informe del ensayo interlaboratorios para fangos...

Asociación Científica Grupo Bioindación Sevilla

Con el patrocinio de: Izasa, Emasesa, Tecnología del Agua y Surcis.

INFORME DEL ENSAYO INTERLABORATORIOS PARA

FANGOS ACTIVOS (Mayo 2006)

ÍNDICE

1. Introducción

2. Participantes

3. Resultados

4. Análisis de datos

Caracterización macroscópica y microscópica del fango activado (IF)

Identificación y cuantificación de bacterias filamentosas

Caracterización de la microfauna

Otros parámetros de interés

5. Conclusiones

• Generales

• Valoración de la muestra

6. Consideraciones para los próximos ejercicios interlaboratorios

7. Agradecimientos

8. Bibliografía

Anexo I: Reportaje fotográfico (se adjunta en un documento aparte)

Anexo II: Estudio respirométrico de la muestra (se adjunta en un documento aparte)

INFORME "EJERCICIO INTERLABORATORIOS DE 24 DE Mayo de 2006" 1

1. INTRODUCCIÓN

Con el objetivo de unificar criterios en los análisis de tipo microbiológico de fangos activos ("evaluación del fango: características macro- y microscópicas" y "evaluación de la microfauna: filamentos y protozoos"), GBS organiza ejercicios interlaboratorios con muestras de distintas características. Estos ensayos ofrecen la oportunidad al laboratorio participante de comparar sus resultados con aquellos aportados por el resto, posibilitándole conocer su desempeño técnico y detectar posibles errores sistemáticos.

El ejercicio del día 24 de mayo de 2006 se realizó sobre una muestra puntual de Fango Activo, distribuida desde la sede de GBS (EDAR Ranilla), junto con los formatos de remisión de resultados. La toma de muestras se efectuó el día 23 de febrero a las 7.30h a.m., siendo los participantes convocados a realizar el análisis el día 24, a fin de evitar diferencias entre los que reciben la muestra antes respecto a los que lo hacen después.

Conjuntamente, se adjuntó muestra de una suspensión biológica procedente de un sistema de depuración fuera de servicio, en el que la influencia mareal, por la cercanía a la costa de las instalaciones, era muy acusada. En este caso, el formato de datos a cumplimentar se simplificó, pues se trataba de realizar un ejercicio de identificación de estructuras de resistencia, micrometazoos, amebas testáceas y “otras observaciones” poco frecuentes en un fango activo.

De la misma forma que en el ejercicio anterior, la muestra de fango activo repartida en el ejercicio fue estudiada de forma respirométrica por la empresa Surcis, S.L., cuyo informe adjuntamos en anexo aparte (Anexo II). Por nuestra parte, entendemos que muchos de los aspectos aquí recogidos son complementados y en ocasiones confirmados por los resultados extraídos con este método indirecto de evaluación de la biomasa, la respirometría. La elaboración del presente informe, se ha realizado sin conocimiento de los datos técnicos del estudio respirométrico.


2. PARTICIPANTES

Durante este ejercicio, el total de participantes ha sido de 21, de los cuales el 60%, aproximadamente, trabajaba por primera vez con esta metodología de análisis. El otro 40% había trabajado con anterioridad con las hojas de trabajo y tan sólo un 10% puede considerarse "experto" respecto al uso de esta metodología.

En la Tabla 1 se recogen los plazos de tiempo transcurridos entre la toma de muestras y el análisis en el caso de cada participante.

Tabla 1. Días transcurridos entre el análisis de la muestra y su toma.

P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 P11 P12 P13 P14 P15 P16 P17 P19 P20 P21 P261 1 1 1 1 1 1 1 1 - 2 1 1 2 2 2 1 1 1 1 1

Pi= Participante 1-26

3. RESULTADOS

Los resultados más relevantes del análisis microscópico de la muestra, para cada uno de los participantes, se recogen en la Tabla 2.

Se advierte a los participantes que los cuadros-resumen aquí recogidos presentan modificaciones respecto a los adelantados por correo electrónico. En algunos casos, los participantes ratificaron o aportaron la información ausente solicitada. En otras ocasiones, los datos han debido de quedar como ausentes o sin ratificar por falta de respuesta, señalándose en rojo en este último caso.

Sería conveniente llamar la atención de los participantes sobre la Clase Madoni, que en algunos casos ha debido de ser modificada por nuestra parte, al haber sido establecida de forma errónea. Este aspecto se trató en el informe de la muestra pasada, por lo que se recomienda la lectura del documento entregado.

Con relación al valor del índice de Shannon-Weaver ha debido de ser calculado en frecuentes ocasiones por GBS, cuando ha sido posible, para evitar perder esta información y dejar de incluirla en el presente informe. De la misma forma, las densidades de población parciales y por especies han tenido que ser calculadas en algunos casos para poder ser analizadas en el presente informe.

En cualquier caso, se informa a los participantes que, una vez conocida la sistemática de trabajo, esta información habrá de ser aportada de forma personal en próximos ejercicios. De lo contrario, se entenderá que se trata de información omitida por el participante.


Tabla 2 (I). Resultados aportados por los participantes 1-10.


Tabla 2 (II). Resultados aportados por los participantes 11-17 y 19-21.


Tabla 2 (III). Resultados aportados por el participante 26.

4. ANÁLISIS DE DATOS

En este apartado se realizará un análisis estadístico de los valores obtenidos en cada uno de los puntos en los que está dividido el análisis de fangos activos. Los parámetros estadísticos seleccionados son:

El cálculo de la media nos informa sobre el valor más probable de la variable a estudiar. Es afectada fuertemente por los valores extremos de la población.

La desviación estándar muestra como de agrupados o dispersos se encuentran los valores. Si la varianza tiende a cero, quiere decir que la dispersión de los datos es muy baja y se encuentran concentrados en torno a la media.

Dada la dispersión natural de los datos biológicos, y más aún de este tipo de análisis que no presentan capacidad de contraste con un patrón, hemos preferido realizar una invalidación de medidas que se ha determinado mediante el test de la Q de Dixon. Dicho test tiene en cuenta la diferencia de los valores máximos y mínimos respecto a la media, inhabilitando aquéllos que superen el valor preestablecido para este estimador.


CARACTERIZACIÓN MACRO- Y MICROSCÓPICA DEL FANGO ACTIVO

En los resultados que se muestran a continuación se resaltan en color anaranjado aquellos datos que, sin ser excluídos por el Test de la Q de Dixon, se alejaron de la tendencia extraída del total de datos. Se resaltan en color amarillo los datos rechazados por el test de invalidación.

- MACROSCOPÍA

En la Figura 1 se recogen los valores puntuados por el total de participantes para las características macroscópicas de la muestra. Se resalta el valor aportado por el participante 26, el cual fue invalidado por el test de la Q de Dixon.

La inestabilidad de la muestra, propia de un fango activo joven que evoluciona rápidamente en sus características macroscópicas, es la causa principal de la dispersión de los datos.

CARACTERÍSTICAS MACROSCÓPICAS

0

5

10

15

20

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 19 20 21 26

participante

MACROSCOPÍA MEDIA

Figura 1. Características macroscópicas de la muestra para cada uno de los participantes, así comola media y varianza calculadas. Descartado el dato del participante 26 según el test de la Q deDixon.

1 13,52 123 13,54 195 13,56 97 98 99 12

10 1211 13,512 913 1214 915 13,516 16,517 919 16,520 921 16,526 25,5

MEDIA 13,0VARIANZA 4,2

INTERV CONF

PARTICIP DESCARTADO 26MEDIA CORREG 12,4VAR CORREG 3,1

MACROSCOPÍA


En la Tabla 3 se representan las categorías seleccionadas para cada uno de los parámetros que definen la macroscopía de la muestra, resaltándose las menos frecuentes. Es decir, turbidez “baja”, flóculos en suspensión “bajo” y sedimentabilidad “media”.

Tabla 3. Características macroscópicas de la muestra (turbidez, flóculos en suspensión,sedimentabilidad y olor) para cada uno de los participantes. Se resaltan en naranja las categorías menosfrecuentes.

PARTICIPANTE TURBIDEZ FLÓCULOS EN SUSP. SEDIMENTABILIDAD OLOR1 Alta Medio Alta Incorrecto2 Alta Alta Alta Correcto3 Alta Medio Alta Incorrecto4 Baja Medio Media Correcto5 Media Alta Alta Incorrecto6 Alta Alta Alta Incorrecto7 Alta Alta Alta Incorrecto8 Alta Alta Alta Incorrecto9 Media Medio Media Correcto10 Alta Medio Media Correcto11 Alta Medio Alta Incorrecto12 Alta Alta Alta Incorrecto13 Alta Alta Alta Correcto14 Alta Alta Alta Incorrecto15 Alta Medio Alta Incorrecto16 Alta Medio Alta Correcto17 Alta Alta Alta Incorrecto19 Alta Medio Alta Correcto20 Alta Alta Alta Incorrecto21 Media Medio Alta Correcto26 Media Baja Alta Correcto

REPARTO PORCENTUAL DE LAS CARACTERÍSTICAS MACROSCÓPICAS.


- MICROSCOPÍA

En la Figura 2 se representan las puntuaciones relativas a las características microscópicas. Al igual que para las características microscópicas, la inestabilidad de la muestra es la causa principal de la dispersión de los datos.

En la Tabla 4 están desglosadas las características microscópicas de cada uno de los participantes, resaltándose aquellas categorías menos frecuentes: forma “regular”, tamaño “pequeño”, estructura “compacta”, cobertura “<10%”, filamentos en flóculo “>20 filamentos/flóculo” y diversidad de protozoos “>7 sp”.

Figura 2. Características microscópicas de la muestra para cada uno de los participantes, así como lamedia y varianza calculadas. Ningún participante descartado.

CARACTERÍSTICAS MICROSCÓPICAS

0

10

20

30

40

50

60

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 19 20 21 26

participantes

MICROSCOPÍA MEDIA

1 412 413 474 345 326 347 378 479 33

10 3311 2812 5113 1414 4115 4116 4217 6019 2120 3221 2826 23


MICROSCOPÍA


Tabla 4. Características microscópicas de la muestra (forma, tamaño, estructura, textura y cobertura flocular,filamentos en flóculos y en disolución, diversidad de especies) para cada uno de los participantes. Se resaltan enamarillo las categorías menos frecuentes.

PARTICIPANTE FORMA TAMAÑO ESTRUCTURA TEXTURA COBERTURA FIL EN FLÓC. FIL EN DIS. DIV PROTOZ1 Irregular Medio Media Fuerte 10-50% 5-20 fil./flóc. Alta 4-7 sp.2 Irregular Medio Media Fuerte 10-50% 5-20 fil./flóc. Alta 4-7 sp.3 Irregular Medio Media Débil 10-50% < 5 fil./flóc. Baja 4-7 sp.4 Irregular Pequeño Abierta Débil 10-50% 5-20 fil./flóc. Baja 4-7 sp.5 Irregular Pequeño Abierta Fuerte 10-50% < 5 fil./flóc. Alta 4-7 sp.6 Irregular Medio Media Fuerte 10-50% 5-20 fil./flóc. Alta < 4 sp.7 Regular Medio Media Débil 10-50% 5-20 fil./flóc. Baja < 4 sp.8 Irregular Medio Media Fuerte 10-50% 5-20 fil./flóc. Alta > 7 sp.9 Irregular Medio Abierta Débil 10-50% 5-20 fil./flóc. Alta < 4 sp.10 Irregular Medio Media Débil 10-50% > 20 fil./flóc. Baja 4-7 sp.11 Irregular Medio Abierta Débil 10-50% 5-20 fil./flóc. Alta 4-7 sp.12 Irregular Medio Media Fuerte 10-50% < 5 fil./flóc. Baja 4-7 sp.13 Irregular Pequeño Abierta Fuerte < 10% 5-20 fil./flóc. Baja < 4 sp.14 Irregular Medio Media Fuerte 10-50% 5-20 fil./flóc. Alta 4-7 sp.15 Regular Pequeño Media Fuerte 10-50% < 5 fil./flóc. Baja < 4 sp.16 Irregular Medio Compacta Débil 10-50% 5-20 fil./flóc. Baja < 4 sp.17 Irregular Medio Compacta Fuerte 10-50% < 5 fil./flóc. Baja 4-7 sp.19 Irregular Medio Abierta Débil < 10% 5-20 fil./flóc. Alta 4-7 sp.20 Irregular Medio Abierta Fuerte 10-50% 5-20 fil./flóc. Alta 4-7 sp.21 Irregular Medio Abierta Débil 10-50% 5-20 fil./flóc. Alta 4-7 sp.26 Irregular Medio Media Débil < 10% 5-20 fil./flóc. Alta < 4 sp.


- ÍNDICE DE FANGO

En la Figura 3 se representa el IF de cada uno de los participantes. El test de la Q de Dixon indica la invalidación del dato aportado por el participante 13, englobado en la categoría “malo”.

La media extraída del total es de aproximadamente 48 sobre 100, lo que indica un IF de calidad “regular”.

CATEGORÍA IF

80%

15%5%

RegularBuenoMalo

ÍNDICE DE FANGO (IF)

0

20

40

60

80

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 19 20 21 26participante

ÍNDICE DE FANGO ( IF) MEDIA

Figura 3. IF (sumatorio de las características macro- y microscópicas) para cada uno de losparticipantes, así como la media y varianza calculadas. Descartado el participante 13.

CATEGORÍA1 54,5 Regular2 53 Regular3 60,5 Bueno4 53 Regular5 45,5 Regular6 43 Regular7 46 Regular8 56 Regular9 45 Regular10 45 Regular11 41,5 Regular12 60 Bueno13 26 Malo14 50 Regular15 54,5 Regular16 58,5 Regular17 69 Bueno19 37,5 Malo20 41 Regular21 44,5 Regular26 48,5 Regular


INTERV CONF

PARTICIP DESCARTADO 13MEDIA CORREG 47,9VAR CORREG 7,99

ÍNDICE DE FANGO ( IF)


IDENTIFICACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE BACTERIAS FILAMENTOSAS

- ABUNDANCIA DE BACTERIAS FILAMENTOSAS IDENTIFICADAS: CATEGORÍA NUMÉRICA Y OTROS MÉTODOS PROPUESTOS.

En la Figura 4 se recoge la presencia de bacterias filamentosas en función a una técnica "cualitativa" que permite establecer un criterio subjetivo de abundancia para la densidad total de microorganismos filamentosos en una muestra.

En el caso de aquellos participantes que adoptaron la categoría intermedia "entre 3 y 4", se ha definido una categoría numérica de "3,5" por simplificación a la hora de calcular la media y varianza y evitar la invalidación de dichos datos.

Dado que el valor medio calculado para la categoría numérica de bacterias filamentosas es de 3,1, la categoría finalmente adoptada debe ser la situación intermedia entre las categorías 3 y 4, aunque más próxima a esta primera ("filamentos en todos los flóculos, de 1-5 filamentos/flóculo"). Este resultado se encuentra en concordancia con un valor medio del IVF de 135 mL/g, propio de un bulking ligero (Wanner, 1997).

ABUNDANCIA FILAMENTOS (CATEGORÍA)

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 19 20 21 26

participante

CATEGORÍA BACTERIANA MEDIA

Figura 4. Abundancia de bacterias filamentosas (categoría numérica) para cada uno de losparticipantes, así como la media y varianza calculadas. Ningún participante descartado.

1 4,02 4,03 2,04 3,05 3,06 4,07 3,08 3,59 3,0

10 4,011 2,012 2,013 4,014 4,015 1,016 3,017 3,019 3,520 3,521 3,526 3,0


CATEGORÍA BACTERIANA


Decantabilidad de un fango activado de acuerdo con su IVF (Wanner, 1997)

Tipo de fango IVF (mL/g) Buena decantabilidad < 100

Ligero 100-200 Bulking > 200

Recordamos a los participantes que, la categoría seleccionada en el IF en su apartado de microscopía "filamentos en flóculo", siempre deberá mostrarse acorde con la seleccionada en el apartado destinado a filamentos, apartado que nos ocupa, en la segunda hoja de trabajo.

A continuación, en las Tablas 5 y 6, se recogen los resultados referentes a "otros procedimientos de cuantificación de organismos filamentosos". La mayoría de participantes que aportó este dato, empleó la técnica basada en el cálculo de los "m/mL filamentos" (13 participantes) y el resto empleó la técnica de "cortes con la diagonal" (7 participantes).

Con relación a esta primera técnica de cuantificación de filamentos, aunque los datos indican que la dispersión es importante, informamos de que ésta ha descendido notablemente respecto al ejercicio anterior. Se han resaltado los datos aportados por los participantes 15 y 16, los que por su alejamiento de la media y

Tabla 5. Cuantificación de los filamentos de la muestra como "m/mL filamentos".

RECUENTO FILAMENTOS (m/mL filamentos)

0100200300400500600700800

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 19 20 21 26

RECUENTO FILAMENTOS (m/mL filamentos) Media

1 340,482 -3 222,724 788,85 2516 491,87 -8 102,89 -

10 -11 -12 334,113 148,514 64,9615 46,216 37117 213,4419 584,6420 -21 -26 -


RECUENTO FILAMENTOS (m/mL filamentos)


teniendo en cuenta la presencia de filamentos en la presenta muestra, entendemos que se han apartado más de la tendencia general.

En cuanto a la segunda técnica, el participante que aportó el dato más disperso fue el 9 (Tabla 6). Si se aplicase el test de invalidación de la Q de Dixon, este dato sería suprimido. Sin embargo, por la escasez de resultados, no pueden extraerse conclusiones sobre los datos aportados por este método de recuento de filamentos.

Algunos de los aspectos que pueden revisarse con relación a esta técnica son: valorar si es necesario diluir la muestra, cuestión ésta que habrá de ser tenida en cuenta en el valor final determinado; tener en cuenta que un mismo filamento puede interceptar varias veces con la diagonal y, por último, no utilizar este sistema para el caso de muestras en las que Nocardia sp. esté presente.

Atendiendo a la dispersión de los datos observada por ambos métodos, proponemos un estudio específico para aclarar esta cuestión, a realizar durante el circuito interlaboratorios del año próximo. La distribución de muestras para el recuento de filamentos se realizará de forma conjunta a la muestra principal del ejercicio y es necesaria la colaboración de todos los participantes.

Tabla 6. Cuantificación de los filamentos de la muestra como "cortes con la diagonal".

1 -2 0,563 1,884 -5 3,376 -7 -8 -9 14,5

10 -11 -12 -13 -14 -15 -16 0,37517 0,9719 -20 -21 0,8726 -


RECUENTO FILAMENTOS (CORTES DIAGONAL)

RECUENTO FILAMENTOS (corte diagonal)

0

2

4

6

8

10

12

14

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 19 20 21 26

RECUENTO FILAMENTOS (CORTES DIAGONAL) Media


IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS FILAMENTOSAS

En este apartado quedan recogidas las identificaciones realizadas por los analistas, referidas a los filamentos “dominante”, “secundario” y “otros filamentos” (Tabla 7).

En la Tabla 8 se resume el total de especies identificadas por los participantes. Por tratarse de un aspecto del análisis relacionado con la experiencia del analista, no se ha aplicado test de invalidación. El número medio de especies observadas fue de 6.

Tabla 7. Filamentos dominante, secundario y "otros filamentos". Especies totales identificadas porcada participante.

1 62 83 74 35 46 47 28 59 610 511 812 613 714 315 416 517 319 820 421 826 10

MEDIA 6 VARIANZA 2,14

Nº TOTAL DE SP BACT. DETERMINADAS

NÚMERO TOTAL SP BACTERIANAS

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 19 20 21 26

participantes

nº total sp. media

PARTICIPANTE F.DOMINANTE F. SECUNDARIO OTROS FILAMENTOS1 Tipo 1863 Sphaerotilus natans Thiotrhix II, Beggiatoa sp., H. hydrossis y NALO2 Tipo 1863 y Tipo 0411 Tipo 1701, Beggiatoa sp., Flexibacter sp. N. limicola, S. natans, H. hydrossis3 Sphaerotilus natans Tipo 1863 T 021N, Streptococcus sp., T 1701, Nocardia sp., N. limicola I4 Tipo 1863 Sphaerotilus natans Thiothrix sp.5 Tipo 021N Microthrix parvicella Thiothrix I6 Tipo 1863 Beggiatoa sp. H. hydrossis, Nocardia sp.7 Sphaerotilus natans Microthrix parvicella -8 Thiothrix sp. Sphaerotilus natans / Tipo 1863 Tipo 1701, Streptococcus sp., Nocardia sp.9 S. natans, Thiothrix II Tipo 1701 y Tipo 1863 H. hydrossis, N.limicola I

10 Tipo 021N Streptococcus sp. Nocardia sp., H. hydrossis, M. parvicella11 Sphaerotilus natans Thiothrix sp. Nocardia sp., T 1852, Nostocoida limicola12 Sphaerotilus natans Thiothrix II Tipo1701, Tipo 1863 y Cianofíceas13 Nostocoida limicola I y II Tipo 1863, Sphaerotilus natans Nocardia sp., Beggiatoa sp., H. hydrossis14 Sphaerotilus natans Tipo 1863 y Tipo 0914 -15 Nostocoida limiicola Microthrix parvicella Sphaerotilus natans, Tipo 186316 Thiothrix I y II Tipo 1863 Sphaerotilus natans, Microthrix parvicella17 Thiothrix sp. Sphaerotilus natans Tipo 186319 Thiothrix sp. Sphaerotilus natans N.limicola, H. hydrossis,T 1863, T 1701, T 0675, Estreptococcus sp.20 Sphaerotilus natans Flexibacter sp., NALO, T1863, Thiothrix sp. -21 Tipo 1701, Thiothrix II Tipo 1863, Sphaerotilus natans Bacillus sp., Streptoccus sp., Flexibacter sp., H. hydrossis26 S. natans, Thiothrix II Nostocoida limicola NALO, T021N,H.hydrossis,T1701,T1863,Streptococcus sp.Flexibacter sp.

Tabla 8. Especies totales identificadas por cada participante. No se ha aplicado test de invalidación.


En la Tabla 9 se presenta un resumen de la frecuencia asociada a los filamentos dominante y secundario observados por los participantes. Dichas frecuencias han sido calculadas como “nº participantes que identifican un filamento/total participantes”, entendiéndose que la frecuencia máxima para un filamento y una misma categoría (categoría "filamento dominante" o "filamento secundario") sería de 21/21=1.

De la información recogida en las Tablas 7 y 9 se extrae que la mayoría de los participantes identificó a Sphaerotilus natans como microorganismo dominante, seguido muy de cerca de Thiothrix sp.. Ambos filamentos, en algunas ocasiones, han sido cuantificados como dominantes en conjunción con otro filamento distinto, es decir, en situación de codominancia.

Entre los filamentos secundarios, el morfotipo 1863 y Sphaerotilus natans son los identificados con mayor frecuencia. El Tipo 1863 también fue identificado por algunos participantes como dominante, aunque en menor proporción que los anteriormente citados.

En aquellas muestras en las que la densidad y diversidad de bacterias filamentosas es importante, el establecimiento de la especie dominante y secundaria se ve dificultada. Este es precisamente el caso que nos ocupa.

En la categoría “otros filamentos observados”, Haliscomenobacter hydrossis fue el más frecuentemente identificado. Los morfotipos 1863 y 1701 también fueron recogidos en esta categoría, aunque con menor frecuencia que H. hydrossis.

Otros filamentos identificados, bien entre los filamentos secundarios o entre los de observación incidental, han sido: Flexibacter sp., Nostocoida limicola, NALO, Streptococcus sp. y Beggiatoa sp.

En el Anexo I están ilustrados algunos de los microorganismos recogidos en los partes de resultado de los distintos laboratorios.

Respecto al principal efecto del crecimiento filamentoso sobre la estructura flocular, han sido mayoritarios los participantes que han recogido en

Filamento F (Fil.dominante) F (Fil. secundario) Tipo 1863 4/21 7/21 S. natans 8/21 7/21

Thiothrix sp. 7/21 3/21

Tabla 9. Frecuencia de los filamentos observados como dominantes y secundarios.


su informe la “disgregación flocular”, seguida de la “ausencia de efectos” y por último, la “formación de puentes interfloculares”.

La valoración de los filamentos en disolución se encuentra representada en la Tabla 10. Aunque no todos los participantes han recogido la presencia de filamentos en disolución, las bacterias identificadas más comúnmente han sido: Tipo 1863, Flexibacter sp. y Streptococcus sp. El 50% de los participantes identificó filamentos en disolución que se correspondieron con los recogidos en el bloque de “filamentos en el flóculo”.

Otros filamentos recogidos fueron Bacillus sp. y bacterias helicoidales. En este último caso, se recuerda a los participantes que la presencia de bacterias helicoidales puede especificarse en la “hoja 1 de trabajo”, junto con otras características como fibras orgánicas, Zoogloea sp., partículas inorgánicas, burbujas, color, hinchazón y espumas.

En cualquier caso, la cuantificación de filamentos en disolución no debe ser confundida con las definidas para filamentos en el flóculo, cuyos valores numéricos oscilan entre 0 y 6. Sin embargo, no siempre los filamentos en el interior del flóculo son distintos a los filamentos hallados en disolución.

Tabla 10. Densidad de filamentos en disolución.

1 Tipo 1863 -2 - -3 No -4 - Categoría 25 Streptococcus sp. Categoría 16 Tipo 1863 Categoría 17 - -8 Tipo 1863, Streptococcus sp. Categoría 1-29 Tipo 1863 Categoría 1

10 - -11 Flexibacter sp., Tipo 1863, Bacillus sp. Categoría 212 Tipo 1863, Flexibacter sp. Categoría 113 Bacterias helicoidales -14 Tipo 1863 Categoría 115 - -16 Tipo 1863 Categoría 117 - Categoría 019 Tipo 1863 -20 - -21 Tipo 1863 Categoría 126 Tipo 1863 -

FILAMENTOS EN DISOLUCIÓN


CARACTERIZACIÓN DE LA MICROFAUNA

- DENSIDAD PROTOZOARIA

En la Figura 5 se recoge la densidad de microfauna estimada por los participantes. Se destaca el dato de densidad aportado por el participante 11, anormalmente bajo, quien realizó el análisis de la muestra con 2 días de retraso respecto a la toma de muestras. Como se expondrá en próximos apartados, esta disparidad de resultados se explica con el retraso en el análisis de la muestra por parte del participante 11 y en la rápida puesta en marcha del protocolo de conservación en el caso del participante 26.

DENSIDAD DE PROTOZOOS

0

1

2

3

4

5

6

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 19 20 21 26

participante

DENSIDAD PROTOZOARIA (10 exp 6) MEDIA

Figura 5. Densidad de microorganismos (protozoos y metazoos) para cada uno de los participantes, asícomo la media y varianza calculadas. Ningún participante descartado.

1 3,362 3,843 3,284 4,305 4,906 5,027 3,208 2,129 5,45

10 -11 0,7612 3,2813 1,6414 3,6615 2,3416 2,5017 2,3819 4,9820 1,5221 3,7226 5,56


DENSIDAD PROTOZOARIA (10 exp 6)


- ÍNDICE DE SHANNON (H)

Para esta población de datos se ha aplicado el test de invalidación y, aunque ningún participante ha de ser descartado (Figura 6), las diferencias son importantes. La explicación reside no sólo en la experiencia del analista, quien tendrá mayor o menor capacidad para distinguir entre especies distintas y cuantificarlas debidamente, sino también en el tiempo transcurrido entre la toma de muestra y el análisis, de dos días para los participantes 11, 14, 15 y 16.

Se recuerda a los participantes que para el cálculo de este índice se han de tener en cuenta todas las especies de microorganismos observadas (protozoos y metazoos), independientemente del tratamiento que se siga con éstas para el Método Madoni.

ÍNDICE DE SHANNON

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 19 20 21 26participante

ÍNDICE DE SHANNON MEDIA

Figura 6. Índice de Shannon para uno de los participantes, así como la media y varianza calculadas.Ningún participante descartado.

1 2,952 2,303 0,404 1,315 0,966 1,417 0,708 2,469 1,10

10 -11 1,9112 1,6113 0,9214 0,1715 -16 0,9917 0,7319 1,8820 0,9721 2,0426 1,27


ÍNDICE DE SHANNON


- ÍNDICE DE MADONI (Sludge Biotic Index, SBI)

En la Figura 7 se recogen las categorías numéricas definidas por el total de participantes así como la clase asociada a cada una de ellas. El test de invalidación no indica la necesidad de descartar ningún dato, pero se han resaltado en la tabla los valores del SBI y clases asociadas menos frecuentes (Clase II).

Como se observa en la Figura 8, la coincidencia en cuanto a clase es reducida, encontrándose valores del SBI distribuidos entre las clases III y IV, principalmente. Esta situación se analizará en apartados posteriores.

Figura 7. Índice de Madoni (1-10) para cada uno de los participantes, así como la media y varianza calculadas. Ningún participante descartado.

Figura 8. Clase Madoni (I-IV) definida por el total de participantes.

1 5 III2 3 IV3 1 IV4 5 III5 3 IV6 1 IV7 1 IV8 1 IV9 4 III10 - -11 4 III12 1 IV13 7 II14 4 III15 3 IV16 3 IV17 6 II19 2 IV20 5 III21 5 III26 1 IV

MEDIA 3VARIANZA 1,89

ÍNDICE DE MADONI

CLASE MADONI

0%

5%

40%55%

Clase IClase IIClase IIIClase IV

ÍNDICE DE MADONI

0

1

2

3

4

5

6

7

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 19 20 21 26

participante

ÍNDICE DE MADONI MEDIA


- N º ESPECIES DE PROTOZOOS

En la Figura 9 se presentan los resultados referidos al número de especies de protozoos observados por cada participante. El valor medio se ha situado en 5, razón por la que se destaca el valor aportado por el participante 15, aunque no por ello se quiere significar que se trate de un valor incorrecto. Ningún participante descartado según el test de la Q de Dixon.

Para una mejor interpretación del concepto diversidad, se recomienda a los participantes comparar los resultados recogidos en las figuras 6 y 9. Esta comparación permite entender que la diversidad medida con este índice responde a un concepto más complejo que el número de especies. De hecho, como se observa en la siguiente regresión lineal, el valor de R es pequeño y, para valores iguales del número de especies, los valores del Índice de Shannon son distintos. Esto nos indica que la densidad de cada especie en particular juega un papel preponderante en el establecimiento del valor de este índice y, en consecuencia, de la estabilidad ecológica del sistema.

Nº ESPECIES (MICROFAUNA)

0

2

4

6

8

10

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 19 20 21 26participante

Nº DE ESPECIES (MICROFAUNA) MEDIA

Figura 9. Número de especies protozoarias identificadas por cada uno de los participantes.

1 62 73 44 55 46 27 38 69 3

10 -11 512 613 314 315 1016 217 419 520 521 726 4

MEDIA 5VARIANZA 1,95

Nº DE ESPECIES (MICROFAUNA)


- GRUPO FUNCIONAL DOMINANTE (PROTOZOOS)

Como se puede observar en los datos aportados (Tabla 11), la mayoría de participantes obtuvo densidades máximas para el grupo de los bacterívoros sésiles. Tan sólo un participante obtuvo la máxima densidad para los bacterívoros nadadores y un participante para el grupo de los pequeños flagelados. En este último caso, en el que los pequeños flagelados dominaron, la muestra fue analizada con un día de retraso respecto al resto de participantes, por lo que pensamos que esta pueda ser la causa.

Puesto que han sido varios los participantes que han realizado consultas relacionadas con el grupo de los pequeños y grandes flagelados y el establecimiento del grupo funcional dominante, se ahondará en esta cuestión en próximos apartados.

Tabla 11. Grupo funcional dominante para cada uno de los participantes.

1 Bacterívoros sésiles2 Bacterívoros nadadores3 Bacterívoros sésiles4 Bacterívoros sésiles5 Bacterívoros sésiles6 Bacterívoros sésiles7 Bacterívoros sésiles8 Bacterívoros sésiles9 Bacterívoros sésiles

10 -11 Pequeños flagelados12 Bacterívoros sésiles13 Bacterívoros sésiles14 Bacterívoros sésiles15 Bacterívoros sésiles16 Bacterívoros sésiles17 Bacterívoros sésiles19 Bacterívoros sésiles20 Bacterívoros sésiles21 Bacterívoros sésiles26 Bacterívoros sésiles

GRUPO DOMINANTE

Nº sp. vs Shannon

y = 0,3392x - 0,1268R2 = 0,5103

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00

3,50

0 2 4 6 8

Nº sp

Índi

ce d

e Sh

anno

n


- LISTADO DE ESPECIES DE PROTOZOOS

En la Tabla 12 se recogen, por grupos funcionales, las especies de protozoos y los grupos de metazoos observados por la totalidad de participantes.

Como se deduce de la Tabla 12, se trata de una muestra de diversidad pequeña (Figura 6), con un mínimo de dos especies observadas y un máximo de diez para los participantes más expertos (Figura 9). Como se ha comentado en apartados anteriores, la experiencia del analista, el retraso con el que se realizó el análisis y el protocolo de conservación seguido, tienen gran influencia sobre estos resultados. Se agradece el esfuerzo realizado a los participantes, quienes han tratado de ser precisos en sus identificaciones y han seguido nuestras recomendaciones realizadas en el informe anterior.

Tabla 10. Protozoos y grupos de metazoos observados por el total de participantes.

Epistylis sp., Complejo Vorticella aquadulcis, Complejo Vorticella infusionum, Complejo Vorticella convallaria, Vorticella sp.,Complejo Vorticella microstoma, Opercularia sp., Vorticella campanula, Vorticella picta, Stentor sp.

Uronema sp., Colpoda sp.,Tetrahymena sp.

Bodonianos, Bicosoeca sp.,Trepomonas rotans

Euglena sp., Peranema sp., Grandes flagelados (sin identificar)

Amebas desnudas

Arcella sp., Centropyxis sp., Euglypha sp.

Litonotus sp.

Acineta sp.

Bacterívoros reptantes

Bacterívoros sésiles

Rotíferos, Lecánidos, Philodina sp., Nematodos

Euplotes sp., Aspidisca sp.

Metazoos

Especies de protozoos y Grupos de metazoosPequeños flagelados

Grandes flagelados

Amebas desnudas

Carnívoros nadadores

Carnívoros suctores

Bacterívoros nadadores

Amebas testáceas

Tabla 12. Grupos funcionales, especies de protozoarios y grupos de micrometazoos.


En la Tabla 13 se recoge el total de especies observado por cada uno de los participantes.

Tabla 13. Especies observadas por cada uno de los participantes.

En el Anexo I, se incluyen ilustraciones de algunos de los organismos presentes en la muestra.

PARTICIPANTEBicosoeca sp., Arcella sp., Centropyxis sp., Euglypha sp., Bacterívoro nadador sin identificar, Epistylis sp., Complejo Vorticella aquadulcis, Bacterívoros sésiles sin identificar, Complejo Vorticella infusionum, Lecánidos, Philodina sp.

Euglena sp., Peranema sp., Uronema sp., Bacterívoro nadador sin identificar, Epistylis sp., Complejo Vorticella aquadulcis, Complejo Vorticella microstoma, Complejo V. infusionum

Bacterívoro nadador sin identificar, Vorticella sp., Complejo Vorticella microstoma, Nematodo

-

Amebas testáceas, Uronema sp., Aspidisca sp., Euplotes sp., Stentor sp., Opercularia sp., Epistylis sp., Vorticella campanula, Vorticella sp., Rotíferos

Uronema sp., Complejo Vorticella microstoma

Tetrahymena sp., Bacterívoro nadador sin identificar, Complejo Vorticella convallaria

Colpoda sp., Aspidisca sp., Complejo Vorticella infusionum

16

11

6

8

9

7

ESPECIES OBSERVADAS

Arcella sp., Colpoda sp., Complejo Vorticella microstoma

Grandes flagelados, Uronema sp., Bacterívoro nadador sin identificar, Epistylis sp., Complejo Vorticella convallaria, Vorticella sp., Complejo Vorticella infusionum2

Euglena sp., Tetrahymena sp., Acineria sp., Complejo Vorticella aquadulcis, Complejo Vorticella microstoma, Nematodos

Pequeños flagelados, Euglena sp., Complejo Vorticella aquadulcis

Pequeños flagelados, Ciliado nadador sin identificar, Complejo Vorticella microstoma, Complejo Vorticella infusionum

Uronema sp., Epistylis sp., Complejo Vorticella microstoma, Rotíferos

Peranema sp., Amebas desnudas, Colpoda sp., Uronema sp., Epistylis sp., Complejo Vorticella convallaria, Complejo Vorticella microstoma

26

3

4

5

10

21

12

13

14

15

20

Amebas testáceas, Colpidium sp., Epistylis sp., Complejo Vorticella microstoma

Pequeños flagelados, Uronema sp., Opercularia sp., Complejo Vorticella convallaria, Vorticella campanula

Peranema sp., Litonotus sp., Uronema sp., Complejo Vorticella aquadulcis, Complejo Vorticella infusionum, Nematodos

17 Trepomonas rotans, Litonotus sp., Euplotes sp., Complejo Vorticella aquadulcis

Uronema sp., Vorticella sp., Vorticella picta, Complejo Vorticella microstoma, Complejo Vorticella infusionum19

Acineta sp., Uronema sp., Complejo Vorticella microstoma, Complejo Vorticella infusionum, Vorticella sp.

1


- RELACIÓN DE PORCENTAJES DE PROTOZOOS

En la Tabla 14 se recoge la abundancia relativa de cada grupo funcional.

En cuanto a la densidad de pequeños flagelados, se recuerda a los participantes que, si bien ha de ser tenida en cuenta en la valoración global de la muestra y en la determinación del SBI (Método Madoni), es necesario que dicha densidad de población no esté incluida en la densidad global de la muestra.

En la hoja 3 de trabajo existe un recuadro específico para cumplimentar con esta información.

La densidad de amebas desnudas, al igual que la de pequeños flagelados, no ha de ser incluida en la densidad total de la muestra. Sin embargo, la presencia de amebas desnudas es un aspecto más a tener en cuenta en la valoración de la estabilidad de la muestra.

La presencia de amebas testáceas, recogida por escasos participantes, consideramos puede deberse a estados anteriores de funcionamiento del reactor y no a la situación actual de la balsa. En ese caso, sería necesario comprobar mediante un test de actividad si los organismos eran viables o sólo restos inertes.

Tabla 14. Porcentajes de abundancia de los distintos grupos funcionales obtenidos por cada uno de losparticipantes. G. FLAG: grandes flagelados; AMEBAS: amebas desnudas; C. NADAD: carnívorosnadadores; C. SUCTOR: carnívoros suctores; B. NADAD: bacterívoros nadadores; B.REP: bacterívorosreptantes; B. SÉSIL: bacterívoros sésiles; METAZOOS: metazoos.

PARTICIPANTE G. FLAG (%) AMEBAS (%) A. TESTÁCEAS (%) C. NADAD (%) C. SUCTOR (%) B. NADAD (%) B. REPT (%) B. SÉSIL (%) METAZOOS (%)1 - - - - - 8 - 92 -2 17 - - - - 61 - 22 -3 - - 3,6 - - 2,4 - 94 -4 1,2 - - - - 2,3 1,2 94,2 1,25 - - 1,6 - - 22,8 - 75,6 -6 58 - - - - - - 42 -7 - - - - - 12 - 88 -8 4 5 - - - 32 58 - -9 - - - 2,8 - - - 97,2 -

10 - - - - - - - - -11 - - - - - 13 - 87 -12 1,3 - - 2,6 - 30,4 - 65,7 -13 - - - - - 22 - 78 -14 - - - - - 2 1 98 -15 - 7,7 - - - 5,1 20,5 62,4 4,316 - - - - 45 - 55 -17 14 - 1 - - 1 84 -19 - - - - 16 - 84 -20 - - - 1 8 - 91 -21 - - - - 28 - 72 -26 - - - - 10 - 89 1


OTROS PARÁMETROS DE INTERÉS

En la Figura 10 se recogen los resultados referentes al ensayo de sedimentabilidad en probeta (V30), la concentración de sólidos en suspensión del licor mixto (SSLM), porcentaje de sólidos en suspensión volátiles (SSVLM) e índice volumétrico de fangos (IVF).

Ensayo de sedimentabilidad en probeta

0

2040

60

80

100120

140

160180

200

1 2 3 4 5 6 7 8 9 11 12 13 14 15 17 19 20 21 26

participante

mL/

L

V30 (mL/L) Media

Figura 10 (I). V30, SSLM y SSVLM, así como IVF para cada uno de los participantes, incluidaslas medias y varianzas. Participante 7 descartado en el ensayo de los SSLM.

PARTICIPANTE V30 (mL/L) SSLM (mg/L) % SSVLM IVF (mL/g)1 155 1111 94,7 1402 140 946,7 - 147,93 160 927 - 1734 175 1387 81,2 117,75 120 1100 98 1096 170 1267 - 184,27 170 2160 86 798 170 1130 85 1509 180 1220 83,6 148

10 - - - -11 160 1120 89,3 14212 110 1258 82,5 87,413 180 1200 91,6 15014 180 1222 81,3 14715 110 1020 78 10816 - - - -17 190 1218 84,5 15619 170 1310 - 13020 160 - - -21 140 - - -26 160 1300 - 123

MEDIA 158 1.229 86 135VARIANZA 23,6 271 5,96 30

PARTICIP DESCARTADO - 7 - -MEDIA CORREG - 1.171 - -VAR CORREG - 130 - -


Del total de datos aquí presentados, tan sólo el correspondiente a SSLM del participante 7 hubo de ser descartado. En el gráfico en el que se representan la concentración de sólidos y el porcentaje de volátiles así como las medias respectivas, los ejes de ordenadas empleados han sido, respectivamente, el principal y secundario.

Figura 10 (II) (continuación). IVF, SSLM y %SSVLM para cada uno de los participantes,incluidas las medias y varianzas. Participante 7 descartado en el ensayo de los SSLM.

Índice volumétrico de fangos (IVF)

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

1 3 5 7 9 12 14 17 26

participante

mL/

g

IVF (mL/g) Media

Sólidos en suspensión del licor mixto (SSLM) y % sólidos en suspensión volátiles (SSVLM)

0

5001000

1500

20002500

3000

1 3 5 7 9 12 14 17 26

participante

mg/

L

0

20

40

60

80

100

% v

olát

iles

% SSVLM SSLM (mg/L) Media (SSLM) Media (%SSVLM)


5. CONCLUSIONES

■ VALORES MEDIOS ESTIMADOS DE LA MUESTRA ANALIZADA

En la Tabla 15 se recogen los valores "medios" de los principales parámetros que definen la calidad de la muestra estudiada, extraídos entre el total de datos aportados por los participantes.

■ CONCLUSIONES GENERALES

Las presentes conclusiones se han obtenido como compendio de las observaciones realizadas por los distintos participantes.

- Calidad previsible del agua tratada: regular-mala.

Nos encontramos ante una muestra de fango joven e inestable, en la que la turbidez ha sido valorada como “alta” y la presencia de microflóculos en suspensión se ha repartido entre las categorías “alta” y “media” casi de forma equitativa. La turbidez de esta muestra, al menos en parte, puede ser atribuida a la presencia de organismos filamentosos en disolución, característica microscópica que fue valorada mayoritariamente como "media” por los participantes.

La sedimentabilidad, en cambio, quedó definida mayoritariamente como "alta" entre el total de participantes.

Tabla 15. Valores medios estimados de la muestra analizada a partir de los resultadosobtenidos por el total de participantes.

ÍNDICE DE FANGO 49 (Regular)3 a 4

IDENTIFICACIÓN DE FILAMENTOS ¨Sphaerotilus natans, Tipo 1863 y Thiothrix sp. DENSIDAD PROTOZOARIA APROXIMADA 3,2 x 106 individuos/LÍNDICE DE SHANNON 1,2ÍNDICE DE MADONI 3CLASE MADONI Clase IVNº DE ESPECIES ENCONTRADAS 5GRUPO DOMINANTE Bacterívoros sésilesRENDIMIENTO SEGÚN MADONI Depuración biológica escasa en la balsa de aireación;

bajo rendimientoV30 estimada 158SSLM 1171IVF 135

RESULTADOS MEDIOS ESTIMADOS DE LA MUESTRA

CATEGORÍA BACTERIANA


En cuanto a la evaluación del olor, ha existido un reparto casi al 50% entre las categorías "correcto" e “incorrecto”, cuestión relacionada con el tiempo transcurrido entre la toma de muestras y la puesta en marcha del protocolo de conservación de muestra. Las apreciaciones respecto a este parámetro han sido las siguientes: "olor de fango joven (inicio proceso), leve falta de estabilización", “olor a azufre, propio de un arranque, coincidente con la presencia de organismos como Thiothrix sp. y Beggiatoa sp. y asociado a condiciones de septicidad”.

En cuanto a las características microestructurales del fango, una apreciación recogida por algunos participantes ha sido la observación de “protoflóculos” o “flóculos en sus estadios iniciales de desarrollo”, de tamaño pequeño-medio, escasa consistencia, reducida resistencia a la tracción y estructura media-abierta; estos microflóculos, muy probablemente, son los observados en el clarificado final. Esta circunstancia, junto con la presencia de filamentos en disolución, es causa suficiente para una mala calidad del clarificado pese a la buena sedimentabilidad del fango.

Como se confirmará en apartados posteriores, nos encontramos con un fango joven e inestable que, como tal, ha evolucionado rápidamente tanto en sus características macroscópicas como microscópicas. Entre las causas de esta baja edad de fangos, los participantes han barajado como posibilidades “un brusco descenso de los sólidos en suspensión en el reactor por elevadas purgas de fango”, “una posible sobrecarga orgánica que ha traído consigo una deficiente oxigenación del sistema” y, para un sector más restringido, “las condiciones aquí observadas más bien podrían señalar hacia la puesta en marcha o re-arranque de un reactor biológico que a un sistema bajo condiciones estables de funcionamiento”.

En conclusión, nos encontramos ante un sistema en el que la depuración no parece suficiente, bien por un tiempo de retención celular pequeño, bien por una situación de sobrecarga orgánica que en consecuencia está acompañada de unos niveles de oxígeno insuficientes.

- Valoración de la calidad del fango y de la estabilidad del sistema: regular.

La densidad de microfauna media, extraída del total de participantes, indica que el fango activo estudiado supera los límites mínimos establecidos por el Método Madoni, estimado en un millón de individuos por litro. El grupo de protozoos ciliados establecido como dominante por la mayoría ha sido el de los


bacterívoros sésiles, englobado a su vez en tres posibles grupos funcionales (Madoni, 1994): “Vorticella microstoma”, “ciliados reptantes + ciliados sésiles y/o amebas testáceas" y “ciliados sésiles >80%, no siendo Opercularia sp. y V. microstoma abundantes”.

En cualquier caso, la estabilidad del sistema ha sido valorada como "regular-mala" por los participantes, quienes han tenido en cuenta la presencia de pequeños flagelados, el valor medio del Índice de Shannon, de aproximadamente 1,2 y las Clases III-IV según Madoni determinadas.

En efecto, nos encontramos ante un sistema en el que las poblaciones que lo colonizan, prácticamente en exclusividad, son las de los ciliados sésiles bacterívoros (solitarios) y, minoritariamente, la de los ciliados nadadores. Condiciones de transitoriedad en las intalaciones pueden dar lugar a incrementos en la densidad de población de los ciliados del género Vorticella. Dichas condiciones pueden ser: rápido aumento de la carga másica debido a pérdidas o extracciones de fangos, carga orgánica introducida de modo discontinuo, etc. (Madoni, 1994).

Concretamente, la población de ciliados sésiles dominante es la de “Vorticellas de peristoma constreñido” Es decir, el peristoma presenta menor diámetro que la anchura del cuerpo celular (Complejo Vorticella microstoma, Complejo Vorticella infusionum, Complejo V. aquadulcis y V. octava), situación que indica una abundante presencia de bacterias en disolución y una DBO5 también elevada. De hecho, se trata ésta de una muestra con una población de vorticelas relativamente diversa, debido a la falta de presión competitiva por una concentración de “alimento” (crecimiento disperso) en exceso. De hecho, las “Vorticellas de peristoma amplio”, de diámetro peristomático igual o mayor que la anchura del cuerpo, propias de cargas orgánicas moderadas, apenas fueron observadas.

La presencia de ciliados nadadores bacterívoros, por su parte, en combinación con una población de ciliados sésiles bacterívoros, indica la falta de madurez del sistema así como la deficiente estructuración del fango. Especialmente, por una población de ciliados reptantes prácticamente inexistente y una importante población de pequeños flagelados poco habitual en sistemas que funcionan bajo condiciones estables de funcionamiento.

Por último, con relación a este apartado, sería conveniente reseñar que la presencia del flagelado Trepomonas y de representantes del Complejo Vorticella microstoma son indicativos de una baja concentración de oxígeno disuelto en el reactor. Situación ésta que es confirmada por la población de bacterias filamentosas observada, constituida por claros indicadores de malas condiciones


de oxigenación: Sphaerotilus natans, Thiothrix sp., Tipo 1863, Tipo 1701 y Haliscomenobacter hydrossis.

- Tiempos de retención celular bajos y carga entrante alta.

La proporción de sólidos en suspensión volátiles del licor mixto, en torno al 86%, es indicativa de un fango activo de mineralización baja y por tanto de una edad de fangos moderada-baja. Por su parte, la proporción de ciliados sésiles, al margen de la importante población de pequeños flagelados y la presencia de grandes ciliados nadadores, sugiere igualmente un tiempo de retención celular bajo-moderado, en un sistema en el que la carga másica resultante es elevada y la concentración de oxígeno podría ser deficitaria.

Siguiendo nuestras propias recomendaciones, que se basan en la valoración global de la muestra atendiendo a la información procedente de la estructuración del fango y el crecimiento filamentoso, así como la diversidad y estado de la microfauna, podemos concluir que nos encontramos ante una muestra en la que los valores de los tres índices empleados, Índice de Fangos, Índice de Shannon y Método Madoni, apuntan comúnmente hacia una baja calidad.

Por último, invitamos a los participantes a contrastar algunas de las teorías aquí presentadas con los datos recogidos en el estudio respirométrico realizado por Surcis (Anexo II).


■ CONCLUSIONES DE CADA APARTADO

ÍNDICE DE FANGO

Los resultados obtenidos en cuanto a características macroscópicas que han presentado mayor dispersión han sido los parámetros flóculos en suspensión y olor. Los flóculos en suspensión fueron definidos con las categorías “alta” y “media” con porcentajes en ambos casos del 48%. A diferencia con otras características macroscópicas, para la determinación de los flóculos en suspensión no se puede aportar una referencia sencilla, como pueda ser el caso de la turbidez o la sedimentabilidad. Por esta razón, estamos desarrollando un estudio sobre la concentración de sólidos en suspensión en el clarificado de distintas muestras de fango activo. Las conclusiones que surjan de este estudio serán incorporadas a las hojas de trabajo, las cuales se harán llegar a los participantes antes del próximo circuito interlaboratorios.

En el caso del olor, por tratarse ésta de una muestra de fango joven e inestable, la evolución de las características macroscópicas ha sido rápida y, en este caso en particular, los participantes que antes recepcionaron la muestra y pudieron llevar a cabo el protocolo de conservación han sido los que han evaluado el olor como “correcto”. Para el olor hubo un reparto equitativo entre las categorías “correcto” (43%) e “incorrecto” (57%).

Turbidez y sedimentabilidad han sido parámetros más coincidentes, con porcentajes del 76% y 86%, respectivamente, para la categoría “alta” en ambos casos. Es grato comprobar que la dispersión en el parámetro sedimentabilidad ha descendido con relación al ejercicio anterior. En la siguiente tabla se recogen los valores correspondientes a V10, V20 y V30 aportados por dos participantes así como las expresiones que pueden ser empleadas para valorar este concepto. En ambos casos, se comprueba que la categoría correspondiente es "alta" pues, transcurridos 10 minutos, el volumen de fango decantado con relación al volumen compactado a los 30 min es superior a 0,5. Tal y como se observa en el "Gráfico de sedimentabilidad", en el que se representa gráficamente la evolución temporal de la V30, el mayor volumen de fango depositado en la probeta se corresponde con los 10 minutos iniciales del ensayo.


Participante Vn Volumen (mL) Expresión para estimación

V10 230 = 0,91

V20 180 = 0,97P 1

V30 155

V10 250 = 0,89

V20 190 = 0,96P 19

V30 160

Por nuestra parte, añadir que la turbidez fue uno de los parámetros que sufrió una evolución más negativa desde la toma de muestras hasta el análisis, en concordancia con el carácter de fango joven, del que es esperable una evolución importante de las características macro- y microscópicas. Por esta razón, realizamos un estudio de los parámetros macroscópicos durante el día de la toma de muestras, con el fin de que pudieran ser comparados con los valorados al día siguiente, en el que todos los participantes estábamos convocados a realizar el estudio (Tabla 16). Este estudio nos permitió comprobar que el incremento experimentado por la turbidez se correspondió con un aumento de filamentos y

min 30 t 0t

min 10 t 0 t

aVolumen -aVolumen aVolumen - aVolumen

==

==

min 30 t 0t

min 02 t 0 t


==

==

1 aVolumen -aVolumen aVolumen - aVolumen

min 30 t 0t

min 03 t 0 t=

==

==

min 30 t 0t

min 10 t 0 t


==

==

min 30 t 0t

min 02 t 0 t


==

==

1 aVolumen -aVolumen aVolumen - aVolumen

min 30 t 0t

min 03 t 0 t=

==

==

Gráfico de sedimentabilidad

050

100150200250300350

5 10 15 20 25 30

Tiempo (min)

Volu

men

(mL)

V30

Figura 11. Secuencia de sedimentación del fango.


bacterias en disolución. De la misma forma, el olor empeoró pasando de la categoría “correcto” a “incorrecto”.

Parámetros Categoría a T = 2h Categoría a T = 24h

Turbidez Media Alta Flóculos en suspensión Medio Medio

Sedimentabilidad Alta Alta

Olor Correcto Evolución negativa

del olor, síntomas de septicidad

T: tiempo transcurrido desde la toma de muestra

De dicho análisis hemos obtenido que la turbidez ha sido el parámetro que ha evolucionado más rápidamente, pasando de ser “media” a las dos horas de la toma de muestras, a “alta” en el día del ejercicio. Esta misma es la evolución seguida por el olor.

El resto de parámetros, en especial la sedimentabilidad, no experimentaron cambios de consideración, para lo que adjuntamos la secuencia de sedimentación durante el día de la toma de muestra, la cual puede ser comparada con las secuencias recogidas anteriormente, aportadas por los participantes 1 y 19:

Vn a T = 2h Volumen (mL) V10 220 V20 200 V30 170

T: tiempo transcurrido desde la toma de muestra

Atendiendo a las características "medias" extraídas de los datos aportados por los participantes, la muestra quedaría definida en cuanto a sus características macroscópicas de la siguiente manera:

Tabla 16. Evolución de las características macroscópicas del IF a las 2 y 24 h transcurridasdesde la toma de muestras.

Tabla 17. Secuencia de sedimentación del fango a las 2h de la toma de muestras(T=2h).


Con relación a las características microscópicas, aquellas que presentaron mayor dispersión fueron la textura, que se distribuyó entre las categorías “fuerte” (58%) y “débil” (42%), la estructura definida con las categorías “media” (52%) y “abierta” (38%) y filamentos en disolución repartida entre las categorías “alta” (57%) y “baja” (43%).

Sobre las características estructura y textura, efectivamente, nos encontramos ante un fango en el que probablemente los tiempos de retención celular programados sean cortos y en el que el crecimiento filamentoso es medio. Esto da lugar a que la estructura del fango esté muy poco mineralizada y que como tal lleve asociada una textura poco resistente a la tracción. Probablemente, la situación real del sistema sea la descrita por los participantes, es decir, un fango en el que conviven flóculos muy jóvenes y poco resistentes a la tracción, con otros algo más maduros y resistentes que, en ningún caso, presentarán estructura compacta (10% de los participantes). En casos como el que nos ocupa, la recomendación es evaluar ambas características sobre un número mayor de flóculos y adoptar las categorías predominantes para las características evaluadas. Si fuera necesario, podría aumentarse el número de visus realizados. La valoración de la estructura ha de realizarse sobre la muestra en vivo, sin teñir, con el fin de evitar cambios en la estructura del fango ejercidos por los propios reactivos de tinción.

En conclusión, entendemos que si bien la definición final de la textura puede ser la intermedia entre “fuerte” y “débil”, para el caso de la estructura, por una ligera diferencia en cuanto a porcentajes, podría adoptarse la categoría “media”.

En cuanto al parámetro filamentos en disolución es curioso observar que nos encontramos con una dispersión en el IF que, prácticamente, no existe en la “hoja 2 de trabajo” destinada específicamente al estudio de los microorganismos filamentosos y que valora igualmente esta característica. En este caso, la mayoría de participantes seleccionaron la categoría 1 “medios” para valorar la presencia

Parámetro Categoría más frecuente

Turbidez Alta

Flóculos en suspensión Medio/Alto

Sedimentabilidad Alta

Olor Incorrecto


de filamentos en disolución. Entendemos que la definición en el IF de tan sólo las dos categorías extremas, “alta” y “baja”, puede ser la razón de esta división de opiniones, según la cual los participantes se han visto forzados a elegir una de estas dos categorías para suplir la inexistente categoría “media”. Esta observación será tenida en cuenta durante la próxima revisión de las hojas de trabajo que GBS lleve a cabo.

La presencia de filamentos en flóculo se presentó mayoritariamente con la categoría “5-20 filamentos/flóculo” (71%), equivalente a la categoría numérica 4, definida en la “hoja de trabajo 2”. Teniendo en cuenta que el valor medio extraído, relativo a dicha categoría numérica, fue de 3,1, situación más próxima a la categoría numérica 3 (<5 filamentos/flóculo) que a la 4 (5-20 filamentos/flóculo), entendemos que existe una falta de concordancia entre ambos apartados sobre la que todos los participantes deberíamos prestar mayor atención.

El resto de parámetros, tales como forma, tamaño y cobertura, quedaron definidos con categorías mayoritarias que superaron el 80% en todos los casos, siendo tales categorías “irregular”, “medio” y “10-50%”, respectivamente.

La diversidad de protozoos se situó con un 62% para la categoría “4-7 sp”, parámetro éste que depende de la experiencia del analista, del tiempo transcurrido entre la toma de muestras y la observación microscópica, así como del protocolo de conservación seguido. En la muestra que nos ocupa, la densidad de población de ciertas especies, principalmente ciliados peritricos, fue reducida. Adicionalmente, si el participante realizó el análisis con retraso, el estrés ambiental sufrido por los organismos es acusado y en el caso de la población señalada anteriormente, el resultado final es que la identificación de especies se dificulta especialmente. De nuevo, se recuerda a los participantes la necesidad de que este parámetro se muestre en concordancia con el número de especies observadas en la "hoja 3 de trabajo" destinada al estudio de microfauna.

El IF ha resultado con un reparto en categorías como sigue: 80% "Regular", 15% "Bueno" y 5% "Malo" (Figura 3). Estos resultados permiten definir el IF de esta muestra como "Regular", con una puntuación comprendida en el intervalo 40-59.

Finalmente, en el apartado "observaciones" incluido en la primera "hoja de trabajo", han sido escasas las anotaciones realizadas, que han apuntado comúnmente hacia:

- Presencia de "bacterias helicoidales" (Espirilos y Espiroquetas)

- Ausencia de "fibras orgánicas"


- Presencia moderada de "Zoogloea sp."

- Ausencia de "partículas inorgánicas"

- Ausencia de "burbujas"

- "Color" marrón claro propio de un fango joven

- Sin "hinchazón"

- Ausencia de "espumas"

En cuanto a las características microscópicas, a modo de resumen, se recogen las categorías seleccionadas con mayor frecuencia por los participantes:

DENSIDAD Y DIVERSIDAD DE PROTOZOOS

En líneas generales podría calificarse ésta muestra como poco diversa y con una densidad de población media-alta (3,2 x 106 ind/L), atendiendo al histórico de datos de los ejercicios interlaboratorios organizados por GBS, en los que las densidades de población estuvieron en torno a los 2,5 millones de individuos por litro.

La densidad de protozoos ha sido dispersa, destacándose los datos de los participantes 11 y 26, con las densidades mínima y máxima, respectivamente. Ante esta disparidad, nos pusimos en contacto con el participante 11, quien nos explicó que la razón de la baja densidad de población se encontraba en el retraso sufrido en la realización del análisis (Tabla 1). Por parte del participante 26, la única razón podría residir en que este laboratorio recibió la muestra el mismo día

Parámetro Categoría más comunes y frecuencia asociada (%)

Forma Irregular (90%)

Tamaño Medio (81%)

Estructura Media (52%)

Textura Fuerte (52%)/Débil (48%)

Cobertura 10-50% (86%)

Filamentos en flóculo 5-20 filamento/flóculo (71%)

Filamentos en disolución Baja (57%)

Diversidad protozoos 4-7 sp. (62%)


del reparto y, rápidamente, puso en marcha el protocolo de conservación de muestras aunque retrasando el análisis hasta el día siguiente.

Aunque se expone en próximos apartados de forma más detallada, entre las normas a tener en cuenta durante el cálculo de la densidad de protozoos, se recuerda a los participantes no incluir las densidades de población relativas a amebas desnudas y pequeños flagelados. En el informe interlaboratorios correspondiente al mes de febrero, se aportó una serie de pautas a tener en cuenta durante el cómputo de microfauna que se aconsejan seguir.

El número de especies identificadas se ha repartido de la siguiente forma: 65% entre las categorías 4-7 especies, 30% para <4 sp. y 5% para >7 especies, siendo el valor medio de especies identificadas de 5.

Principales grupos de organismos observados y notas sobre su morfología

Las notas sobre las características morfológicas de los organismos aquí expuestas y otras consideraciones sobre el SBI, han sido tomadas de la siguiente bibliografía:

Foissner, W. y Berger, H. (1996). A user-friendly guide to the cilates (Protozoa, Ciliophora) commonly used by hidrobiologists as bioindicators in rivers, lakes, and waste waters, with notes on their ecology. Freshwater Biology 35, 375-482.

Foissner, W., Berger, H. y Kohmann, F. (1992). Taxonomische und ökologische revision der ciliaten des saprobiensystems. Band II: Peritrichia, Heterotrichida, Odontostomatida. Informationsberichte des Bayerischen Landesamtes für Wasserwirtschaft. München.

Foissner, W., Berger, H. y Kohmann, F. (1994). Taxonomische und ökologische revision der ciliaten des saprobiensystems. Band III: Hymenostomata, Prostomatida, Nassulida. Informationsberichte des Bayerischen Landesamtes für Wasserwirtschaft. München.

Foissner, W., Berger, H., Blatterer, H. y Kohmann, F. (1991). Taxonomische und ökologische revision der ciliaten des saprobiensystems. Band I: Cyrtophorida, Oligotrichida, Hypotrichia, Colpodea. Informationsberichte des Bayerischen Landesamtes für Wasserwirtschaft. München.

Foissner, W., Berger, H., Blatterer, H. y Kohmann, F. (1995). Taxonomische und ökologische revision der ciliaten des saprobiensystems. Band IV: Gymnostomatea, Loxodes, Suctoria. Informationsberichte des Bayerischen Landesamtes für Wasserwirtschaft. München.


Madoni, P. (1994). A sludge biotic index (SBI) for the evaluation of the biological performance of activated sludge plants based on the microfauna analysis. Wat. Res. 28, 1, 67-75.

Serrano, S., Pérez-Uz, B., Arregui, L. y Calvo, P. (2004). Claves de identificación de protistas en estaciones depuradoras de fangos activos. Curso: Protozoos en el fango activo. Fundación Emasesa, Sevilla.

Streble, H. y Krauter, D. (1987). Atlas de los microorganismos de agua dulce. La vida en una gota de agua. Ed. Omega, Barcelona.

Warren, A. (1986). A revision of the genus Vorticella (Ciliophora: Peritrichida). Bull. Br. Mus. Nat. Hist. (Zool). 50, 1, 1-57.

Amebas desnudas

La presencia de amebas desnudas ha sido recogida por la casi totalidad de los participantes, siendo la categoría 0 la más frecuentemente seleccionada, es decir, “pocos”. La presencia de amebas desnudas, cuando es dominante, está asociada a estadios de colonización de la planta, frecuentemente junto con el grupo de los flagelados, así como a fases de inestabilidad por sobrecarga en el reactor.

Amebas testáceas

Los tres géneros identificados por algunos participantes han sido Arcella, Centropyxis y Euglypha. Dado que la presencia de este grupo tan sólo fue recogida por dos participantes, sería conveniente recordar que el cómputo de amebas testáceas ha de realizarse sólo sobre la población activa. Probablemente, por la baja densidad y la escasa frecuencia con que fueron observadas, se tratasen de organismos correspondientes a un estado anterior del reactor.

A continuación se recogen las especies más frecuentes en fangos activos, pertenecientes a los géneros citados anteriormente:

Arcella vulgaris: Teca redondeada de color amarillo-marrón, 100-145 µm de diámetro, 50-80 µm de altura, pseudoestoma 30-50 µm.

Arcella hemisphaerica: Muy parecida a A. vulgaris respecto al tamaño, 100-150 µm, pero con la teca casi semiesférica.

Centropyxis tipo aerophyla: Sin espinas, apertura de la teca situada de forma excéntrica. Largo: 53-85 µm, anchura: 42-66 µm y altura: 15-21 µm.


Centropyxis aculeata: Apertura de la teca redondeada-ovalada (30-60 µm); 2-8 espinas; diámetro: 138-200 µm.

Euglypha alveolata: Teca sin espinas (rara vez con espinas), pequeñas escamas silíceas redondas u ovaladas, 60-100 µm de largo.

Grandes flagelados:

La presencia de grandes flagelados fue recogida por gran parte de los participantes, quienes identificaron, principalmente, al género Peranema.

Género Peranema: célula alargada, muy elástica, con extremo posterior amplio y redondeado o truncado cuando la célula está en movimiento. La apertura del reservorio donde se anclan los flagelos está en el extremo anterior. Presenta dos flagelos: uno libre y largo, que en movimiento deslizante tiene aspecto rígido con el extremo libre y apunta en la dirección del movimiento; otro flagelo es corto y recurrente, adherido a la película. Núcleo central. Vacuola contráctil posterior.

Género Euglena: células fusiformes y flexibles, redondeadas anteriormente y generalmente apuntadas posteriormente. Realiza movimientos variados, desde deslizamiento hasta desplazamientos muy activos. Presenta un flagelo, más o menos largo dependiendo de las especies. Cuerpo celular coloreado por la presencia de pigmentos.

Pequeños flagelados

Género Bodo: células pequeñas, ovoides, arriñonadas o piriformes con núcleo central o anterior. Dos flagelos diferentes en posición subapical.

Muy frecuente en fangos activos es Bodo saltans: cuerpo celular con forma arriñonada, entre 5-8 µm de largo y 2-5 µm de ancho, con dos flagelos desiguales que surgen de una depresión anterior. Se fija al sustrato por el extremo de su flagelo recurrente que es 10-15 µm de largo. El flagelo anterior crea corrientes hacia la apertura del citostoma mientras que la célula se balancea y salta erráticamente alrededor de un punto fijo, el del flagelo recurrente.

Bicosoeca sp.: células biflageladas envueltas por una lóriga orgánica, frecuentemente en forma de cuenco. Organismos solitarios o coloniales. La lóriga puede unirse directamente al sustrato o presentar un pedúnculo. Flagelo recurrente dirigido hacia la zona anterior.


Trepomonas rotans: células comprimidas bilateralmente, con un tamaño aproximado de 5-30 µm, con 8 flagelos organizados en dos grupos de 4 flagelos: uno locomotor y 3 recurrentes, situados lateralmente en ambos lados de la célula y casi a nivel ecuatorial.

Es importante recordar a los participantes que la población de pequeños flagelados, a efectos del cálculo del SBI, no debe ser incluida entre la población de microfauna total (Ejemplo 1). Si dicha población fuera incluida en el cómputo total de la microfauna, el valor final de densidad es alterado, de la misma forma que el reparto de grupos funcionales (Ejemplo 2). Como ejemplo, se adjunta la plantilla de recuento de un participante cualquiera, en la que la población de pequeños flagelados ha sido incluida en el valor de densidad total.

EJEMPLO 1. Reparto de grupos funcionales y densidad total, sin incluir el número de pequeños flagelados.


EJEMPLO 2. Reparto de grupos funcionales y densidad total, incluyendo el número de pequeños flagelados.

Como se comentaba anteriormente, no existe coincidencia entre uno y otro ejemplo en cuanto a reparto de grupos funcionales. Adicionalmente, no se podría calcular el valor correspondiente del SBI en ambos casos pues, salvo que se realice el recuento de pequeños flagelados en la cámara Fuchs-Rosenthal, no es posible determinar el rango concreto en el que se encontraban los pequeños flagelados en la muestra. Las dos posibles categorías, descartando la posibilidad de que hubiera < 10 pequeños flagelados, podrían ser:

- > 100 pequeños flagelados: sería necesario establecer como grupo funcional dominante al de los “pequeños flagelados” e ingresar en la “tabla de doble entrada” con este grupo funcional.

- 10-100 pequeños flagelados: sería necesario tener en cuenta este dato para determinar el valor final del SBI, pero el grupo funcional en este caso sería el de “ciliados sésiles 80%, no siendo Opercularia sp. y Vorticella microstoma abundantes”.


Por último, en este apartado nos gustaría recoger una duda planteada a un pequeño sector de los participantes, la distinción entre pequeños y grandes flagelados. Aunque no existe un tamaño determinado a partir del cual se distinga entre pequeño y gran flagelado, los géneros más frecuentes en fangos activos para los pequeños flagelados son Tetramitus, Trepomonas, Bodo o Polytoma. Para el caso de los grandes flagelados, Euglena, Entosiphon y Peranema son los más habituales. Como se observa en ambos esquemas, las diferencias en cuanto a tamaño son significativas. Frente a una longitud media de 8 µm para Bodo, la longitud del cuerpo celular de Euglena puede ser de incluso 100 µm para algunas especies.

Bodo (pequeño flagelado) Euglena (gran flagelado)

Ciliados reptantes bacterívoros:

Algunos de los ciliados reptantes identificados dentro de este grupo funcional han sido:

Aspidisca cicada (sinónimo de Aspidisca costata): ciliado de cuerpo redondeado con crestas dorsales patentes y cirros en el lado ventral. Cirros frontales y transversos muy desarrollados. Son característicos los cirros transversos que emplea para desplazarse como si fueran “patas”. Tamaño: 25-40 µm.

Euplotes sp.: campo peristomático y zona de membranelas que se dirige hasta cerca de la zona de cirros transversales. La vista de perfil, permite observar bien los cirros ventrales. Tamaño: 80-150 µm.

El género Euplotes se distingue del género Aspidisca por su mayor tamaño y por su zona adoral de membranelas (ZAM).


Ciliados sésiles bacterívoros:

A continuación se muestran algunas características morfológicas con relación a los microorganismos sésiles detectados por los distintos participantes:

◙Complejo Vorticella microstoma: zooide de 22-50 µm de ancho y 35-85 µm de largo, con forma de campana invertida; pedúnculo fino de aproximadamente 6 veces la longitud del cuerpo. Gránulos en el endoplasma, estriación en el borde del peristoma y macronúcleo en "C" fácilmente diferenciable. Es muy característica la constricción en la zona anterior del peristoma, de menor anchura que el cuerpo celular.

◙Complejo Vorticella aquadulcis: organismos de dimensiones aproximadas de 15-35 µm de ancho y 25-55 µm de largo. Cuerpo piriforme dotado de labio peristomial de menor diámetro que la anchura máxima de la célula. Macronúcleo en "C" situado transversalmente al cuerpo y rodeando la cavidad peristomática. Vacuola contráctil en la zona anterior y próxima al infundíbulo. Estriación transversal aparente de borde convexo. Especie incluida en este complejo:

- Vorticella striata (Complejo V. aquadulcis): cuerpo celular de 20-50 µm de largo y 15-32 µm de ancho. Constricción bajo el labio peristomial de aproximadamente 18 µm; disco convexo. Vacuola contráctil situada justo debajo del peristoma; macronúcleo en forma de "C" situado transversalmente en el centro del cuerpo. Pedúnculo de anchura media 3 µm y longitud media 100 µm.

[Según indicaciones del Profesor Madoni, Vorticella microstoma y Vorticella infusionum están incluidas en el mismo grupo a efectos del SBI. No así para el cálculo del Índice de Shannon, para el que han de ser tenidas en cuenta como especies distintas].

◙Complejo Vorticella infusionum: zooide de 35-60 µm de largo y 50 µm de ancho con forma de campana invertida con un labio peristomial bien desarrollado de 55 µm de ancho. Vacuola contráctil situada justo debajo del centro del zooide; macronúcleo en forma de "J". Pedúnculo delgado de más de 80 µm de largo.

◙Complejo Vorticella convallaria: zooide de 22-55 µm de ancho y 40-120 µm de largo con forma de campana esbelta; pedúnculo de 100-500 µm de longitud. Vacuola contráctil situada en el tercio anterior del zooide y abundantes vacuolas alimenticias. Macronúcleo en forma de "J". Labio peristomial de diámetro igual o ligeramente superior al cuerpo.


◙V. campanula: zooide de 50-157 µm de largo (media 68 µm) y 35-99 µm de ancho (media 58 µm) con forma de campana invertida; constricción bajo el labio peristomial; vacuola contráctil situada en el primer tercio superior de la célula; macronúcleo en forma de "J", situado longitudinalmente al cuerpo; citoplasma con numerosos gránulos refringentes; pedúnculo estriado y largo (incluso >500 µm).

◙Género Epistylis: ciliado colonial de pedúnculo ramificado sin capacidad contráctil (sin espasmonema). Los zooides presentan labio peristomial. Tamaño: 70-90 µm (zooide); colonias hasta 2-3 mm. Presentes frecuentemente en sistema de fangos activos que trabajan a medias cargas.

◙ Vorticella picta: cuerpo celular con reborde peristomático en forma de corazón volcado hacia la derecha. Cuerpo muy translúcido. No presenta corona de cilios. Tamaño: 41-63 µm (largo) y 20-37 µm (ancho) (zooide). Diámetro aprox. del labio 45 µm.

◙ Stentor sp.: individuos “libres” con morfología celular oval, pero una vez que se anclan al sustrato por la parte posterior, se expanden y adquieren forma de “trompeta”, expandiendo también la zona oral. Macronúcleo en forma de collar de cuentas o vermiforme, dependiendo de la especie. Pigmentos en gránulos que le confieren color verde-azulado. Tamaño expandido: 1-2 mm.

Se reproduce a continuación, a modo de resumen, una clave de identificación del género Vorticella (Zornoza, 2005) que pensamos puede ser de utilidad

:

Pequeñas vorticellas( < 60 um)

Macronucleoen forma de “C”

longitudinal

C.V. AQUADULCIS

C.V MICROSTOMA

Generalmente estriacion muy

marcada. < 30 L.A. Pequeño tamaño

C.V. INFUSIONUM

Labio peristomialclaramente

estrecho. 30-45 L.A

C.V. OCTAVASimilar a C.V. infusionum

pero con el labio peristomial menos

estrecho

Labio peristomialestrecho . 50-70 L.A

Grandes vorticellas( > 60 um)

C.V CONVALLARIA

Macronucleoen forma de “herradura”transversal

Labio peristomialmas ancho que

los demascomplejos. 100

L.A.

Macronucleoen forma de “J”

longitudinal

L.A: Lineas argirófilas


Bacterívoros nadadores:

Las características más importantes para la determinación de estos organismos son las siguientes:

Género Uronema: cuerpo ovoide con polo anterior aplanado y carente de ciliación somática. Cilios somáticos largos, de los que destaca el cilio caudal, de mayor longitud que el resto. Vacuola contráctil posterior. Tamaño 30-50 µm.

Género Colpoda: cuerpo celular con forma arriñonada y estriación patente en el borde anterior izquierdo. Vestíbulo densamente ciliado, que crea corrientes para su alimentación. Tamaño: 25-100 µm. Carga media; asociado a niveles altos de hierro.

Género Colpidium: Tamaño y formas variables: redondeada, ovalada, alargada, cilíndrica, arriñonada. Citostoma pequeño, triangular, situado a 1/4 del polo anterior. Macronúcleo esférico, micronúcleo; vacuola contráctil. Tamaño: 50-155 µm (depende de la sp.).Frecuente en aguas muy contaminadas. Presente en las primeras fases de colonización del fango. Ineficiencia biológica de la depuración.

Tetrahymena sp.: cuerpo piriforme. Pequeña abertura oral situada en el tercio anterior de la célula. Vacuola pulsátil en el extremo posterior. Macronúcleo esférico. Tamaño: 25-90 µm. Asociado a los primeros estadios de formación flocular.

Carnívoros nadadores:

La densidad de población de este grupo funcional ha sido escasa, recayendo sobre los siguientes géneros:

Género Litonotus: cuello en forma de pico con citostoma lateral. Ciliación somática a la derecha; 2 macronúcleos y un micronúcleo; vacuola contráctil terminal. Tamaño: 80-100 µm. Altas concentraciones de oxígeno, bajas concentraciones de H2S; estabilidad ecológica si aparecen a bajas concentraciones. A elevadas concentraciones indican deterioro del sistema.

Carnívoros sésiles:

En este grupo, el único género recogido es:

Acineta sp.: Forma del cuerpo celular ovalada o triangular. Lóriga exterior comprimida lateralmente. Tentáculos agrupados en dos fascículos que tienen su origen en dos protuberancias anteriores. Macronúcleo esférico u ovoide.


Metazoos:

Dentro de este grupo han sido observados Rotíferos y Nematodos, pero a baja densidad de población.

ÍNDICE DE MADONI E ÍNDICE DE SHANNON

Las clases según Madoni mayoritariamente definidas han sido las III y IV, con porcentajes de reparto del 40 y 55%, respectivamente. En ambos casos, el grupo funcional dominante ha sido el de los bacterívoros sésiles, aunque el ingreso en la tabla de doble entrada para la determinación del SBI ha sido posible mediante los siguientes grupos: “Vorticella microstoma”, “ciliados sésiles >80%, no siendo Opercularia y V. microstoma abundantes” y “ciliados reptantes+ciliados sésiles+y/o amebas testáceas”.

La presencia de pequeños flagelados ha estado comprendida entre los 10-100 pequeños flagelados en la diagonal de la cámara de Fuchs-Rosenthal. Tan sólo un participante recogió a este grupo como el dominante, entendiéndose en este caso que la presencia en la muestra de estos superó la centena.

El número de especies identificadas se ha repartido, principalmente, entre las categorías 4-7 especies (65%) y <4 sp. (30%), siendo el valor medio de especies identificadas de 5.

En el estudio de la presente muestra, como se comentó anteriormente, la inclusión en una u otra clase, para la mayoría de participantes, ha estado supeditada al ingreso en la tabla de doble entrada mediante uno de los tres grupos definidos, así como al número de especies observadas. Entendemos que la dispersión observada en los datos se debe principalmente a las especies del género Vorticella identificadas, determinadoras del grupo funcional, y cuyas identificaciones implican cierta dificultad para los analistas menos expertos. En el reportaje fotográfico así como en el presente informe, se aportan ilustraciones e información de representantes de los distintos complejos de este género, definidos por Foissner, lo cual esperamos contribuya a mejorar este aspecto del análisis.

Dentro del grupo de los ciliados sésiles bacterívoros también han sido observados, aunque de forma incidental, ciliados sésiles coloniales como Epistylis sp. y Opercularia sp.

Con relación a la interpretación de esta situación, en la Tabla 18 se recoge una síntesis según el propio Método Madoni, de las situaciones en el reactor biológico más frecuentemente asociadas a las dominancias de unos u otros


grupos de protozoarios dentro de la comunidad de un fango activo. En el caso que nos ocupa, el predominio de ciliados sésiles, indica condiciones de “sobrecarga orgánica; fango escasamente aireado” (Madoni, 1994).

Una mejor interpretación de los resultados aquí recogidos y de la importancia de una correcta identificación de la microfauna será posibilitada si los participantes comparan el presente análisis de la microfauna con el realizado durante el ejercicio anterior. Como se comprobará, poblaciones dominantes aparentemente similares, el grupo de los bacterívoros sésiles (solitarios), con abundante representación del género Vorticella, pueden ser indicativos de situaciones en el sistema de depuración totalmente distintas.

En este sentido, el análisis de las poblaciones que acompañan al grupo establecido como dominante es crucial. Concretamente, el caso que nos ocupa, en el que la presencia de reptantes prácticamente es inexistente, y la población de ciliados nadadores está presente, entendemos que las condiciones que se están desarrollando en el reactor son poco favorables y probablemente no circunstanciales. Es decir, posiblemente no nos encontremos con un simple cambio transitorio en la operación del reactor, como se estimó para la muestra del ejercicio de febrero, en la que convivían tanto organismos propios de buenas condiciones de funcionamiento en el reactor, como bioindicadores de un tratamiento biológico en retroceso.

Grupo dominante Depuración Causas posibles

Pequeños flagelados Baja Escasa aireación del fango; sobrecarga orgánica; sustancias en fermentación.

Pequeños ciliados nadadores Mediocre Tiempo de retención celular demasiado corto;

fango escasamente aireado. Grandes ciliados

nadadores Mediocre Sobrecarga orgánica; fango escasamente aireado.

Ciliados reptantes Buena -

Ciliados sésiles y reptantes Buena -

Ciliados sésiles En descenso Fenómenos transitorios (carga discontinua, extracción de fango reciente).

Amebas desnudas y flagelados Pobre Muy alta carga orgánica, no fácilmente

degradable.

Amebas testáceas Buena -

Tabla 18. Grupos funcionales dominantes y situación en el reactor biológico asociada(Madoni, 1994).


En el presente apartado se quiere poner de manifiesto la importancia de realizar el recuento de pequeños flagelados adecuadamente, empleando la cámara de Fuchs-Rosenthal. Con relación al recuento de pequeños flagelados, han sido varios los participantes que han tenido dificultad con la identificación de pequeños flagelados y su cómputo. El principal problema residió en la distinción entre pequeños y grandes flagelados y, adicionalmente, en la ubicación de la densidad de esta población.

En cualquier caso, se recuerda a los participantes que no se precisa de la identificación de los pequeños flagelados, ni al nivel de género ni al de especie. Por parte de los grandes flagelados, los géneros más frecuentes en fangos activos son Peranema, Euglena y Entosiphon, todos ellos aparecidos en las muestras de este circuito y descritos en los informes correspondientes. Esperamos que esta aclaración simplifique el trabajo de los analistas menos expertos.

Por otra parte, con las consultas planteadas por los participantes ante la confusión entre pequeños y grandes flagelados, se esbozaba una situación poco frecuente en un fango activo, el predominio de los grandes flagelados en la microfauna, que tampoco se ajustaba a la realidad de la muestra. Esta situación, además de poco frecuente, no está contemplada por el Método Madoni, por lo que tiempo atrás nos pusimos en contacto con el Profesor Madoni, a quien trasladamos esta misma cuestión, la cual reproducimos a continuación:

Consulta efectuada al Profesor Madoni:

"De forma ocasional hemos observado una particular situación en algunas muestras de fangos activos maduros: la dominancia de los grandes flagelados (Peranema sp., principalmente). Sin embargo, la dominancia de este grupo funcional no es contemplada por el SBI (sólo lo hace para pequeños flagelados). ¿Cuál es la respuesta del SBI a esta poco frecuente situación? ¿Es posible definir la calidad biológica de estas muestras?”

La respuesta se reproduce a continuación:

"The massive presence (dominance) of large flagellates (or nematodes, rotifers, etc.) is an occasional event in AS. In this case, two situations may be present:

1) the microfauna is present only with these organisms,

2) other organisms are present (i.e., attached ciliates, and/or crawlers, etc.).

In the first case it is not possible to apply the SBI method (due to the anomalous situation); in the second case, we can apply the method entering the table with the prevalent group of the microfauna (excluding the large flagellates).


Nevertheless, in the final report the presence of these organisms should be considered."

Es decir, en el caso que nos ocupa, al estar presente una población de ciliados sésiles bacterívoros, además de la supuesta población dominante de grandes flagelados, la determinación del SBI debería realizarse atendiendo a dicha población de ciliados sésiles. No obstante, en el informe final de evaluación de la microfauna, como indica el profesor, es necesario recoger dicha observación.

En cuanto al Índice de Shannon, los resultados obtenidos por los distintos participantes han resultado igualmente dispersos (Figura 6), presentando un valor medio de 1,2. Se han destacado los valores más extremos, aportados por los participantes 1 y 14, con las densidades máxima y mínima respectivamente. En este caso, el tiempo transcurrido entre la toma de muestras y la observación es determinante (Tabla 1).

IDENTIFICACIÓN DE ESPECIES BACTERIANAS

En la Tabla 19 se recogen conjuntamente las características que describen a los organismos filamentosos más frecuentes en la muestra según la evaluación de los distintos participantes (Jenkins et al., 1993 y Seviour y Blackall, 1999). La mayoría de estos organismos están recogidos en el Anexo fotográfico.

De los datos observados en la Tabla 7 se deduce que los microorganismos identificados más comúnmente, incluidos entre las categorías "dominante" (de forma compartida o no con otro filamento) y "secundaria" han sido Sphaerotilus natans y Thiothrix sp. Ambos filamentos han sido incluidos también en el grupo “otros filamentos”, aunque con menor frecuencia. Secundariamente, el morfotipo 1863 ha sido incluido como filamento dominante por algunos analistas, aunque su inclusión ha sido, principalmente, en el grupo de los filamentos secundarios y entre “otros filamentos”.

En el grupo “otros filamentos”, la bacteria más comúnmente observada ha sido Haliscomenobacter hydrossis, seguida del Tipo 1863 y el Tipo 1701. En este mismo grupo, menos frecuentemente, otros filamentos observados, además de los mismos identificados como dominantes, fueron Nostocoida limicola y Streptococcus sp.

Un pequeño sector de los participantes recogió en su parte de resultados al filamento Tipo 021N, quizás por el parecido con otros filamentos presentes en la muestra como Thiothrix sp., cuya reactiva a Gram es similar por la presencia de gránulos de azufre.


Tabla 19. C

aracterísticas morfológicas y reacción a tinciones de los filam

entos más abundantes en la m

uestra según criterio de los distintos participantes.


En cuanto a la ecología de los filamentos mayoritariamente observados en la muestra, es sabido que el desarrollo de Sphaerotilus natans, Tipo 1701 o Haliscomenobacter hydrossis está favorecido por concentraciones de oxígeno relativamente bajas en el tanque de aireación; una sobrecarga orgánica puede inducir esta deficiencia en la oxigenación. Por esto se considera que los tanques de aireación deberían ser operados a una concentración mínima de 2 mg O2/L, con el fin de evitar el predominio de filamentos como Sphaerotilus natans (Chudoba, 1985). La cinética de crecimiento de S. natans y su interacción con la bacteria formadora de flóculo Citrobacter sp. ha sido estudiada bajo condiciones de laboratorio, utilizando técnicas de cultivo en continuo. En dicho estudio se demostró que la concentración de oxígeno es el factor que mayormente contribuye a la proliferación de este filamento en el fango activo. A diferencia con otros filamentos tales como Microthrix parvicella o el Tipo 0041, la dependencia de Sphaerotilus natans por la concentración de oxígeno está clara (Bitton, 2005).

Altas concentraciones de sulfuro en el reactor biológico son causa del desarrollo masivo de bacterias tales como Thiothrix sp., Beggiatoa sp. o Tipo 021N. Todos ellos utilizan el sulfuro como fuente de energía, oxidándolo hasta azufre en estado elemental, que es acumulado como gránulos de azufre. Con relación a esta situación, recordamos la interesante anotación realizada por un participante, el cual reconoció “olor a azufre” y condiciones de septicidad en la muestra (apartado destinado a conclusiones generales). Otros participantes, anotaron la presencia de Thiospirillum sp., organismo que se desarrolla libremente, no asociado al flóculo, y que al igual que los anteriormente citados presenta la capacidad de acumular azufre en forma de gránulos intracelulares.

En la siguiente figura, extraída de Jenkins et al. (2004), se recoge la relación entre el tiempo de retención celular (TRC) y la carga másica (F/M) en los organismos de observación más frecuente en el fango activo, resaltándose los más frecuentemente observados en la muestra:


Como se extrae de la información recogida en la figura anterior, la población formada por S. natans, Thiothrix sp., H. hydrossis y el Tipo 1701 se desarrolla bajo unas condiciones de F/M y TRC similares, a la vez que amplias. El morfotipo 1863 se desarrolla en un rango de condiciones para ambos parámetros más estrecho, aunque la coincidencia en cuanto a las bajas concentraciones de oxígeno y los elevados valores de la DBO5 en el reactor son comunes.

Ambos requerimientos de crecimiento para la población de organismos filamentosos, baja oxigenación y elevada carga orgánica, están en estrecha relación con el deficiente estado de estructuración del fango, en el que el crecimiento disperso era abundante. Es decir, en un sistema de fango activo bien operado, las bacterias que no están asociadas al flóculo son consumidas por los protozoos, reduciéndose así la presencia del crecimiento disperso. Sin embargo, como resultado de elevadas cargas orgánicas y limitaciones de oxígeno, el crecimiento disperso aparece, asociado a un fallo en el proceso de floculación por parte de las bacterias floculantes. La presencia de estas células dispersas en un número muy elevado, son la causa principal de un efluente turbio. Entre los organismos observados en la muestra, causantes de este crecimiento disperso, están: Tipo 1863, Flexibacter sp. y Streptococcus sp.


A modo de resumen, en la tabla siguiente, extraída de Richard et al. (1985), se recogen las causas principales de proliferación asociadas a los distintos morfotipos filamentosos. Pese a estar bastante simplificada, en ella se confirman algunas de las ideas expuestas anteriormente.

Causas asociadas más comúnmente a los

Por último, entre los organismos formadores de flóculo, con frecuencia fácilmente observable dentro de los flóculos, quedó recogido Zoogloea sp. Nuevamente, la presencia de este microorganismo está asociada a valores altos de la relación F/M (“food/microorganisms”), especialmente si el agua residual contiene sustratos fácilmente degradables, compuestos orgánicos solubles y pH bajo (Jenkins et al., 2004).

En resumen, podría concluirse que la muestra analizada es diversa en su población de bacterias filamentosas, presentando una presencia de éstas media (Figura 4 y Tabla 7). El valor medio de densidad de organismos filamentosos, extraído del total de los datos, es de aproximadamente 3, es decir, "filamentos en todos los flóculos 1-5 fil./flóculo". El número medio de especies identificadas ha sido de 5.

El efecto del crecimiento filamentoso sobre la estructura del flóculo, más comúnmente anotado por los participantes, ha sido la disgregación.


6. CONSIDERACIONES PARA LOS PRÓXIMOS EJERCICIOS INTERLABORATORIOS

Agradecemos el esfuerzo realizado a los distintos laboratorios durante este segundo ejercicio y especialmente a aquellos que se han incorporado al circuito. En algunos casos, el avance realizado por los analistas ha sido notable, muchos de ellos iniciándose en este tipo de prácticas por primera vez, por lo que les hacemos llegar nuestras más sinceras felicitaciones.

Una vez más, rogamos a los participantes que cumplimenten de forma rigurosa los distintos apartados que se proponen para cada una de las hojas de trabajo. Si bien durante estos primeros ejercicios hemos tratado de cumplimentar todos los apartados posibles que los participantes habían dejado desiertos, en próximos ejercicios esta posibilidad no se contemplará.

Igualmente, se ruega a los participantes que cumplan con los plazos propuestos de entrega de resultados o, de lo contrario, el desarrollo general del ejercicio se retrasa considerablemente.

Para la próxima temporada estarán disponibles las nuevas hojas de trabajo, a las que se habrán incorporado algunas de las modificaciones que durante este circuito se han estimado oportunas.

Como en ejercicios anteriores, estamos interesados en conocer todas las objeciones, desacuerdos u observaciones, que pudieran surgir en torno al presente informe. Todas ellas serán tenidas en cuenta y discutidas en la jornada final de interlaboratorios. Igualmente, se agradecen todas las observaciones relativas a las hojas de trabajo, pues nuestro interés es mejorar este material en todo lo posible. También será necesaria la inestimable colaboración de los participantes para mejorar algunos apartados de la "hoja 2 de trabajo" en próximos ejercicios interlaboratorios, concretamente aquellos destinados al recuento de bacterias filamentosas.

En el caso de que exista dificultad en la determinación de alguno de los parámetros solicitados en el parte de resultados, los analistas deberán ponerse en contacto con nosotros antes de la realización de la próxima intercomparativa.

Con relación al material fotográfico, nos gustaría invitar a los laboratorios participantes a aportarlo para ser añadido al anexo fotográfico, tanto en el apartado de microfauna y bacterias filamentosas como en el de características macro- y microscópicas del fango activo. En ese caso, es imprescindible que el nombre del autor aparezca inserto en el mismo archivo fotográfico (jpg o tiff) y, especialmente, que la identificación del organismo aparezca claramente recogida


en la documentación adjunta. Igualmente, todos los comentarios que los participantes consideren oportunos serán incluidos en el informe final.

En cuanto al tema de la microfotografía, todos los participantes están invitados a participar en el Concurso de Microfotografía que GBS ha convocado y que tendrá resolución el día de la jornada final de interlaboratorios, en la III Jornada de Transferencia sobre Microbiología del Fango Activo, la cual tendrá lugar el día 26 de Octubre y en la que esperamos su asistencia.

Saludos cordiales y feliz verano,

Grupo Bioindicación Sevilla


7. AGRADECIMIENTOS

A D. Juan Antonio Díaz, de la empresa IZASA, por su imprescindible asesoramiento técnico en microscopía óptica y su disponibilidad en todo momento.

A D. Emilio Serrano y D. Josep Xavier Sensada, de la empresa Surcis S.L., por el estudio respirométrico realizado y por el interés mostrado durante todo momento en el desarrollo del mismo.

A la revista Tecnología del Agua, patrocinadora de GBS.

Al personal de la EDAR Ranilla, por la ayuda prestada a GBS durante todo el circuito interlaboratorios.

Nuestro agradecimiento a D. Andrés Zornoza (EDAR Quart de Benager), por el material fotográfico aportado y su participación.

A todos los participantes, especialmente aquellos que se incorporan al circuito, por el esfuerzo realizado y por los comentarios y observaciones añadidos en el parte de resultados.


8 .BIBLIOGRAFÍA

◙ Bitton, G. (2005). Wastewater Microbiology. 3rd Edition. Wiley-Liss.

◙ Chudoba, J., Cesh, J.S., Farcac, J. y Grau, P. (1985). Control of activated sludge filamentous bulking. Experimental verification of kinetic selection theory. Water Res. 19, 191-196.

◙ Foissner, W. y Berger, H. (1996). A user-friendly guide to the cilates (Protozoa, Ciliophora) commonly used by hidrobiologists as bioindicators in rivers, lakes, and waste waters, with notes on their ecology. Freshwater Biology 35, 375-482.

◙ Grupo Biondicación Sevilla y A. Zornoza (2004-2005). Coleccionable de fichas sobre Microbiología del Fango Activo. Tecnología del Agua Octubre 2004-Enero 2005.

◙ Jenkins, D., Richard, M. G. y Daigger, G. T. (1993). Manual on the Causes and Control of Activated Sludge Bulking and Foaming. WRC, Pretoria y USEPA, Cincinnati.

◙ Jenkins, D., Richard, M. G. y Daigger, G. T. (2004). Manual on the Causes and Control of Activated Sludge Bulking and Foaming. Lewis Publishers.

◙ Jiménez, C., Fernández, N., de la Horra, J. M., Rodríguez, E., Isac, L., Salas, D. y Gómez, E. (2001). Sistema rápido de estimación de los rendimientos en depuración de una E.D.A.R. en función de las características macroscópicas y microscópicas del fango activado. Tecnología del Agua 216, 40-44.

◙ Madoni, P. (1994). A sludge biotic index (SBI) for the evaluation of the biological performance of activated sludge plants based on the microfauna analysis. Wat. Res. 28, 1, 67-75.

◙ Madoni, P. (1996). The Sludge Biotic Index for the Evaluation of the activated-sludge plant performance: the allocation of the ciliate Acineria uncinata to its correct functional group. Acta Protozoologica 35, 209-214.

◙ Richard, M.G., Hao, O. y Jenkins, D. (1985). Growth kinetics of Sphaerotilus species and their significance in activated sludge bulking. J. Water. Pollut. Control Fed. 57, 68-81.

◙ Streble, H. y Krauter, D. (1987). Atlas de los microorganismos de agua dulce. La vida en una gota de agua. Ed. Omega, Barcelona.

◙ Wanner, J. (1997). Microbial population dynamics in biological wastewater treatment plants. En: Microbial Community analysis: the key to the design of


biological wastewater treatment systems. T.E. Cloete y N.Y.O. Muyima Eds. University Press. Cambridge.

◙ Warren, A. (1986). A revision of the genus Vorticella (Ciliophora: Peritrichida). Bull. Br. Mus. Nat. Hist. (Zool). 50, 1, 1-57.

◙ Zornoza, A. (2005). Determinación de ciliados sésiles en estado de estrés. II Jornada Técnica sobre Microbiología del Fango Activo. Sevilla, 27 de Octubre de 2005. Asociación científica Grupo Bioindicación Sevilla.

◙ http://wslar.epfl.ch/mitchell/edward/testate_amoebae.htm

Edward Mitchell, 2005.

informe del ensayo interlaboratorios para fangos...

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