Inmunoensayo no-isotópicoJesús Manuel Anzano LacarteControl de Procesos en Química Sostenible

2010

Marcadores no-isotópicos

• Reacción antígeno-anticuerpo• Enzimas• Co-enzimas• Precursores quimioluminiscentes• Iones metálicos• Sustratos fluorescentes

Enzimoinmunoensayo, EIA

• Se mide la actividad de una enzima• Homogéneo: EMIT (Enzyme Multiplied Inmunoassay)• Heterogéneo: ELISA Enzyme-Linked

Inmunoabsorbent Assay)

Marcador enzimático

• Gran actividad enzimática• Estables al pH• Método sensible, exacto, económico• Contener grupos activos• Soluble• Fácil de purificar• No ser activo frente a otros grupos componentes de

matriz

EMIT

• Basado en el cambio que se produce en la actividad enzimática del marcador.

• Al producirse esta reacción hay una inhibición enzimática, de forma que el marcador libre es enzimático activo, mientras que el enlazado al anticuerpo pierde su actividad.

• El anticuerpo reduce la afinidad del sustrato por el sitio activo de la enzima:• Efecto estérico• Cambio conformacional de la enzima para modificar su

actividad

• Hay moléculas que actúan en los sitios activos de los enzimas, que al enlazarse con los anti-cuerpos aumentan la actividad de la enzima.

• El marcador y el analito compiten por el anti-cuerpo.• Se ha aplicado a la cuantificación de las proteínas.

Se mezclan cantidades de anticuerpo y marcador

• En ausencia de analito:• Disminuye la actividad enzimática del marcador al

enlazarse al anticuerpo.

• En presencia de analito:• Aumenta la actividad enzimática ya que la cantidad del

marcador unida al anticuerpo disminuye.

• DETECCIÓN:• Fotometría• Fluorometría

ELISA

• El marcador puede ser antígeno o un anticuerpo marcado con una enzima cuya actividad no se modifica al producirse la reacción inmunoquímica.

• Se realiza la separación de la matriz.• Se aplica a pequeñas moléculas y macromoléculas.• Ensayos no-competitivos, tipo sanwich.

• Se incuba la muestra con un exceso de antígeno unido a una fase sólida.

• Se complementa la reacción y lavado de la fase sólida.• Se adiciona el marcador (2º anticuerpo).• Lavado para eliminar el exceso de marcador.• Se mide la actividad de la enzima enlazada que será

proporcional a la cantidad de antígeno.

Determinación inmunométrica de un antígeno mediante columna de afinidad

• Se utilizan anti-cuerpos monoclonales marcados con una enzima.

• Se incuban con la muestra, que contiene el antígeno.• La mezcla se pasa por una columna de afinidad que

contiene antígeno inmovilizado en gran exceso.• En la columna queda retenido el exceso de anticuerpo

marcado mientras se eluye el complejo.• La medida de la actividad enzimática del mismo es

proporcional a la concentración de antígeno de la muestra.

Ventajas-ELISA

• Buena sensibilidad• Alta exactitud• Alta precisión• INCONVENIENTES:• Separar fases• Realizar el lavado• Dificil automatización

Kits-ELISA

• Proteínas de soja• Residuos de antibióticos en leche• Especiación de carnes• Micotoxinas (Alfatoxina B1) en cacahuetes, LOD: 1-

5ppb.• Pesticidas (Metalaxil en frutas, LOD: 0.4 ppm.• Pesticidas (Diflubenzuron) en leche, LOD: 2 ppb.

Fluoroinmunoensayo

• Se basa en el uso de marcadores fluorescentes cuyas características espectrales se relacionan con la extensión de la reacción antígeno-anticuerpo.

• Si las características se modifican al enlazarse al anticuerpo o antígeno: inmunoensayo homogéneo.

• CARACTERÍSTICAS:• Aumenta la absortividad molar• Aumenta el rendimiento cuántico• Longitudes de onda de excitación y emisión distintas de la matriz.• Estable y soluble en agua• No interfiere la reacción inmune

Inmunoensayo por polarización de la fluorescencia, FPI

• Cuando un compuesto fluorescente se excita con la radiación linealmente polarizada producida por un filtro polarizador situado entre la fuente de radiación y la muestra, las moléculas cuyos dipolos de absorción están alineados con el vector eléctrico de la radiación polarizada son las que tienen mayor probabilidad para excitarse

• APLICACIONES: • Farmácos: antibióticos, antiarrítmicos, anticonvulsivos,

antidepresivos• Drogas de abuso: anfetaminas, barbitúricos, LSD• Hormonas: tiroxina, esteroides

Conclusiones

• Existe instrumentación automatizada y «kits» comerciales que permiten obtener resultados de forma simple y rápida.

• No muy establecida en el campo de análisis de alimentos.• Es interesante disponer de marcadores cuya medida no

esté interferida por dicha señal.• Alto coste de reactivos