 57.8±9.3 41.8±10.3
Grupo III 2 44.3±11.2 56.3±18.1 52.5±21.9
NS
80.3±20.1 63.0±10.3 76.3±22.1 54.0±12.2
Grupo IV 2 38.3±10.3 55.3±10.8 60.0±14.5 61.5±5.6 75.8±17.7 104.3±17.8 76.8±30.4
Grupo V (control positivo) 2 39.8±11.9 46.3±2.4 49.3±7.3 92.0±8.1 97.8±18.3 100.0±19.7 94.8±17.1
Los datos están expresados como media ± desviación estándar. Eritrocitos micronucleados; ET: Eritrocitos totales. Todos los grupos recibieronuna dosis diaria del compuesto correspondiente durante 3 días consecutivos. Todas las dosis fueron administradas vía oral. Se empleó aguacomo control negativo y ciclofosfamida como control positivo.
45
Cuadro 11. EPCMN/1000 EPC de los grupos de trabajo a los diferentes tiempos de muestreo
Tiempos de muestreo
Grupo n 0 h (Basal) 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h 144 h
Grupo I (control negativo) 2 5.3±1.0 6.0±5.0 6.5±1.7 7.8±1.9 12.5±5.7 11.5±4.8 8.5±3.8
NS
Grupo II 2 6.3±1.9 6.8±2.8 7.3±2.8 9.0±2.9 9.0±3.4 8.8±5.3 6.3±3.0
Grupo III 2 6.5±3.7 8.5±3.1 11.5±1.3 14.0±2.7 10.3±3.8 16.0±4.2 8.8±2.9
Grupo IV 2 4.0±0.8 7.8±5.5 12.0±8.4 13.5±2.4 17.8±5.7 14.5±6.8 11.0±7.4
NS
Grupo V 2 4.8±1.7 7.5±4.2 10.3±1.5 27.3±5.6 22.8±7.0 20.0±5.2 17.5±2.7
Los datos están expresados como media ± desviación estándar. Eritrocitos micronucleados; ET: Eritrocitos totales. Todos los grupos recibieronuna dosis diaria del compuesto correspondiente durante 3 días consecutivos. Todas las dosis fueron administradas vía oral. Se empleó aguacomo control negativo y ciclofosfamida como control positivo.
46
Cuadro 12. EPC/1000 ET de los grupos de trabajo a los diferentes tiempos de muestreo
Tiempos de muestreo
Grupo n 0 h (Basal) 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h 144 h
Grupo I (control negativo) 2 65.8±19.5 56.6±14.8 73.2±22.3 48.8±19.6 61.0±8.9 78.0±26.3 61.5±12.0
Grupo II 2 56.3±16.1 54.8±18.3 50.3±10.0 53.8±11.2 63.0±9.4 69.3±13.4 747.0±49.2
Grupo III 2 58.5±13.3 47.5±11.1 46.8±9.3 63.5±6.2 71.5±9.8 54.5±7.6 54.5±6.1
Grupo IV 2 60.3±6.0 59.8±6.3 56.8±5.0 58.5±3.8 60.3±5.8 68.8±4.6 63.3±4.5
Grupo V (control positivo) 2 69.3±4.8 65.3±5.8 59.8±4.1 62.0±6.3 65.3±5.2 53.0±3.8 58.0±4.0
Los datos están expresados como media ± desviación estándar. Eritrocitos micronucleados; ET: Eritrocitos totales. Todos los grupos recibieronuna dosis diaria del compuesto correspondiente durante 3 días consecutivos. Todas las dosis fueron administradas vía oral. Se empleó aguacomo control negativo y ciclofosfamida como control positivo.
47
II MM PP AA CC TT OO SS OO CC II AA LL
La información anatómica del xilema secundario del tallo de orégano generada en este
trabajo contribuirá para su posible cultivo de la planta in vitro, para la preservación de la
amisma, así como para la caracterización sistemática de la especie a través se la
comparación de estructuras anatómicas.
Los ensayos realizados en las semillas de lechuga y tomates verde y rojo, señalan que los
extractos orgánicos de tallo de orégano, muestran actividad fitotóxica importante en el
control enfermedades de la planta.
Así mismo, la reducción de microorganismos mesofílicos aeróbios en la carne molida de
cerdo, representa una opción para la adición del aceite esencial como aditivo en alimentos
y confirman su potencial como antimicrobiano en los mismos.
Los resultados de la actividad estrogénica (en útero) no aportaron elementos importantes
que puedan ser concluyentes, por lo que es necesario realizar más ensayos, así como
evaluar otras especies animales, para que el resultado pueda ser más representativo.
En la actividad genotóxica se puede predecir que la hoja de orégano estudiada, a la
concentración administrada, aumentó de manera poco significativa la inducción de las
células micronucleadas, sin daño al ADN.
Dichos resultados amplían los conocimientos sobre las propiedades biológicas del extracto
de la hoja de orégano y contribuyen a la estimación del riesgo-beneficio que puede
derivarse del uso de estas plantas como fitoterapeúticos para uso humano.
Por todo lo anterior, el tallo de orégano se continúa desperdiciando, pero podría ser
susceptible de aprovechamiento por las industrias química, farmacéutica y agropecuaria
para generar un ingreso extra en las comunidades de las zonas áridas y semiáridas del
país, además de la explotación comercial de la hoja.
48
L I T E R A T U R A C I T A D A
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