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Rev. Cubana Quím.

Vol. 29, no.1, enero-abril, 2017, págs. 89-102, e-ISSN: 2224-5421

http://ojs.uo.edu.cu/index.php/cq

Influencia de las condiciones de cultivo sobre el crecimiento y

contenido de pared celular en una cepa floculante de Kluyveromyces

marxianus

Influence of the Culture Conditions on the Growth and Cell Wall Content

in a Flocculent Strain of Kluyveromyces marxianus

Dr.C. Manuel Serrat−DíazI, Ph.D. Juan A. Vallejo−Vidal

II, Ph.D. José M.

Ageitos−MartínezII, MSc. Gabriel Llauradó-Mauri

I, MSc. Imilci Urdaneta−Laffita

III,

Ph.D. Tomás G. VillaII

[email protected]

ICentro de Estudios de Biotecnología Industrial, Universidad de Oriente, Santiago de Cuba,

Cuba; IIDepartamento de Microbiología y Parasitología, Facultad de Farmacia, Universidad

de Santiago de Compostela, Santiago de Compostela, España; III

Departamento de Farmacia,

Facultad de Ciencias Naturales, Universidad de Oriente, Santiago de Cuba, Cuba

Recibido: 18 de mayo de 2016 Aprobado: 2 de octubre de 2016

Resumen Los polisacáridos de paredes celulares de levadura poseen reconocidos efectos

inmunomoduladores, prebióticos e hipocolesterolémicos. En este trabajo se evaluó la influencia

de las condiciones de cultivo sobre el crecimiento y contenido de la pared celular en una cepa

floculante de la levadura Kluyveromyces marxianus. Se encontró que el contenido promedio de

pared celular estuvo en el rango referido habitualmente (15-30 %); este fue afectado

principalmente por la naturaleza de las fuentes de nitrógeno y carbono y la temperatura. Se

observó una correlación negativa entre el contenido de pared celular y la concentración de

biomasa, siendo esta última el factor principal en la producción de pared celular por la levadura.

El contenido de carbohidratos totales en pared celular estuvo fuertemente influenciado por

factores nutricionales y físicos del cultivo. Estos resultados sugieren que las condiciones de

cultivo resultan de especial significación para el desarrollo de procesos productivos de

preparados pared celular en levaduras.

Palabras clave: Kluyveromyces marxianus, levadura, pared celular, condiciones de cultivo.

Abstract Polysaccharides from yeast cell wall show immunomodulatory, prebiotic and

hypocholesterolemic effects. In this study the influence of culture conditions on growth and

content of the cell wall in a flocculent yeast strain of Kluyveromyces marxianus was evaluated.

It was found that the average content of the cell wall ranged according to usually referred values

(15-30%); this one was affected by nitrogen and carbon sources and temperature, mainly. It was

observed a negative correlation between cell wall content and biomass concentration, being the

last one the most important factor in cell wall production by the yeast. The total carbohydrates

content in cell wall was hardly influenced by the nutritional and physic factors of the culture.

These results suggest that the culture conditions are of special significance for the development

of production processes of cell wall preparations in yeasts.

Keywords: Kluyveromyces marxianus, yeast, cell wall, culture conditions.

Manuel Serrat−Díaz, Juan A. Vallejo−Vidal, José M. Ageitos−Martínez, Gabriel

Llauradó-Mauri, Imilci Urdaneta−Laffita, Tomás G. Villa

90 Rev. Cubana Quím., vol. 29, no. 1, enero-abril, 2017. e-ISSN 2224-5421

Introducción

Las levaduras tienen actividades de fermentación diversas, por lo que han sido usadas

desde la antigüedad para la producción de variadas clases de alimentos tales como

cerveza, pan, vinos y derivados lácteos fermentados. Las levaduras desecadas

(usualmente inactivadas por el calor) también han sido usadas como un suplemento

nutricional pues las células de levaduras íntegras son ricas en vitaminas del grupo B,

fibras dietéticas y proteínas. Entre las especies de levadura más conocidas y utilizadas

se encuentran Saccharomyces cerevisiae, Candida utilis y dos del género

Kluyveromyces: K. lactis y K. marxianus [1, 2].

Sin embargo, las levaduras de la especie Kluyveromyces marxianus han ganado

protagonismo en los últimos años en la industria biotecnológica, debido a las numerosas

ventajas que presentan con respecto a la más tradicional S. cerevisiae. Entre estas

ventajas pueden citarse sus mayores velocidades de crecimiento, termotolerancia,

fenotipo Crabtree negativo y capacidad de crecer sobre una gama más amplia de

fuentes de carbono [3, 4]. Además, comparte con S. cerevisiae su estatus reconocido de

organismo seguro para el hombre (GRAS), aspecto este esencial para el uso de un

microorganismo en la obtención de productos para consumo humano [5].

La cepa K. marxianus CCEBI 2011 (Colección de Cultivos Microbianos del Centro de

Estudios de Biotecnología Industrial de la Universidad de Oriente) ha sido muy

estudiada en los últimos años, tanto desde el punto de vista fisiológico como de su

potencial de aplicaciones [6-9]. Ejemplo de ello fue la obtención, mediante

modificación genética in vitro de esta cepa, de clones con fenotipo floculante inducible

por anoxia [10].

Los efectos beneficiosos de las levaduras sobre la salud humana son objeto de

numerosas investigaciones en la actualidad. Por ejemplo, en un estudio donde se

comparó de la actividad hipocolesterolémica de 81 levaduras, se encontró que la K.

marxianus YIT 8292 exhibía la actividad hipocolesterolémica más potente [11] y, un

año más tarde, se reportó que los polisacáridos de la pared celular eran los principales

componentes activos de esta levadura [5]. Entre los componentes bioactivos destacan

los (1,3)-β-D- glucanos y α-D-mananos, componentes mayoritarios de la pared celular

del microorganismo [12]. Por otro lado, también ha sido referido el efecto estimulante

sobre el sistema inmune de estos polisacáridos, especialmente de los (1,3)-β-D-glucanos,

Influencia de las condiciones de cultivo sobre el crecimiento y contenido de pared celular en

una cepa floculante de Kluyveromyces marxianus

Rev. Cubana Quím., vol. 29, no. 1, enero-abril, 2017. e-ISSN 2224-5421 91

así como de sus actividades antiinflamatoria, antimicrobiana, antiviral, antitumoral,

radioprotectora y cicatrizante [12, 13].

Con vista a lograr una explotación biotecnológica integral de la levadura Kluyveromyces

marxianus CCEBI 2011, en particular de su estirpe floculante, resultaría de gran interés

el aprovechamiento de los polisacáridos estructurales derivados de su pared celular. Esta

investigación tuvo como objetivo evaluar cómo se relacionan las afectaciones en el

crecimiento como consecuencia de las variaciones en las condiciones de cultivo

(nutricionales, físico-químicas) con el contenido y composición polisacarídica de la

pared celular en esta cepa de levadura. Este ha sido un aspecto muy poco estudiado en

levaduras. Sin embargo, el control sobre el contenido y la composición de la pared

celular sería relevante ante la perspectiva del interés comercial creciente en la

producción de β-glucanos y mananos para fines agroalimentarios, farmacéuticos y

cosméticos [14].

Materiales y métodos

Microorganismo. Se utilizó la cepa Kluyveromyces marxianus CCEBI 2011 Flo 5.4

[10] depositada en la Colección de Cultivos del Centro de Estudios de Biotecnología

Industrial (Universidad de Oriente, Santiago de Cuba).

Obtención de la biomasa de levadura. En todos los casos el medio de cultivo consistió

en el medio sintético completamente definido para levaduras [15]. Se empleó glucosa a

20 g/L como fuente de carbono, excepto en los casos donde se evaluó otra fuente

carbonada (sacarosa y lactosa) o en los cultivos en microaerobiosis, donde la

concentración fue de 100 g/L. Como fuente de nitrógeno se usó sulfato de amonio a 5

g/L, disminuyendo la concentración de la misma a 2 g/L y 0,5 g/L en los experimentos

donde se estudió el efecto de la limitación por nitrógeno; cuando la variable fue la

naturaleza de la fuente de nitrógeno se sustituyó la sal de amonio por peptona a 5 g/L.

Los medios se esterilizaron a 121 ºC durante 20 min.

Los cultivos se propagaron en agitación a 200 rpm y temperatura de 30 ºC, con la

excepción de los cultivos en microaerobiosis, que se mantuvieron sin agitar y aquellos

donde se evaluó la influencia de la temperatura, donde también se incubó a 40 ºC. El pH

inicial se ajustó siempre a 5,4, excepto en la variante donde se estudió el efecto de esta

variable, en cuyo caso también se evaluó el pH inicial de 3,5.

Los cultivos aerobios se llevaron a cabo en matraces de 100 mL, conteniendo 25 mL de

medio, en tanto los cultivos microaerobios se realizaron en matraces de 500 mL,




conteniendo 250 mL de medio. Todos los cultivos son inoculados a razón del 2 % (v/v)

con un cultivo fresco de la levadura en medio YPD (extracto de levadura 10 g/L,

peptona 20 g/L y glucosa 20 g/L). Los cultivos agitados se incubaron durante 14 horas y

los estáticos por espacio de 48 horas, correspondiendo en ambos casos a cultivos en fase

exponencial tardía. Los experimentos se realizaron por triplicado.

Para la colecta de la biomasa, los tres cultivos réplica correspondientes a cada variable

experimental en estudio, se unieron y se centrifugaron (9000 rpm, 10 min, 4 ºC). El

sobrenadante se utilizó para la determinación del pH final de los cultivos. La biomasa se

lavó dos veces con agua destilada, se resuspendió en 10 mL de agua destilada y se

tomaron tres alícuotas de 1 mL para la determinación de la concentración celular (base

seca) gravimétricamente. La suspensión celular restante se centrifugó, se escurrió bien y

se guardó a -20 ºC hasta su utilización en la obtención de las paredes celulares.

Preparación de paredes celulares. Primeramente se estandarizó el protocolo de

ruptura celular en vortex con perlas de vidrio (0,45-0,55 mm Ø, B. Braun Biotech), de

forma tal que se lograse un índice de ruptura superior al 99 %, el cual se comprobó de

dos maneras distintas: mediante observación al microscopio del debris celular y

mediante conteo de viables en medio YPDA (YPD al que se adicionó agar a 20 g/L).

Para la ruptura y preparación de las paredes celulares se siguió el protocolo descrito por

de Groot et al. [16] con ligeras modificaciones. La ruptura completa se consiguió con 10

ciclos de 3 min de agitación en vortex y 30 seg de reposo en hielo. Para la ruptura se

utilizó tampón Tris-HCl 10 mM (pH 8) conteniendo CaCl2 0,2 g/L.

En la preparación de las paredes celulares se contempló la extracción repetida (4 veces)

a 100 ºC durante 10 min con solución detergente (Tris–HCl 50 mM, pH 7,8; SDS 2 %,

Na–EDTA 100 mM, NaCl 150 mM y β-mercaptoethanol 0,8 % (v/v)). Estas

extracciones se realizaron con el objetivo de separar toda la proteína no unida

covalentemente a la pared celular y los restos de membrana (lípidos). Los preparados de

pared celular se lavaron dos veces con etanol absoluto, luego tres veces con acetona y se

liofilizaron para la determinación del peso en balanza analítica (Sartorius). Se

conservaron en viales sellados a -20 ºC.

Caracterización de la composición de la pared celular. Para el análisis del contenido

de polisacáridos estructurales se efectuó la hidrólisis completa de los preparados de

pared celular con ácido sulfúrico 72 % (m/m) a temperatura ambiente, seguida de

hidrólisis en ácido sulfúrico 2 mol/L a 100 ºC, por 4 h, según [17]. Se llevó un control




de -glucano (laminarina) y manano de levadura (ambos de Sigma) para el estimado del

recobrado de monosacáridos.

A los hidrolizados se les determinó el contenido de carbohidratos totales por el método

del fenol-sulfúrico [18] usando como patrón una mezcla de glucosa/manosa 6:4 [14].

Para comprobar la extensión de la hidrólisis se realizó la determinación colorimétrica

del contenido de azúcares reductores totales [19] empleando el mismo patrón que para

el ensayo de carbohidratos totales.

Resultados y discusión

Influencia de las condiciones de cultivo sobre el crecimiento de la levadura y la

biosíntesis de la pared celular

La concentración de biomasa del clon floculante (inducible por anoxia) de la cepa de

levadura K. marxianus CCEBI 2011 se afectó de manera significativa ante los cambios

en los factores nutricionales y ambientales de cultivo (tabla 1).

TABLA 1. CRECIMIENTO DE LA LEVADURA, CONTENIDOA Y PRODUCCIÓN

B

DE PARED CELULAR

Condiciones

pH final

del cultivo

Concentración

de biomasa

(mg/mL, base seca)

Contenido de

Pared celular

(%)

Producción

de pared celular

(mg/mL)

Glucosac

2,2 3,22 ± 0,19 27,5 ± 0,63 0,89 ± 0,06

Sacarosa 2,2 2,97 ± 0,16 30,4 ± 0,76 0,90 ± 0,06

Lactosa 2,7 0,89 ± 0,11 18,4 ± 0,58 0,16 ± 0,02

(NH4)2SO4 0,5 g/L 2,3 2,11 ± 0,14 27,6 ± 0,49 0,58 ± 0,05

(NH4)2SO4 2,0 g/L 2,2 2,59 ± 0,20 23,3 ± 0,40 0,60 ± 0,05

(NH4)2SO4 5,0 g/L 2,2 2,95 ± 0,19 26,7 ± 0,48 0,79 ± 0,06

Peptona 5,0 g/L 3,6 4,65 ± 0,22 12,3 ± 0,24 0,57 ± 0,03

30ºCc

2,2 3,22 ± 0,19 27,5 ± 0,63 0,89 ± 0,06

40ºC 2,4 2,51 ± 0,24 31,0 ± 0,77 0,78 ± 0,09

pH 3,5 2,2 3,81 ± 0,14 17,5 ± 0,30 0,67 ± 0,03

pH 5,4c

2,2 3,22 ± 0,19 27,5 ± 0,63 0,89 ± 0,06

Aerobiosisc

2,2 3,22 ± 0,19 27,5 ± 0,63 0,89 ± 0,06

Microaerobiosisd

2,7 0,76 ± 0,18

26,1 ± 0,46 0,20 ± 0,05

(Leyenda)

a) Expresado como gramos de pared celular liofilizada por 100 gramos de masa celular seca.

b) Expresado como miligramos de pared celular por mililitro de cultivo.

c) Estos resultados corresponden a una misma variante experimental (fuente de carbono:

glucosa 20 g/L, fuente de nitrógeno: sulfato de amonio 5 g/L; pH 5,4, aerobiosis, 30 ºC).

d) En esta variante la concentración inicial de sustrato fue 5 veces mayor que en las restantes

variantes.

e) Los valores son presentados como la media ± desviación estándar de tres experimentos

independientes para la concentración de biomasa y de tres muestras aleatorias para el

análisis de la pared celular.




De este modo, se observó una disminución marcada en respuesta a la limitación de

nitrógeno, alcanzándose concentraciones de biomasa un 30 % menor cuando la

concentración de sulfato de amonio fue de 0,5 g/L. La naturaleza de las fuentes de

nitrógeno y carbono también incidieron en la concentración final de biomasa, la cual se

favoreció en presencia de la fuente de nitrógeno orgánico (peptona), ocurriendo lo

contrario cuando la fuente de carbono fue lactosa, donde se observó una reducción de

más del 70 %. El pH inicial del medio de cultivo y la temperatura también afectaron los

rendimientos de biomasa, los cuales fueron superiores a pH 3,5 (con respecto a 5,4) y a

la temperatura de 30 ºC (con respecto a 40 ºC). La oxigenación del cultivo fue un

parámetro que afectó drásticamente la concentración final de biomasa, la cual llegó a

ser, en condiciones de microaerobiosis, solo el 24 % de la alcanzada en condiciones de

aerobiosis, aún cuando en este cultivo se partió de una concentración inicial de glucosa

cinco veces mayor.

Las afectaciones antes descritas están relacionadas tanto con aspectos cinéticos como

energéticos del crecimiento, predominando estos últimos. Por ejemplo, las menores

concentraciones celulares en microaerobiosis y a 40 ºC obedecen al menor rendimiento

energético de la fermentación con respecto la respiración y a los mayores gastos en

mantenimiento celular, respectivamente. El crecimiento sobre la fuente de nitrógeno

orgánico también implica un menor gasto energético para la célula con relación al uso

del nitrógeno inorgánico [20]. La baja concentración de biomasa cuando la levadura

creció sobre lactosa fue un hecho ya referido con anterioridad por Serrat [21] para la

variante salvaje de K. marxianus CCEBI 2011. Esto podría estar ocasionado por

limitaciones asociadas al transporte o a la hidrólisis de la lactosa en esta cepa, la cual

fue aislada de residuales del beneficio húmedo del café y no asociada a ambientes

lácteos [22].

El crecimiento de la levadura en medio mineral se caracterizó por una pronunciada

disminución del pH. Hacia el final de la fase exponencial, en la mayoría de las variantes

estudiadas, el pH estuvo alrededor de 2,2, siendo algo superior (2,7) en el cultivo donde

se usó lactosa como fuente de carbono y en el que se desarrolló bajo limitación de

oxígeno. Estos dos últimos casos se corresponden con los cultivos que presentaron

menor crecimiento.

En la variante que empleó peptona como fuente de nitrógeno se presentó la menor

variación del pH, lo cual concuerda con el reconocido efecto tampón de este

componente [23]. La disminución del pH en cultivos de levadura en medio mineral, sin




control de pH, es usual en presencia de sales de amonio, debido a la liberación de iones

hidronio que acompaña la asimilación del nitrógeno presente [23].

En correspondencia con el carácter dinámico de la biosíntesis de la pared celular [14] es

de esperar que las variaciones antes señaladas en los rendimientos de biomasa, como

consecuencia de diferentes condiciones nutricionales y físico-químicas, se relacionen

con posibles afectaciones sobre la masa específica y composición de esta estructura

celular.

Como puede observarse en la tabla 1, los contenidos promedio de pared celular

estuvieron dentro del rango informado usualmente para levaduras (15-30 %) [24],

siendo influenciados principalmente por la naturaleza de las fuentes de nitrógeno

y carbono y por la temperatura. Se observó un valor por debajo de estos promedios en

presencia de la fuente orgánica de nitrógeno (12,3 %); en tanto, los valores más

altos correspondieron a los cultivos donde se usó sacarosa como fuente de carbono

(30,4 %) y en los sometidos a estrés térmico (40 ºC), donde el contenido de pared

celular llegó al 31 %.

Para los cultivos aerobios, excluyendo del análisis al cultivo con lactosa, se observó una

correlación negativa fuerte (R = -0,82) entre la concentración celular al final de la fase

exponencial y el contenido de pared celular en K. marxianus (figura 1).

Figura 1. Correlación entre el contenido de pared celular y la concentración de biomasa

Backhaus et al. (2010) [17], en su estudio sobre la composición de la pared celular de K.

lactis bajo diferentes condiciones de cultivo, encontraron que cuando la levadura crece




sobre etanol el espesor de la pared es aproximadamente un 64 % mayor que el

observado cuando crece sobre glucosa; en tanto, se conoce que el rendimiento de

biomasa en K. marxianus CCEBI 2011 crecido sobre etanol es un 36 % del alcanzado

sobre glucosa [21].

Integrando estos resultados, se puede afirmar que existe correspondencia con la

correlación encontrada en el presente estudio. La disminución del rendimiento de

crecimiento está asociada a un mayor gasto energético en el proceso de síntesis de la

nueva biomasa o en el mantenimiento celular, lo cual podría desencadenar mecanismos

de protección en la célula que impliquen el engrosamiento de la pared celular. Hasta

donde se conoce, este es el primer informe de la existencia de correlación entre el

rendimiento de biomasa y el contenido de pared celular.

En cualquier proceso de obtención de productos de origen microbiano, la concentración

final de estos con respecto al volumen del cultivo constituye un parámetro de crucial

importancia para la economía del bioproceso, debido a su incidencia tanto en el

aprovechamiento de las materias primas como en los gastos de recuperación [25]. En el

caso de un producto intracelular, este parámetro es afectado simultáneamente por dos

variables, la concentración de biomasa y el porcentaje en peso del producto de interés

en la masa celular. En la tabla 1 pueden observarse las producciones de paredes

celulares, expresadas como masa de pared por unidad de volumen de cultivo, alcanzadas

bajo las diferentes condiciones estudiadas.

No se observaron diferencias significativas en las concentraciones de paredes celulares

a las dos temperaturas ensayadas (30 y 40 ºC), pero sí se ocurrieron importantes

disminuciones al bajar el pH a 3,5, en el medio con peptona como fuente de nitrógeno,

en los cultivos limitados de nitrógeno y de oxígeno y, de modo muy marcado, en el

cultivo donde se utilizó lactosa como fuente de carbono. En la mayoría de los casos, el

factor que más peso tuvo en estos resultados fue la disminución en la concentración de

biomasa, a excepción de las variantes a pH 3,5 y en el cultivo con peptona, donde el

factor más importante fue el contenido notablemente bajo de pared celular.

Influencia de las condiciones de cultivo sobre el contenido en polisacáridos de la

pared celular

En esta investigación se realizó la determinación de los contenidos de carbohidratos y

azúcares reductores totales por los métodos del fenol-sulfúrico y Nelson,

respectivamente, a cada uno de los hidrolizados de pared celular. Se esperaba que

ambos métodos rindieran resultados similares y, en caso de observarse una proporción




carbohidratos totales/azúcares reductores significativamente superior a la unidad, este

resultado podría tomarse como indicativo de una hidrólisis ácida incompleta. Esto, a su

vez, podría sugerir algún tipo de alteración estructural importante en la pared celular.

Como se puede apreciar en la tabla 2, en la casi totalidad de las muestras ensayadas se

encontraron relaciones carbohidratos/azúcares reductores próximas a 1, dentro de los

límites del error experimental.

TABLA 2. CONTENIDO DE CARBOHIDRATOS EN LA PARED CELULAR DE K.

MARXIANUS BAJO DIFERENTES CONDICIONES DE CULTIVO

Condiciones Carbohidratos Totales

(%)a

Carbohidratos/Reductores

Glucosab

62,4 ± 1,82 1,21 ± 0,07

Sacarosa 68,8 ± 3,40 1,09 ± 0,11

Lactosa 44,9 ± 1,32 1,57 ± 0,09

(NH4)2SO4 0,5 g/L 70,1 ± 3,96 1,23 ± 0,14

(NH4)2SO4 2 g/L 63,0 ± 3,56 0,79 ± 0,09

(NH4)2SO4 5 g/L 63,0 ± 3,56 1,01 ± 0,11

Peptona 5 g/L 53,4 ± 1,34 1,00 ± 0,05

30ºCb

62,4 ± 1,82 1,21 ± 0,07

40ºC 80,7 ± 4,45 1,07 ± 0,12

pH 3,5 59,4 ± 2,56 1,07 ± 0,09

pH 5,0b

62,4 ± 1,82 1,21 ± 0,07

Aerobiosisb

62,4 ± 1,82 1,21 ± 0,07

Microaerobiosisc

52,4 ± 2,70 0,98 ± 0,10

(Leyenda)

a) Expresado como gramos de carbohidratos totales por 100 gramos de pared celular

liofilizada.

b) Estos resultados corresponden a una misma variante experimental (fuente de carbono:

glucosa 20 g/L, fuente de nitrógeno: sulfato de amonio 5 g/L; pH 5,4, aerobiosis, 30 ºC).

c) En esta variante la concentración inicial de sustrato fue 5 veces mayor que en las restantes

variantes.

Los valores son presentados como la media ± desviación estándar de tres muestras aleatorias para

el análisis de la pared celular.

Una excepción fue la muestra correspondiente al cultivo crecido sobre lactosa como

fuente de carbono, donde la relación fue de 1,572. Se considera que para este caso

particular se deben valorar con cautela las demás determinaciones realizadas. Como ya

se señaló con anterioridad, esta variante experimental mostró un valor de concentración

de biomasa inusualmente bajo para un cultivo aerobio. Un aspecto que pudiera haber

incidido en este resultado podría ser la existencia de un alto contenido de humedad en el




preparado de pared celular, pues esto afectaría la hidrólisis primaria con ácido sulfúrico

concentrado [26].

Las paredes celulares de levadura se componen mayoritariamente de polisacáridos

estructurales (glucanos y mananos principalmente), los cuales pueden llegar a constituir

hasta el 85 % de la masa seca de la pared celular. El 15 % restante son

fundamentalmente proteínas enlazadas covalentemente a estos polisacáridos [27]. El

contenido de carbohidratos totales en pared celular estuvo de modo general entre 60-70

%, algo por debajo a lo habitualmente referido para levaduras [27].

Entre las variantes estudiadas, el valor más alto (80,7 %) se observó cuando la levadura

se cultivó a 40 ºC (estrés térmico); este resultado concuerda con lo encontrado por

Backhaus et al. [17] en su estudio con K. lactis. De igual modo, valores

significativamente más bajos (45-52 %) se obtuvieron en los cultivos donde se empleó

lactosa como fuente de carbono o peptona como fuente de nitrógeno, así como en

aquellos efectuados en condiciones de microaerobiosis.

Un contenido relativo bajo de polisacáridos estructurales podría estar asociado a un

incremento en el contenido de proteínas asociadas a la pared celular, principalmente de

manoproteínas. En los cultivos a base de peptona como fuente de nitrógeno se logra el

crecimiento más vigoroso, por lo que, como consecuencia, debe existir también una tasa

de síntesis proteica más elevada, incluida la de aquellas proteínas y enzimas asociadas a

la pared celular. Kruppa et al. (2011) [28] encontraron que el contenido de

manoproteínas se incrementa en Candida albicans en medios a base de suero, o sea,

ricos en fuente de nitrógeno orgánico. Este incremento en el contenido proteico podría

explicar el bajo tenor de carbohidratos encontrado en pared celular cuando se usó la

fuente de nitrógeno orgánico.

Por otro lado, la cepa objeto de esta investigación expresa la floculina Flo5 de

Saccharomyces cerevisiae bajo el control del promotor homólogo del gen de la enzima

endopoligalaturonasa [10]. La síntesis de esta enzima se induce en condiciones de

hipoxia, constituyendo la principal proteína en el medio extracelular de K. marxianus

cuando se cultiva bajo limitación de oxígeno [22]. Por tanto, debe esperarse que en los

cultivos microaerobios se acumulen grandes cantidades de la proteína Flo5 en la pared

celular de la levadura, contribuyendo a un incremento relativo del contenido proteico en

esta estructura celular, con la consiguiente reducción, en proporción, del contenido de

polisacáridos, como fue encontrado en este estudio.




En qué medida la presencia en el medio de azúcares distintos de glucosa pueda interferir

en el ensamblaje de la malla de glucanos que conforma la pared celular de la levadura

queda como una interrogante abierta para estudios posteriores.

Conclusiones

En este estudio ha sido caracterizada la relación existente entre el crecimiento de la

levadura Kluyveromyces marxianus CCEBI 2011 Flo 5.4 y el contenido de la pared

celular, como respuesta a las variaciones en las condiciones de cultivo, incluidos

factores nutricionales y físico-químicos. Como un aspecto relevante de este estudio,

puede señalarse el hecho práctico de haber obtenido determinadas regularidades que

relacionan la producción de pared celular en K. marxianus con las condiciones de

cultivo imperantes. Estos resultados sirven de base para posteriores estudios dirigidos

a la optimización de los indicadores de eficiencia industrial (rendimiento,

productividad) en la producción de componentes de pared celular en esta cepa de

levadura, la cual ya posee un reconocido perfil de potenciales aplicaciones en la

industria biotecnológica.

Agradecimientos

Los autores agradecemos al Programa de Cooperación Interuniversitaria e Investigación

Científica de la Agencia Española de Cooperación Internacional para el Desarrollo

(PCI-AECID) por el financiamiento a los proyectos A/024951/09 y A/030029/10, los

cuales sirvieron de soporte a esta investigación.

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