INTRODUCCIÓ

El mitocondri INTRODUCCIÓ

9

4 EL MITOCONDRIEl mitocondri va ser el primer orgànul cel∙lular relacionat amb una malaltia humana. Aixòva succeir el 1962, quan Luft et al. van descriure un pacient amb hipermetabolisme el qualpresentava disfunció mitocondrial (Luft 1962).

Els mitocondris són orgànuls presents al citoplasma de la majoria de les cèl∙lules eucariotes.Van ser identificats per primer cop a finals del segle XIX per Altmann, qui els va definir coma "organismes elementals" que vivien dins de la cèl∙lula. Gairebé un segle més tard, LynnMargulis va formular la teoria endosimbiont que proposa que els mitocondris actuals sóndescendents d'organismes primitius amb capacitat aeròbica els quals van ser "ingerits" percèl∙lules protoeucariotes anaeròbiques fa 1.500–2.000 milions d'anys. Com a conseqüènciad'aquesta associació les dues espècies s'haurien beneficiat: l'hoste utilitzant l'energiagenerada per l'activitat aeròbica del bacteri incorporat, i aquest accedint a nutrients queaconseguiria l'hoste. Les similituds entre mitocondris i bacteris (observacions que donensuport a la teoria endosimbiont) són molt interessants, però s'allunyen del tema d'estudid'aquesta tesi. En aquest capítol s'ofereix una breu descripció morfològica del mitocondri ies presenten les funcions mitocondrials més rellevants en casos de malaltia.

CARACTERÍSTIQUES PRINCIPALS

El mitocondri té una mida mitjanad'aproximadament 0,3–1,0 per 5–10 µm. Potdesplaçar-se a través del citoplasma cel∙lular, i laseva estructura bàsica la formen dues membranesdiferents quant a funció i composició: lamembrana externa i la interna, que es plega enestructures anomenades crestes (FIGURA 1). Lamembrana externa és una bicapa fosfolipídicacomposta per gairebé un 50% de lípids, que

conté estructures proteiques anomenades porinesles quals la fan permeable a molècules ≤10 kDa.La membrana interna ocupa molta més superfícieque l'externa a causa dels plegaments quepresenta, i té una estructura molt més complicadaja que alberga una sèrie de proteïnes i complexosbàsics per al desenvolupament de les funcionsmetabòliques que tenen com escenari elsmitocondris. Està composta per aproximadament

membranaexterna

crestesmatriu

espaiintermembrana

membranainterna

FIGURA 1. ESTRUCTURA MITOCONDRIAL.Constituents principals d'un mitocondri en una imatge al microscopi electrònic.

Respiració aeròbica

10

un 20% de lípids, amb un elevat contingut encardiolipina, i només és permeable a l'oxigen, elCO2 i l'aigua, la qual cosa té una granimportància, com s'explicarà més endavant.

Les membranes delimiten dues cavitats o espaisdins del mitocondri: la matriu i l'espaiintermembrana. La matriu és més densa que elcitoplasma cel∙lular, i normalment al microscopielectrònic són visibles punts foscos (grànulsmitocondrials) que són condensacions de calci. Amés a més, hi ha oxigen, CO2, aigua, enzims (queparticipen en el cicle de Krebs, l'oxidació delsàcids grassos...), ribosomes i el DNA propi delmitocondri (mtDNA), que acostuma a localitzar-sea prop de la membrana interna i del qual esparlarà abastament. A l'espai intermembrana estroben enzims que catalitzen reaccions detransferència de grups fosfat a partir del trifosfatd'adenosina (ATP), com ara la creatin-quinasa i lamioquinasa.

El nombre de mitocondris per cèl∙lula és forçavariable: de 10 a 2.000 en cèl∙lules somàtiques, ifins al voltant de 100.000 en oòcits. Sónespecialment abundants en cèl∙lules (i parts decèl∙lules) associades a processos que requereixenmolta energia. Per exemple, a esperma demamífers i a protozous flagel∙lats els mitocondrises localitzen a la base dels flagells1; a músculcardíac ocupen l'espai entre les miofibril∙les. Elsòrgans molt actius des d'un punt de vistametabòlic —per exemple fetge, cervell i músculesquelètic— presenten un nombre més gran demitocondris. La seva forma externa, el nombre decrestes i la seva estructura també varia segons eltipus cel∙lular (FIGURA 2).

Els mitocondris són el compartiment cel∙lularon té lloc la respiració aeròbica. Aquest procés,al qual està acoblada la fosforilació oxidativa (osistema OXPHOS), serà tractat amb més detall acontinuació. Als mitocondris tenen lloc, però,altres funcions importants, com ara la produccióde calor mitjançant el desacoblament de larespiració oxidativa i la síntesi d'ATP a teixitadipós marró, l'homeòstasi del calci a la matriumitocondrial, la síntesi del grup hemo en fetge iprecursors d'eritròcits, i l'apoptosi. A més, aquestsorgànuls participen també en la síntesid'aminoàcids, nucleòtids, fosfolípids, pirimidines idiversos metabòlits.

1 Recentment s'ha comprovat que la qualitat del semen

(referida a la mobilitat dels espermatozoides, la concentraciódels mateixos, etc.) és directament proporcional a l'activitatdels complexos de la cadena respiratòria (Ruiz-Pesini 2000).

RESPIRACIÓ AERÒBICA

És considerada la principal funció mitocondrialja que proporciona al voltant d'un 90% delrequeriment cel∙lular d'ATP. Al mitocondri entrenàcids grassos que són oxidats a acetilcoenzim A(acetilCoA) en el procés anomenat ß-oxidació. Elpiruvat (producte final de la glucòlisi alcitoplasma cel∙lular) també entra al mitocondri, iés descarboxilat per la piruvat descarboxilasa, queincorpora la molècula del coenzim A i esprodueix acetilCoA. La regió acetat d'aquestamolècula s'oxida en el cicle dels àcidstricarboxílics o cicle de Krebs, al final del qual es

A B

CD

E

FIGURA 2. MITOCONDRIS.A, mitocondri de les glàndules suprarenals amb un elevatnombre de crestes. A i D són imatges obtingudesmitjançant microscòpia electrònica de transmissió, i B i C,per microscòpia electrònica d'escombrat. E és unareconstrucció tomogràfica obtinguda per T. Frey i G.Perkins (departament de Neurociències de la Universityof California, San Diego).

El mitocondri INTRODUCCIÓ

11

generen dues molècules de CO2 i 4 parellsd'àtoms d'hidrogen, els quals es transfereixen aldinucleòtid d'adenina i nicotinamida (NAD+) i aldinucleòtid de flavina i adenina (FAD) que esredueixen a NADH i FADH2 respectivament.Aquests compostos tenen una capacitat donadorad'electrons molt elevada i aquesta energia es vaalliberant en una sèrie de reaccions redox quetenen lloc a les crestes mitocondrials en les queparticipen complexos enzimàtics i coenzims. Estracta de la cadena respiratòria mitocondrial(CRM) o cadena de transport d'electrons (FIGURA3).

Les proteïnes que intervenen en la cadenarespiratòria estan agrupades en complexoslocalitzats a la membrana de les crestes, quetravessen la bicapa lipídica i sobresurten a lamatriu i a l'espai intermembrana. Els coenzimsestan dissolts en lípids i difonen al llarg de lamembrana o a través de la seva superfície. Elcomplex I, NADH ubiquinona oxidoreductasa (oNADH deshidrogenasa), és el més gran i estàcompost per un mínim de 42 polipèptids.Catalitza la transferència d'electrons des del

NADH a l'ubiquinona o coenzim Q (CoQ). Elcomplex II, succinat CoQ oxidoreductasa, estàformat per 4 pèptids i catalitza l'oxidació desuccinat a fumarat (dins del cicle de Krebs), itransfereix els electrons també a l'ubiquinona(dins de la CRM). La citocrom c oxidoreductasa ocomplex III està constituïda aproximadament per10 subunitats. El citocrom c actua com aintermediari per a la transferència d'electronsentre els complexos III i IV i està localitzat al'espai intermembrana. El complex IV, citocrom coxidasa (COX), transfereix 4 electrons des delcitocrom c a l'oxigen molecular, i es genera unamolècula d'aigua. Està format per 13 subunitats.

Aquesta transferència d'electrons d'un membrede la cadena de transport d'electrons a un altregenera energia que s'inverteix en la síntesi d'ATPper una via indirecta. A l'inici de la cadena, lesmolècules de NADH i FADH2 transfereixen elselectrons de l'hidrogen al següent complexenzimàtic, i alliberen els protons a la matriumitocondrial mitjançant mecanismes no conegutsencara. Quan els complexos enzimàticstransfereixen els electrons al següent component

2 H+2 H+

3 H+

3 H+

ADP+Pi

ATPATP+

H2O

NADH NAD+succinat fumarat

H+

4 H+

2 H+ 2 H+½ O2 H2O

Q C

membrana externa

cicle deKrebs

acetil-CoA

NADH + H+

NAD+

matriumitocondrial

matriumitocondrial

III

III IV

V

FIGURA 3. OXPHOS.Esquema del funcionament de la cadena respiratòria mitocondrial acoblada a la fosforilació oxidativa. Les fletxes grisesindiquen el flux d'electrons a través dels complexos enzimàtics i dels citocroms Q i C.

Apoptosi

12

de la cadena, utilitzen l'energia generada enaquest procés per bombejar protons a l'espaiintermembrana travessant la membrana interna.Aquesta acumulació de protons a l'espaiintermembrana en front als electrons de la matriu,crea un potencial elèctric que tendeix a portar elsprotons de nou cap a la matriu. Però la membranainterna és extremadament impermeable alsprotons i cal l'acció del complex V (F0-F1-ATPsintasa) perquè aquests puguin ser transportatsde nou a l'interior mitocondrial. L'energiagenerada amb l'entrada dels protons s'utilitza pera sintetitzar ATP a partir d'ADP i fòsfor inorgànic(Pi). A continuació, l'ATP generat pel mitocondriés bescanviat per ADP citoplasmàtic mitjançant eltransportador de nucleòtids d'adenina (ANT). Elcomplex V està constituït per 12–14 polipèptids, is'hi diferencien dues regions: la F0, que estàlligada a la membrana i hom pensa ques'encarrega de transportar electrons, i la F1, querepresenta la part catalítica de la molèculainserida a la matriu mitocondrial.

Perquè la fosforilació oxidativa tingui lloc,calen dues condicions: que la membrana internaestigui intacta de forma que els protons noméspuguin tornar a la matriu per un procés acoblat ala síntesi d'ATP; i que s'acumuli una concentracióelevada de protons a l'espai intermembrana.

L'any 1961 el bioquímic Peter Mitchell vaproposar per primera vegada el mecanisme pelqual les cèl∙lules produïen ATP a partir delmetabolisme oxidatiu. El 1978 li va ser conceditel premi Nobel de Química.

APOPTOSI

L'estudi de la mort cel∙lular programada —oapoptosi— ha captat l'interès d'un gran nombred'investigadors en els últims anys. És lògic, si esconsidera que l'apoptosi s'esdevé en una granvarietat de teixits en resposta a certes situacionstant fisiològiques com patogèniques. És un procéscrític per a l'existència de molts organismes,necessari per a modelar el sistema nerviós durantel desenvolupament, i per a mantenir elfuncionament normal del sistema immunològic.L'alteració dels mecanismes normals d'apoptosipot comportar conseqüències greus: càncer imalalties autoimmunitàries si manca, i infarts o ladegeneració nerviosa típica de la malaltiad'Alzheimer si es produeix en excés.

L'apoptosi pot ser iniciada per una varietatd'agents que danyen el DNA, per a exemple lesradiacions ultraviolades i X, i determinadesdrogues terapèutiques. Les proteïnes que detecten

el dany al DNA i engeguen l'apoptosi tambéafecten al cicle cel∙lular: aturen la divisió perquèel dany es pugui reparar o bé la cèl∙lula mori si lesalteracions al DNA són irreversibles.

Tres són les fases observades a la majoria demodels d'apoptosi estudiats: 1) acidificació delcitoplasma; 2) disfunció mitocondrial; 3) activacióde les caspases (família de cisteïna-proteasesintracel∙lulars). Així doncs, a banda de ser lescentrals energètiques de les cèl∙lules, elsmitocondris també s'han descobert íntimamentimplicats en diverses vies de mort cel∙lular.Diversos membres de la família Bcl-2 es localitzena les membranes mitocondrials. A aquesta granfamília pertanyen alguns dels senyals de mortcel∙lular més potents i també alguns dels agentsmés actius en la supervivència cel∙lular, com per aexemple el mateix Bcl-2 (inicialment identificatcom el producte d'un gen l'expressió del qualestava incrementada en cèl∙lules B ambtranslocacions cromosòmiques).

De quina manera participa el mitocondri alprocés apoptòtic? Es coneixen, com a mínim, tresmecanismes generals, que poden estar inter-relacionats:

! interrupció del transport d'electrons! alteració del potencial redox cel∙lular! alliberament de factors que promouen

l'activació de les caspases (citocrom c,...)

Fa dècades que es coneix que la interrupció dela CRM és un senyal primerenc de mort cel∙lular.Les radiacions γ indueixen apoptosi a timòcits iaturada de la cadena de transport d'electronsprobablement a nivell de la interacció entre elcomplex III i el citocrom c (vegeu la FIGURA 3)(Scaife 1966). Una conseqüència d'aquestainterrupció hauria de ser la disminució de lasíntesi d'ATP, i en efecte aquesta ha estat descrita,però només en les fases finals del procésd'apoptosi (Bossy-Wetzel 1998). Per això es pensaque és poc probable que el dèficit d'ATP sigui elmecanisme inductor de l'apoptosi, malgrat puguicomportar la mort cel∙lular.

Els mitocondris són la font més gran deproducció d'anions superòxid (O2

•−). La majorpart de l'oxigen que consumeix el mitocondri éstransformat en H2O pel complex IV (FIGURA 3).Tot i amb això, existeix un 4–5% de l'oxigen queaccepta electrons directament de les flavina-deshidrogenases i CoQH2 i genera anionssuperòxid. Qualsevol factor que desacobli la CRMpot provocar un augment en la producció d'ionssuperòxid. Tant la peroxidació lipídica com els

El mitocondri INTRODUCCIÓ

13

superòxids estan incrementats quan la cèl∙lulaentra en apoptosi, però sembla que aquestsfenòmens es donarien en una fase tardana, un copla cascada de les caspases hagués estat activada.

Durant l'apoptosi, el mitocondri alliberacitocrom c al citosol. A hores d'ara no es coneixper quin mecanisme deixa el citocrom c lamembrana interna mitocondrial, a la que estàassociat mitjançant interaccions electrostàtiques.Al citosol el citocrom c, juntament amb lamolècula Apaf-1 (Apoptotic Protease ActivatingFactor) i la procaspasa-9, forma "l'apoptosoma". Elresultat de l'acció de l'apoptosoma és l'activacióde la caspasa 9, que inicia la cascada proteolíticaque deriva en apoptosi. La sortida del citocrom cdel mitocondri sembla encaminar la cèl∙lula cap ala mort, bé per un mecanisme apoptòticmitjançant l'activació de les caspases per Apaf-1,bé per un procés necròtic més lent causat per lamanca de transport d'electrons, que pot provocarla generació de radicals d'oxigen lliure i ladisminució en la producció d'ATP. El bloqueig del'alliberament de citocrom c per part de Bcl-2inhibeix l'apoptosi (Kluck 1997; Zamzami 1997).

A més del citocrom c, els mitocondris alliberenaltres molècules, com el factor inductord'apoptosi (o AIF) i la procaspasa-3.

El porus de transició mitocondrial (MTP), uncanal no selectiu d'estructura parcialment definidaque té components a les dues membranesmitocondrials, ha estat implicat en la pèrdua de

Ca2+ i també en la mort cel∙lular. En algunssistemes experimentals s'ha vist que la fase inicialdel procés apoptòtic (és a dir, l'estat queprecedeix a la desintegració nuclear) està preceditper la pèrdua del potencial de membrana interna(∆∆∆∆ΨΨΨΨm) com a conseqüència de l'obertura delsMTP, regulada per Bcl-2. Una part dels fenòmensapoptòtics serien secundaris a l'obertura del MTP(Marchetti 1996). Aquesta obertura podria com-portar la sortida del mitocondri de substratsmetabòlics i substàncies antioxidants essencials(ATP, NADH, glutatió reduït o GSH). La dismi-nució de GSH pot afectar enormement la viabilitatmitocondrial ja que és necessari per a la reducciódel peròxid d'hidrogen (H2O2) i altres espèciesd'oxigen reactiu (ROS). En la pàg. 26 dinsl'apartat Mitocondri i malaltia es parla d'aquestesespècies. Són nombrosos els treballs que lesimpliquen en les malalties neurodegeneratives.

Per una altra banda, l'obertura del MTP a lamembrana interna podria provocar ques'equilibressin les concentracions de protons de lamatriu i de l'espai intermembrana, amb la qualcosa es desacoblaria la cadena respiratòria. Enaquest cas, a més, per causa de la hipertonicitatnormal de la matriu, el volum mitocondrial esveuria afectat per l'entrada de molècules d'aigua.Això podria esdevenir en el trencament de lamembrana externa, amb l'alliberament des del'espai intermembrana de proteïnes activadores deles caspases. En alguns sistemes s'ha aconseguitevitar l'apoptosi mitjançant la utilització de

FIGURA 4. FACTORS IMPLICATS A L'APOPTOSI MITOCONDRIAL.Il∙lustració de la complexitat i l'elevat nombre de molècules implicades en la regulació de l'apoptosi. Reproduïda deBrenner i Kroemer (Brenner 2000).

El genoma mitocondrial

14

molècules que inhibeixen l'obertura del MTP, elque presenta aquest porus com a un factor centralen les processos apoptòtics (Zamzami 1996). Tot iamb això, alguns estudis demostren que la pèrduade citocrom c i l'activació de les caspases potsucceir sense que es detecti una baixada de ∆Ψm,el que implicaria que en aquests casos l'oberturadel MTP ocorreria després de l'activació de lescaspases per l'apoptosoma (Bossy-Wetzel 1998).

La FIGURA 4 (pàg. 13) és un dels moltsesquemes que intenten incloure els principalsfactors implicats en el fenomen apoptòtic.

L'apoptosi és tan indispensable per l'organismecom la divisió cel∙lular, i segurament està tanfinament regulada com aquesta. Fins ara han estatidentificats els elements més importants de lamaquinària de mort cel∙lular (molts dels qualsimpliquen l'acció del mitocondri), però encararesten detalls per a poder tenir la fotografiacompleta del mecanisme de mort cel∙lularprogramada. Això ha de permetre novesperspectives a l'hora de guarir certes malalties quetenen el seu origen en el funcionament anòmaldels mecanismes apoptòtics.

5 DNA MITOCONDRIALEl 1963 Nass i Nass (Nass 1963) descobriren que els mitocondris contenien el seu propiDNA (mtDNA), la qual cosa representava un argument més a favor dels que pensaven quehavien estat organismes independents milions d'anys enrera. En l'actualitat es coneix laseqüència completa del mtDNA de molts vertebrats i invertebrats, i se sap que les sevesfuncions essencials estan molt conservades. Una pàgina web del NCBI2 ofereix lapossibilitat de consultar les seqüències dels mtDNA de 40 espècies diferents de mamífersinclòs l'home, que van des de l'esquirol vermell fins al rinoceront indi, passant pel ratpenati el catxalot (<www.ncbi.nlm.nih.gov/coffeebreak/archive>, cytosolic help for mitochon-drial defects). Tan sols dues espècies de marsupials presenten una desviació parcial del'ordre genètic mitocondrial respecte a les altres espècies.

Encara que el mtDNA d'algunes espècies de protozous ciliats, algues o llevats és lineal, lagran majoria dels mtDNAs són circulars. Quant a la mida de les molècules, s'observencertes diferències interespecífiques, però aquestes no necessàriament impliquen diferènciesen el contingut genètic. El sistema genètic mitocondrial més estudiat és el dels humans, i ésaquest en el qual ens centrarem.

EL GENOMA MITOCONDRIAL

2 National center for biotechnology information.

Cada mitocondri conté entre 2 i 10 molèculesde mtDNA, i hi ha entre 1.000 i 10.000molècules a la cèl∙lula. Anderson et al. vancompletar la seva seqüència l'any 1981 (Anderson1981). El número d'accés de Genbank és J01415.

La molècula de mtDNA humana és una doblecadena circular de 16.569 parells de bases (pb). ElmtDNA (FIGURA 5), que es replica i transcriu a lamatriu mitocondrial, conté 37 gens. Vint-i-doscorresponen a RNA de transferència (tRNA), dos aRNA ribosòmics (rRNA), i 13 codifiquen poli-pèptids que formen part dels complexos de laCRM (FIGURA 3): set d'aquests del complex I (ND1a ND6), un al complex III (Cit b), tres al complexIV (COX 1 a COX3), i dos al complex V (ATPasa 6i 8). Així doncs, tan sols el complex II està

enterament codificat pel genoma nuclear. Per a laformació (que inclou la síntesi i l'encaixament)dels altres quatre complexos enzimàtics de laCRM cal la participació dels dos genomescel∙lulars, el nuclear i el mitocondrial.

L'observació de l'organització genètica delmtDNA revela una estructura altament compac-tada en la qual la cadena pesant codifica per lamajoria de gens, mentre que la lleugera tan solsconté els gens per a la subunitat 6 de la NADdeshidrogenasa i vuit tRNA. Una regió que nocodifica per a cap gen és la del bucle D (D dedesplaçament, ja que en les fases inicials de lareplicació de la cadena pesant una secciód'aquesta es desplaça i es forma una triple hèlix).Aquesta també és anomenada zona de control, i

DNA mitocondrial INTRODUCCIÓ

15

allotja regions dites "hipervariables" per l'elevadavariabilitat de seqüència que presenten. La zonaque inclou el bucle D (entre els gens tRNAPhe itRNAPro, de 1.122 pb) conté l'origen de replicacióde la cadena pesant i els promotors de latranscripció de les dues cadenes (FIGURA 5).Enríquez et al. descriuen amb detall el que esconeix en l'actualitat sobre la replicació itraducció mitocondrials (Enriquez 1998).

LA GENÈTICA MITOCONDRIAL

El sistema genètic dels mitocondris presentadiverses característiques que el diferencien del

genoma nuclear, i que estan resumides a la TAULA1 (pàg. 16).

Com s'acaba d'esmentar suara, l'estructura delmtDNA és molt densa. La cadena pesant estàorganitzada en gens contigus sense seqüènciesintròniques. Les seqüències intergèniques sónescasses, la més gran de les quals és el bucle D.Un altre factor que il∙lustra el grau decompactació del mtDNA és el fet que la majoriade gens que codifiquen proteïnes manquen decodó de terminació: després de l'últim codó ambsentit es troba una T o TA, i immediatamentdesprés comença un altre gen. El codó determinació es formarà després de la transcripcióper poliadenilació de l'extrem 3'.

bucle D Cit b

ND

5

ND

4N

D 4

L

ND 3

rRNA

12SrR

NA 16S

ND

1

ND

2COX I

COX II ATPasa 6COX III

ATPasa 8

ND 6

cadenapesant (H)cadena

pesant (H)

cadenalleugera (L)

cadenalleugera (L)

OH

OL

LH1

H2

Phe

Pro

Thr

Glu

LeuSerHis

ArgGly

Lys

Ser

Asp

AlaAsn

CysTyr

GlnIleMet

Leu

Val

Trp

FIGURA 5. DOBLE CADENA DE MTDNA HUMÀ.Representació esquemàtica dels gens codificats per cada cadena. Els tRNA es designen pel codid'aminoàcids de 3 lletres. Cit b, citocrom b; ND, subunitats de la NADH deshidrogenasa; COX,subunitats de la citocrom c oxidasa. OH i OL representen l'origen de replicació de la cadena pesant illeugera, respectivament. Les fletxes indiquen la direcció de la síntesi. H1, H2 i L assenyalen els puntsd'iniciació de la transcripció de la cadena pesant i lleugera, respectivament, i les fletxes la direcció dela transcripció.

La genètica mitocondrial

16

El codi genètic mitocondrial difereix delnuclear en cinc codons: UGA codifica triptòfan,en comptes de ser un codó d'aturada, AGA i AGGsón codons d'aturada, en comptes de codificararginina; i AUA i AUU codifiquen la metionina enlloc de l'isoleucina, així juntament amb AUG sónels tres possibles codons d'iniciació.

El mtDNA s'hereta per via materna (Giles1980). És l'oòcit —amb ~100.000 molècules demtDNA— el que aporta la immensa majoria demitocondris en el moment de la fecundació. ElmtDNA patern s'elimina a la fase primerenca del'embriogènia (Kaneda 1995). Sembla que lesescasses molècules de mtDNA aportades perl'espermatozoide són eliminades en serreconeguts senyals d'ubiquitinació (Sutovsky2000). En cap cas no sembla que participin en elgenotip de la descendència.

L'elevada taxa de mutació del mtDNA encomparació a la del DNA nuclear (Neckelmann1987) es creu probablement conseqüència de lamanca d'histones que protegeixin les dobleshèlixs de mtDNA. D'altra banda, el mtDNA potser danyat per un excés de molècules ROSsubproductes de la fosforilació oxidativa. Aquestefecte nociu està afavorit pel fet que el mtDNAestà en contacte amb la membrana mitocondrialinterna i, per tant, molt a prop de la CRM quegenera les ROS.

Malgrat s'han descrit alguns mecanismes dereparació del mtDNA en resposta a danysespecífics (Shen 1995; Stierum 1999), fins aquestmoment no sembla existir dins del mitocondri unsistema general reparador de mutacions, el quepot provocar que certes mutacions es vaginacumulant. Pel que fa a la possibilitat derecombinació mitocondrial, es creia que noexistia, però en l'actualitat s'estan publicanttreballs a favor (i en contra) d'aquesta hipòtesi(Eyre-Walker 2000; Elson 2001a).

Hom parla d'homoplàsmiaquan totes les cèl∙lules tenenel mateix mtDNA, i d'hetero-plàsmia quan coexisteixenmolècules salvatges i molècu-les mutants. Els percentatgesd'heteroplàsmia poden serdiversos, segons la proporcióde mtDNA normals i mutantsque hi hagi. Durant la divisiócel∙lular els mitocondris esdistribueixen a l'atzar entreles cèl∙lules filles i, en conse-qüència, aquestes poden

rebre diferents percentatges de mtDNA mutants.Això és el que s'anomena segregació replicativa(Wallace 1986). Com a conseqüència, elpercentatge de molècules mutants pot variar entreels diferents teixits, i també anar canviant al llargdel temps.

El fenotip d'una cèl∙lula, teixit o individuheteroplàsmic depèn del percentatge de mtDNAmutant. Si el nombre de molècules mutants ésbaix es produirà una complementació de la funcióper part de les molècules normals, però a midaque augmenta la proporció de molèculesanòmales la complementació és més difícil, finsque s'arriba a un fenotip patogènic. Així, elfenotip s'expressa d'acord amb un efecte llindar.La malaltia apareix quan la producció d'ATP alteixit heteroplàsmic és insuficient per al seufuncionament normal. Els requeriments energèticssón particulars de cada teixit, i el nombre demitocondris i de molècules de mtDNA també.D'aquesta manera, es pot donar la situació en quèun determinat percentatge de molècules demtDNA mutants tingui repercussions completa-ment diferents segons sigui l'òrgan afectat: des deno afectar el funcionament fins a anul∙lar-lo percomplet. Els òrgans i teixits que més pateixen unadeficiència en la síntesi d'ATP són ulls, sistemanerviós, múscul, cor, pàncrees, ronyó i fetge.

Per a concloure aquest breu repàs sobre elmtDNA, cal afegir que el mtDNA s'utilitzarutinàriament en identificacions forenses perorganitzacions de gran "prestigi" com són elDepartament de Defensa i el FBI nord-americans.La mida de la molècula de mtDNA i el nombre decòpies per cèl∙lula facilita molt la seva extraccióen restes forenses en comparació al DNA nuclear.L'anàlisi de les regions hipervariables a la zona decontrol del mtDNA ha permès identificar fills quehavien estat separats dels seus pares durant elsrègims militars a l'Argentina, i va ser clau en elreconeixement de les restes de la família real

TAULA 1. CARACTERÍSTIQUES DEL SISTEMA GENÈTIC MITOCONDRIAL

" estructura del mtDNA molt densa

" alguns codons difereixen del codi universal

" el mtDNA s'hereta exclusivament de la mare

" taxa de mutació 10-20 vegades superior a la del DNA nuclear

" la replicació del mtDNA és independent de la divisió cel∙lular

" el mtDNA es distribueix a l'atzar a les cèl∙lules filles

" efecte llindar en el fenotip

DNA mitocondrial INTRODUCCIÓ

17

russa 70 anys després de la seva mort durant laRevolució (Ivanov 1996). Les regions hiper-variables aporten una base per a diferenciar grupshumans, i la transmissió per herència maternaevita les confusions possibles en casos derecombinació genètica. L'elevada taxa de mutaciódel mtDNA representa una eina molt valuosa pera establir relacions evolutives entre organismes,sempre que aquests no estiguin molt allunyatsevolutivament. Mitjançant l'estudi del mtDNA,també s'ha determinat que els Neandertals i elshumans moderns van divergir genèticament fa500.000–600.000 anys, per la qual cosa no esconsideren els avantpassats de l'Homo sapiensmodern3 (Krings 1997). En general, es consideraque l'anàlisi del mtDNA és una eina molt útil perals estudis antropològics (Wallace 1999b).

TIPUS DE MUTACIONS AL MTDNAEn aquest subapartat es descriuen breument els

tipus de mutacions descrites al mtDNA, i al'apartat Mitocondri i malaltia es tractarà, entred'altres temes, de les malalties associades aaquestes mutacions.

Les alteracions al mtDNA poden serreordenaments que canvien la longitud de lamolècula —delecions i duplicacions—, o bépoden afectar punts concrets —mutacionspuntuals. Les delecions —senzilles o múltiples—impliquen, donada la compactació del mtDNA, lapèrdua de gens o parts de gens mitocondrials. Engeneral, s'ha vist que afecten la regió compresaentre el gen del citocrom b i el de la subunitat Ide la citocrom oxidasa (FIGURA 5, pàg. 15).Existeix una àmplia gamma de delecionsidentificades, que van des d'una kilobase (kb) finsa 8 kb, però n'hi ha dues d'especialmentfreqüents ja que s'han trobat al voltant del 60% decasos, per això se les anomena delecionscomunes. Les seves mides són 7.436 i 4.977 pb.Malgrat la majoria de les delecions representencasos esporàdics també se n'han descrit ambherència materna —pocs— i amb herènciamendeliana dominant i recessiva. El mecanismeque provoca l'aparició de delecions al mtDNA ésa hores d'ara desconegut.

A les duplicacions es troba la presènciarepetida d'algun segment del mtDNA. El mtDNAduplicat d'entre 23 i 26,5 kb podria ser un estat

3 De tota manera, els investigadors insisteixen que aquestes

troballes s'han fet a partir d'un únic espècimen i que l'homeNeardental no hauria contribuït al mtDNA de l'home modernperò potser sí a alguns gens nuclears.

intermedi previ a la formació de molèculesdelecionades (Poulton 1993).

Les delecions són rarament detectades enteixits amb una elevada taxa de recanvi, com perexemple el teixit sanguini. És possible que elsmtDNA delecionats es perdin per selecció clonalen aquests teixits i, per contra, s'acumulin enteixits postmitòtics (cervell, múscul). En sang sís'han detectat duplicacions, fet que facilita la sevaidentificació perquè no cal practicar mètodesagressius sobre els pacients (vegeu FIGURA 8, pàg.28).

Des de l'any 1988 en què Wallace et al. vandescriure una mutació puntual al gen ND4(Wallace 1988), s'han identificat unes 100mutacions puntuals al mtDNA que afecten tant agens que codifiquen polipèptids de la CRM com agens dels tRNA i dels rRNA. Les mutacionspuntuals s'anomenen d'acord amb la seva posicióa la cadena lleugera de la seqüència de referènciade Cambridge (Anderson 1981).

Tant les delecions com les mutacions puntualsque afecten gens dels tRNA i rRNA poden alterarla síntesi proteica mitocondrial, fet que en algunscasos comporta conseqüències molt greus, tal icom s'explica al proper apartat.

Existeix una darrera categoria de mutació —omés pròpiament dit anomalia, car no implical'alteració de la seqüència— al mtDNA ques'anomena depleció. La síndrome de depleciósuposa una reducció del contingut de molèculesde mtDNA que algunes vegades ha arribat a serdel 90% respecte a controls d'edat similar. Elsmecanismes moleculars responsables d'aquestfenomen no es coneixen, però qualsevol defecteen algun punt de la replicació pot alterar elnombre de còpies del mtDNA (Hirano 2000).

Les molècules de mtDNA identificades en lasíndrome de depleció són normals. No presentendelecions ni mutacions puntuals, la qual cosa fapensar que no és conseqüència de cap altreprocés patogènic sinó precisament causa demalaltia.

Classificació de les malalties mitocondrials

18

6 MITOCONDRI I MALALTIACom ja s'ha esmentat anteriorment, el mitocondri va ser el primer orgànul cel∙lularrelacionat amb una malaltia humana, l'any 1962. En la darrera dècada, el descobriment degran quantitat de mutacions al mtDNA causants de malalties ha generat una nova àread'estudi dins de la genètica, la genètica molecular mitocondrial.

El concepte de malaltia mitocondrial s'aplica només a aquelles malalties que tenen alterat elfuncionament de la CRM, malgrat existeixen enzims mitocondrials també implicats enmalalties del metabolisme intermediari, com per exemple en alteracions de la ß-oxidació oel cicle de Krebs. Com ja s'ha vist, en la CRM participen polipèptids codificats pel mateixmitocondri i sintetitzats a la matriu mitocondrial, i també moltes subunitats codificades pelDNA nuclear (nDNA), sintetitzades al citosol i guiades a la membrana interna delmitocondri mitjançant pèptids–senyal amino–terminals. Conseqüentment, les malaltiesmitocondrials poden tenir l'origen no únicament en defectes del genoma mitocondrial, sinótambé en defectes del genoma nuclear. Alteracions en les translocases mitocondrials(encarregades del transport de metabòlits des del citoplasma a la matriu mitocondrial), en lacomunicació entre els dos genomes o en els mecanismes que importen proteïnes delcitoplasma també poden provocar malalties. Aquest darrer és el cas de la síndrome Mohr-Tranebjaerg, o síndrome de sordesa-distonia-atròfia òptica (Koehler 1999).

Tots els factors necessaris per a la replicació del mtDNA són codificats pel nDNA, aixídoncs no és estrany que mutacions al nDNA afectin d'una forma important el funcionamentdel mitocondri.

CLASSIFICACIÓ DE LES MALALTIES MITOCONDRIALS

El fet que els mitocondris estiguin àmpliamentdistribuïts entre els diferents teixits i òrgans fa queles típiques classificacions anatòmiques no siguinoportunes per al conjunt de les malaltiesmitocondrials. La primera característica quedefineix les malalties mitocondrials és la granheterogeneïtat de les manifestacions clíniques quepresenten. Els fenotips poden ser diversos icoincidents. Una mutació concreta al mtDNA potproduir fenotips molt variables, i mutacionsdiferents poden provocar símptomes similars.

La TAULA 2 (modificada de (Chinnery 1999))recull els trets clínics més característics de lesmalalties mitocondrials. Són malalties multi-sistèmiques que afecten òrgans i teixits no semprerelacionats funcionalment —ni embriològicament.L'afectació no depèn només del teixit ons'expressa la mutació, sinó també de lesnecessitats energètiques d'aquest teixit.

La classificació de les malalties mitocondrialss'ha modificat en el temps a mesura que s'ha anatavançant en el coneixement d'aquestes. Eldiagnòstic de les primeres citopaties mitocondrialses realitzava en base a la presència o no de fibresvermelles desestructurades (RRF, ragged-redfibres). Les RRF són fibres musculars ambacumulacions anormals de mitocondris sota elsarcolemma que es tenyeixen de color púrpura o

vermell amb la tinció tricromàtica de Gomori, ique també es poden observar mitjançant unatinció de la succinat deshidrogenasa (SDH), laqual es troba únicament a mitocondris. Ara se sapque no són un marcador específic ja que s'hantrobat en una àmplia varietat de malaltiesmusculars, i fins i tot a atletes. Les classificacionspurament clíniques o bioquímiques s'han deixatde banda, i el que potser interessa més enl'actualitat és conèixer on resideix el defecte queprovoca la malaltia per a poder arribar ràpidamenta un diagnòstic encertat i per a intentar aplicar lamillor teràpia disponible. La TAULA 3 (pàg. 20,modificada de (Chinnery 2000c) resumeix lesprincipals malalties mitocondrials a partir de lalocalització del defecte primari que les causa4.

Les malalties mitocondrials mostren unspatrons d'herència variats: materna, mendeliana, iuna combinació d'ambdues. Les alteracionsprimàries al mtDNA es tradueixen en unadisminució de la producció d'energia, sigui quinsigui el tipus de gen mutant. Els teixits amb majorsnecessitats energètiques són els preferentmentafectats (cervell, cor, múscul...). Les malaltiesresultants es transmeten per herència materna. Un

4 Per a una relació més extensa consulteu la revisió de

Chinnery et al. (Chinnery 1999).

Mitocondri i malaltia INTRODUCCIÓ

19

altre grup de malalties es troba freqüentmentassociat a delecions múltiples del mtDNA però estransmet de forma autosòmica, per aquest motiues pensa que són conseqüència d'unacomunicació defectuosa entre el nucli i elmitocondri.

REORDENAMENTS

L'oftalmoplegia externa progressiva (PEO,progressive external ophthalmoplegia, MIM5

165130) és una de les formes d'afectaciómuscular característica de les malaltiesmitocondrials que es presenta generalment com aconseqüència de defectes al mtDNA o en lacomunicació entre el genoma mitocondrial inuclear. Els pacients pateixen oftalmoparesi, ptoside parpelles, disfàgia i debilitat proximal, ques'inicien en l'adolescència o lleugerament méstard, i que van progressant lentament. Als casosesporàdics de PEO s'han descobert delecionssenzilles al mtDNA, el que permet diferenciar-losd'altres formes hereditàries causades permutacions al DNA nuclear que provoquendelecions múltiples al mtDNA (TAULA 3). Aquestamalaltia aportà la primera evidència que una

5 MIM, número de referència al Mendelian Inheritance in

Man (V.A. McKusick, Johns Hopkins University Press, 1998) oa l'Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM,<http//www.ncbi.nlm.nih.gov/omim>).

mutació a un gen nuclear podia afectar laintegritat del mtDNA (Zeviani 1989).

La síndrome Kearns-Sayre (KSS, MIM 530000)es caracteritza per la presència de delecionssimples al mtDNA, i comporta oftalmoplegiaexterna progressiva i retinopatia pigmentària, ambinici dels símptomes anterior als 20 anys. Eldiagnòstic es confirma si a més es dóna alguna deles següents condicions: bloqueig cardíac,síndrome cerebelosa i concentració de proteïnesal líquid cefaloraquidi superior a 1 g/L. Aquestesalteracions poden ésser acompanyades persordesa neurosensorial, deteriorament cognitiu,diabetis, hipoparatiroïdisme i baixa estatura. En latercera o quarta dècada de vida, el pacient mor.

També té un pronòstic fatal la síndrome dePearson (MIM 557000), que afecta a nens petitsamb anèmia sideroblàstica, pancitopènia,disfunció pancreàtica exocrina, i vacuolitzaciódels precursors cel∙lulars de la medul∙la òssia. Elspacients que aconsegueixen sobreviure —gràciesa transfusions i factors de creixement de lamedul∙la— desenvolupen una KSS.

L'encefalomiopatia neurogastrointestinal mito-condrial, o MNGIE (MIM 550900), s'inicia entrela segona i la cinquena dècada de vida de lapersona, i es caracteritza per greus alteracionsgastrointestinals, ptosi, oftalmoplegia externaprogressiva, neuropatia perifèrica, miopatia,leucoencefalopatia i acidosi làctica. Els afectats

TAULA 2. MANIFESTACIONS CLÍNIQUES DE LES MALALTIES MITOCONDRIALS

cardíaquescardiomiopatia hipertròfica, bloqueig cardíac

dermatològiqueslipomatosi múltiple

endocrinesdiabetis mellitus, hipoparatiroïdisme, hipogonadisme, infertilitat

gastrointestinalsepisodis de nàusees i vòmits, disfàgia, pseudoobstrucció, pèrdua de pes

hematològiquessíndrome de Pearson amb pancitopènia, anèmia sideroblàstica

neuromuscularsatàxia, infarts, atacs, demència, migranya, encefalomiopaties, miopatia, sordesa neurosensorial, distonia,neuropatia perifèrica, paraparèsia, atròfia òptica, oftalmoplegia externa i ptosi, retinopatia, rabdomiolisi

pàncrees i fetgefallada pancreàtica exocrina, fallada hepatocel∙lular

psiquiàtriquesdepressió, psicosi

renalsaminoacidúria, disfunció tubular, síndrome de Fanconi, glomerulopatia

Classificació de les malalties mitocondrials

20

acostumen a ser de constitució molt prima, i elmúscul esquelètic presenta diverses alteracionsmitocondrials: RRF amb mitocondris ultra-estructuralment anòmals, activitats dels enzims dela CRM disminuïdes, i delecions múltiples i/odepleció del mtDNA.

MUTACIONS PUNTUALS

Les mutacions puntuals més freqüents són lesque causen l'atròfia òptica hereditària de Leber(LHON, Leber's hereditary optic neuropathy; MIM535000), que predominantment afecta a homesen la segona dècada de vida amb una pèrduaindolora i progressiva de visió dels dos ulls(bilateral). A aquesta malaltia es dedicarà un

capítol especial atès que el seu estudi en poblacióespanyola ha ocupat part del treball d'aquestatesi.

La NARP (neurogenic myopathy, ataxia andretinitis pigmentosa; MIM 551500) es caracteritzaper retard en el desenvolupament, retinopatiapigmentària, atàxia, demència, debilitat proximal ineuropatia sensitiva. L'inici de les manifestacionsclíniques acostuma a donar-se a l'adult jove, i vanprogressant lentament. En aquests pacients s'hantrobat les mutacions T8993G i T8993C, queafecten el gen de la subunitat 6 de l'ATPasa (c. V).El canvi T8993C acostuma a presentar un fenotipmés lleu. Si la mutació és molt abundant (superioral 90%, detectada en sang i cervell) es produeix

TAULA 3. MALALTIES MITOCONDRIALS

DEFECTES PRIMARIS AL MTDNA

reordenamentsPEO

KSS

síndrome de Pearson

diabetis i sordesa

mutacions puntualsa gens que codifiquen proteïnes

LHON: G11778A, T14484C, G3460A

NARP/síndrome de Leigh: T8993G/C

intolerància a l'exercici i immunoglobinúria: citocrom b

a gens dels tRNA

MELAS: A3243G, T3271C, A3251G

MERRF: A8344G, T8356C

CPEO: A3243G, T4274C

miopatia: T14709C, A12320G

cardiomiopatia: A3243G, A4269G

diabetis i sordesa: A3243G, C12258A

encefalomiopatia: G1606A, T10010C

sordesa neurosensorial no sindròmica: A7445G

a gens dels rRNA

sordesa no sindròmica induïda per aminoglucòsids: A1555G

DEFECTES DEL NDNA

afecten directament la MRCsíndrome Leigh (c. I): subunitat AQDQ al cromosoma 5

síndrome de Leigh (c. II): subunitat Fp de la SDH al cromosoma 5

síndrome de Leigh (c. IV): gen a 9q1 que codifica SURF I

atròfia òptica i atàxia (c. II): subunitat Fp de la SDH al cromosoma 5

cardioencefalomiopatia (c. IV): gen que codifica SCO2

afecten indirectament la funció mitocondrial; associats a delecions múltiples del mtDNAPEO autosòmica dominant: gens C10orf2 (10q24), ANT1 (4q34-35), POLG (15q25), 3p14-21MNGIE: gen timidina fosforilasa a 22q13.32-qter

Mitocondri i malaltia INTRODUCCIÓ

21

una encefalopatia infantil anomenada síndromede Leigh d'herència materna (o MILS, MIM516060) que atura el desenvolupamentpsicomotor de nens de 6–12 mesos i que causa lapèrdua dels coneixements adquirits fins aleshoresi l'aparició d'atròfia òptica, oftalmoplegia,tremolor i atàxia, entre d'altres símptomes. A unamateixa família poden trobar-se casos NARP icasos Leigh. Els afectes NARP tenen aproxi-madament el 70-90% de molècules mutants. Lesmares, assimptomàtiques, poden arribar apresentar fins el 70% de les molècules de mtDNAmutants en sang.

La síndrome de MELAS (mitochondrialencephalomyopathy with lactic acidosis andstroke-like episodes, MIM 251910) es caracteritzaper quadres recurrents d'hemiparèsia i ceguesacortical, acidosi làctica i episodis de vòmits.També pot donar-se deteriorament cognitiu ibaixa estatura. Els pacients normalmentdesenvolupen sordesa bilateral al final de lainfantesa o principi de l'adolescència, i diabetis,atacs i encefalopatia cap els 30–40 anys. A lamajoria de casos es troba un defecte al complex Ide la CRM causat per la mutació puntual A3243Gal gen tRNALeu, però s'han descrit altres mutacionsen el mateix gen o en gens diferents (COXIII,ND5, tRNAVal, tRNACis) associades a aquestasíndrome.

La síndrome de MERRF (myoclonic epilepsywith ragged-red fibres, MIM 254775) provocaepilèpsia mioclònica, atàxia i miopatia ques'inicien a la infantesa, i que poden derivar endemència progressiva, atròfia òptica, sordesa iacidosi làctica. Bioquímicament hi ha defectes alscomplexos III o IV, o en diversos alhora, i lesmutacions causants es localitzen al gen tRNALis

essent la més freqüent la A8344G (Enriquez1995). Aquesta transició ha estat detectada tambéen algun pacient amb lipomatosi simètricamúltiple6 (Gamez 1998).

La sordesa neurosensorial amb diabetis (MIM520000) és present en pacients amb la mutacióA3243G i també en individus amb una deleciósenzilla. En ambdós casos la sordesa s'inicia al'adolescència i progressa lentament al llarg delsprimers anys. Cap els 40 anys acostuma aaparèixer la diabetis.

6 La lipomatosi simètrica múltiple es caracteritza per

acumulacions de greix subcutani al voltant de la cara, partposterior del cap, coll i braços, preferentment.

Avui es coneixen més de 50 mutacionspuntuals al mtDNA que causen una àmpliagamma de manifestacions clíniques.

OBSERVACIONS GENERALS

MITOMAP és una base de dades de mutacionsdel genoma mitocondrial, i la seva pàgina aInternet<http://www.gen.emory.edu/mitomap.html>ofereix la informació disponible sobre lesmutacions descrites.

El paper patogènic d'una mutació s'estableix enfunció dels següents criteris:

! la mutació afecta un residu important desd'un punt de vista funcional i evolutivamentconservat

! les mutacions deletèries acostumen a trobar-se en heteroplàsmia, malgrat existeixenalgunes excepcions (per exemple, la mutacióLHON G11778A)

! el grau d'heteroplàsmia entre els familiars hade correlacionar amb la gravetat delssímptomes que presenten

Nombroses observacions clíniques han suggeritque les mutacions que afecten la síntesi proteicamitocondrial —mutacions puntuals a gens delsrRNA o tRNA i delecions— causen malaltiesmultisistèmiques, acidosi làctica i RRF. Mentreque les malalties associades a mutacions puntualses transmeten mitjançant herència materna, lesdelecions senzilles són fenòmens esporàdics en lagran majoria dels casos.

Fins a aquest moment els únics complexos dela CRM als quals s'han descrit mutacionspatogèniques al DNA nuclear són l'I, el II i el IV, ipel que fa al complex IV, cap d'aquestes no afectadirectament subunitats del complex sinó proteïnesnecessàries per a l'encaixament de les subunitats.La manca de mutacions a subunitats "nuclears"dels complexos III, IV i V potser és deguda a quèmutacions d'aquest tipus podrien ser incom-patibles amb la vida. Les activitats dels complexosI i II són paral∙leles, de forma que si un falla, laCRM pot seguir funcionant per l'acció de l'altre.En canvi, els complexos III, IV i V tenen un paperúnic i seqüencial en la CRM i la fosforilacióoxidativa (FIGURA 3, pàg. 11).

A diferència de la diversitat en l'expressiófenotípica que caracteritza a les mutacions almtDNA, les mutacions al nDNA causen unfenotip ben concret des d'un punt de vista clíniccom és el cas de la síndrome de Leigh.

Hi ha correlació genotip/fenotip en les malalties mitocondrials?

22

Existeix una sèrie de malalties associades a ladepleció del mtDNA i delecions múltiples que esconsideren el resultat d'alteracions en lacomunicació entre nucli i mitocondri, mésconcretament entre els seus genomes. Hom pensaque en aquestes malalties les mutacions al nDNAinterrompen l'intercanvi normal que controla laintegritat i quantitat de mtDNA. La primeramalaltia d'aquest tipus —la PEO autosòmicadominant— fou descrita l'any 1989 (Zeviani 1989)i en l'actualitat n'hi ha al voltant d'una desenamés, entre les que fins fa poc es trobava lasíndrome de Wolfram (vegeu la recopilació fetaper Hirano i Vu (Hirano 2000)), qüestió aradebatuda7.

HI HA CORRELACIÓ GENOTIP/FENOTIP ENLES MALALTIES MITOCONDRIALS?

Com ja s'ha comentat anteriorment, la malaltiamitocondrial es caracteritza per l'afectació dediversos òrgans. A aquesta afectació multi-sistèmica cal afegir la variabilitat en l'expressiófenotípica —també entre membres de la mateixafamília— que fa que de vegades passi molt tempsfins que el pacient arriba a ser diagnosticatcorrectament. Sens dubte l'heteroplàsmia i l'efectellindar són trets exclusius de la genèticamitocondrial que tenen un paper bàsic en aquestsdos fenòmens.

Qualsevol tipus de mutació al mtDNA tépotencialment com a conseqüència l'alteració enel funcionament de la CRM i la disminució de laproducció d'energia en forma d'ATP. De quinamanera, doncs, un mateix defecte es tradueix enproblemes en uns òrgans o teixits però no end'altres dins d'un mateix individu? Per què undeterminat defecte provoca malaltia en unapersona i no en una altra? L'existència de l'efectellindar pot respondre d'un mode relativamentsimple aquestes qüestions: cada òrgan té unconsum d'energia particular i no és estrany que elmateix percentatge de molècules de mtDNAmutants pugui comprometre el funcionament delnervi òptic i no el del fetge, per exemple.

Però hi ha molts altres factors que condicionenl'aparició de malalties mitocondrials —i la sevatransmissió dins d'un pedigrí—, cosa que les faparticularment interessants des d'un punt de vistacientífic, però també especialment complicades

7 Dins de l'apartat Síndrome de Wolfram o DIDMOAD

(pàg. 39) s'amplia aquest tema en ser aquesta una de lesmalalties estudiades durant aquesta tesi.

des d'una perspectiva mèdica. Certes mutacions almtDNA heretades per via materna predisposen auna varietat de malalties neurodegeneratives, i lagravetat de les mutacions correlaciona amb l'edatd'inici de les malalties. Si les mutacions s'hanheretat via materna és que són presents enl'individu des del naixement, aleshores, què és elque retarda l'aparició dels primers símptomes demalaltia? Es pensa que l'acumulació secundària demutacions al mtDNA en teixits postmitòticsassociada a l'edat pot ser el factor que engegal'aparició dels primers símptomes. Els individusque hereten un defecte "menor" al mtDNAnecessitaran un major nombre de mutacionssomàtiques per a arribar al llindar quecomprometi la funcionalitat del teixit mutant i, pertant, poden viure la major part de la seva vidasense manifestacions clíniques. En canvi si lamutació heretada és deletèria, la capacitatrespiratòria de l'individu serà limitada des delprincipi i caldran menys mutacions somàtiquesper a l'aparició de la malaltia8.

Una altra "complicació" de les malaltiesmitocondrials és el fet que dins d'una família lamateixa mutació pugui tenir efectes fenotípicsdiferents. És possible que les molècules demtDNA mutants del zigot es distribueixin demaneres diferents al llarg de les divisionscel∙lulars que succeeixen durant el desen-volupament embrionari. Així, en un individu lesmolècules de mtDNA mutants es podrienacumular al cervell i múscul esquelètic, mentreque en el germà —per exemple— es podenacumular al miocardi. A propòsit d'això, ¿què ésel que determina el nivell de mtDNA mutant alsoòcits? Aquest és un tema que s'està estudiantamb interès per part dels grups més importantsdins del camp de la genètica mitocondrial.

Una dona amb una mutació heteroplàsmica pottransmetre una quantitat variable de mtDNAmutant a cada fill. Llavors, ¿hi ha selecció en latransmissió de mutacions patogèniques, os'hereten com a variants gèniques neutres? S'handescrit casos en els quals una mutació nova s'hafixat en molt poques generacions, el quesuggereix que existeix algun procés que fa quenomés una petita proporció de lesaproximadament 100.000 molècules de mtDNAque contenen els oòcits sigui transmesa a lescèl∙lules filles, l'anomenat coll d'ampolla genètic.Un cop superat aquest, el mtDNA es replicaria

8 A l'apartat L'envelliment i el paper dels radicals lliures

(pàg. 26) es parla més extensament de l'acumulació demutacions somàtiques amb l'edat.

Mitocondri i malaltia INTRODUCCIÓ

23

fins a assolir la quantitat normal, i les molèculeses distribuirien a l'atzar entre les cèl∙lules filles.Grans diferències en la proporció de molècules demtDNA mutants entre una progènie indiquen quehi ha hagut, en algun moment (durant l'oogènesi,l'embriogènesi...), un procés de restricció delnombre de molècules per cèl∙lula seguit d'unaamplificació. Un coll d'ampolla a la línia germinalprovoca deriva genètica d'una manera ràpida, deforma que o es perd directament la mutació, oalternativament es generen individus que sónhomoplàsmics per a la nova mutació, exposant-laa les forces de la selecció natural que operarien anivell de l'individu. Chinnery et al. creuen quel'efecte del coll d'ampolla a la línia germinal téuna "utilitat" evolutiva ja que suposa la pèrdua demutacions mitjanament deletèries abans ques'acumulin a la població, però a curt termini potocasionar problemes a l'individu ja que lesmutacions que "superen" el coll d'ampolla,tendiran a ser homoplàsmiques amb rapidesa(Chinnery 2000b). En un treball més recent delmateix grup en el qual estudien 82 oòcits primarisd'una dona amb la mutació MELAS A3243G (ambel 18% de molècules mutants a quàdriceps i el7% a leucòcits) s'afirma que és la deriva genèticael que determina la proporció de mtDNA mutantals oòcits primaris humans (Brown 2001), tal coms'havia determinat per a ratolins (Jenuth 1996).

Si bé a la línia germinal no sembla, doncs,existir selecció genètica, hom pensa que peralgunes mutacions al mtDNA —especialmentaquelles amb efectes fenotípics més greus— sí esdonen fenòmens de selecció al llarg de la vida del'individu. En alguns teixits la selecció provocauna disminució de la quantitat de mtDNA mutant,mentre que en d'altres un increment. Enpoblacions de cèl∙lules mare que es divideixenràpidament, el mtDNA mutant pot ser eliminatper selecció que actuï a nivell de cèl∙lula. Lasegregació replicativa pot resultar en quantitatselevades de mtDNA mutant en algunes cèl∙lulesmare, i en quantitats baixes en unes altres. Lesprimeres potser no es podran dividir, però lessegones és probable que es divideixinnormalment. Potser és un mecanisme similar elque fa que disminueixi el nivell de la mutacióA3243G en sang amb el temps (t Hart 1996). Encanvi, en altres casos i en altres teixits la quantitatde molècules mutants pot augmentar amb eltemps, i de vegades, l'increment s'ha relacionatamb l'evolució de la malaltia (Larsson 1990;Weber 1997). Les raons per a aquesta "selecció"positiva són desconegudes, però sovint s'ha parlatd'un intent de compensar les deficiències en laCRM mitjançant la replicació selectiva del

mtDNA en mitocondris amb un funcionamentalterat per la presència de mtDNA mutant(Shoubridge 1990; Yoneda 1992).

La genètica mitocondrial té un importantcomponent quantitatiu. Utilitzant un sistema invitro d'híbrids transmitocondrials (o cíbrids, delsquals es donen més detalls a l'apartat Cíbridstransmitocondrials, pàg. 29), el grup del professorGiuseppe Attardi determinà que un 10% demolècules de mtDNA salvatges és capaç decomplementar la síntesi de proteïnes i elfuncionament de la CRM per a les mutacionsMELAS A3243G i MERRF A8344G, dues de lesmutacions puntuals més freqüents enencefalopaties (Attardi 1995). Attardi pensa que lacomplementació es dóna perquè els productesgenerats a partir del 10% (o més) de molèculesnormals interacciona amb els productesdefectuosos del 90% de molècules mutants, mésque no pas perquè per a mantenir la capacitatenergètica normal només calgui un 10% demolècules salvatges. En un altre estudi ambcíbrids aquest cop preparats a partir d'un pacientamb PEO (amb delecions al mtDNA) s'observàcomplementació dels tRNA no transcrits per lesmolècules mutants quan el percentatge demolècules salvatges era superior al 40% (Hayashi1991). L'aparent discrepància entre les dues xifresno és tal segons Attardi ja que el seu grup hadeterminat una capacitat d'aminoacilació deltRNALis en cèl∙lules transformants portadores de lamutació MERRF del 40-50% respecte trans-formants salvatges (Attardi 1995).

Pel que fa a dades sobre pacients amb aquestesmutacions, s'ha vist que existeix correlació entrela freqüència de les manifestacions clíniques méshabituals i la proporció de mtDNA mutant amúscul, però no a sang (Chinnery 1997). Elsautors creuen que la manca de correlació en elcas de la mutació MERRF en sang pot ser degudaa la petita mida de la mostra analitzada, ja quenormalment els individus amb la mutacióA8344G tenen els mateixos percentatges a músculque a sang. En aquest treball, en el qual elspacients s'agrupen d'acord amb el percentatge demtDNA mutant que presenten —tant a músculcom a sang— i segons els símptomes clínics quepateixen, s'observa que la mutació MELASA3243G causa manifestacions fenotípiques apartir d'un 30% de molècules mutants, i lamutació MERRF A8344G a partir del 70%.Aquestes xifres són molt inferiors al 90% establerten experiments in vitro, però Chinnery et al.pensen que dins d'un òrgan es pot donar unaacumulació de mutacions a algunes cèl∙lules i no

Malalties neurodegeneratives

24

a d'altres, cosa que afecta igualment el seufuncionament, però que fa que el percentatge migal teixit sigui baix. Així, individus amb menys del60% de mtDNA mutant a algun teixit del sistemanerviós central (SNC) poden arribar a patirsíndromes neurològiques molt greus.

A banda de diferències quant a percentatged'heteroplàsmia i susceptibilitat particular de cadateixit, hi ha altres factors (genètics i ambientals)que poden determinar unes manifestacionsclíniques completament diferents per a duespersones amb la mateixa mutació mitocondrial.En experiments amb cíbrids s'havist que l'entorn nuclear de lacèl∙lula que rep artificialment lamutació MELAS A3243G potinfluenciar la segregació de lesmolècules de mtDNA mutants,de manera que en uns casosaquestes molècules estiguinafavorides mentre que en d'altres,es tendeixi a la seva eliminació(Dunbar 1995). L'entorn nucleartambé pot tenir un paper clau enla manifestació fenotípica de lasordesa no sindròmica associadaa la mutació A1555G (Guan2001). Fins i tot és possible queen determinades situacionsexisteixin interaccions entre lesmateixes molècules de mtDNAque puguin condicionar lesrepercussions clíniques de lesmutacions. En aquest sentit, s'hadescrit l'aparició d'una segonamutació al mtDNA capaç desuprimir l'efecte patogènic de lamutació introduïda A3243G (ElMeziane 1998).

MALALTIESNEURODEGENERATIVES

S'ha especulat que les neurones poden serespecialment vulnerables a la disminució delmetabolisme mitocondrial que se suposaacompanya el procés d'envelliment. El teixitneuronal és postmitòtic, i conseqüentment s'hipoden acumular mutacions espontànies almtDNA que no seran eliminades en no haver-hiselecció clonal per divisió cel∙lular. La disfunciómitocondrial pot generar radicals lliures i danyoxidatiu, factors implicats en la patogènesi de lesmalalties neurodegeneratives. Dins d'aquestimportant conjunt de malalties s'han descrit

anomalies a la CRM associades a defectesprimaris al mtDNA i també com a conseqüènciade mutacions a gens nuclears directamentimplicats en funcions mitocondrials, com perexemple els gens que codifiquen les proteïnesSURF1, frataxina i paraplegina. També s'hanobservat defectes en la fosforilació oxidativa i unaproducció incrementada de radicals lliures enmalalties neurodegeneratives no causades perdefectes al mitocondri. En aquests casos es pensaque la disfunció mitocondrial és probablement unepifenomen que, en tot cas, contribueix aprecipitar la mort cel∙lular del teixit.

A continuació es presenta unrecull breu de les principalsmalalties neurodegeneratives idel paper que hi tenen elsmitocondris.

La paraplegia espasmòdicahereditària és una malaltia carac-teritzada per rigidesa progressivaa les cames, hiperreflèxia i difi-cultats per caminar. Afecta a lainfantesa o més tard a l'adoles-cència. S'han descrit diversesformes d'herència de la malaltia.En famílies que pateixen la formaautosòmica recessiva s'han iden-tificat delecions homozigòtiques imutacions de canvi de pauta delectura en el gen responsableSPG7 (paraplegina), a la regió16q24.3. La paraplegina té unagran homologia amb Zn—metal∙-loproteases dependents d'ATPque són actives als mitocondris.La seva localització mitocondriales va descobrir mitjançanttècniques immunohistoquímiques(FIGURA 6). Curiosament, no vaser fins després d'aquests ex-periments que no es van analitzarmúsculs esquelètics de malalts i

s'hi van identificar RRF i fibres COX negatives.

L'atàxia de Friedreich és l'atàxia hereditàriamés comú (prevalença aproximada: 1/50.000) quees caracteritza per l'atàxia progressivad'extremitats, cardiomiopatia i diabetis. Lamalaltia apareix abans dels 25 anys, i es transmetde manera autosòmica recessiva. El gens'anomena frataxina i es localitza a 9q13, i a lamajor part dels casos l'alteració genètica és unaexpansió GAA al primer intró. Les mutacionsprovoquen una disminució en l'expressió de laproteïna, que es troba a diversos teixits i al SNC

FIGURA 6.Localització mitocondrial de laparaplegina. Immunofluorescències ambcèl∙lules COS-7 transfectades amb elcDNA de la paraplegina marcat amb laseqüència per l'epítop c-myc. Dalt, tincióamb un anticòs anti-c-myc. Baix, tincióamb rodamina utilitzant un anticòspoliclonal anti proteïna mitocondrial ques'uneix a cadena senzilla (mtSSB).S'observa que la paraplegina colocalitzaamb la mtSSB en el mitocondri. [Imatgeextreta de (DiMauro 1998), cedida per A.Ballabio i G. Casari].

Mitocondri i malaltia INTRODUCCIÓ

25

és abundant al cerebel i medul∙la espinal. Dins dela cèl∙lula, la frataxina es localitza al mitocondri,on podria intervenir en l'homeòstasi del ferro, jaque en teixits afectats s'ha descrit un increment deferro i una disminució de les activitats delscomplexos I, II, III i aconitasa, els quals contenengrups de ferro i sofre.

A la malaltia de Wilson, en canvi, el que s'handescrit són alteracions en el metabolisme delcoure. Es tracta d'una condició autosòmica reces-siva a la que es pateix distonia i parkinsonisme,símptomes psiquiàtrics i fallada hepàtica. L'alte-ració en l'homeòstasi del coure resulta enl'acumulació del metall a fetge, als ganglis basalsdel cervell i al ronyó. El gen associat a la malaltia(WND) codifica una ATPasa tipus P transportadorade coure. La proteïna WND existeix en duesisoformes, una que es troba a la xarxa delcomplex de Golgi, i l'altra que es troba almitocondri. Els mitocondris de teixits afectatspresenten unes anomalies característiques, imalgrat no es coneix la funció de la WND espensa que la isoforma mitocondrial podria tenirun paper en les funcions dels enzimsmitocondrials dependents de coure.

L'esclerosi lateral amiotròfica (ALS) és unamalaltia degenerativa que apareix cap els 40-50anys aproximadament, i que en un temps mig detres anys comporta la paràlisi i la mort del'individu. La major part dels casos són esporàdicsi de causes desconegudes. Entre un 10 i un 20%dels pacients són casos familiars i d'entre aquests,en un 10% s'han trobat mutacions al gen de lasuperòxid dismutasa (Rosen 1993), gen essencialper a l'eliminació de radicals O2

•−, els quals nosón especialment tòxics però poden transformar-se en radicals hidroxil (•OH) que sí ho són.D'aquesta manera, s'ha suggerit que l'ALS esproduiria en casos en què s'alterés l'equilibri deles ROS i es produís dany oxidatiu mitocondrial.

La malaltia de Huntington (HD) és autosòmicadominant amb una penetració completa en elsadults. Es caracteritza per movimentscoreoatetòsics9 i per alteracions progressivesemocionals i de reconeixement. Està causada perrepeticions del triplet CAG al gen IT15 en elcromosoma 4 que codifica la huntingtina, unaproteïna encara de funció desconeguda. Pelsresultats obtinguts a partir de teixits in vivo i postmortem, es creu que pot existir un defecte en elmetabolisme energètic malgrat no es coneix

9 Moviments involuntaris ràpids, desordenats i irregulars de

predomini facial i de la part distal de les extremitats.

encara per quin mecanisme la hungtintinaanòmala causaria la disfunció mitocondrial.

Diversos treballs apunten a una implicaciómitocondrial també en malalties com el Parkinsoni l'Alzheimer. A la substància nigra de malalts deParkinson es va detectar deficiència del complex Ii un increment del dany oxidatiu (Mecocci 1994).Moltes neurotoxines emprades com a pesticides oherbicides alteren el funcionament mitocondrial isón utilitzades en l'actualitat com a models demalalties neurodegeneratives. La 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropirina (MPTP) —que causaparkinsonisme a humans, primats i altresmamífers— té com a dianes les neurones dopa-minèrgiques de la substància nigra i es concentradins dels mitocondris. Es metabolitza a 1-metil-4-fenilpiridini (MPP+), que inhibeix selectivamentel complex I i també provoca la disminució delnombre de còpies del mtDNA.

La malaltia d'Alzheimer (AD) és la demènciamés freqüent a la vellesa. Un 5% dels casos estransmeten de forma autosòmica dominant i sóncausats per mutacions en el gen de la proteïnaprecursora amiloide o presenilina. La gran majoriade pacients amb AD representen casos esporàdicssense que es conegui el defecte genètic que elsorigina. Neuropatològicament es caracteritzen perla presència de cabdells neurofibril∙lars i deplaques amiloides, i per pèrdua neuronal. Encervells de malalts s'ha vist que l'activitat COXestà reduïda. Diverses mutacions al mtDNA s'hanassociat amb l'AD, però no s'ha demostrat unpaper d'aquestes en la patogènesi de la malaltia.Benjamín Rodríguez, en el nostre grup, haestudiat mostres de cerebel, còrtex frontal ihipocamp de cervells AD, i no ha detectatreordenacions ni quatre mutacions puntuals almtDNA associades a AD (B. Rodríguez, enpremsa). Sí ha detectat, però, una reducció en elcontingut de mtDNA en còrtex frontal del 28%respecte a cervells controls, tot i que aquestadiferència no és estadísticament significativa,potser degut a la mida de la mostra (12 cervellsAD i set cervells controls) (Rodríguez-Santiago2001).

L'escassa disponibilitat de mostres de teixitcerebral humà sens dubte limita enormementl'estudi de les malalties neurodegeneratives. Lageneració de models animals knock-out als qualses redueixi la producció d'energia de diferentsàrees del cervell potser aportarà algun indici sobreels mecanismes patogènics d'alguna d'aquestesgreus malalties.

L'envelliment i el paper dels radicals lliures

26

L'ENVELLIMENT I EL PAPER DELS RADICALSLLIURES

Diverses funcions mitocondrials es veuenafectades per l'edat. Els factors que hicontribueixen inclouen el pas intrínsec de protonsa través de la membrana mitocondrial interna, ladisminució en la fluïdesa de les membranes, ireduccions en la quantitat i funció de lacardiolipina, que té un paper molt important jaque facilita la tasca d'enzims de la membranainterna (Ames 1995).

Com ja s'ha esmentat anteriorment, la taxa demutació del mtDNA és més de 10 vegadessuperior a la del DNA nuclear. Mentre quemutacions a cèl∙lules de la línia germinalprovoquen malalties d'herència materna,l'acumulació de mutacions somàtiques en teixitspostmitòtics pot tenir com a conseqüència eldeclivi progressiu del metabolisme mitocondrialobservat en el desenvolupament de malaltiesheretades i també en l'envelliment. L'inici tardà iel curs progressiu de moltes malaltiesmitocondrials suggereixen que el funcionamentdels mitocondris va empitjorant amb el temps.

Diversos treballs han descrit incrementsestadísticament significatius en l'acumulació demutacions somàtiques al mtDNA amb l'edat, tantdelecions com mutacions puntuals (Corral-Debrinski 1992; Cortopassi 1992; Liu 1998). Elque no és tan clar però, és si l'envelliment implicala disminució de l'activitat de la CRM. Mentre hiha estudis als que es detecten reduccions enl'activitat d'alguns complexos, altres no trobencorrelació entre edat i capacitat energètica delmúscul (Barrientos 1996a; Chretien 1998;Kopsidas 1998). És possible que aquests resultatscontraposats siguin conseqüència de diferènciesquant a factors com el grau d'exercici o el consumde tabac o altres substàncies tòxiques en els grupsestudiats pels diversos laboratoris. En qualsevolcas, no és especialment sorprenent quel'envelliment no impliqui necessàriament unareducció de l'activitat OXPHOS de l'individu si esconsidera que l'increment de mutacionsmitocondrials en persones grans (del 0,1 al 10%)és molt inferior a, per exemple, el percentatge dedelecions necessari per a la disminució del'activitat COX en experiments in vitro ambcèl∙lules d'un pacient amb PEO (50-60%)(Hayashi 1991).

La teoria mitocondrial de l'envellimentproposa que si les espècies d'oxigen reactiu (oROS) que es generen com a subproductes de lacadena respiratòria es produeixen en excés i no

són neutralitzades pels mecanismes antioxidantsde què disposa la cèl∙lula, poden reaccionar ambel mtDNA i danyar-lo. Això afectarà elfuncionament de la pròpia CRM, i aleshores esproduiran més radicals lliures. Aquest cercleviciós pot comportar una disminució en laproducció d'ATP que alteraria el potencialtransmembrana i induiria la cèl∙lula cap al'apoptosi (vegeu l'apartat Apoptosi, pàg. 12).L'excés d'oxidants també pot afectar els lípids demembrana, proteïnes i altres macromolècules.

Barja i Herrero han demostrat que espèciesanimals amb una menor durada de vida presentenmés dany oxidatiu en cervell i cor que altresespècies de longevitat superior10 (Barja 2000). Laimplicació de les espècies ROS en l'envellimentha estat confirmada per estudis a D. melanogaster,C. elegans i ratolí. La sobreexpressió del gen de lasuperòxid dismutasa a motoneurones deDrosophila va aconseguir incrementar un 40% elperíode de vida de les mosques (Parkes 1998). I jas'ha esmentat anteriorment l'existència demutacions en aquest gen a humans afectats peresclerosi lateral amiotròfica (pàg.25).

La FIGURA 7 il∙lustra els fenòmens que podenparticipar en el procés de l'envelliment i lesmalalties neurodegeneratives. Les mutacionssomàtiques són probablement conseqüència deldany oxidatiu, que s'incrementa amb l'edat tant aratolins com a humans (Ames 1993; Mecocci1993). Diversos treballs suggereixen que lesmutacions somàtiques s'acumulen amb l'edat ateixits postmitòtics a causa del dany ocasionat perles ROS. La disminució de la fosforilació oxidativaresultant alteraria la capacitat energètica del teixitfins ultrapassar un determinat llindar a partir delqual apareixeria l'envelliment (Wallace 1999a) isímptomes o malalties degeneratives que sovintl'acompanyen (problemes cardiovasculars,disfunció cerebral, cataractes, càncer, afectaciódel sistema immunològic...).

En un treball d'aquest any 2001 Elson et al.(Elson 2001b) dissenyen i apliquen un model pera la replicació del mtDNA que explical'acumulació de mutacions somàtiques al mtDNAamb l'edat. Conclouen que la replicaciómitocondrial (que és independent de la divisiócel∙lular i segueix ocorrent també en teixitspostmitòtics) pot provocar —sense l'existència

10 Aquest treball també demostra que el dany oxidatiu

(mesurat en forma de 8-oxo-7,8-dihidro-2'-desoxiguanosina) almtDNA és com a mínim tres vegades superior al del nDNA,tant en cervell com en cor.

Mitocondri i malaltia INTRODUCCIÓ

27

d'avantatges replicatius— un canvi substancial enla quantitat de molècules de mtDNA mutants dinsd'una cèl∙lula al llarg de la vida d'un individu.Mantenen que les mutacions somàtiquessusceptibles de provocar un efecte patogènic hand'aparèixer probablement durant la infantesa ojoventut, ja que en cas de succeir en una fase méstardana de la vida de l'individu, no podrienacumular-se en proporcions suficients per a causarla malaltia.

Si les premisses d'aquest grup són correctes, lesconseqüències biològiques del "cercle viciós"proposat per a explicar l'envelliment i la malaltiamitocondrial podrien ser mínimes, per tal com lesnoves mutacions originades pel dany oxidatiu notindrien temps d'assolir un percentatge patogènic.

EINES PER AL DIAGNÒSTIC I L'ESTUDI DELES MALALTIES MITOCONDRIALS

L'estratègia bàsica que cal seguir davant lasospita d'una malaltia mitocondrial es recull a laFIGURA 8, pàg. 28, modificada de (Nardin 2001) i(Chinnery 1999). Ambdós treballs remarquen lanecessitat de realitzar tota una sèrie de provesclíniques en els pacients amb símptomesneuromusculars abans d'endegar la recerca delpossible defecte mitocondrial, ja que per aquestapot ser necessària una biòpsia muscular. Algunesmalalties mitocondrials (com per exemple laMERRF o la LHON) sovint poden ser diagnos-

ticades a partir de mostres de sang, però end'altres casos (MELAS, KSS, PEO...) la quantitat demtDNA mutant en sang és molt baixa o inexistent.

Si el pacient no presenta cap de les mutacionsmitocondrials més freqüents (LHON, MELAS oMERRF), caldrà analitzar una mostra de múscul.La quantitat de mtDNA mutant pot variar d'òrgana òrgan, però també de cèl∙lula a cèl∙lula, per aixòmolts experts prefereixen realitzar una biòpsianormal en lloc d'una biòpsia amb agulla quecausa moltes menys molèsties. Un cop s'haobtingut el teixit muscular es poden iniciar tresgrans grups d'estudi: els histològics, elsbioquímics i els genètics (FIGURA 8, pàg. 28).

La presència de RRF11 és freqüent en casos dedeleció, depleció del mtDNA o en mutacionspuntuals als gens dels tRNA; en canvi, rarament esdetecten quan existeixen mutacions a gensestructurals. Per aquest motiu es creu queaquestes fibres anormals apareixen com aconseqüència d'una síntesi de proteïnesmitocondrials alterada. Un altre sistema per aidentificar anomalies mitocondrials és tenyir el tallhistològic per a comprovar l'activitat de lacitocrom c oxidasa. Les fibres COX-negativesrevelen un defecte en el complex IV. Si el defecte

11 Vegeu l'apartat Classificació de les malalties

mitocondrials, pàg. 18.

mutacions almtDNA

ATP

alteracionsa la CRM⇑ ROS

trencamentmembrana

Cit. c

apoptosiENVELLIMENT,

MALALTIA

⇓ ATP

necrosi

⇓ ∆ψm

FIGURA 7. CERCLE VICIÓS.Model (modificat de (Graff 1999)) que proposa la seqüència d'esdeveniments quedesembocarien en envelliment o malaltia mitocondrial. ∆ψm, potencial de membranainterna; CRM, cadena respiratòria mitocondrial; Cit. c, citocrom c; ROS, espècies d'oxigenreactiu. Vegeu l'explicació en el text.

Eines per al diagnòstic i l'estudi de les malalties mitocondrials

28

es troba a un altre complex, les fibres són COX-positives.

Les proves bioquímiques determinen l'activitatindividual dels complexos mitocondrials. A més,estudien el funcionament global de la CRMacoblada a l'OXPHOS a partir de mitocondrisaïllats de teixit fresc. Si hi ha diversos complexosafectats és probable que existeixi alguna alteracióde la síntesi proteica mitocondrial. Quan nomésun complex és afectat, pot ser resultat d'unamutació a un gen que codifica algun polipèptidque el constitueix. Si el complex II és deficient, eldefecte molecular caldrà buscar-lo al DNAnuclear, atès que no està constituït per capsubunitat codificada al mtDNA. L'heteroplàsmia ila complementació (vegeu la pàg. 23 dins l'apartatHi ha correlació genotip/fenotip en les malaltiesmitocondrials?) fan que sigui difícil identificardèficits enzimàtics.

Aquestes proves són les que estableixen siexisteix o no alguna alteració mitocondrial enl'individu amb senyals i símptomes sospitosos demalaltia mitocondrial, independentment que lacausa es trobi al mateix mitocondri o fora d'ell.Per a determinar aquest darrer punt cal l'anàlisimolecular del mtDNA, i si aquest no dónaresultats positius s'haurà de contemplar lapossibilitat d'un defecte al DNA nuclear.

Les tècniques bàsiques per a l'estudi moleculardel mtDNA són la reacció en cadena de lapolimerasa (PCR) —tant l'estàndard com la llarga,que pot amplificar la molècula sencera demtDNA— i el Southern blot. La seqüenciació delgenoma mitocondrial és una altra eina, però caltenir present que el mtDNA és altamentpolimòrfic i que, a més de la mutació responsabledel fenotip del pacient, poden identificar-se canvissense cap efecte perjudicial (els criteris per aconsiderar una mutació com a patogènica estroben resumits a la pàg. 21). També és important

Possibilitat de malaltia mitocondrialen base a l’examen mèdic i l’historial

Possibilitat de malaltia mitocondrialen base a l’examen mèdic i l’historial

Investigacions clíniques:" Sang: lactat, piruvat, alanina, glucosa, CK" Orina: aminoàcids, àcids orgànics" Líquid cerebroespinal: lactat, proteïnes" Placa R.X. de pit, electrocardiograma ± ecocardiograma" Electroencefalograma/electromiografia" Tomografia computeritzada o ressonància magnètica del cervell

sospita de síndromemitocondrial conegut

(MELAS, MERRF, NARP...) ?Cerca de mutacionsconegudes en sang Biòpsia muscular

Histoquímica: RRF, tinció COX i SDH Ultraestructura: microscopi electrònic

Estudis bioquímics

Anàlisi molecular del mtDNA:" reordenaments" mutacions puntuals" depleció

sí no

negatiu

FIGURA 8. ALGORITME DE RECERCA D'UNA MALALTIA MITOCONDRIAL.

Mitocondri i malaltia INTRODUCCIÓ

29

tenir en compte que si s'està analitzant un teixitque no és el diana, es poden obtenir seqüènciescompletament normals en pacients hetero-plàsmics per a mutacions causants de malaltia.Una altra font de "falsos negatius" pot serl'amplificació de pseudogens mitocondrials alDNA nuclear, per la qual cosa és important feruna bona selecció dels encebadors que s'hand'emprar en les PCR.

Pel que fa a l'estudi dels mecanismespatofisiològics de les malalties mitocondrials, lestècniques utilitzades són diverses: hibridació insitu, PCR en fibra muscular aïllada, cultiu demioblasts12, fibroblasts i limfoblasts, generació delínies de cíbrids, preparació de models animals.

Aquesta darrera eina no s'ha aconseguit finsmolt darrerament, a causa de la dificultat quesuposa obtenir models animals adequats. Enl'actualitat es disposa de ratolins amb deficiènciacrònica d'ATP causada per la inactivació del gennuclear ANT1 (translocador de nucleòtidsd'adenina); altres porten mutacions que inactivenels gens nuclears que codifiquen la superòxiddismutasa mitocondrial; també existeixen ratolinsamb el gen nuclear que codifica el factor detranscripció mitocondrial Tfam inactivat, que potser un model per a les malalties amb depleció delmtDNA (Wallace 1999a). Darrerament s'haaconseguit un ratolí amb una deleció al mtDNApatogènica, el que permetrà desenvolupar estudissobre la seva transmissió i la segregació en elsdiferents teixits (Inoue 2000); també s'ha descritun ratolí amb una mutació natural al mtDNA queprovoca sordesa (Johnson 2001). És previsible queen un futur no gaire llunyà apareixeran dadesmolt interessants sobre aquests models animals,que a més potser podran ésser aprofitades per acrear noves estratègies terapèutiques. En el campde les malalties neurodegeneratives tindrà un granvalor el desenvolupament d'animals que presentinuna producció d'energia selectivament dismi-nuïda en diverses regions del cervell.

12 Les fibres musculars són sincicis polinucleats

postmitòtics, per la qual cosa no és possible el seu cultiu. Elsmioblasts són cèl∙lules satèl∙lit que les envolten i queconserven la capacitat de dividir-se, per tant es poden aïllard'una biòpsia muscular i establir un cultiu primari a partird'ells. Si s'indueix la diferenciació dels mioblasts, aquests esfusionen i formen miotubs, de manera que es pot estudiar comuna determinada mutació al mtDNA afecta la diferenciaciómuscular. També han estat usats per a l'estudi de la traducciómitocondrial.

CÍBRIDS TRANSMITOCONDRIALS

Sens dubte una de les tècniques que més dadesha aportat al coneixement de les malaltiesmitocondrials ha estat la preparació de cíbridstransmitocondrials Aquesta metodologia consis-teix a fusionar mitocondris de pacients amb líniescel∙lulars que contenen mitocondris "buits" demtDNA. La FIGURA 9 (pàg. 30) esquematitza tot elprocés.

Va ser el grup del doctor Attardi el que vaaconseguir establir per primera vegada una líniacel∙lular sense mtDNA (King 1989). Per tal deseguir la nomenclatura emprada amb elsequivalents a llevat, aquestes cèl∙lules van seranomenades ρ° (rho zero). La forma més freqüentd'obtenir les cèl∙lules ρ° és afegir bromur d'etidi(a una concentració ~50 ng/mL) al medi de cultiude línies cel∙lulars establertes. A baixaconcentració, el bromur d'etidi inhibeix la síntesidel mtDNA però no afecta la síntesi del nDNA.Després de n divisions (al voltant de 15generacions) les cèl∙lules han perdut tot elmtDNA. Els mitocondris mantenen el potencial demembrana utilitzant el translocador de nucleòtidsd'adenina i l'ATP generat a la glucòlisi, però hanperdut la capacitat de sintetitzar els polipèptids dela CRM i en conseqüència, no "respiren". Lescèl∙lules ρ° creixen en un medi amb glucosaenriquit amb piruvat13 i generalment uridina(50 µg/mL), com a font de pirimidines, ja que lasíntesi d'aquestes està interrompuda per la mancad'un transport d'electrons funcional.

S'han preparat cèl∙lules ρ° a partir de líniesestablertes de cèl∙lules de carcinoma de pulmó,de cèl∙lules HeLa, de cèl∙lules derivades defibroblasts i de la línia 143B Tk- derivada d'unosteosarcoma. Aquesta línia és deficient entimidina-quinasa, fet que la fa resistent a labromodesoxiuridina i que és aprofitat com amarcador nuclear recessiu per a la selecció.Aquestes cèl∙lules sense mtDNA es podencongelar i utilitzar posteriorment, com qualsevolaltra línia establerta.

13 A una concentració de 100 µg/mL. El piruvat pot ser

necessari com a substrat de la lactat deshidrogenasa per aoxidar el NADH citosòlic.