il biomonitoraggio ambientale attraverso lo stress silvia franzellitti · 1 il biomonitoraggio...

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Il biomonitoraggioambientale attraverso lo studio della regolazione genica della risposta allo stress

Il biomonitoraggioambientale attraverso lo studio della regolazione genica della risposta allo stress

Silvia FranzellittiSilvia Franzellitti

Seminario per il corso “misure con biomarcatori” A.A. 2005-2006Seminario per il corso “misure con biomarcatori” A.A. 2005-2006

Perché utilizzare lo studio dell’alterazione dell’espressione genica nella tossicologia ambientale?Perché utilizzare lo studio dell’alterazione dell’espressione genica nella tossicologia ambientale?

Dose/Concentration

Rele

vanc

e to

Eco

syst

em ‘H

ealt

h’

Ecosystem

Organelle

Molecular

Cell

Individual

Population

Community

Dose/Concentration

Rele

vanc

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Eco

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Ecosystem

Organelle

Molecular

Cell

Individual

Population

Community

Dose/Concentration

Rele

vanc

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Eco

syst

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h’

Ecosystem

Organelle

Molecular

Cell

Individual

Population

Community

Ecosystem

Organelle

Molecular

Cell

Individual

Population

Community

tempo

Le modificazioni a livello molecolare rappresentano il primo stadio, estremamente precoce, della serie di eventi che governano i meccanismi di risposta.

ESITE UNA GERARCHIA DELLA RISPOSTA ALLO STRESS AMBIENTALE

ESITE UNA GERARCHIA DELLA RISPOSTA ALLO STRESS AMBIENTALE

S. Franzellitti - Il biomonitoraggio ambientale attraverso lo studio della regolazione genica della risposta allo stressS. Franzellitti - Il biomonitoraggio ambientale attraverso lo studio della regolazione genica della risposta allo stress

AAAAAAAAmRNAmRNA

TRADUZIONETRADUZIONE

NUCLEONUCLEONUCLEO

genepromotorepromotore

RNA RNA polimerasipolimerasi

TRASCRIZIONETRASCRIZIONE

AAAAAAAAmRNAmRNA

trasportotrasportotrasporto

STIMOLO

AAAAAAAAmRNAmRNA AAAAAAAAAAAAAAAAmRNAmRNA

TRADUZIONETRADUZIONETRADUZIONETRADUZIONE

NUCLEONUCLEONUCLEO




AAAAAAAAmRNAmRNA


NUCLEONUCLEONUCLEO




AAAAAAAAmRNAmRNA





TRASCRIZIONETRASCRIZIONETRASCRIZIONETRASCRIZIONE


trasportotrasportotrasportotrasportotrasportotrasporto

STIMOLOSTIMOLO

RISPOSTARISPOSTARISPOSTA

proteinaproteina

AAAAAAAAmRNAmRNA

TRADUZIONETRADUZIONE

NUCLEONUCLEONUCLEO




AAAAAAAAmRNAmRNA


STIMOLO


TRADUZIONETRADUZIONETRADUZIONETRADUZIONE

NUCLEONUCLEONUCLEO




AAAAAAAAmRNAmRNA


NUCLEONUCLEONUCLEO




AAAAAAAAmRNAmRNA





TRASCRIZIONETRASCRIZIONETRASCRIZIONETRASCRIZIONE


trasportotrasportotrasportotrasportotrasportotrasporto

STIMOLOSTIMOLO


proteinaproteina


proteinaproteina

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Metodi per lo studio dell’espressione genicaMetodi per lo studio dell’espressione genica

Basati sull’ibridazione degli acidi nucleici

Basati sull’ibridazione degli acidi nucleici

Basati sulla PCR

(Reazione a catena della DNA polimerasi)

Basati sulla PCR

(Reazione a catena della DNA polimerasi)

RT-PCR

PCR semi-quantitativa

PCR real-time

Southern/Northernblotting

Ibridazione in situMicroarray a DNA/cDNA



IbridazioneIbridazione

A-T G-C

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TECNOLOGIA DEL MICROARRAYTECNOLOGIA DEL MICROARRAY

CHIP GENICI

Supporti in vetro su cui sono collocati in posizioni definite dei frammenti di DNA.

Ogni vetrino può contenere svariate migliaia di spot

Ogni posizione (spot) rappresenta un singolo gene.


Acquisizione e analisi delle immagini

Preparazione dei microarray(spottaggio)

controllocontrollo trattatotrattato

AAAAAA

AAAAAA

AAAAAA

AAAAAA

AAAAAA AAAAAA

Cy5Cy5--dCTPdCTPCy3Cy3--dCTPdCTP

Preparazione dei campioni

Isolamento Isolamento dell’mRNAdell’mRNA

Retrotrascrizione Retrotrascrizione e marcatura dei e marcatura dei

cDNAcDNA

ibridazione ibridazione

S. Franzellitti - Il biomonitoraggio ambientale attraverso lo studio della regolazione genica della risposta allo stress

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2 SOTTO-ARRAYS con 50 oligonucleotidispottati su un supporto in vetro “attivato” didimensioni 26 mm x 76 mm

I 50 oligonucleotidirappresentano i 25 geni: 2 spots diversi per ognigene in esame

Mytox-chipMytox-chip Un microarray per studiarela risposta allo stress inM. galloprovincialis

Hg2+ (750 nM)Hg2+ (750 nM)

NSO (0.5ppm)NSO (0.5ppm)


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Applicazione del mytox-chip al biomonitoraggio del Visnes fjord (Norvergia)Applicazione del mytox-chip al biomonitoraggio del Visnes fjord (Norvergia)


Stabilità delle membrane lisosomiali

Rapporto volume lisosoma/citoplasma

Accumulo lipidi neutri

Accumulo lipofuscine

DAI DATI DEL MICROARRAY….DAI DATI DEL MICROARRAY….


Messa a punto di metodiche di PCR quantitativa per studiare la risposta allo stress ambientale mediante

Messa a punto di metodiche di PCR quantitativa per studiare la risposta allo stress ambientale mediante

GENI SENSIBILI ALLE ALTERAZIONI AMBIENTALIGENI SENSIBILI ALLE ALTERAZIONI AMBIENTALI

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I METODI BASATI SULLA REAZIONE A CATENA DELLA DNA POLIMERASI (PCR)I METODI BASATI SULLA REAZIONE A CATENA DELLA DNA POLIMERASI (PCR)

Estensione

Permette l’amplificazione selettiva di singolitratti genici, cioè la produzione in vitro di un elevato numero di copie di una specificasequenza di DNA.

La PCR si basa sulle proprietà dell’enzimaDNA polimerasi di ripetere in vitro ciò cheaccade normalmente in vivo durante ilprocesso di duplicazione del DNA, ossia la sintesi di nuovi filamenti complementari ad un filamento stampo, e sulla possibilità di miraretale sintesi ad uno specifico tratto di DNA scegliendo opportunamente gli inneschi o primer.

I primers sono oligonucleotidi sintetici lunghi10-30 pb, complementari alle regionifiancheggianti il frammento genico daamplificare. Appaiandosi a tali regioni, i primer costituiscono un piccolo tratto diDNA a doppia catena, dal quale la DNA polimerasi può iniziare la sintesi, ossiaformazione di legami fosfodiesterici tral'estremità 3' del segmento iniziatore e ildNTP complementare allo stampo.

Analisi Analisi d’immagined’immagine

LA PCRSEMI-QUANTITATIVALA PCRSEMI-QUANTITATIVA


ElettroforesiElettroforesi

C 1 2 3HSP70

HSC70

18s rRNA

C 1 2 3C 1 2 3HSP70

HSC70

18s rRNA

C 1 2 3

n° cicli di PCRn° cicli di PCR

[amplificat

o][a

mplificat

o]

n° cicli di PCRn° cicli di PCR

[amplificat

o][a

mplificat

o]

la quantità di un determinato target prodotto dalla duplicazione in vitro è esponenzialmente proporzionale alla quantità di cDNA inizialmente presente

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Le Hsp70 e la risposta allo stress termico Le Hsp70 e la risposta allo stress termico

time of recovery (hour)0 5 10 20 25

fold

indu

ctio

n

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

HSP70

HSC70

**

*

35°C

35°C

1h1h

Marker

Marker

Hsp 77Hsp 72Hsp 69

Control

Heat

shocked

Marker

Marker

Hsp 77Hsp 72Hsp 69

Control

Heat

shocked

LA RISPOSTA AI METALLI PESANTILA RISPOSTA AI METALLI PESANTI


tempo di esposizione a Hg (giorni)

0 1 2 3 4 5 6 7

n°m

olec

ole

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

MT10

MT20

tempo di esposizione a Hg (giorni)

0 1 2 3 4 5 6 7

n°m

olec

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0

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10000

15000

20000

25000

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MT10

MT20

MT10

MT20

time of exposure (days)0 1 2 3 4 5 6

fold

indu

ctio

n

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

**

*

**HSP70

HSC70

time of exposure (days)0 1 2 3 4 5 6

fold

indu

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2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

**

*

**HSP70

HSC70 L’espressione dei geni HSP70 è modulata durante l’esposizione a Hg2+

I geni MT sono differentemente regolati dall’esposizione a Hg2+

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ABC transporter

0

2

4

6

8

ctr 24h

rapp

orto

d'in

duzion

e*

Pgp

00.5

11.5

22.5

33.5

ctr 24h

rapp

orto

d'ind

uzione

Mrp2Mrp2 *

*

Hg2+

CH3Hg+

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