informe parcial proyecto multidisciplinario en extenso sip2011

PROYECTO MULTIDISCIPLINARIO CIIDIR UNIDAD SINALOA Y UNIDAD MICHOACAN

INFORME PARCIAL Proyecto Multidisciplinario: Formulación de dietas de bajo costo para el cultivo del camarón blanco Litopenaeus vannamei, mediante la sustitución de la harina de pescado. Responsable: Dr. Hervey Rodríguez González (IPN-‐CIIDIR-‐SIN) Instituciones Participantes de la Red:

1. Centro Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo Integral Regional, Unidad Sinaloa (CIIDIR-‐IPN)

2. Centro Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo Integral Regional, Unidad Michoacán (CIIDIR-‐IPN)

Participantes:

1. Dr. Hervey Rodríguez González (CIIDIR-‐SIN) NIVEL SNI I 2. Dr. Antonio Luna González (CIIDIR-‐SIN) NIVEL SNI I 3. Dr. José Luis Montañez Soto (CIIDIR-‐ MICH)

Usuarios

1. Industria de alimentos balanceados (Agroversa, S.A. de C.V., More Pharmaceutical Company S.A de C.V., Productores Integrados de Guasave, S.A. de C.V.)

2. Comercialización de subproductos agrícolas (Agroversa, S.A. de C.V.) 3. Instancias gubernamentales (Gobierno de Puebla y Consejo de Desarrollo de

Sinaloa CODESIN) Tiempo de realización: 2 años


Resumen Actualmente, a nivel mundial, la acuicultura y maricultura proveen de un cuarto del alimento de origen marino; la FAO pronostica que en el año 2030 éstas aporten alrededor del 50% del alimento mundial. La acuacultura en México se ha venido consolidando en los últimos años. La camaronicultura representa en México el 90% del total de su producción acuícola con un volumen cercano a las 130 mil toneladas al cierre de 2009 y con un valor estimado en más de 670 millones de dólares. Sin embargo, su desarrollo se ha limitado principalmente por los costos de alimentación que son muy elevados (>60%), por lo tanto, es urgente una reducción de los costos de producción, siendo una opción el uso de dietas de bajo costo, mediante la sustitución de la harina de pescado (como principal fuente de proteína). Para esto, el presente proyecto plantea la realización de evaluaciones de fuentes de proteína alternas de bajo costo, como lo son harina de planta acuática (Lemna minor) fermentada por bacterias ácido lácticas, harina de macroalgas, pasta de higuerilla (Jatropha curcas) y subproductos agrícolas (sangre de bovinos, el suero de leche y la pasta de maíz y de girasol). Los ingredientes antes mencionados son subproductos de la industria de producción de biocumbustibles (Jatropha curcas) o de alimentación (sangre de bovinos, el suero de leche y la pasta de maíz y de girasol). Así mismo, se prueba dos ingredientes que actualmente no se explotan (macroalgas y plantas acuáticas), pero tienen gran potencial (abundancia y contenido nutricional) para su comercialización. El análisis se realiza mediante la determinación de la composición química, digestibilidad, porcentajes de sustitución, sistema inmune y metabólico y variables de producción (sobrevivencia, crecimiento y factor de conversión alimenticia) del camarón blanco. Los ingredientes se probarán en bioensayos de laboratorio y se realizarán pruebas en campo (granjas camaroneras) para poder definir el efectos de los mismos. El proyecto se realiza en conjunto con empresas del ramo de la industria alimentaria y de granjas acuícolas. La información obtenida de la investigación propuesta contribuirá a la optimización de las técnicas de producción con una base científica que permita, por un lado, la formulación de una dieta de costo mínimo para la producción de juveniles en condiciones nutricias ideales.


Antecedentes La camaronicultura ha mostrado un constante incremento durante las últimas décadas, proporcionando en la actualidad la mitad del suministro mundial (Goarant et al., 2006). De igual manera, México ha experimentado esta tendencia, durante el periodo 1998-‐2008, el aporte en peso vivo de camarón por acuacultura se incremento aproximadamente 548%. Esta tendencia continúa hoy en día, para el año 2008, el camarón de cultivo representó el 66.33 % de la producción total en peso vivo; del cual, el estado de Sinaloa aportó el 28.73 % ubicándose como el segundo productor nacional (CONAPESCA, 2008). El continuo crecimiento e intensificación de la producción de la acuacultura a nivel mundial, demandan el desarrollo de fuentes de proteína sustentables para el reemplazo de la harina de pescado en el alimento para organismos acuáticos. La nutrición y alimentación son dos de los principales aspectos en la actividad camaronícola. Además, el alimento suplementario llega a representar hasta un 50% de los costos operativos (Martínez et al., 2002). En la actualidad, existe una tendencia entre los camaronicultores, a proporcionar alimentos con altos niveles proteicos, considerando que esto acelera el crecimiento de los organismos en cultivo. De esta manera se ha sugerido la utilización de alimentos con alto contenido de proteína y bajo de carbohidratos, con el fin de obtener una mayor digestibilidad (Chamberlain, 1995). Dentro de los trabajos de investigación sobre las necesidades nutritivas de los organismos acuáticos, se destacan los referentes a la inclusión de la proteína en el alimento, debido esencialmente a que este componente juega un papel fundamental en el crecimiento, representa un porcentaje elevado dentro de la formulación y es el ingrediente más costoso (Tacon y Akiyama, 1997). Tradicionalmente las fuentes de proteína marinas han sido usadas como el principal ingrediente en alimentos acuáticos, debido a su excelente contenido de aminoácidos esenciales, ácidos grasos, vitaminas y minerales, además de mejorar la palatabilidad (Tacon y Akiyama, 1997; Davis y Arnold, 2000). Sin embargo, hoy en día la mayoría de los investigadores proponen que se debe utilizar un ingrediente alternativo a la harina de pescado, debido al suministro limitado y altos costos de ésta. Actualmente, se han venido realizando una serie de estudios enfocados en la sustitución de esta proteína con ingredientes de menor costo. Uno de los principales enfoques de la investigación está dedicado a la sustitución de la harina de pescado con fuentes de proteína vegetales como la harina de soya (Oliva-‐Teles et al., 1994; Refstie et al., 1998) y varias leguminosas (Gouveia y Davies, 1998; Hossain et al., 2001). Existen diferentes fuentes, entre ellas la lenteja de agua dulce (Lemna minor), como fuente de proteína natural, posee un mejor perfil de aminoácidos esenciales que la mayoría de las fuentes de proteína vegetal y a su vez este es más parecido a las fuentes de proteína animal. Las plantas de Lemna recién cosechadas contienen hasta un 43% de proteína en peso seco, adicionalmente las hojas de lenteja de agua contienen poco contenido de fibra (5% en materia seca de las plantas cultivadas) con respecto a otras plantas y poco o ningún material no digerible, incluso para los animales monogástricos (Chaturvedi et al., 2003). Lemna minor crece fácilmente en


aguas ricas en nutrientes, tiene una alta concentración de minerales traza, potasio, fósforo y pigmentos, principalmente caroteno y xantofilas, por lo cual se ha considerado la harina de Lemna minor como un efectivo suplemento dietético para peces (Leng et al., 1995). En la mayoría de los estudios se ha utilizado la harina de lenteja de agua como fuente de proteína en lugar de la harina de pescado en dietas para peces como carpas y tilapias (Wee, 1991). Adicionalmente, existen estudios sobre fermentación de fuentes de proteína con baja digestibilidad, en los cuales se utilizan microorganismos que degradan sustratos inusuales como plumas de aves, además de hidrolizar los compuestos de éstas para mejorar la digestibilidad (Bertsch et al., 2003). Así mismo existe la perspectiva de incluir harinas hechas a partir de macroalgas, las cuales presentan una opción viable en la sustitución de la harina de pescado que normalmente se utiliza como fuente principal de proteínas en la elaboración de los alimentos balanceados. Algunos trabajos recientes han demostrado que la inclusión de harina de Macrocystis pyrifera (alga parda) en un 10% en el alimento balanceado para camarón incrementa la ganancia en peso (Rivera et al., 2002). Adicionalmente, los mismos autores mencionan que la harina de dicha alga favorece las propiedades de digestibilidad del alimento y funciona como un antibiótico con efecto vibriostático, lo cual favorece el cultivo en la etapa de engorda del camarón blanco.

Por otra parte, México es un país que alberga una amplia diversidad de plantas terrestres. El piñón o piñoncillo (Jatropha curcas L.) es una planta originaria de México y Centroamérica, es miembro de la familia de las Euphorbiaceae que se localiza en climas tropicales y semitropicales, es un arbusto resistente a la sequía que se cultiva en América central y del sur, el sudeste asiático, india y África. La planta puede ser fácilmente propagada por estacas, es ampliamente plantada como cobertura para proteger campos que ya no son cultivados ó aprovechados por el ganado u otros animales. Las semillas son una buena fuente de aceite y han adquirido importancia debido a sus fines energéticos (biocombustibles), las cuales una vez prensadas para obtener aceite brindan una pasta proteica (50 – 62%) que se obtiene como subproducto (Martínez et al., 2006). La presente propuesta de investigación pretende evaluar el efecto de la sustitución de harina de pescado por harina fermentada de Lemna minor, macroalgas, pasta de Jatropha curcas y subproductos agrícolas en dietas para Litopenaeus vannamei, en el crecimiento, supervivencia y sistema inmune. Justificación El cultivo de camarón constituye una de las actividades de la acuacultura que ha tenido más rápido crecimiento a nivel mundial en los últimos años, constituyéndose en un gran promotor de divisas y empleo. México también ha experimentado este crecimiento, siendo los estados de Sonora y Sinaloa los principales productores a nivel nacional. Sin embargo, los costos del alimento suplementario son considerablemente elevados, llegando a representar hasta un 50% de los costos operativos. Por lo tanto, es necesaria la reducción de los costos de producción, siendo una de las opciones la


utilización de dietas de bajo costo. Adicionalmente, la proteína es el ingrediente de mayor costo en las dietas, por lo que la sustitución de harina de pescado por ingredientes de menor costo, es una de las tendencias actuales en la acuacultura. La harina de Lemna minor, Jatropha curcas, macroalgas y algunos subproductos agricolas presenta características deseables para ser usada como sustituto de la harina de pescado, entre ellos un alto contenido de proteína en peso seco. Además, recientemente se han realizado estudios sobre la utilización de bacterias para fermentar harinas con baja digestibilidad, mejorando de esta manera la disponibilidad de sus componentes. Así, la utilización de bacterias ácido lácticas para fermentar la harina de Lemna minor, representa una opción para aumentar su digestibilidad y utilizarla en dietas para Litopenaeus vannamei, con el fin de disminuir el costo de las dietas al reducir la inclusión de harina de pescado. En el sector agrícola de Sinaloa se están produciendo cultivos de Jatropha curcas con fines energéticos, con el propósito de general biodiesel como combustible alternativo para motores diesel (Makkar, 2010). Sinaloa cuenta con una superficie óptima para el cultivo de Jatropha curcas de 557, 641 ha. El Centro de Validación de Tecnología de Sinaloa A.C. (CVTTS) y Fundación Produce Sinaloa A.C. a mediados del 2007 establecieron el primer lote demostrativo ubicado en el municipio de Sinaloa de Leyva para validar la capacidad productiva de cuatro tipos de Jatropha (Félix , 2007). Sin embargo, actualmente no se tiene una utilidad el desecho que se generaría durante la producción de biocombustibles. Esto mismo se presenta en algunos subproductos agrícolas y en la mayoría de las macroalgas, las cuales no se explotan comercialmente. Por lo anterior, el proyecto busca definir el potencial de sustitución de ingredientes que reduzcan el costo y mantengan o beneficien los valores de producción. Hipótesis La utilización de ingredientes vegetales (Lemna minor, macroalgas, pasta de Jatropha curcas) y subproductos agrícolas como sustitutos de harina de pescado en dietas para Litopenaeus vannamei, permitirá formular alimentos de bajo costo con contenido nutricional adecuado para el crecimiento, supervivencia y mejora del sistema inmune de los camarones. Objetivo general Determinar el efecto de la sustitución en dietas para camarón, de harina de pescado por harina de Lemna minor fermentada por bacterias ácido lácticas, harina de macroalgas, pasta de Jatropha curcas y subproductos agrícolas (sangre de bovinos, el suero de leche y la pasta de maíz y de girasol) en el crecimiento, supervivencia y sistema inmune de Litopenaeus vannamei.

Objetivos específicos 1. Aislar, caracterizar e identificar bacterias acido lácticas del intestino y glándula

digestiva de camarón blanco (Litopenaeus vannamei) silvestre.

2. Comparar la composición química de la harina fermentada y no fermentada de Lemna minor.


3. Evaluar diferentes porcentajes de sustitución de harina de pescado por harina de L. minor fermentada en dietas para L. vannamei.

4. Determinar el efecto en el sistema inmune y variables metabólicas, de la inclusión de harina fermentada de Lemna minor en la dieta de L vannamei.

5. Determinar la cantidad máxima de harina de macroalga a ser utilizada en una dieta isoproteica al 30% sin que se reduzca significativamente la tasa de crecimiento del camarón o exista rechazo por parte del animal a consumir la dieta con harina de alga.

6. Determinar si existen diferencias en el crecimiento y supervivencia del camarón blanco alimentado con una dieta tradicional isoproteica al 30% en base a harina de pescado y una dieta isoproteica al 30% en la que se reduzca un porcentaje de harina de pescado (5, 10 o 15%) y se incluya un porcentaje de harina de macroalgas rojas y/o verdes del Golfo de California.

7. Evaluar la composición proximal y el perfil de aminoácidos esenciales de las dietas isoproteicas formuladas con distintos porcentajes de harina de pescado y de un alimento comercial utilizados en la alimentación de los camarones.

8. Obtener pasta de Jatropha curcas (libre de cáscara) variedad no tóxica y determinarle la composición química nutrimental y el perfil de aminoácidos.

9. Elaborar ensilado a partir de pasta de Jatropha curcas y evaluar sus características fisicoquímicas y nutrimentales.

10. Determinar la digestibilidad in vitro de las dietas elaboradas antes del ensayo biológico.

11. Determinar el potencial de la sangre de bovinos, el suero de leche y la pasta de maíz y de girasol, como fuente de proteínas en la formulación de dietas para la alimentación del camarón blanco (Litopenaeus vannamei).

12. Formular dietas con una sustitución de 0, 25, 50, 75 y 100% de proteína de origen vegetal, manteniendo el requerimiento óptimo de aminoácidos para camarón.

13. Evaluar el efecto de la sustitución de fuentes vegetales en el crecimiento, factor de conversión alimenticia y sobrevivencia

14. Evaluación en campo de la dieta con mejor respuesta a variables productivas


Modulo 1. Dr. Hervey Rodríguez González (USO DE PASTA DE JATROPHA CURCAS Y PRUEBAS EN CAMPO DE INGREDIENTES)

Descripción de actividades Mes de inicio Mes de terminación

Encargado de la actividad

Obtener pasta de Jatropha curcas (libre de cáscara) variedad no tóxica y determinarle la composición química nutrimental y el perfil de aminoácidos.

Enero 2011 Abril 2011

Dra. Laura Gabriela Espinosa Alonso

Elaborar una dieta con pasta de Jatropha curcas. Mayo 2011 Agosto 2011 Dr. Hervey Rodríguez

Evaluación de la dieta para el uso en alimento balanceado para la acuacultura en laboratorio. Septiembre 2011 Diciembre 2011 Dr. Hervey Rodríguez Determinar el porcentaje de inclusión de la Jatropha curcas en dietas para camarón. Enero 2012 Agosto 2012 Dr. Hervey

Rodríguez Evaluación de campo (granja) de los ingredientes potenciales para sustituir la harina de pescado en dietas de camarón.

Marzo 2012 Agosto 2012 Ing. Arturo Polanco

Análisis de resultados. Cálculo de la tasa de conversión alimenticia para cada dieta. Análisis estadísticos para determinar diferencias entre tratamientos.

Septiembre 2012 Octubre 2012

Dr. Hervey Rodríguez

Elaboración de informe final. Revisión del escrito de tesis. Elaboración de borrador de artículo científico.

Noviembre 2012 Diciembre 2012 Dr. Hervey Rodríguez

Modulo 2. Dr. Hervey Rodríguez González (USO DE MACROALGAS)



Colecta de macroalgas. Secado y preparación de la harina de macroalgas. Molienda de otros insumos. Puesta en marcha del sistema de cultivo.

Enero 2011 Marzo 2011

Dr. Orduña Ing. Arturo Polanco

Formulación de dietas isoproteicas al 30%. Elaboración y secado de los pellets que se utilizarán para la alimentación de los organismos. Análisis químico (NO3, NO2, NH4, PO4) de la calidad del agua del sistema de cultivo

Marzo 2011 Abril 2011

Bio. Elysara López

Tesista de Mestría

Obtención de organismos experimentales; puesta en marcha del ensayo de crecimiento. Toma de muestras de agua para análisis de la calidad de agua del sistema. Realización de biometrías de los camarones en el sistema de cultivo y ajuste de la tasa de alimentación.

Abril 2011 Agosto 2011

M.C. Luis Daniel García Tesista de Maestría


Análisis de resultados de calidad de agua, crecimiento, sobrevivencia. Calculo de la tasa de conversión alimenticia para cada dieta. Análisis estadísticos para determinar diferencias entre tratamientos. Envío de muestras de alimento para su análisis proximal y de ser posible de aminoácidos.

Agosto 2011 Noviembre 2011

Dr. Orduña Dr. Antonio

Luna

Elaboración de informe final. Revisión del escrito de tesis. Elaboración de borrador de artículo científico

Noviembre 2011 Diciembre 2011 Dr. Antonio

Luna Dr. Orduña

Fabricación de jaulas (varilla y malla mosquitera plástica) para cultivo de camarón en estanques rústicos. Instalación de unidades en granja


M.C. Luis Daniel García Ing. Arturo Polanco

Colecta de macroalgas. Secado y preparación de la harina de macroalgas. Molienda de otros insumos. Elaboración de pellets en base a la formulación de la mejor dieta del ensayo anterior.

Febrero 2012 Marzo 2012

Dr. Orduña Ing. Arturo Polanco

M.C. García

Evaluación de campo (granja) de la mejor dieta del ensayo anterior. Marzo 2012 Agosto 2012

Ing. Arturo Polanco

Estudiante de Maestría

Análisis químico (NO3, NO2, NH4, PO4) de la calidad del agua del estanque de cultivo Marzo 2012 Agosto 2012 Bio. Elysara

López Envío de articulo científico a una revista indexada Abril 2012 Mayo 2012 Dr. Orduña

Dr. Luna Análisis de resultados de calidad de agua, crecimiento, sobrevivencia. Calculo de la tasa de conversión alimenticia para cada dieta. Análisis estadísticos para determinar diferencias entre tratamientos.


Dr. Orduña Dr. Antonio

Luna

Elaboración de informe final. Revisión del escrito y defensa de tesis. Elaboración de borrador de artículo científico.

Noviembre 2012 Diciembre 2012 Dr. Antonio

Luna Dr. Orduña

Modulo 3. Dr. Antonio Luna González (USO DE FERMENTADOS)

Descripción de actividades Mes de inicio

Mes de terminación


Aislamiento de bacterias ácido lácticas (BAL) Aislar BAL del intestino y hepatopáncreas de camarón blanco (Litopenaeus vannamei) y azul (P. stylirostris).


M. en C. Ma. del Carmen Flores (doctorante)

Caracterización de las BAL Marzo 2011 Abril 2011 Ma. del Carmen


Actividad hemolítica, cinética de crecimiento, conteo de UFC, prueba de hidrofobicidad, actividad enzimática extracelular, tinción de Gram.

Flores, M. en C. Jesús A. Fierro, Biol. Ely Sara

López

Identificación molecular de BAL. Mayo 2011 Julio 2011

Ma. del Carmen Flores, M. en C. Jesús A. Fierro, Dr. Antonio Luna

Fermentación de harina de L. minor Cultivo de la planta y fermentación de harina utilizando BAL y suero de leche de vaca.

Agosto 2011 Septiembre 2011

M. en C. Ma. del Carmen Flores, Dr. Antonio Luna

Análisis proximal de la harina Se hará un análisis del contenido de humedad, proteína, carbohidratos, lípidos, fibra, cenizas y perfil de aminoácidos.

Octubre 2011

Noviembre 2011

Lab. de análisis del CIBNOR,

M. en C. Ma. del Carmen Flores, Luis D. García

Elaboración del alimento Formulación del alimento. Elaboración del alimento peletizado. Análisis proximal.

Noviembre 2011

Diciembre 2011

Lab. del CIBNOR, M. en C. Ma. del Carmen Flores, Dr. Antonio Luna

Análisis de resultados. Elaboración de tesis de doctorado. Elaboración de borrador de artículo científico.

Enero 2012 Febrero 2012 M. en C. Ma. del Carmen Flores, Dr. Antonio Luna

Experimento 1 Efecto del alimento con lenteja en el crecimiento y supervivencia del camarón blanco. Análisis de resultados. Tesis de doctorado. Congreso internacional I. Envío del primer artículo internacional indizado.

Marzo 2012 Julio 2012

M. en C. Ma. del Carmen Flores, Ely Sara López, Luis D. García, Jesús A. Fierro, Dr. Antonio Luna

Experimento 2 Efecto del alimento con lenteja en el sistema inmune y variables metabólicas del camarón blanco. Análisis de resultados. Tesis de doctorado. Congresos internacional II. Elaboración y envío de un segundo artículo internacional indizado.


M. en C. Ma. del Carmen Flores, Ely Sara López, Luis D. García, Jesús A. Fierro Dr. Antonio Luna

Inclusión de resultados en el escrito de la tesis doctoral. Elaboración de informe final.

Noviembre 2012

Diciembre 2012

M. en C. Ma. del Carmen Flores, Dr. Antonio Luna

Modulo 4. Dr. José Luis Montañez (USO DE SUBPRODUCTOS AGRÍCOLAS)


Encargado de la

actividad Revisión bibliográfica Enero 2011 Febrero 2011


Investigar los requerimientos nutricionales del camarón ó especies afines.

Dr. J.L. Montañez

Análisis químico porcentual Realizar el análisis químico porcentual de las materias primas propuestas para la formulación de alimento para camarón

Febrero 2011 Mayo 2011

Dr. J.L.

Montañez

Perfil de ácidos grasos Determinar el perfil de ácidos grasos que conforman el extracto oleoso de las diferentes materias primas seleccionadas.

Junio 2011 Agosto 2011

Dr. J.L.

Montañez

Composición mineral Determinar la composición mineral de las diferentes materias primas seleccionadas.

Septiembre 2011 Diciembre 2011

Dr. J. L. Montañez

Formulación de una dieta con subproductos agrícolas. Enero 2012 Agosto 2012

Dr. J.L. Montañez/ Dr. Hervey Rodríguez

Evaluación de la dieta para el uso en alimento balanceado para la acuacultura en laboratorio. Marzo 2012 Agosto 2012


Análisis de resultados. Cálculo de la tasa de conversión alimenticia para cada dieta. Análisis estadísticos para determinar diferencias entre tratamientos.

Septiembre 2012 Octubre 2012


Elaboración de informe final. Revisión del escrito de tesis. Elaboración de borrador de artículo científico.

Noviembre 2012 Diciembre 2012


Metodología científica MODULO 1. Dr. Hervey Rodríguez González (USO DE PASTA DE JATROPHA CURCAS Y PRUEBAS EN CAMPO DE INGREDIENTES) 1. Obtención de la pasta de Jatropha curcas no tóxica (sin cáscara) Semilla de Jatropha curcas será descascarillada de manera manual. En un sistema de prensado en frío se procesará la semilla sin cáscara de Jatropha curcas para extraer el aceite y posteriormente la pasta será procesada en un molino de martillos. 2. Caracterización de la materia prima (análisis bromatológico, fisicoquímico y perfil de aminoácidos). 2.1. Determinación de humedad.


Se basa en la determinación de la pérdida de peso debida a la evaporación del agua en el punto de ebullición o a temperaturas cercanas a él. La proporción de agua pérdida aumenta al elevar la temperatura; por lo tanto es importante comparar sólo los resultados obtenidos usando las mismas condiciones de secado, sobre todo, si por el tipo de muestra es factible que ocurra alguna descomposición. A su vez la pérdida de peso depende de diversos factores como son: el tamaño de la partícula, el peso de la muestra y las variaciones de temperatura entre una y otra charola en el horno. Para secar la materia prima homogeneizada, se llevará a cabo un secado grueso en una estufa de corriente forzada esto debido al gran contenido de humedad, y posteriormente se realizará el secado en estufa de vacío. 2.2. Determinación de cenizas totales. Las cenizas de los productos alimentarios están constituidas por el residuo inorgánico que queda después de que la materia orgánica se ha incinerado a 500 ºC. Las cenizas, normalmente, no son las mismas sustancias inorgánicas presentes en el alimento original, debido a las pérdidas por volatilización o a las interacciones químicas entre los constituyentes. 2.3. Determinación de proteína cruda. Se utiliza el método de Kjeldahl, que determina el nitrógeno total contenido en una matriz alimenticia. Este método se basa en la combustión en húmedo de la muestra por calentamiento con ácido sulfúrico concentrado en presencia de catalizadores metálicos y de otro tipo, para reducir el nitrógeno orgánico de la muestra hasta nitrógeno inorgánico en forma de amoníaco, el cual queda en solución en forma de sulfato ácido de amonio. El producto de la digestión, una vez alcalinizado, se destila directamente o por arrastre con vapor para desprender el amoníaco, el cual es atrapado en una solución de ácido bórico y es posteriormente titulado con ácido clorhídrico. 2.4. Determinación de grasa. El contenido de lípidos libres, que básicamente consiste en grasas neutras (triglicéridos) y ácidos grasos libres, se determina sin mayor problema en los alimentos por extracción del material seco y molido con una fracción ligera de petróleo o con éter etílico en un aparato de extracción continua. Para la determinación de la grasa cruda se utilizará el método de Goldfish, en el cual el material seco y molido se coloca en un aparato de extracción continua en el que las gotas condensadas del disolvente caen sobre la muestra contenida en un recipiente poroso o dedal, alrededor del cual pasan los vapores calientes del disolvente. Así el disolvente esta en contacto continuo con la muestra lográndose la extracción total de la grasa. Al eliminar el disolvente, el extracto etéreo se determina gravimétricamente. 2.5. Determinación de carbohidratos totales. Se determinaron por diferencia restando al 100% la suma de los porcentajes de humedad, cenizas totales, grasa y proteína crudas, mediante la fórmula siguiente: %Carbohidratos = 100% -‐(%humedad+%proteína+% grasa+%ceniza).


3. Ensayo de preparación de ensilado Se realizará un ensayo piloto a fin de conocer si las condiciones a usar (temperatura, pH, agitación y la homogenización del pescado) son adecuadas para la obtención de los ensilados y con base en ello poder elaborar los demás ensilados de estudio. 3.1 Elaboración del ensilado Para elaborar el ensilado se emplearán 50 g de desechos de pescado homogeneizados, midiéndose el pH inicial. Se adicionará lentamente ácido fórmico concentrado (88% de pureza) hasta llegar a un pH entre 3,8 y 4. El ensilado será preparado en un frasco de vidrio color ámbar de 500 ml de capacidad y se incubará a 37±1 °C por 14 días, con agitación frecuente. En los días 1, 2, 5, 6, 7, 8, 9, 12 y 14 se monitoreo el pH y en caso de ser necesario se agregó más ácido fórmico concentrado para mantenerlo al pH deseado. 3.2 Elaboración de ensilado de pescado enriquecido con pasta de Jatropha curcas. En esta etapa se realizará un ensilado bajo la metodología anterior, enriqueciéndolo con la adición de pasta de Jatropha curcas previamente obtenida mediante el proceso de prensado en frío. 3.3 Monitoreo de parámetros durante el proceso de ensilado sin Jatropha curcas y el proceso de ensilado con Jatropha curcas. Se determinará el pH del ensilado mediante el uso de potenciómetro durante un periodo de 14 días. Además se medirá el nitrógeno total (NT) usando el método de Kjeldahl y el nitrógeno no proteínico (NNP) mediante precipitación con ácido tricloroácetico al 20% seguido por digestión y destilación de acuerdo al método de Kjeldahl. Estas mediciones se realizaran a las 48, 120, 168 y 216 horas de elaborado, con el fin de conocer el grado de hidrólisis proteínica durante el proceso de ensilado.

3.4 Obtención del ensilado para su evaluación nutrimental En esta etapa se evaluará la calidad nutrimental del producto obtenido y se comparará con los desechos de pescado sin procesar con el objetivo de conocer si durante el proceso de ensilado hay alguna afectación de las características nutricias del pescado. Se examinará al igual el ensilado adicionado con pasta de Jatropha curcas durante el ensilado para determinar si hay una mejora de la calidad nutrimental. 4. Elaboración del ensilado Los desechos de pescado se obtendrán de la congeladora Guasave 400, serán trasladados al Centro Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo Integral Regional (CIIDIR) Unidad Sinaloa en contenedores de 200 litros serán descongelados y homogeneizados, se utilizarán 2017 g de desechos de pescado homogeneizado, al cual se le añadirán 200 ml de agua desionizada para facilitar su agitación y ayudar a una mejor distribución del antioxidante y los ácidos utilizados. En el caso del ensilado con Jatropha curcas, la pasta será añadida antes de incorporar los ácidos y el antioxidante. Se utilizará como antioxidante butilhidroxitolueno (BHT) al 0.02% con respecto al contenido lipídico del pescado y ácido fórmico diluido (1:4) para mantener


el pH entre 3.8-‐4, la proporción total de ácido diluido añadido será de alrededor de 11.68% v/p. La incubación de los ensilados se realizará a temperatura ambiente (23+3°C en el día) los primeros 3 días del proceso y posteriormente se incubarán 5 días más a 37°C, se incluirá agitación manual frecuente durante todo el período de incubación. 5. Secado del ensilado Los ensilados se someterán a secado empleando una estufa con corriente de aire a una temperatura de entre 65 y 70 °C por aproximadamente 8 horas. Una vez seco el producto se molerá en un molino hasta obtener una harina homogénea con un tamaño de partícula de 0.5 mm. 6. Diseño experimental del bioensayo El bioensayo se realizará en el Laboratorio de Acuacultura del Centro Interdisciplinario para el Desarrollo Integral Regional (CIIDIR-‐SINALOA), el cual cuenta con un sistema de 21 tanques de plástico de un volumen de 1,000 litros, con fondo color negro y 1.5 m2 de área. El agua utilizada se tomará de la red municipal de agua potable. Durante las 120 Semanas de periodo experimental, se realizará monitoreo de las variedades fisicoquímicas del agua (oxígeno disuelto, temperatura, amonio, nitritos y nitratos). Los recambios de agua (30% del volumen total) se llevarán a cabo semanalmente. Cada unidad experimental será equipada con un suministro de aireación constante. Después del periodo de aclimatación los juveniles serán sembrados con un peso promedio de 1 g Las densidades de siembra serán de 15 organismos por m2. Posteriormente a ser sembrados los organismos serán aclimatados a los parámetros fisicoquímicos del agua y densidades de siembra durante un periodo de una semana antes de dar inicio con el bioensayo. La alimentación de los camarones será basada en pellet comercial con una composición de 32% de proteína como alimento control y dietas a partir de: ensilado de pescado, ensilado de pescado y Jatropha curcas y ensilado de pescado enriquecido con Jatropha curcas. Estos alimentos serán suministrados en dos raciones por día, a las 9 hrs y a las 17 hrs. La cantidad de alimento suministrado será del 2 al 3 por ciento de peso seco. Se realizarán biometrías, al inicio cada quince días y al final del experimento se realizarán biometrías donde será registrado el peso de los organismos. Diariamente se medirá oxígeno, temperatura y pH. 7. Porcentaje de inclusión de las fuentes de proteína. Se realizarán experimentos de crecimiento por sextuplicado en las unidades de 60 l para dietas con diferentes fuentes de proteínas (0, 25, 50, 75, 100%). Se seleccionarán juveniles de 3 (+ 0.5) g, y reproductores de 100 (+ 15) g, los cuales serán colocados a una densidad de 25/m2 en los tanques de 60 l. Diariamente se registrarán los parámetros de calidad de agua (O2, pH, y temperatura), así como el número de muertos. El alimento residual se retirará junto con las heces y organismos muertos. El primer día de la evaluación se suministrarán los alimentos experimentales a razón de 5% de la biomasa de juveniles. A partir del segundo día se corregirá la cantidad de alimento tomando como base la estimación aparente del alimento residual. Se ofrecerá una cantidad similar de alimento en cada tratamiento utilizando


alimentadores automáticos de compartimiento, a fin de proporcionar alimento cada 2 horas. La duración de la evaluación será de 70 días. Para evaluar las diferentes dietas se usaran como criterios la sobrevivencia y la biomasa final por unidad de área, mediante la cosecha del total de los organismos en las unidades experimentales. Así mismo, se definirán diferencias entre tratamientos utilizando el paquete Statistica, versión 5.0, mediante el cálculo de los siguientes parámetros de producción (Naranjo et al., 2004): Peso final promedio, tasa de crecimiento absoluta (TCA), tasa de crecimiento específica (TCE), factor de conversión aparente alimenticia (FCA), sobrevivencia (S), y biomasa total. MODULO 2. Dr. Hervey Rodríguez González (USO DE MACROALGAS) 1. Colecta y procesado de las macroalgas Para la elaboración de las dietas experimentales primeramente se colectaron en la Bahía de Navachiste algas de las especies Ulva lactuca y Gracilaria parvispora. La colecta de las algas se realizó mediante buceo libre directamente de las poblaciones naturales que se presentan en las islas de la bahía. Las algas colectadas se transportaron en hieleras de plástico con agua de mar del sitio de colecta a las instalaciones del CIIDIR-‐IPN, Sinaloa. Una vez en el laboratorio las algas se enjuagaron con agua de mar para retirar restos de sedimento. Posteriormente se retiraron a mano las epifitas y epizoos visibles y se enjuagaron con agua dulce para reducir la cantidad de sales al momento de secarlas. Las algas se colocaron en charolas plásticas al aire libre y a la sombra. Para ayudar a su secado se colocaron ventiladores caseros de pedestal. Ya secas, las algas se trituraron en una licuadora casera y posteriormente se pulverizaron utilizando un molino Thomas Willey y una malla # 40 de 420 µm de luz de malla. La harina de alga obtenida se guardó en un recipiente de plástico hermético hasta el momento de su inclusión en la elaboración de las dietas. 2. Preparación de las dietas 2.1. Determinación de los porcentajes de aceptación (palatabilidad) de la harina de macroalgas. A fin de responder al planteamiento del primer objetivo específico relacionado con la cantidad de macroalga que pudiera ser adicionada a la dieta de los camarones, se diseñaron 7 dietas distintas, todas isocalóricas e isoproteicas (Tabla 1). En estas dietas para mantener un rango estable de proteína de 31±1 % de proteína se ajustó en la formulación la cantidad de harina de pescado. Tabla 1.-‐ Dietas formuladas en base a la composición proximal de los ingredientes y los requerimientos proteicos y lipídicos del camarón blanco (Litopenaeus vannamei), cantidades en gramos.

CONTROL

0% D1 5%

D2 10 %

D3 20 %

D1 5%

D2 10 %

D2 10 %

HARINA DE PESCADO 250 255 265 270 255 265 270

H. DE ALGA VERDE 0 50 100 200 0 0 0


H. DE ALGA ROJA 0 0 0 0 50 100 200

H. DE TRIGO 506 459.9 399.9 292.9 459.7 399.9 293.9

PASTA DE SOYA 160 150 150 150 150 150 150

GRENETINA 40 40 40 40 40 40 40

ACEITE DE PESCADO 21.5 22 22 23 22.1 22 22

LECITINA DE SOYA 21.5 22 22 23 22.1 22 22

PREMEZCLA DE VITAMINAS 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1

PREMEZCLA DE MINERALES 1.1 1.1 1.1 1.1 1.1 1.1

1.1

1000 1000 1000 1000 1000 1000

% PROTEINA EN LA DIETA 35.5 35.8 35.7 35.3 35.5 35.2

35.8 2.2 Efecto de la disminución en la cantidad de harina de pescado y la inclusión de distintos porcentajes de harina de macroalga en la dieta. Para dar respuesta a este objetivo, se formularon siete dietas experimentales (Tabla 2). Una dieta control (sin inclusión de algas), tres con inclusión de harina de Ulva lactuca al 10, 15, y 20% (dietas D1 A.V. 10%, D2 A.V. 15% y D3 A.V. 20 %) y tres con inclusión de harina de Gracilaria parvispora al 10, 15 y 20 % (dietas D1 A.R. 10%, D2 A.R 15% y D3 A.R. 20 %). En estas dietas se reemplazó parcialmente la harina de pescado en un 5, 10 y 15% y se aumentó gradualmente la harina de trigo hasta completar el 100%, procurando que las dietas fueran isoprotéicas al 31.5 ± 1 %.

Tabla 2 Dietas formuladas en base a la composición proximal de los ingredientes y los requerimientos proteicos y lipídicos del camarón blanco (Litopenaeus vannamei), cantidades en gramos. CONTROL

(100%) D1 A.V. 95%

D2 A.V. 90 %

D3 A.V. 85 %

D1 A.R 95%

D2 A.R. 90 %

D3 A.R. 85 %

HARINA DE PESCADO 150 142.5 135 127.5 142.5 135 127.5

H. DE ALGA VERDE 0 100 150 200 0 0 0

H. DE ALGA ROJA 0 0 0 0 100 150 200

H. DE TRIGO 558.8 466.3 423.8 381.3 466.3 423.8 381.3

PASTA DE SOYA 200 200 200 200 200 200 200

GRENETINA 40 40 40 40 40 40 40

ACEITE DE PESCADO 25 25 25 25 25 25 25

LECITINA DE SOYA 25 25 25 25 25 25 25

PREMEZCLA DE

0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1


La formulación de las dietas se realizó mediante el programa Excel basados en una formulación comercial con harina de pescado (Tacon et al., 1983). 3. Preparación de los pellets En una mezcladora comercial marca Kitchen Aid (Modelo K5SS, Michigan, USA) de 5 L, se mezclarán los ingredientes por 15 minutos en los porcentajes formulados y pesados previamente hasta formar una masa húmeda y homogénea lo que se logrará añadiendo un poco de agua. Una vez formada la masa ésta será pasada a través de un molino para carne marca TORO-‐REY (Modelo 22-‐R) equipado con un una cuchilla y disco con orificios de 1/8 de pulgada que servirá para elaborar los pellets que se utilizarán en la alimentación de camarón blanco. 4. Sistema de cultivo A fin de probar las dietas y su efecto en el crecimiento y sobrevivencia de los camarones se diseñó un sistema cerrado de recirculación de agua de mar consistente en 24 tinas de plástico con medidas de 50 x 34 x 38 cm, de largo, ancho y alto, con capacidad aproximada de 40 l cada una. Básicamente el sistema de recirculación utilizado consiste en un filtro biológico con capacidad de 150 l y un tinaco marca rotoplas de 250 l como reservorio del agua de mar filtrada. El filtro está habilitado con una pequeña bomba sumergible para subir un flujo de agua de 290 L h-‐1. El suministro de agua desde el reservorio hacia las tinas se realiza por gravedad a razón de ca. 200 ml por minuto, generando con esto 7 recambios totales diarios por tina. El tinaco-‐reservorio está equipado con 2 calentadores de 300 watts para mantener la temperatura constante a 28±1 °C. Para el retorno del agua al filtro biológico, en la parte superior en una de las caras de cada tina se colocó un tubo de PVC de media pulgada de diámetro que sirve de descarga del exceso de agua que entra a cada tina. Para la oxigenación del agua, cada tina cuenta con una manguera y una piedra difusora conectadas a un Blower de 5 HP. Las condiciones iniciales del agua en el sistema serán: salinidad de 32 ‰, oxígeno disuelto > 5 mg L, temperatura 28 ± 1 °C y un foto período 12 h luz: 12 h oscuridad.

Para los ensayos, se utilizarán camarones L. vannamei de aproximadamente 1 g de peso los cuales se colocarán (n=6) en los contenedores de plástico (tinas de 40 l de capacidad) por triplicado para cada formulación. Los camarones se alimentarán de

VITAMINAS

PREMEZCLA DE MINERALES

1.1 1.1 1.1 1.1 1.1 1.1 1.1

1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000

% PROTEINA EN LA DIETA 32.75 32.12 31.64 31.15 31.84 31.21 30.58


acuerdo a su peso dos veces al día, media ración por la mañana y media ración por la tarde (9:00 y 17:00 h). Diariamente por la mañana antes de suministrar el alimento se retiraran las heces mediante un sifoneo en cada una de las tinas. Semanalmente se determinarán la cantidad de nitratos, nitritos, amonio y fósforo totales en el agua del sistema de cultivo mediante las técnicas descritas por Strickland y Parsons (1968). Los ensayos tendrán una duración de 90 días. Quincenalmente se estimará la tasa de crecimiento y sobrevivencia en cada tina y se ajustará la ración de alimento suministrado en base al peso (biomasa) de los organismos de acuerdo a las tablas de alimentación de Purina. Al término del periodo experimental se determinará el contenido de colesterol y su composición química; (Casas et al., 2006)

5. Evaluación de campo (granja) de la mejor dieta

Con base en los resultados obtenidos de tasa de crecimiento, sobrevivencia y conversión alimenticia del ensayo con dietas y disminución del contenido de harina de pescado se seleccionará la composición proximal que será probada en campo. Nuevamente se procederá a elaborar la dieta del modo ya descrito anteriormente. La evaluación de la dieta en campo se hará utilizando jaulas de 2x2x2 m fabricadas con varilla metálica y cubierta de malla plástica tipo mosquitero. Las jaulas (n= 5) se colocarán al interior de un estanque rústico de 2 hectáreas de superficie de espejo de agua propiedad de una granja camaronera por lo que las condiciones de calidad y productividad primaria del agua serán semejantes a las del resto de los estanques de la granja. La densidad de siembra a utilizar en las jaulas será similar a la utilizada en el cultivo comercial de camarón en Sinaloa, es decir 12 camarones por metro cuadrado, de este modo se colocaran 24 camarones por jaula. La alimentación de los organismos se realizará utilizando el método de charolas. La ración de alimento diario se suministrará en dos porciones, una por la mañana y otra por la tarde, y será de acuerdo a la biomasa de los organismos siguiendo la tabla de alimentación de purina más un 10%. Semanalmente se realizarán biometrías de los organismos por jaula a fin de ajustar la ración alimenticia y cuantificar la mortalidad. Al término del periodo experimental de 90 a 110 días se realizará una biometría final para estimar los parámetros mencionados anteriormente.

Durante la realización de este bioensayo de crecimiento en campo se tomaran muestras semanales de agua del estanque de cultivo donde se colocaran las jaulas a fin de mantener un registro de la calidad del agua, así como de la productividad primaria de la misma. MODULO 3. Dr. Antonio Luna González (USO DE FERMENTADOS) Aislamiento de bacterias ácido lácticas (BAL) Se realizará la extracción del intestino y glándula digestiva de camarón blanco (L. vannamei) silvestre capturado en la Bahía de Navachiste, Guasave, Sinaloa. Cada una de las muestras se colocará en tubos Eppendorf (1.5 mL) con 200 µL de solución salina estéril y se macerará con un homogeneizador automático Pellet Pestle motor


(Kontes, NY, USA). Se sembrarán por esparcimiento 100 µL del homogenizado de cada muestra, en placas con medio Rogosa LS (Difco, Sparks, MD, USA) al 2% de NaCl, y se incubarán a 30 °C por 120 h, observando su crecimiento cada 24 h. Posteriormente, cada colonia resultante se resembrará de forma masiva en medio MRS (Man, Rogosa & Sharp; BD Difco, Sparks, MD, USA) con 2% de NaCl, y se incubarán a 30 °C por 24 h. Finalmente, se cosecharán las bacterias y se colocarán en tubos Eppendorf con caldo MRS con 15% (v/v) de glicerol y 2% de NaCl. Los aislados se almacenarán a -‐80 °C (Stock) para su posterior caracterización. Caracterización de los aislados bacterianos Determinación de hemólisis en sangre humana La actividad hemolítica de las cepas aisladas será determinada conforme a la propuesta de Cowan y Steel (1993). Se prepararán cajas petri con medio de cultivo agar sangre (20 mL de medio agar sangre BD Bioxon + 1 mL de sangre humana por placa). Se harán perforaciones en la placa con un horadador estéril. Los aislados se cultivarán en caldo MRS a 30 ºC por 24 h y se centrifugarán a 10,000 x g por 5 min. El pH del sobrenadante se ajustará 6.5 con NaOH 1 M para evitar crear falsos halos de lisis ocasionados por la acidez del medio. Finalmente se depositaran 50 µL del sobrenadante en los pozos y las placas se incubarán a 37 ºC, por 48 h, utilizando medio de cultivo para el control negativo. Después de transcurrido el tiempo de incubación se analizará y medirá el halo de lisis con una regla y se determinará el tipo de hemólisis: α (parcial), β (total) ó γ (sin halo de hemólisis). Cinética de crecimiento bacteriano y conteo de UFC/mL de los aislados de BAL Con la finalidad de conocer las fases del crecimiento de los aislados, se llevará a cabo una cinética de crecimiento, cultivando 20 µL del stock de cada aislado en 50 mL de medio MRS con 2% de NaCl y se incubarán a 30°C. Se determinará la absorbancia (580 nm) a las 6, 12, 24, 48, 72 y 96 h en un espectrofotómetro Thermo Spectronic Genesys 2 (Thermo Scientific). Para contar las bacterias, se sembrarán individualmente en medio MRS caldo con 2% de NaCl y se incubarán por 24 h a 30 ºC. Las bacterias se centrifugarán a 10,000 x g durante 20 min. La pastilla obtenida se resuspenderá en 1 mL de solución salina (NaCl 2.0 %) estéril. Esta solución se ajustará a una densidad óptica de uno en un espectrofotómetro Thermo Spectronic Genesys 2 (Thermo Scientific) con una longitud de onda de 580 nm. Se determinaran las UFC/mL para cada cepa, utilizando el método de diluciones seriadas decimales. Prueba de hidrofobicidad con Rojo Congo Para determinar la hidrofobicidad de las bacterias, cada aislado será cultivado en agar MRS con 2% de NaCl, adicionado con Rojo Congo (0.03%). Cada aislado será sembrado por el método de estría y se incubará a 30 °C por 24 h. Se tomarán como resultados positivos aquellos aislados con coloración roja y negativos aquellos aislados que formaron colonias blancas o translúcidas. Actividad enzimática extracelular


La producción de enzimas extracelulares se determinará cualitativamente y para ello se cultivaron los aislados de BAL en medio MRS con 2% de NaCl y se incubarán a 30 ºC por 24 h. Los cultivos se centrifugarán a 12,000 x g por 10 min para obtener el sobrenadante. Prueba de degradación de la caseína (proteasas) Se prepararán placas con medio basal (agar 1.5% y extracto de levadura 0.5%) adicionado con 2% de leche descremada, se realizarán perforaciones de 6 mm diámetro con un horadador estéril. Los pozos se inocularán con 50 μL del sobrenadante de los cultivos, se utilizará como control el medio de cultivo. Las placas se incubarán a 30 °C por 24 h. Se considerará como resultado positivo los aislados que formen un halo transparente alrededor del pozo. Prueba de hidrólisis de la gelatina (proteasas) Se prepararán placas con medio basal (agar 1.5% y extracto de levadura 0.5%) adicionado con 1% de gelatina. Se realizarán perforaciones de 6 mm de diámetro con un horadador estéril. Los pozos se inocularán con 50 μL del sobrenadante de los cultivos, se utilizará como control el medio de cultivo. Las placas se incubarán a 30 °C por 24 h. Se considerará como resultado positivo los aislados que formen un halo nuboso alrededor del pozo. Prueba de hidrólisis de Tween 80 (lipasas) Se prepararan placas de Petri con medio basal (agar 1.5% y extracto de levadura 0.5%) adicionado con 1% de Tween 80. Se realizaran perforaciones (6 mm de diámetro) con un horadador estéril de forma homogénea. Los pozos se inocularán con 50 μL del sobrenadante de los cultivos, se utilizará como control medio de cultivo. Las placas se incubarán a 30 °C por 24 h. Se considerará como resultado positivo los aislados que formen un halo nuboso alrededor del pozo. Prueba de hemólisis con hemolinfa de camarón La detección de hemólisis en hemolinfa de camarón se realizará mediante una adaptación de la técnica usada por Chin-‐l et al. (2000). Los aislados se sembrarán en MRS caldo con 2% de NaCl y se incubarán a 30 °C por 36 h. El pH de los cultivos se ajustará a 6.5 con NaOH 1 M. Se tomará 1 mL de cada aislado y se centrifugará a 10,000 x g por 20 min. La actividad en hemolinfa se realizará en los aislados que presentaron hemólisis α en sangre humana. Se extraerá 1 mL de hemolinfa de camarones adultos e inmediatamente se transferirá a un tubo Eppendorf con 266 µL de anticoagulante (buffer de SIC-‐EDTA; NaCl 450 mM, KCl 10 mM, Hepes 10 mM + EDTA, Na2 10 mM, pH 6.9), se agregará el colorante rosa de Bengala (0.03%) para teñir las células (hemocitos). El contenido del tubo se mezclará en un matraz con 15 mL de medio basal agar (10 g de Bacto peptona, 5 g cloruro de sodio y 15 g de Bacto agar disuelto en 1000 mL de agua, pH 6.8). Una vez solidificadas las placas, se realizaran pozos con un horadador estéril. Se inocularán 50 µL del sobrenadante del cultivo bacteriano en los pozos. Como control negativo se colocarán 50 µL de MRS caldo con 2% de NaCl. Las placas se incubarán a 30 °C por 24 h y se medirá el halo de lisis.


Tinción de Gram Se realizara una tinción de Gram a los aislados que presenten actividad γ hemolítica. Para este análisis se usara un kit comercial. Lo anterior servirá para determinar si los aislados son Gram (+) o Gram (-‐), además se determinará la forma y el arreglo celular, mediante su observación bajo el microscopio con el objetivo 100 x. Identificación molecular de BAL Extracción de ADN bacteriano con el kit Bactozol (MRC, Cincinnati, OH., USA) A partir de 3 mL de cultivo bacteriano se obtendrán aproximadamente 40 µg de ADN. La suspensión bacteriana se sedimentará a 6,000 x g por 4 min a 4-‐25 °C. El sobrenadante será descartado y el pellet resultante se resuspenderá en 100 µL de Solución Enzimática Bactozol 1X, agitando con el vortex para homogeneizar. La suspensión se lisará incubando a 50 °C por 15-‐30 min. Una suspensión turbia puede indicar una lisis incompleta. Para mejorar la lisis celular y la recuperación de ADN, se incrementará el tiempo de incubación por 15-‐30 min más y se elevará la temperatura de incubación a 55 °C. Si la solución continúa turbia, se centrifugará a 10,000 x g por 7 min a 4-‐25 °C y se colectará el sobrenadante. Posteriormente se agregarán 400 µL del reactivo DNAzol, se dejará incubar a temperatura ambiente por 10 min, y 15 min más a 55 °C. Se centrifugará a 10 000 x g, por 7 min y se recuperarán 400 µL de sobrenadante. El ADN del lisado se precipitará adicionando 500 µL de etanol al 100% y se incubará a temperatura ambiente por 10 min. Las muestras se mezclarán invirtiendo los tubos 5-‐8 veces. Se centrifugará a 3 000 g por 5 min y se decantará el sobrenadante. Se adicionará 1 mL de etanol al 75% y se centrifugará a 4 000 x g por 4 min. Se decantará el sobrenadante y se extraerá el líquido remanente con una pipeta. Las muestras se secarán por 10 min en un Termoblock a 55 °C. Finalmente el ADN se resuspenderá en 30 µL de agua ultrapura y se almacenará a -‐20 °C. Amplificación de ADN con la PCR La identificación de los aislados se realizará mediante la secuenciación del ADN ribosomal 16S. Para la amplificación del ADNr 16S se utilizarán oligonucleótidos universales diseñados en base a secuencias conservadas del gen que codifica para la subunidad ribosomal 16S (Jensen et al., 2002). Los oligos que se utilizarán en la PCR serán 27f (sentido) 5’-‐AGAGTTTTGATCCTGGCTCAG-‐3’ y 1492r (contrasentido) 5’-‐TACGGCTACCTTGTTACGACTT-‐3’. El tamaño esperado del fragmento es de aproximadamente 1500 pb. La mezcla de reacción para la PCR se realizará en tubos Eppendorf de 0.2 mL en un volumen total de 25 µL, como sigue: 14.75 µL de H2O; 2.5 µL de búfer de reacción 10X (Bioline); 1.0 µL de MgCl2 (50 mM; Bioline); 0.5 µL de dNTPs (100 µM; Bioline); 0.5 µL de cada oligo (10 mM cada uno; Sigma-‐Genosys) y 0.25 µL de Taq polimerasa (5 U/ µL; Bioline). Se añadirán 5 µL del ADN a una dilución 1:30. La amplificación se realizará en un termociclador Biometra (Tpersonal) usando el siguiente programa: desnaturalización inicial a 95 °C°C por 5 min, 94 °C por 1 min, 60 °C por 1 min para el anillado, 72 °C por 45 s para la extensión y 72 °C por 5 min para la extensión final. El número de ciclos será de 34. Los fragmentos amplificados se


visualizarán (incluido un marcador de peso molecular de 1 kb) en un gel de agarosa al 0.8 %, teñido con bromuro de etidio, bajo luz UV. Clonación y secuenciación del producto amplificado Los ADNs amplificados se clonarán con el kit pCMV-‐Script® PCR Cloning Kit (Stratagene) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las células transformantes serán seleccionadas en cajas Petri con LB-‐agar conteniendo kanamicina (50 µg/ml), X-‐Gal (40 µg/mL) y IPTG (0.5 mM). Un solo clon será seleccionado por cada cepa. Los plásmidos recombinantes serán aislados usando el kit GenElute HP Plasmid Maxiprep (Sigma-‐Aldrich). Los plásmidos se digerirán con la enzima EcoR1 y se visualizarán en geles de agarosa para confirmar la presencia del fragmento insertado. Los fragmentos de ADN obtenidos se mandarán a secuenciar. Finalmente, la secuencia obtenida se comparará con las secuencias nucleotídicas reportadas en el banco genómico (GeneBank database) mediante el software BLAST del NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Las alineaciones de las secuencias se realizarán mediante el software Clustal W de la EBI (European Bioinformatic Institut, Reino Unido, www. ebi.ac.uk) que forma parte de EMBL (The European Molecular Biology Laboratory). Obtención de harina de Lemna minor Se colectará un stock silvestre de lenteja de agua dulce (Lemna minor), para cultivarlo en el agua de desecho de un cultivo de tilapia. Una vez que el cultivo presente una alta cantidad de biomasa, se cosechará parcialmente; este procedimiento se llevará a cabo periódicamente permitiendo así que el cultivo se mantenga. La biomasa será extendida sobre charolas y secada en un horno a 80 ºC hasta eliminar completamente la humedad. Las plantas secas serán molidas hasta obtener un tamaño de partícula de aproximadamente 450 µm. Fermentación de la harina de Lemna minor Para la fermentación de la harina, se contará con un cultivo de 50 mL/kg de harina de las BAL. Se colocarán 300 g de harina en recipientes de 1 L, se agregarán 300 mL suero de leche bovina, 20 g/kg de melaza previamente hervida, 1% de ácido fúlvico y 4% de vinagre de manzana comercial. Los recipientes serán tapados para conservar condiciones anaeróbicas y se agitarán con cuidado diariamente. Se determinará la composición proximal de los fermentos a las 48, 72, 96 y 120 h, además se realizará un análisis organoléptico de la harina, esto con el fin de determinar el tiempo adecuado de fermentación. El intervalo de tiempo seleccionado se utilizará en la fermentación de la harina para la fabricación de las dietas, para esto se determinaran los volúmenes necesarios de harina para la elaboración de las dietas para cada experimento. Una vez obtenida la harina fermentada se secará en un horno a 45 °C para eliminar el exceso de humedad. Posteriormente se llevará a cabo la formulación y elaboración de las dietas. Composición química de los ingredientes y dietas Una vez obtenida la harina de Lemna minor fermentada se determinará su composición química. Serán determinados los contenidos de humedad, proteína,


extracto etéreo, fibra cruda, cenizas, extracto libre de nitrógeno, determinación de energía bruta y análisis de perfil de aminoácidos. Estos análisis se realizarán tanto para la harina como para las dietas elaboradas. Humedad La humedad se determinará por desecación, las muestras se secarán a 105 ºC hasta obtener un peso constante.

Cenizas Para determinar el contenido de cenizas en las muestras, estas serán calcinadas a 650 °C hasta obtener un peso constante.

Proteína El contenido de proteínas se determinará a partir del contenido total de nitrógeno de las muestras, mediante la técnica Kjeldhal. Dicho método consiste en la digestión de las muestras con ácido sulfúrico concentrado a 400 °C, a la cual se le adiciona un catalizador. Posteriormente se realizará una destilación con Na (OH) al 40%, utilizando una solución indicadora con ácido bórico al 4%. Finalmente, se realizará una titulación con HCl 0.1 N. Extracto etéreo El contenido de extracto etéreo de las muestras se determinará mediante el método Soxhlet. Fibra cruda El contenido de fibra cruda será determinado mediante hidrólisis sucesivas ácido-‐base. Extracto libre de nitrógeno Será determinado por la diferencia de 100 menos la suma de los demás nutrientes. Determinación de energía bruta La determinación de energía bruta se determinará mediante la combustión de la muestra en forma de pastilla en una bomba calorimétrica. Análisis del perfil de aminoácidos El perfil de aminoácidos se determinará por cromatografía líquida (HPLC), utilizando digestiones ácido-‐base para el método de análisis cromatográfico.

Diseño experimental Para los experimentos se utilizarán tinas ovaladas de plástico con una capacidad de 120 L, llenadas con 80 L de agua de mar filtrada (20 µm). Los organismos se pesarán y


se aclimatarán a las condiciones del laboratorio por 10 d, alimentándolos con una ración diaria de alimento comercial equivalente al 5% de la masa corporal. La ración se dividirá alimentando dos veces al día (09:00 y 16:00). La limpieza del sistema de cultivo se realizará cada tres días, eliminando la materia particulada del fondo por sifoneo y haciendo un recambio de agua del 50%. Los parámetros fisicoquímicos como la temperatura, oxígeno, salinidad y pH se medirán cada 3 días. Se formularán seis dietas experimentales (Tabla 1). Una dieta control (sin inclusión de harina fermentada de L. minor) y cinco con inclusión de harina fermentada de L. minor. En estas dietas se reemplazará la harina de pescado en un 10, 20, 40, 80 y 100% por harina fermentada de L. minor, procurando que las dietas sean isoprotéicas. Los porcentajes de sustitución estarán sujetos a modificación conforme a la composición proteica final de la harina fermentada de L. minor.

*La cantidad de harina de pescado en las dietas experimentales estará dada por la cantidad de harina fermentada de L. minor que se adicione, a su vez la cantidad de harina de L. minor que se utilice estará dada por su contenido proteico final. La formulación de las dietas se realizará mediante el programa Excel basados en una formulación comercial con harina de pescado (Tacon et al., 1983).

Tabla 1 Dietas formuladas en base a la composición proximal de los ingredientes y los requerimientos proteicos y lipídicos del camarón blanco (Litopenaeus vannamei), cantidades en gramos. CONTROL

(100%) D1 90%

D2 80%

D3 60%

D4 20%

D5 0%

HARINA DE PESCADO 250 * * * * *

H. FERMENTADA DE L. minor 0 * * * * *

H. DE TRIGO 506 506 506 506 506 506

PASTA DE SOYA 160 160 160 160 160 160

GRENETINA 40 40 40 40 40 40

ACEITE DE PESCADO 21.5 21.5 21.5 21.5 21.5 21.5

LECITINA DE SOYA 21.5 21.5 21.5 21.5 21.5 21.5

PREMEZCLA DE VITAMINAS 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1

PREMEZCLA DE MINERALES 1.1 1.1 1.1 1.1 1.1 1.1

1000 1000 1000 1000 1000 1000

% PROTEINA EN LA DIETA 35.5 32.12 32.12 31.64 31.15 31.84


Preparación de los pellets Para la elaboración de los pellets los ingredientes serán mezclados por 15 min en una mezcladora comercial marca Kitchen Aid (Modelo K5SS, Michigan, USA) de 5 L, Una vez formada una masa homogénea, ésta será pasada a través de un molino para carne marca TORO-‐REY (Modelo 22-‐R) equipado con un una cuchilla y disco con orificios de 1/8 de pulgada. Experimento 1. Efecto de diferentes porcentajes de sustitución de harina de pescado por harina fermentada de L. minor en la supervivencia y crecimiento de L. vannamei Se utilizarán 180 camarones de aproximadamente 1 g obtenidos de granjas de Guasave, Sinaloa. La duración será de 60 d. Los organismos serán repartidos al azar, colocando 10 organismos por tina. El bioensayo constará de 6 tratamientos, en los cuales solo variará el porcentaje de sustitución de harina de pescado por harina fermentada de Lemna minor en la dieta, cada uno con tres réplicas: 1) Control (Dieta comercial); 2) Sustitución 10%; 3) Sustitución 20%; 4) Sustitución 40%; 5) Sustitución 80%; 6) Sustitución 100%. Se realizarán biometrías cada 10 días y se registrará la supervivencia y el peso al final del bioensayo. Experimento 2. Efecto en el sistema inmune y variables metabólicas de la inclusión de harina fermentada de Lemna minor en la dieta de Litopenaeus vannamei. Se utilizarán 150 camarones de aproximadamente 8 g obtenidos de granjas de Guasave, Sinaloa. La duración será de 60 d. Los organismos serán repartidos al azar, colocando 10 organismos por tina. El bioensayo constará de 5 tratamientos cada uno con 3 réplicas. En este bioensayo se utilizará la dieta del mejor tratamiento del experimento 1, señalada como Dieta 1, con la cual se alimentarán los organismos en diferentes intervalos de frecuencia. Los tratamientos quedarán de la siguiente manera: 1) Control 1(Dieta comercial, Purina u otra marca con 30% de proteína); 2) Dieta control elaborada; 3) Dieta 1-‐diariamente; 4) Dieta 1-‐cada 3 días; 5) Dieta 1-‐cada 6 días. Al final del bioensayo, se registrará el peso y la supervivencia y se realizará la extracción de la hemolinfa para determinar la expresión semicuantitativa de 9 genes del sistema inmune en hemocitos, además del análisis de parámetros inmunológicos tales como conteo de hemocitos totales (CHT), profenoloxidasa, actividad del anión superóxido y tiempo de coagulación. Adicionalmente se determinarán variables metabólicas (lactato, colesterol, glucosa, carbohidratos y lípidos totales) en hemolinfa, glándula digestiva y músculo del camarón. Obtención de hemolinfa Para determinar la expresión de los genes del sistema inmune, la actividad de la fenoloxidasa, lisozima, peroxidasa y anión superóxido intracelular, se extraerá la hemolinfa de 4 camarones por tina (réplica) y se hará un pool. La hemolinfa se extraerá con jeringas para insulina (27G x 13 mm) de la parte ventral del camarón, justo en la zona del segundo par de pleópodos. La jeringa se cargará con una solución isotónica para camarón y EDTA como anticoagulante (SIC-‐ EDTA, Na2) (NaCl 450 mM,


KCl 10 mM, Hepes 10 mM + EDTA, Na2 10 mM, pH 7.3, 850 mOsm/kg), previamente enfriada a 4 °C (Vargas-‐Albores et al. 1993) en una proporción 2:1 (2 volúmenes de SIC-‐EDTA por cada volumen extraído de hemolinfa). Inmediatamente después de ser extraída la muestra de hemolinfa, ésta se colocará en tubos Eppendorf de 1.5 mL. Para separar los hemocitos del plasma, la hemolinfa se centrifugará a 1000 x g por 10 min a 4 °C. El plasma se eliminará y el paquete celular se lavará con 1 mL de SIC frío. La muestra lavada se centrifugará a 1000 x g por 10 min a 4 °C y el sobrenadante se desechará. Al paquete celular se adicionarán 1.5 mL de Trizol enfriado en hielo y se guardará a -‐80 °C. Extracción de ARN y RT-‐PCR semicuantitativa Se utilizarán los hemocitos guardados a -‐80 ºC en Trizol. El ARN total será extraído de acuerdo al protocolo del fabricante (Invitrogen) y guardado a -‐80 ºC hasta su uso en la RT-‐PCR. La concentración y pureza del ARN total extraído será determinado midiendo la absorbancia a 260/280 nm en un espectrofotómetro Spectronic Genesis 5. Se usará la transcriptasa reversa M-‐ML (Invitrogen) para sintetizar la primera hebra (ADNc) con el primer oligo dT20 a partir de 2 µg de ARN total a 40 ºC por 50 min. El ADNc resultante será cuantificado, llevado a una concentración final de 100 mg/mL en búfer TE 1x, y almacenado a -‐20 °C para su uso en las reacciones de PCR. Los genes de las proteínas de unión a beta-‐glucanos (PUBG) y lipopolisacáridos (PULPS), profenoloxidasa (proFe), transglutaminasa (TG), crustina (CR), peneidina 3a (PEN), lisozima (LIZ) y superóxido dismutasa (SD) serán amplificados del ADNc de hemocitos (Wang et al. (2009). El gen de la β-‐actina será usado como control en todas las reacciones de amplificación. La tabla que se inserta muestra los primers que se utilizarán en este trabajo. Dos microlitros de las muestras de ADNc serán usadas para la PCR en una reacción con volumen de 20 µL. La amplificación se realizará en un termociclador Biometra (Whatmann), con las siguientes condiciones: desnaturalización inicial a 95 °C por 3 min, seguido por 30 ciclos de desnaturalización a 95 °C por 30 s, anillado (temperatura variable para cada gen) por 30 s y extensión a 72 ºC por 1 min y una elongación final a 72 °C por 5 min. Los productos de la PCR (5 µL) serán visualizados en un gel de agarosa al 1.0%, teñido con bromuro de etidio, usando un sistema de fotodocumentación (BioRad). La cuantificación del ARNm se realizará empleando el programa de análisis de imágenes IMAGE J (http://rsb. info.nih.gov/ij/) que nos permitirá comparar la intensidad de la banda correspondiente al producto amplificado de los genes de estudio con el testigo β-‐actina, calculando la razón gen de estudio/β-‐actina. Gen Secuencia del oligo (5’-‐3’) Producto (pb) Referencia

β-‐actina Sentido

Contrasentido

GTGTGACGACGAAGTAGCC TGGTCGTGAAGGTGTAACCA

605 Wang et al. (2009)

PUBG Sentido

Contrasentido

TCGTCAGCATTGTGGAATC GAAGTCGTAGCCGTAAGC

583 Wang et al. (2009)

PULPS Sentido

Contrasentido

CTGGCTCTAGCAGCAACCTC CCTCGTCCACGTAGAACTCC

399 Wang et al. (2009)


proFe Sentido

Contrasentido

GGAATTGTTTTACTACATGCATCAGC GGAACAAGTCATCCACGAGCTT

563 Wang et al. (2009)

TG Sentido

Contrasentido

CAACCTGGAGGTTCACAAGC CAAAGCTCTYGGKAAATACG

535 Wang et al. (2009)

CR Sentido

Contrasentido

ATTCTGTGCGGCCTCTTTAC ATCGGTCGTTCTTCAGATGG

539 Wang et al. (2009)

PEN Sentido

Contrasentido

AGCCTCACCTGCAGAGACCA

AATCAGGATCRCAGKCTCTTCAC 378 Wang et al. (2009)

LIZ Sentido

Contrasentido

TTCGGGAAGTGCGAATTCG AATGGAAACCCTTGGTGAC

475 Wang et al. (2009)

SD Sentido

Contrasentido

GAGAAGAAGTTGGCTGAGCT ATGTTGGGTCCAGAAGATGG

467 Wang et al. (2009)

Clonación y secuenciación del producto amplificado Para realizar la clonación molecular, se correrá un gel de agarosa al 2% del producto de la PCR, se cortarán bandas únicas por muestra, el ADN contenido en la banda se purificará empleando el kit comercial Gen Clean (Gibco-‐ BRL). Los ADNs amplificados se clonarán con el kit pGEM-‐ Easy vector® (Promega) el cual consiste en lo siguiente: Se adicionarán 3 µL del producto de PCR a clonar ya limpio, se adicionarán 5 µL de buffer de ligación 2X, 1 µL de pGEM-‐Easy vector, 1 µL de DNA ligasa, se incubará a 37 °C por 2 h y se dejará toda la noche a 4 °C. La transformación se hará en células de Escherichia coli electro competentes. Las células transformantes serán seleccionadas en cajas Petri con LB-‐agar conteniendo ampicilina (50 µlg/ml), X-‐Gal (40 µg/ml) y IPTG (0.5 mM). Un solo clon será seleccionado por cada cepa. Los plásmidos recombinantes serán aislados usando el kit GenElute HP Plasmid Maxiprep (Sigma-‐Aldrich). Los plásmidos se digerirán con la enzima EcoR1 y se visualizará en un gel de agarosa al 1.5% para confirmar la presencia del fragmento insertado. Los fragmentos de ADN obtenidos se mandarán a secuenciar. Finalmente, la secuencia obtenida se comparará con las secuencias nucleotídicas reportadas en el banco genómico (GeneBank database) mediante el software BLAST del NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Las alineaciones de las secuencias se realizarán mediante el software Clustal W de la EBI (European Bioinformatic Institut, Reino Unido, www. ebi.ac.uk) que forma parte de EMBL (The European Molecular Biology Laboratory). Medición de fenoloxidasa y profenoloxidasa La medición de la proFO y la FO se realizará con la técnica descrita por Hernández-‐López et al. (1996). La actividad de la FO presente en el plasma será medida espectrofotométricamente por la formación de dopacromo a partir de L-‐dihidroxifenilalanina (L-‐Dopa). A 50 μL de muestra, se le adicionaran 50 μL de búfer de cacodilato 10 mM, pH 7 y 50 μL de L-‐Dopa (3 mg/mL en agua destilada). Se


incubará durante 10 min a temperatura ambiente (aprox. 25 °C), posteriormente se le adicionaran 800 μL de búfer de cacodilato y se determinará la absorbancia a 492 nm en un espectrofotómetro Thermo Spectronic Genesys 2 (Thermo Scientific). En todos los ensayos se utilizará cacodilato como control negativo. La proFO se determinará activándola previamente con tripsina (0.1 mg/mL en agua destilada) para convertirla en FO. La actividad de la FO se medirá como se describió previamente. La actividad total se expresará como actividad específica de la proteína como el cambio en la absorbancia a 492 nm/min/mg de proteína de cada camarón. La cantidad de proFO disponible en la muestra será calculada de la siguiente forma:

FO + FO activada con tripsina = FO total

FO total -‐ FO = proFO

Detección de la actividad de la lisozima Se preparará una solución de 4 mg/mL de la bacteria liofilizada Micrococcus luteus (Sigma) en agua destilada y un búfer (Tris-‐HCl 50 mM, pH 5.2) con el cual se preparará agarosa al 1 %. La agarosa fundida en el búfer se dejará reposar hasta que se enfrie a 40 °C. A 14 mL del búfer se le agregará 1 mL de la solución bacteriana y se mezcló. La mezcla será vaciada en una caja de Petri y se harán 8 pozos de 6 mm de diámetro, los cuales se llenarán con 30 µL de cada muestra de SLH, saliva de humano (diluida 1:9 en solución salina 0.1 % NaCl) como control positivo y búfer como control negativo. Las muestras se incubaran por 48 h a 37 °C y se medirá el diámetro del halo de lisis. Los resultados se expresaran en unidades (0.1 mm = 1 U) relacionadas a la proteína (U/mg de proteína). El análisis se realizará por triplicado (3 pozos por muestra). Anión superóxido intracelular El anión superóxido se cuantificará mediante la metodología de Song y Hsieh (1994). Se tomaran 100 mL de hemolinfa de cada grupo y se centrifugará a 800 g por 5 min. Posteriormente, se descartará el sobrenadante y los hemocitos se lavaran tres veces con HBSS y se teñirá con una solución NBT (0.3% 100 mL) durante 30 min a 37 ºC. La reacción de tinción se finalizará mediante la eliminación de la solución NBT y la adición de metanol absoluto. Después de tres lavados con metanol al 70% los hemocitos serán secados y 120 mL de KOH más 140 mL de DMSO se añadirán para disolver el formazán citoplasmático. La densidad óptica del formazán disuelto será leída a 630 nm para comparar los efectos de los diferentes tratamientos en la generación de O2 en todos los grupos estudiados. Ensayo para la actividad de la peroxidasa La actividad de esta enzima será medida utilizando como sustrato Pirogalol. En una celda de sílice se mezclarán 64 µL de búfer potasio 0.1 M, pH 6.0; 32 µL de H2O2 0.147 M; 64 µL de Pirogalol 5 % (w/v) y 420 µL de agua destilada. Para la mezcla de reacción se agregaran 20 µL de plasma de la hemolinfa. Esta mezcla se mezclara vigorosamente usando la punta de la pipeta y después de 20 s de reacción la absorbancia será medida a 420 nm.


Determinación de variables metabólicas en hemolinfa Determinación de lactato Esta determinación se realizará utilizando el kit comercial PAP (Randox, Crumlin, Reino Unido). Este kit contiene una solución estándar, una solución reactiva y un buffer que se emplea para preparar la solución reactiva. Para este análisis, se elaborará una curva tipo con las siguientes concentraciones: 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10, 20 mg dl–1. Para el blanco se utilizará SIC, el cual es una solución salina isotónica para crustáceos (Mendoza, 1992). Las absorbancias se medirán con un lector de microplaca a 540 nm. Determinación colesterol Esta determinación se realizará utilizando el kit comercial CHOD-‐PAP (Boehringer Mannheim GMBH, Biberach, Alemania). Este kit contiene una solución estándar, una solución reactiva y un buffer que se emplea para preparar la solución reactiva. Para este análisis, se elaborará una curva tipo con las siguientes concentraciones: 6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200 mg dl–1. Para el blanco se utilizará SIC, el cual es una solución salina isotónica para crustáceos (Mendoza, 1992). Las absorbancias se medirán con un lector de microplaca a 490nm. Determinación de glucosa Esta determinación se realizó utilizando el kit comercial GOD-‐PAP (Boehringer Mannheim GMBH, Biberach, Alemania). Este kit contiene una solución estándar, una solución reactiva y un buffer que se emplea para preparar la solución reactiva. Para este análisis, se elaborará una curva tipo con las siguientes concentraciones: 1.562, 3.125, 6.25, 12.5, 25, 50, 100 mg dl–1. Para el blanco se utilizará SIC, el cual es una solución salina isotónica para crustáceos (Mendoza, 1992). Las absorbancias se medirán con un lector de microplaca a 490 nm. Determinación de lípidos totales Esta técnica se basa en el método de Barnes y Blackstock (1973). Una curva tipo será elaborada utilizando como estándar el kit “Lipid LIN-‐TROL” (Sigma, L-‐0524; St. Louis, MO, USA). Para el blanco se empleará la solución contenida en el kit “Lipid LIN-‐TROL”. Las absorbancias se medirán con un lector de microplaca a 540nm. Determinación de proteína La proteína se determinará con el método de Bradford (1976), utilizando albúmina de bovino como estándar. Determinación de variables metabólicas en músculo y hepatopáncreas Determinación de lactato Esta determinación se realizará utilizando el kit comercial PAP (Randox, Crumlin, Reino Unido). Este kit contiene una solución estándar, una solución reactiva y un buffer que se emplea para preparar la solución reactiva. Para este análisis, se elaborará una curva tipo con las siguientes concentraciones: 0.006, 0.013, 0.025, 0.050, 0.100, 0.200 mg ml–1. Para el blanco se utilizará SIC, el cual es una solución


salina isotónica para crustáceos (Mendoza, 1992). Las absorbancias se medirán con un lector de microplaca a 540 nm. Determinación de carbohidratos Esta técnica se basa en el método de Roe (1955). Una curva tipo será elaborada utilizando dextrosa anhidra (Aprotec Mexicana, S.A. de C.V., Tijuana, B.C., México) mezclada con ácido tricloroacético (TCA) al 10% como estándar. Para el blanco se empleará TCA al 10%. Las absorbancias se medirán a 540 nm con un espectrofotómetro. Determinación de lípidos totales Esta técnica se basa en el método de Barnes y Blackstock (1973). Una curva tipo será elaborada utilizando como estándar el kit “Lipid LIN-‐TROL” (Sigma, L-‐0524; St. Louis, MO, USA). Para el blanco se empleó la solución contenida en el kit “Lipid LIN-‐TROL”. Para este estudio, las muestras serán diluidas 1:3 con SIC, el cual es una solución salina isotónica para crustáceos (Mendoza, 1992). Las absorbancias se medirán a 540 nm con un lector de microplaca. Determinación de proteína La proteína se determinará con el método de Bradford (1976), utilizando albúmina de bovino como estándar. Análisis estadístico Los resultados de la supervivencia en porcentaje se transformarán a arcoseno y posteriormente se realizará una ANDEVA de una vía, para determinar si existen diferencias entre tratamientos (p<0.05). Si existen diferencias entre tratamientos, se realizará una prueba de Tukey (HSD) para identificar la naturaleza de estas diferencias (p<0.05). Para los resultados de crecimiento y CHT primero se llevará a cabo una prueba de normalidad (Kolmogorov-‐Smirnov) y homocedasticidad (Bartlett). Posteriormente, se realizará un ANDEVA de una vía para detectar diferencias entre tratamientos (p<0.05). Finalmente, si existieran diferencias entre tratamientos, se realizará una prueba de Tukey (HSD) para identificar la naturaleza de estas diferencias (p<0.05). MODULO 4. Dr. José Luis Montañez (USO DE SUBPRODUCTOS AGRÍCOLAS) Ingredientes empleados: La sangre de bovinos se obtendrá en el rastro del municipio de Jiquilpan, Mich. El suero de leche se obtendrá en la industria quesera establecida en el municipio de Jiquilpan, Mich. La pasta de maíz y la pasta de girasol se obtendrán en las industrias aceiteras establecidas en el Estado de Jalisco. Análisis Químico Porcentual


El análisis químico porcentual de las materias primas se llevará acabo de acuerdo a la metodología descrita en el AOAC (2004). Se determinará el contenido de humedad, cenizas, grasas, proteínas, fibra cruda y carbohidratos totales. Determinación del contenido de minerales: La determinación del contenido de minerales como Ca, P, S, K, Na, Mg y Mn, se determinarán por medio de la técnica de Espectroscopía de Absorción Atómica Determinación del perfil de ácidos grasos El perfil de ácidos grasos en cada una de las muestras será determinado por medio de la técnica de cromatografía de gases de acuerdo al método de Metcalf et al., (1966). Diseño, formulación y fabricación de los alimentos. En el presente estudio se elaborarán dietas compuestas experimentales formuladas con la ayuda del paquete MIXIT-‐Win y serán fabricados según el método descrito por Civera-‐Cerecedo (1989). Tanto los ingredientes como las dietas elaboradas serán analizados para conocer la composición proximal y calórica, y el contenido de aminoácidos de acuerdo a los métodos descritos por Civera-‐Cercedo (1989), y por cromatografía de gases (Fox et al., 2006). Debido a que se plantea una sustitución de harina de pescado en la dieta, se considera que la dieta base tendrá como fuente principal de proteína a la harina de soya. Esta es rica en la mayoría de los aminoácidos esenciales para peces, pero es deficiente en metionina (Milamena et al., 1999). Por ello, se considera necesario contar con al menos 5 niveles de inclusión de las diferentes fuentes de proteína, a fin de poder utilizar ya sea el método de línea quebrada o exponencial para determinar el requerimiento óptimo (Hernández-‐Llamas, en revisión), en donde la media de inclusión se aproxime al nivel supuesto de requerimiento. Los análisis químicos se realizarán por triplicado, de acuerdo a los siguientes métodos: Análisis proximal: humedad, proteína, extracto etéreo, fibra y ceniza (AOAC, 1995). Lípidos totales: Bligh y Dyer (1959). Proteína soluble: Bradford (1976). Quitina : Calvo-‐Carrillo et al., (1995) . Energía bruta: con calorímetro adiabático, marca PARR. Calcio: Gallaguer et al., (1978). Fósforo: Guerin y Napias (1978). Amino-‐ácidos: Meade (1972). Resultados: Modulo 1. Dr. Hervey Rodríguez González (USO DE PASTA DE JATROPHA CURCAS Y PRUEBAS EN CAMPO DE INGREDIENTES) Ensilado de Tilapia El pH se ajustó al día 7 de la hidrólisis, añadiéndose hasta ese día 25 ml de ácido fórmico. Mantuvo una temperatura entre 24.6 ºC y 32.9 ºC y la cantidad de agua añadida fue de 78 ml. Presentó al final del proceso una consistencia liquido-‐pastosa y 68.7 % de humedad Ensilado de Congrio cornudo


El ensilado de congrio cornudo presentó al final del proceso una consistencia acuosa, el pH se ajustó al día 25 de la hidrólisis, añadiéndose hasta ese día 39 ml de ácido fórmico. Mantuvo una temperatura entre 32.8 ºC y 23.6 ºC y la cantidad de agua añadida fue de 75 ml. Ensilado de Botete El ensilado de botete presentó al final del proceso una consistencia acuosa, la parte que no logró licuarse ni hidrolizarse fue la piel. El pH se ajustó al día 14 de la hidrólisis, añadiéndose hasta ese día 21 ml de ácido fórmico. Mantuvo una temperatura entre 33.1 ºC y 24 ºC y la cantidad de agua añadida fue de 81 ml. Potencial de Hidrógeno (pH) El pH de los 3 ensilados (tilapia, congrio cornudo y botete) se mantuvo dentro del los rangos óptimos para el proceso de ensilado Análisis Bromatológico de Homogenados de descartes de pescado (tilapia, congrio cornudo y botete) Humedad

(%) Proteína (%)

Extracto etéreo (%)

Fibra cruda (%)

Cenizas (%) ELN (%)

Tilapia 4.10 43.94 31.72 0.19 19.99 4.16

DS 0.04 1.35 0.19 0.02 0.48

Botete 2.52 76.27 2.15 0.03 21.50 0.05

DS 0.08 0.13 0.32 0.03 0.01

Congrio cornudo

ND 66.33 1.76 0.13 ND ND

DS 0.02 0.12 0.06 0.03 0.03

DS= Desviación estándar Análisis Bromatológico de ensilados de pescado (tilapia, congrio cornudo y botete) Humedad

(%) Proteína (%)


Fibra cruda (%)

Cenizas (%) ELN (%)

Tilapia 4.14 42.29 26.59 0.18 18.01 12.94

DS 0.37 1.80 0.90 0.01 0.26

Botete 7.02 80.31 0.72 0.05 17.87 1.06

DS 0.13 1.73 0.03 0.02 1.18

Congrio cornudo

3.18 48.72 1.49 0.00 40.72 9.08

DS 0.06 0.15 0.06 0.03 0.17

DS= Desviación estándar


Nitrógeno Total de ensilados Tipo de ensilado Día de Hidrólisis % Nitrógeno

Ensilado de Tilapia Día 0 6.30 ± 0.16

Día 3 5.99 ± 0.21

Día 6 6.22 ± 0.02

Día 11 6.17 ± 0.02

Día 14 6.13 ± 0.09

Día 18 6.82 ± 0.34

Día 23 6.16 ± 0.19

Día 28 6.12 ± 0.08

Día 35 6.90 ± 0.28

Ensilado de Botete Día 0 12.38 ± 0.00

Día 6 10.81 ± 0.07

Día 11 10.27 ± 1.34

Día 14 11.10 ± 0.01

Día 18 11.04 ± 0.04

Día 23 10.53 ± 0.10

Día 28 10.90 ± 0.00

Día 35 10.52 ± 0.11

Ensilado de congrio cornudo Día 0 10.98 ± 0.00

Día 6 6.99 ± 0.08

Día 11 6.99 ± 0.04

Día 14 7.53 ± 0.05

Día 18 7.53 ± 0.00

Día 23 7.88 ± 0.23

Día 28 7.22 ± 0.06

Día 35 7.67 ± 0.03

Nitrógeno Proteico de ensilados

Ensilado de Tilapia Día de Hidrólisis Proteína total (mg/g)

Día o 647.49

Día 3 503.06

Día 6 335.27

Día 11 341.35

Día 14 250.34


Día 18 326.84

Día 23 334.23

Día 28 322.21

Día 35 368.56

Ensilado de Botete Día 6 460.74

Día 11 404.38

Día 14 369.43

Día 28 353.02

Día 35 342.04

Ensilado de Congrio cornudo Día 6 343.75

Día 11 277.15

Día 14 300.82

Día 18 264.98

Día 23 273.76

Día 28 322.84

Día 35 350.19

Análisis bromatológico de pasta de Jatropha curcas no tóxica Humedad

(%) Proteína (%)


Fibra cruda (%)

Cenizas (%) ELN (%)

Pasta de Jatropha c.

4.51 29.90 49.66 4.93 5.57 9.94

DS 0.04 0.05 0.37 0.14 0.04

DS= Desviación estándar Modulo 2. Dr. Hervey Rodríguez González (USO DE MACROALGAS) Análisis químico de los ingredientes utilizados 1. Análisis químico de harina de pescado Los resultados de la composición química de las materias primas utilizadas en este estudio se presentan en la tabla 1. En este se puede observar que el valor de PC obtenido de la harina de pescado fue de 61.50 % el cual está dentro de los valores reportados y (9.20 %) de lípidos 2. Harina de Ulva lactuca El valor obtenido de PC obtenido en la harina de la macrolaga Ulva lactuca fue similar a la harina de trigo, con un 12.04 % . 3. Harina de Gracilaria parvispora El valor obtenido de PC obtenido en la harina de la macrolaga G. parvispora fue similar a la harina de trigo, con un 9.18 % . 4. Harina de trigo


El contenido de PC y de lípidos de la harina de trigo es bajo con un (14.79 y 2.14 %) respectivamente. El porcentaje obtenido de PC para este ingrediente fue el más bajo comparado con los otros ingredientes empleados. Estos porcentajes obtenidos están dentro del rango reportado para este cereal. 5. Pasta de soya El valor obtenido de PC obtenido en la pasta de soya fue alto, con un 56.3 % tomando en cuenta los reportes que indican que el promedio de PC de la soya es de (45 a 50 %). Tabla 1. Composición química de los insumos utilizados en las dietas *INGREDIENTE PROTEÍNA LÍPIDOS HUMEDAD FIBRA CENIZAS ELN Harina de pescado 61.50 9.20 6.84 0 24.92 4.43 Harina de Ulva lactuca. 12.04 0.02 11.19 2.06 41.74 44.14 Harina de G. parvispora 9.18 0.05 6.6 3.45 54.67 32.65 Pasta de soya 56.3 2.7 7 3.25 13.1 27.9 Harina de trigo 14.79 2.14 3 8.71 7.33 67.03 *Valores expresados en porcentaje Tabla 2. Análisis proximal de las dietas experimentales con inclusión de 5, 10 y 20% de harina de algas verde y rojas. CLAVE DE LA MUESTRA

HUMEDAD (%)

PROTEINA (%)

EXTRACTO ETEREO

FIBRA CRUDA (%)

CENIZAS (%)

ELN (%)

ENERGIA (cal/g)

D1 VERDE

9.89 ± 0.07 32.69 ± 0.27 4.98 ± 0.09

1.18 ± 0.08

10.65± 0.07

50.49 3957.83 ± 35.98

D1 ROJA 11.64 ± 0.16

32.49 ± 0.38 6.19 ± 0.08

0.60 ± 0.08

10.98 ± 0.10 49.74 4076.43 ± 9.00

D2 VERDE

10.71 ± 0.09

33.27 ± 0.26 4.6 ± 0.02 0.81 ± 0.09

13.39 ± 0.05 47.94 3854.87 ± 26.71

D2 ROJA 6.48 ± 0.22 33.23 ± 0.24 4.03 ± 0.09

0.67 ± 0.06

13.95 ± 0.09 48.12 3858.48 ± 26.97

D3 VERDE

9.54 ± 0.06

33.03 ± 0.17 2.40 ± 0.02

0.70 ± 0.06

18.05 ± 0.11 45.82 3457.71 ± 38.51

D3 ROJA 9.29 ± 0.29 32.2 ± 0.16 6.00 ± 0.08

1.01 ± 0.11

18.98 ± 0.09 41.82 3664.92 ± 21.29

CONTROL 8.95 ± 0.06 29.10 ± 0.15 6.18 ± 0.19

0.24 ± 0.06

9.55 ± 0.04 59.93 3933.67± 35.58

Tabla 3. Crecimiento de camarones blancos Litopenaeus vannamei. Primer bioensayo sobre la alimentación del camarón blanco Litopenaeus vannamei con diferentes dietas con harina de algas marinas (media ± desviación estándar). A1-‐A3 dietas con harina de Ulva lactuca, B1-‐B3 dietas que contienen harina de Gracilaria parvispora; dieta C, sin harina de algas marinas.


Dieta Peso inicial (g)

Peso final (g) *

Peso Ganado (g) TDC (% día) Sobrevivencia (%)

A1 Verde (5 %)

1.23 ± 0.10 10.21 ± 0.90ab

8.97 ± 0.84 3.06 ± 0.11 84

A2 Verde(10%)

1.24 ± 0.10 10.11 ± 1.68ab

9.11 ± 1.12 3.08 ± 0.14 88

A3 Verde(20%)

1.24 ± 0.10 10.24 ± 1.18ab

9.00 ± 1.01 3.06 ± 0.13 86

B1 Roja (5 %)

1.23 ± 0.11 9.02 ± 1.81a 7.97 ± 0.15 2.92 ± 0.16 89

B2 Roja (10 %)

1.23 ± 0.10 11.68 ± 1.68c 10.86 ± 1.80 3.29 ± 0.20 82

B3 Roja (20 %)

1.23 ± 0.11 9.38 ± 1.63a 8.22 ± 0.51 2.95 ± 0.21 85

Control 1.23 ± 0.11 10.77 ± 0.72bc

9.55 ± 0.47 3.14 ± 0.05 88

Los valores en la misma columna con diferentes superíndices son significativamente diferentes (P <0,05) TDC= 100 (En promedio de peso final-‐ peso promedio inicial) / número de días El aumento de peso (%) = (peso final-‐peso inicial) / peso inicial x 100 Supervivencia (%) = número final de camarones / gambas número inicial x 100 TDC, la tasa específica de crecimiento

En la tabla se muestran los resultados en el peso, al variar el porcentaje de inclusión de la macróalgas. Dietas formuladas con U. lactuca no presentaron diferencia significativa con el porcentaje de inclusión y la dieta control (p>0.05) Sin embargo, dietas con 10% de inclusión de G. Parvispora, presentan el mayor peso final de los organismos, sin presentar diferencia con la dieta control. Tabla 4. Análisis proximal de las dietas experimentales con inclusión de 5, 10 y 15% de harina de algas verde y rojas CLAVE DE LA MUESTRA

HUMEDAD (%)

PROTEINA (%)

EXTRACTEXTRACTO ETEREO

FIBRA CRUDA (%)

CENIZAS (%)

ELN (%)

ENERGIA (cal/g)

A1 VERDE

7.85 ± 0.05 36.88 ± 0.12 6.57 ± 0.23

2.00 ± 0.06

9.90 ± 0.04 44.65 3957.83 ± 35.98

B1 ROJA 8.26 ± 0.25 32.63 ± 0.20 6.11 ± 0.22

0.68 ± 0.02

9.37 ± 0.11 51.20 4076.43 ± 9.00

A2 VERDE

8.27 ± 0.07 34.14 ± 0.30 7.43 ± 0.03

2.01 ± 0.08

9.48 ± 0.12 46.94 3854.87 ± 26.71

B2 ROJA 8.11 ± 0.06 36.08 ± 0.24 6.07 ± 0.09

1.24 ± 0.08

12.82 ± 0.09 43.80 3858.48 ± 26.97

A3 VERDE

8.35 ± 0.47 34.02 ± 0.14 6.58 ± 0.12

0.96 ± 0.06

11.56 ± 0.09 46.87 3457.71 ± 38.51

B3 ROJA 8.34 ± 0.06 34.55 ± 0.26 6.38 ± 0.07

1.33 ± 0.06

13.99 ± 0.03 43.75 3664.92 ± 21.29

CONTROL 7.59 ± 0.14 36.73 ± 0.22 7.16 ± 0.03

0.67 ±0.02 8.12 ± 0.23 47.31 3933.67± 35.58


Tabla 5. Crecimiento. (Segundo bioensayo) datos sobre la alimentación del camarón blanco Litopenaeus vannamei con diferentes dietas con harina de algas marinas (media ± desviación estándar). A1-‐A3 dietas con harina de Ulva lactuca, B1-‐B3 dietas que contienen harina de Gracilaria parvispora; dieta C, sin harina de algas marinas y D alimento comercial. Muestra Peso inicial

(g) Peso final (g)*

Peso Ganado (g) TDC (% día)

Sobrevivencia (%)

A1 Verde 5%

1.11 ± 0.029 11.92 ± 0.380 10.81 ± 1.61 1.333760±0.0002 88

A2 Verde 10%

1.10 ± 0.027 11.05 ± 0.290 9.95 ± 1.23 1.333926±0.0001 86

A3 Verde 15%

1.10 ± 0.031 11.68 ± 0.588 10.58 ± 2.78 1.307671±0.0265 89

B1 Roja 5% 1.10 ± 0.031 11.44 ± 0.297 10.34 ± 1.26 1.333888±0.0002 84 B2Roja10% 1.10 ± 0.031 12.11 ± 0.373 11.01± 1.57 1.332282±0.0014 86 B3Roja15% 1.10 ± 0.031 11.22 ± 0.448 10.12 ± 2.0 1.314894±0.018 88 C 1.08 ± 0.033 12.11 ± 0.335 11.03 ± 1.42 1.33333±0.018 89 D 1.11 ± 0.035 12.35 ± 0.356 11.24 ± 1.52 1.352223± 86 Los valores en la misma columna con diferentes superíndices son significativamente diferentes (P <0,05) TDC = 100 (Promedio de peso final-‐ peso promedio inicial) / número de días. El aumento de peso (%) = (peso final-‐peso inicial) / peso inicial x 100. Supervivencia (%) = número final de camarones / número inicial de camarones x 100. TDC, la tasa específica de crecimiento En la tabla se muestran los resultados en el peso, al variar el porcentaje de inclusión de la macróalgas. Dietas formuladas con U. lactuca no presentaron diferencia significativa con el porcentaje de inclusión y la dieta control (p>0.05) Sin embargo, dietas con 10% de inclusión de G. Parvispora, presentan el mayor peso final de los organismos, sin presentar diferencia con la dieta control(C) y la dieta comercial (D). Parámetros físicoquímicos Temperatura Los resultados muestran que durante los primeros días del experimento (inició el 08 de junio de 2011), la temperatura se mantuvo en 30°C ± 2°C. El 27 de julio, el valor de la temperatura disminuyó(por el aire acondicionado en el area) hasta 25°C. En los últimos 24 días la temperatura alcanzó los valores más altos, siendo 30,31 y 32°C.

Promedio 29.1955 Máxima 32.3 Minina 25.2 Des est. 1.41244637

Oxígeno disuelto El oxígeno disuelto muestra que al día 12 del bioensayo el oxígeno disuelto tuvo un valor de 7.18 ± 0.30 mg/l. Para el día 40, el valor tuvo un ligero incremento 7.36 ± 0.40 mg/l. Al


final del bioensayo el valor del oxígeno disuelto disminuyó a 7.04 ± 0.41 mg/l siendo este el valor más bajo del periodo experimental.

Modulo 3. Dr. Antonio Luna González (USO DE FERMENTADOS)

Aislamiento de bacterias ácido lácticas (BAL) Se lograron obtener 29 aislados presuntivos de BAL, seis de los cuales fueron aislados de L. stylirostris y 23 de L. vannamei. Los aislados fueron almacenados a -‐80 °C. Para nombrarlas se les asignó una nomenclatura que atiende al tipo de bacteria (presuntivamente BAL), organismo del cual se aisló, órgano de extracción, y número de secuencia del orden en el que fueron aisladas. De acuerdo a la nomenclatura asignada, los aislados del intestino de L. stylirostris fueron nombrados sucesivamente de BALLsI1 a BALLsI6. Los aislados de intestino de L. vannamei fueron nombrados sucesivamente de BALLvI1 a BALLvI13 y los aislado de hepatopáncreas de L. vannamei fueron nombrados sucesivamente de BALLvHp1 a BALLvHp10. Caracterización de los aislados bacterianos Prueba de hemólisis con sangre humana De los 29 aislados de BAL presuntivas, 6 presentaron hemólisis gamma (γ) y 23 hemólisis beta (β) en agar sangre (Tabla 1). Los aislados que presentaron actividad hemolítica (β) fueron desechados, por el riesgo que conlleva su capacidad para lisar eritrocitos humanos. Cuadro 1. Aislados presuntivos de BAL del intestino y hepatopáncreas de L. vannamei y L. stylirostris. Prueba de hemólisis en sangre de humano (HSH).

Cinética de crecimiento y conteo de BAL presuntivas La figura 1 muestra los resultados de la cinética de crecimiento de los 6 aislados γ-‐hemolíticos. La mayoría de los aislados presentaron una fase de aclimatación de 6 a 9 h, a

Aislado HSH

Aislado HSH Aislado HSH

BALLsI1 β BALLvI5 Β BALLvHp2 γ BALLsI2 γ BALLvI6 Β BALLvHp3 β BALLsI3 β BALLvI7 Β BALLvHp4 β BALLsI4 γ BALLvI8 Β BALLvHp5 γ BALLsI5 γ BALLvI9 Β BALLvHp6 β BALLsI6 γ BALLvI10 Β BALLvHp7 β BALLvI1 β BALLvI11 Β BALLvHp8 β BALLvI2 β BALLvI12 Β BALLvHp9 β BALLvI3 β BALLvI13 Β BALLvHp10 β BALLvI4 β BALLvHp1 Β


excepción del aislado BALLsI4, cuya fase de aclimatación se extendió hasta las 12 h. La fase exponencial de los aislados inició en tres tiempos: 6 h (aislado BALLsI5), 9 h (aislados BALLsI2, BALLsI6, BALLvHp2 y BALLvHp5) y 12 h (BALLsI4). En el Cuadro 2 se muestran las UFC/mL para cada aislado, los valores obtenidos oscilaron entre 2.315 x 109 y 6.020 x 109 UFC/mL. Cuadro 2. Aislados presuntivos de BAL del intestino de L. stylirostris y hepatopáncreas de L. vannamei. Conteo de UFC/mL de cada uno de los aislados. La densidad óptica fue igual a uno.

Aislado UFC/mL BALLvHp2 2.645 x 109 BALLvHp5 2.315 x 109 BALLsI2 5.680 x 109 BALLsI4 4.825 x 109 BALLsI5 6.020 x 109 BALLsI6 3.015 x 109

Modulo 4. Dr. José Luis Montañez (USO DE SUBPRODUCTOS AGRÍCOLAS) El análisis químico porcentual de la sangre de bovino y del suero lácteo en fresco arrojó los siguientes datos (Tabla 1).

Tabla 1: Análisis químico porcentual de la sangre de bovino y del lactosuero Constituyente

Sangre de bovino % base húmeda

Lactosuero % base húmeda

Humedad 81.50±0.50 93.40±1.0 Cenizas 1.30±0.10 0.50±0.05 Grasas 0.30±0.05 0.50±0.02 Proteínas 16.40±0.10 0.90±0.02 Carbohidratos Totales 0.50±0.05 4.70±0.10 Sólidos totales 18.50±0.50 6.60±0.10 De acuerdo con información reportada por SAGARPA, en el año 2010 se sacrificaron en nuestro país 26 millones de cabezas de ganado de las cuales, poco más de 7.5 millones correspondieron a ganado bovino. Puesto que de cada bovino sacrificado es posible obtener de 10 a 12 L de sangre, ello significa que sería posible recuperar hasta 90 millones de litros, o alrededor de 90,000 toneladas de sangre, que de acuerdo a su composición media, ello significa que sería posible recuperar alrededor de 14,760 toneladas de proteínas que de otra forma, van a parar a los drenajes causando la contaminación de ríos y lagos.


Así mismo, si consideramos que anualmente se producen en nuestro país cerca de 1 millón de toneladas de lactosuero, de acuerdo con su composición, esto significa que sería posible la recuperación de 45,000 toneladas de lactosa y 9,000 toneladas de proteína que actualmente no se recuperan y se vierten a los drenajes que finalmente van a parar a ríos y lagos, causando su contaminación. Los rendimientos obtenidos en la obtención de harinas de sangre de bovino y de suero lácteo fueron: A partir de 100 kilogramos de sangre procesada se obtuvieron 22.5 kg de harina, mientras que a partir de 1000 litros de suero lácteo procesado fue posible obtener 12.5 kg de harina. Este bajo rendimiento en la obtención de proteínas del lactosuero obedece al bajo contenido de las mismas en el suero fresco y a que durante el proceso de precipitación, filtración y secado, se elimina la mayor cantidad de sólidos solubles presentes en el suero como lo es la lactosa. En la tabla 2 se presenta el análisis químico porcentual de las harinas obtenidas, incluyéndose también la harina de soya.

Tabla 2: Análisis químico porcentual de los concentrados proteicos

Componente Harina de suero lácteo

Harina de soya

Harina de sangre de bovino

Humedad (%) 5.8 ± 0.1 5.6 ± 0.1 5.5 ± 0.1 Cenizas (%) 3.5 ± 0.1 5.2 ± 0.1 6.5 ± 0.2 Grasas (%) 7.3 ± 0.1 0.8 ± 0.05 1.8 ± 0.1

Proteínas (%) 76.9 ± 0.5 88.3 ± 0.8 83.5 ± 0.5 Carbohidratos (%) 6.5 ± 0.2 0.1 ± 0.01 2.7 ± 0.1

El bajo contenido de humedad (de 5.5-‐5.8%) en las diferentes harinas evita su deterioro y favorece la conservación de las mismas. El contenido de cenizas en la harina de sangre de bovino fue mayor al de las otras harinas, debido a que la sangre fue procesada íntegramente y no fraccionada como en los otros casos. Por otro lado, el contenido de carbohidratos en el concentrado proteico de suero lácteo fue mayor al que contienen las otras harinas. Finalmente el contenido proteico en las diferentes harinas está muy por arriba del valor mínimo que menciona la NMX-‐Y-‐013-‐1998-‐SCFI, la cual especifica que las harinas utilizadas como fuente proteica en la formulación de dietas para la actividad acuícola, deberá contener un mínimo de 62% de proteína cruda. En la tabla 3 se presenta el perfil de aminoácidos que integran los diferentes concentrados proteicos, y se comparan con los requerimientos de aminoácidos esenciales recomendados por la FAO (2004) para el cultivo de camarón. Considerando un nivel de inclusión del 55% de proteínas en la dieta del camarón blanco, en la tabla anterior podemos observar que la arginina constituye el aminoácido limitante del concentrado proteico obtenido del suero lácteo, mientras que la metionina es un aminoácido limitante tanto de las proteínas de soya como del concentrado proteico de sangre de bovino, concentrado proteico este ultimo en el que los aminoácidos cistina e isoleucina también


se presentan como aminoácidos limitantes. Es importante hacer notar que mediante la combinación de los concentrados proteicos estudiados, es posible elaborar dietas que satisfagan los requerimientos de aminoácidos esenciales por el camarón blanco.

Tabla 3: Contenido de aminoácidos en las diferentes harinas (g/100g de proteína)

Aminoácido Requerimiento*

al 55% de proteína Proteínas de Suero lácteo

Proteínas de soya

Harina de Sangre

Alanina -‐-‐-‐-‐-‐ 5.20 ± 0.08 4.30 ± 0.08 5.49 ± 0.07 Arginina 2.98 2.50 ± 0.04 7.90 ± 0.24 4.10 ± 0.08

Ácido aspártico -‐-‐-‐-‐-‐ 10.90 ± 0.08 11.73 ± 0.19 10.10 ± 0.08 Cistina-‐Cisteína 0.52 2.40 ± 0.04 1.30 ± 0.08 0.69 ± 0.03 Acido glutámico -‐-‐-‐-‐-‐ 18.8 ± 0.08 19.50 ± 0.33 13.05 ± 0.04

Glicina -‐-‐-‐-‐-‐ 1.77 ± 0.05 4.20 ± 0.08 4.60 ± 0.04 Prolina -‐-‐-‐-‐-‐ 6.20 ± 0.08 5.30 ± 0.16 3.55 ± 0.04 Serina -‐-‐-‐-‐-‐ 4.90 ± 0.06 5.33 ± 0.12 5.40 ± 0.04 Tirosina 1.50 3.00 ± 0.03 3.83 ± 0.29 3.19 ± 0.03 Histidina 0.85 1.70 ± 0.02 2.70 ± 0.08 5.60 ± 0.09 Isoleucina 1.31 6.08 ± 0.04 4.73 ± 0.12 1.00 ± 0.06 Leucina 2.69 10.90 ± 0.08 8.30 ± 0.08 12.11 ± 0.24 Lisina 2.83 9.30 ± 0.07 6.30 ± 0.08 9.03 ± 0.15

Metionina 1.04 3.75 ± 0.04 1.30 ± 0.08 1.25 ± 0.04 Fenilalanina 1.48 3.05 ± 0.04 5.20 ± 0.16 6.71 ± 0.23 Treonina 1.85 6.75 ± 0.06 3.77 ± 0.05 4.60 ± 0.08 Triptófano 0.52 1.65 ± 0.02 1.30 ± 0.08 1.30 ± 0.08 Valina 1.64 6.25 ± 0.04 4.87 ± 0.12 8.53 ± 0.12

* FAO (2004) CONCLUSIONES PRELIMINARES

• El ensilado de botete presentó una apariencia física acuosa, además tuvo altos niveles de proteína; sin embargo el botete no es propio para ser utilizado en esta técnica ya que no es manipulable debido a que no se degradaron las pieles y espinas.

• El ensilado de lengua presentó altos niveles de ceniza; lo cual no es apto para la alimentación de peces ya que interfiere negativamente en la palatabilidad. Y al igual que el ensilado de botete no es manipulable por tener consistencia acuosa. Por otro lado su rendimiento después del proceso de secado es bajo (25 %) comparado con el de tilapia.

• El ensilado de tilapia tuvo un mejor rendimiento (50%) después de proceso de secado. En cuanto a su contenido nutricional es apto para la alimentación de camarón con la excepción de los lípidos por su alto contenido, por lo que se sugiere un proceso de filtrado en malla antes de secarlo el cual le redujo los lípidos


en un 27.5 %, además puede ser mezclado con otra harina que disminuyan aún mas estos.

• El nitrógeno total en los 3 ensilados se mantuvo, mientras que el nitrógeno proteico tuvo variaciones. En el caso del ensilado de tilapia el nitrógeno proteico decayó del día 0 al día 7(correspondiente al día en que se ajusto el pH) y posteriormente se mantuvo. En el ensilado de botete el nitrógeno proteico decayó del día 6 al día 14 (correspondiente al día en que se ajusto el pH) y posteriormente se mantuvo y en el ensilado de congrio cornudo decayó la proteína total del día 6 al día 25 (correspondiente al día en que se ajustó el pH) teniendo un aumento de proteína el día 14 y posteriormente los días 30 y 35, situación que se atribuye al hecho no haber tomado la muestra adecuadamente, esto debido a la naturaleza que tomo el ensilado de congrio cornudo al igual el de botete, como lo es separación de espinas y pieles los cuales son componentes proteicos.

• La semilla de Jatropha curcas es una fuente atractiva de proteína debido a que después del proceso de la extracción de biocombustible resta una mayor proporción de pasta (60 %) comparada con los lípidos extraídos, además resultó ser una pasta rica en proteínas, y ácidos grasos, particularmente homogénea, lo que permite sea fácil de incorporarse a otros ingredientes en la formulación de alimentos.

• Combinando los concentrados proteicos de lactosuero, soya y sangre de bovino, se puede diseñar dietas que satisfagan los requerimientos de aminoácidos esenciales del camarón blanco (Litopenaeus vannamei).

• Los grandes volúmenes de lactosuero y de sangre de bovino que se generan diariamente en nuestro país, pueden aprovecharse en la elaboración de concentrados proteicos que pueden emplearse en la elaboración de dietas para la alimentación del camarón blanco (L. vannamei).

• Es posible sustituir la harina de pescado en la elaboración de dietas para la alimentación del camarón blanco (L. vannamei), mediante el uso combinado de concentrados proteicos de soya, suero lácteo y sangre de bovino.

• La elaboración de concentrados proteicos del lactosuero y de la sangre de bovino, daría un plus a la industria quesera y la industria cárnica del país, y lo más importante, evitaría con ello el derrame de dichos fluidos a los drenajes, ríos y lagos, causando la contaminación de los mismos.

informe parcial proyecto multidisciplinario en extenso sip2011

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