INTERPRETASI PEMERIKSAAN IMUNOLOGI

DASAR PEMERIKSAAN LABORATORIUM IMUNOLOGIMacam :

SelulerKuantitatif pe atau pe jumlah leukosit, monositosis, eosinofiliaKualitatif uji hambatan migrasi leukosit, uji gangguan fagositosis, uji fungsi membunuh mikrobaHumoralKadar CRP me > 100 x pd infeksi atau kerusakan jaringanKadar komplemen C3, C4, faktor B, properdin

Seluler1. Kualitatif uji transformasi limfosit (dg PHA & con A) uji sitotoksisitas uji produksi limfokin2. Kuantitatif tes rosette (Sebuah tes penapisan kualitatif untuk mendeteksi signifikan-10-foetomaternal perdarahan ml, dimana sel-sel indikator bentuk yang mudah) HumoralElektrpforesis proteinImuno elektroforesis

Elektrpforesis proteinImuno elektroforesis

Reaksi presipitasi- utk antibodi/antigen terlarut terbentuk presipitat (gumpalan)- jml antigen & antibodi hrs seimbang2. Reaksi aglutinasi- utk antibodi/antigen btk partikel terbentuk aglutinasi- jml antigen & antibodi hrs seimbang- m/ : Widal, gol darah, tes kehamilan

3. Interaksi Antigen-antibodi tingkat molekuler

- RIA (radio immunoassay) : penentuan berdasarkan reaksi imunologi yg menggunakan kit RIA (Contoh : utk mendeteksi fs ginjal, fs tiroid)

- ELISA ( enzyme linked immunosorbent assay) : deteksi patogen yg mendasarkan pada reaksi antibodi & antigen (Contoh : utk deteksi fs hati, fs trombositopenia, gangguan fungsi hormonal)

RIA (Radio Immunoassay)

ELISA

*Struktur Virion HIV

*Susunan Gen

Berat molekulGenAntigen gp 160ENVbentuk polimer gp 41 gp 120ENVmembran luar p 66POLreverse transcriptase p 55GAGprecursor protein p 51POLreverse transcriptase gp 41ENVtransmembran p 39GAGfragmen p 55 p 31POLendonuclease p 24GAGcore protein p 17GAGcore protein

*p 24 antigenMerupakan alat laboratorium yang berguna pada infeksi HIV untuk:Prediksi HIV AIDS: rapid progressor (Farzadegan et al., 1996).Diagnosis, prognosis, monitoring terapi anti retroviral, dan skrining bagi donor darah sukarela (Arens, et al., 1997).Skrining darah, identifikasi infeksi akut, monitoring infeksi, deteksi infeksi, dan pemeriksaan infeksi pada Bayi Baru Lahir (Constantine, 2001).

*Window periodIndividu terinfeksi HIV tapi seronegatif thd pemeriksaan antibodi HIVInfeksi HIV dapat dideteksi selama window period:HIV-PCR deteksi asam nukleat:Tdk dpt dikerjakan pad lab rutinPeralatan canggihKetrampilan >>Kultur HIVPemeriksaan p24 antigen

*Deteksi p24 antigenp24 antigen muncul secara karakteristik pada fase awal dan akhir infeksi HIV:Antigen ini muncul cepat setelah infeksi replikasi awal virus dan level viremia selama seseorang terkena infeksi. Ketika antibodi HIV terdeteksi antigen p24 terdeteksi, dikarenakan adanya kompleks antigen antibodi di dalam darah. Jika p24 antigen terdeteksi pertanda infeksi.

*Potentially cross reacting samples:Wanita hamilPenderita autoimmune diseaseSampel (+) utk IgM anti bodi thd:CytomegalovirusHerpes simplex virusRubella virusToxoplasma gondiiSampel (+) rhematoid factorHepatitis C virus antibodyEpstein-Barr virus capsid antigen antibody.

*Sensitivitas pemeriksaan p24 antigenPemeriksaan standart:Neonatus umur 1 bln 0-20%Umur 3 6 bln 55-75%Dewasa asimtomatik 4%Selama infeksi akut (sebelum serokonversi) 55-75%Pemeriksaan ICD:Me sensitivitas 3-8 kali dibandingkan pemeriksaan standart (Praharaj, et al., 2003).Elisa gen ke4 (Saville et al., 2001):100% high risk99,7% low risk

*Spesivisitas pemeriksaan p24 antigen generasi ke3 & 4:WEBER, et al., JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Apr. 2002. Gen 3

*ICD Nishanian et al., 1990:100L spesimen + 50L 0,5 N HCl (pH 2,5-3,0)

Inkubasi pada suhu 37C selama 1 jam

Dinetralisasi dengan 50L 0,5 N NaOH sampai pH 6,8 - 7,2.

Kerjakan pemeriksaan p24 antigen.

*Transmission of HIV Infection to NeonatesMethods of HIV vertical transmission

Transplacental: 30-50%

Intrapartum: 50-70%

BreastfeedingMothers with established disease: 16%Mothers who develop primary disease postpartum: 26%

*Transmission of HIV Infection to Neonates Risk Factors for HIV Vertical TransmissionNeonateFirst born twinPrematurityBacterial infectionBreastfeedingMaternalNew onset diseaseLow CD4+ T-lymphocyte cell count (helper cells)High CD8+ T-lymphocyte cell count (suppressor cells)

*Transmission of HIV Infection to Neonates Risk Factors for HIV Vertical TransmissionMaternalHigh viral load {elevated serum p24 antigen ICD), elevated plasma HIV ribonucleic acid (RNA) and increased circulating cell associated virus}Rapid and efficient viral replication rateT-cell line tropismChorioamnionitisProlonged/complicated laborMixing of maternal and fetal bloodOn-going illicit drug use

*Diagnosing HIV Infection in NeonatesDiagnostic testing should be performed between:

Birth and 48 hours

One to two months of age

Three to six months of age

*Diagnostic TestsHIV Antibody by Enzyme Immunoassay (EIA): This test is not adequate for differentiating maternal versus newborn infection.HIV Culture: Not readily available, expensive to perform, requires a large volume of blood, and definitive results may not be available for two to four weeks.

*Diagnostic Tests HIV-p24 Antigen Assay:Standard Assay:The p24 Antigen (Ag) in the serum of neonates is bound to maternal HIV antibody. This test is not sensitive for the detection of HIV infection in neonates.ICD-HIV-p24 Assay (ICD):If acid hydrolysis is used to interfere with antigen-antibody complexes in the serum, then the sensitivity of p24 can be increased and utilized as an early diagnostic tool. One hundred percent detection by one to three months of age.

*Diagnostic Tests HIV-DNA-PCR (polymerase chain reaction):

Is the preferred virologic method for diagnosing HIV infection in infancy.

It is a highly sensitive and specific test, with 93% of infected neonates PCR positive by 14 days of life.

*Diagnostic Tests HIV-IgA Antibody Test: Maternal IgA antibodies do not cross the placenta, therefore the detection of HIV specific antibodies in the newborn serum indicates presence of HIV infection. This assay is sensitive after the third month of life with 94% detection at six months and 100% detection at nine months (assay not available for commercial use at this time).

*Diagnostic Tests Immunologic Testing: The following tests should be performed on all neonates born to HIV positive mothers.Lymphocyte subsets: CD4, CD8, and CD4/CD8 ratio should be tested at one, three, and six months of age, then every three months until HIV status of the neonate is known. Monitoring should be performed on all neonates who are HIV infected.Quantitative immunoglobulin: IgG, IgM, and IgASkin tests performed later in infancy include: candida, mumps, tuberculin skin test (purified protein derivative-PPD)

*

*Pemeriksaan laboratorium HIVBiakan virus

Deteksi antigen: p24

Deteksi materi genetik: DNA provirus/RNA

Deteksi antibodi: penyaring & konfirmasi

*Berbagai teknik yang dipakai pada pemeriksaan laboratorium infeksi HIV (deteksi antigen/antibodi)Aglutinasi

Enzyme immunoassay (EIA)

Dot blot immunoassay

Imunokhromatografi

*AglutinasipartikelAg

*Imunokromatografi

*Enzyme immunoassay (EIA)Indirect EIA

Competitive EIA

Antigen sandwich EIA

Capture EIA

*Indirect EIA

*Competitive EIA

*Antigen sandwich EIAEnzyme immunoassay (EIA)

*Capture EIAAnti-human Ig G / M

*Perkembangan reagensia EIAGenerasi 1 : viral lysate

Generasi 2 : recombinant antigen

Generasi 3 : recombinant antigen & synthetic peptide

Generasi 4 : antigen + antibodi

*EIA generasi pertamaDari biakan virus dalam jaringan/sel

Sensitivitas sangat tinggi

Spesivisitas rendah

Reaktif palsu >>, karena ada komponen media (kultur jaringan/sel)

*EIA generasi keduaMenggabungkan potongan DNA HIV ke untaian DNA suatu mikroba vehikulum (Candida, E.coli), sehingga dihasilkan antigen rekombinan

Spesifitas lebih tinggi daripada generasi pertama, walaupun masih ada pengaruh dari komponen vehikulum

*EIA generasi ketigaAntigen rekombinan ditambah dengan peptida sintetik

Meningkatkan reprodusibilitas reagensia

Memperkecil kontaminasi oleh komponen sel yang dipakai untuk vehikulum

*EIA generasi keempatDapat mendeteksi baik antigen p24 maupun anti-HIV

Diharapkan dapat memperkecil window period

Telah terbukti dapat menyaring individu dengan antigen positif dan antibodi negatif di populasi dengan prevalensi infeksi HIV tinggiKonfirmasi

*minggutahunKadarEIA generasi keempat

*

*KonfirmasiGenerasi 1 3 : deteksi antibodi

*Generasi 4 : deteksi antigen + antibodiKonfirmasi

*KesimpulanPemilihan jenis reagensia harus memperhatikan tujuan pemeriksaan, banyaknya pemeriksaan, prevalensi infeksi HIV populasi yang diperiksa dan efisiensi yang diharapkan

Perlu diperhatikan pula kemungkinan jenis pemeriksaan konfirmasi yang diperlukan setelah penyaringan yang memberikan hasil yang reaktif atau positif

Cara Pemeriksaan WESTERN BLOT (WB)

*Western BlotQualitative enzyme immunoassay terhadap antibodi HIV-1 dan HIV-2SpesifikMahalMembutuhkan ketrampilan Dapat menginterpretasi hasil

*Prinsip dasarCarik nitroselulosa dilekatkan dengan antigenic protein dari HIV-1 yang sudah dimurnikan dan specific HIV-2 synthetic peptide dengan cara electrophoretic blottingCarik nitroselulosa diinkubasi dengan serum / plasma pasienBila terdapat antibodi spesifik terhadap HIV-1 dan / HIV-2 terjadi ikatan antigen-antibodi

*

*Yang perlu diperhatikanSelalu kerjakan kontrol positif dan negatif

Jangan gunakan reagen dari kit dengan no. lot yang berbeda

Simpan reagensia pada suhu 2-8C

*Kriteria interpretasi

Organisasi Kriteria CDC1 band ENV (gp41 dan gp120/160) dan p24WHO2 band ENVAFDAp24 dan p31 dan gp41 atau gp120/160American Red CrossMasing masing 1 band GAG, POL dan ENV

*Interpretasi hasilLihat hasil carik kontrol positif dan negatif

Bandingkan hasil pasien dengan kontrol positif dan negatif:ReaktifNon-reaktifIndeterminate

*A. Positif untuk infeksi HIV-1B. Positif lemah untuk infeksi HIV-1C. NegatifWestern blot

*(+)(+)(-)(-)(+)(+)HIV-2 +

*

**