ﺖﺳا -ﻲﻤﻠﻋsoleimani.us/paak/imagej_farsi_help.pdf(ﺪﻳﺮﻴﮕﺑ ﻞﻳﻮﺤﺗ...

)فايل آماده چاپ كتاب را از ما تحويل بگيريد. ( و تأليف تخصص ماستترجمه سليماني- 09194654685

اين راهنما توسط دفتر ترجمه و تأليف استيار تهيه شده و به صورت رايگان در اختيار همكاران محقق

.لطفاً نظرات اصالحي خود را با ما در ميان بگذاريد. گيرد قرار مي . نيز به زودي تقديم عالقمندان خواهد شدEndNoteافزار جزوه مختصر و مفيد نرم

.ص ما استپزشكي تخص -علميترجمه متون ، IISSIIمقاله مقاله ،مشاوره در امور پژوهشيمشاوره در امور پژوهشي ،اياي علمي و پايان نامه علمي و پايان نامهتهيه و تنظيم پروپوزالتهيه و تنظيم پروپوزال

ويراستاري ويراستاري ،ترجمه و تأليف كتابترجمه و تأليف كتاب ، SSPPSSSSافزار افزار انجام محاسبات آماري با نرمانجام محاسبات آماري با نرم هاي علميهاي علمي كتابكتاب

Http://www.soleimani.us [email protected]

09194654685

با نام و ياد خدا

)عددي(هاي كمي هاي تصويري به داده تبديل داده ImageJ نرم افزار با ژل الكتروفورز يا وسترن بالت آناليز

محققـين گذاشـته شـده در اختيـار ) NIH( توسط دانشكده ملي بهداشت امريكـا ImageJنرم افزار بـه زبـان (هـاي كمكـي ديگـر هـاي آن و فايـل براي داونلود كردن خود نرم افـزار و پالگـين .ستا

توانيد به آدرس زير مراجعه كنيد مي) انگليسيhtml.index/ij/gov.nih.info.rsb://http

به اين معني كه براي استفاده از آن بايـستي نـرم افـزار ،كند كار مي Jawaبرنامة اين نرم افزار تحت هـاي متنـوع بـراي آن هاي متنوعي بـراي اسـتفاده پالگين. جاوا نيز بر روي ويندوز نصب شده باشد

. فوق الذكر دريافت كنيدهاي متصل به صفحه لينكتوانيد از نوشته شده است كه ميجـاوا بـر روي آخـرين نـسخه اگـر . لود كرده و نصب كنيد داون) رايگان است كه (ابتدا نرم افزار را

را داونلـود كـرده ) مگابايت 35حدود ( بهتر است بسته حاوي جاوا ، نصب نشده است شما كامپيوتر : كنيد كرده داونلوداز اين صفحه انتخاب. و هر دو را با هم نصب كنيد

html.download/ij/gov.nih.info.rsb://ttph وعي مثـل وسـترن بـالت از نـرم افزارهـاي متنـ آميزي شدة براي آناليز ژل الكتروفورز يا غشاء رنگ

.دهيم را توضيح ميImageJ اما ما در اينجا طرز كار با نرم افزار ،استفاده شده است... و فتوشاپهاي روز پالگين همتخصصين و محققين روزب دارد و چون اي كاربردهاي گسترده ImageJنرم افزار

ي از آن را ما فقط عملكردهـاي .شود نويسند كارايي آن هر روز بهتر و بيشتر مي بيشتري براي آن مي .دهيم توضيح ميباشد، مي مربوط به آناليز ژلكه


:هدف از آناليز ژل يا وسترن بالت :حتماً اطالع داريد كه

نه با اسـتفاده از روش هاي مخلوط موجود در يك نمو است از تفكيك مولكول الكتروفورز عبارت ه پس باشند مهم اين است ك ... يا RNA يا DNAها يا توانند پروتيئن ها مي اين مولكول . الكتروفورز

ها از هم جدا شده و بر اسـاس وزن مولكـولي يـا بـار الكتريكـي يـا از الكتروفورز، مخلوط مولكول ظـاهر به صورت باندهاي مـشخص و رديـف شـده در يـك سـتون يگـر، هاي د ويژگي

.دهد را نشان مي نمونه8 ستون مربوط به باندهاي8تصوير زير . شوند مي

بـراي هـر در مرحله آخر الكتروفورز يـا وسـترن بـالت، با اين مقدمه كوتاه، به اينجا رسيديم كه ما

بـه واسـطه رنگشان تقريباً بياند و از زمينة شده در يك ستون رديفباندهايي داريم نمونه لود شده، حـال، و از نظر مـساحت و شـدت رنـگ متفـاوت هـستند ها و اين باند هستند تمايزرنگشان م شدت

را هااز نرم افزار استفاده كنيم تا شدت رنگ باندها و ميزان كـل رنـگ موجـود در بانـد خواهيم مي .گر مقايسه نماييم كمي و عددي تبديل نموده و با هم ديبه صورت

هدف ما : پس . استها به دست آوردن ميانگين رنگ موجود در باند- 1باند اسـت، چـون علـي رغـم يكـسان بـودن ميـانگين هر به دست آوردن كل رنگ موجود در – 2

بـوده و مـساحت بيـشتري را اشـغال ) عـريض (باند، يكي از باندها ممكن است بـزرگ رنگ در دو . كرده باشد

يـا (رنگ به كميـت عـددي، مقايـسه دو بانـد شدت و مساحت هدف ما از تبديل نهايت در – 3 .است) آمارييا همان قضاوت(گيري قطعي و مطمئن و نتيجه) بيشتر

ايـد و تـصوير ديجيتـال آن را بـه ما اين است كه شما الكتروفورز يا وسترن را انجام داده پيشفرض tifذخيره كردن تـصوير بـا فرمـت . بر روي كامپيوتر داريد) … ,tif, ipg, png(هاي يكي از فرمت

.رغم حجم زياد فايل، اطالعات بيشتري از تصوير اصلي را در بر دارد بهتر است چون علي . نيز استفاده شده استآدرس اين صفحه واقع دربراي نوشتن اين رهنمود از محتويات


شصت و چهـار بيتـي 7 نصب شده بر روي ويندوز ImageJ از نرم افزار 1.42qاين رهنمود با نسخه .تهيه شده است

ها و اصطالحات واژهتوصيف

منظور ما در اين توضيحات از كلمه ژل يا وسترن، تـصاوير تهيـه شـده از محـصول : وسترن يا ژل .باشد رز و وسترن بالتينگ مينهايي عمل الكتروفو

از ميـزان پـروتئين خاصـي كـه مطمئنـاً در اثـر مـداخالت ): Loading control (كنترل لودينگ بـه عنـوان كنتـرل كننـده داخلـي )Actinمـثالً (گيرد دارويي و تجربي بيان آن تحت تأثير قرار نمي

تفـاوت (هـاي يـك ژل ك چاه و غلظت پروتئيني منتقل شده به همهبراي پي بردن به صحت حجم . كنترل داخلي پروتئيني است كه بيـان آن ثابـت اسـت . شود استفاده مي ) در ميزان نمونه ريخته شده

هـاي بـين سـتون كنترل داخلي براي اصالح انحرافات ناشي از عدم صحت در انتقال نمونـه در .شود استفاده مييك ژل

هـا وجـود نـدارد ني بيـان آن در همـه نمونـه اين كنترل داخلي نيست به اين مع :كنترل استاندارد شود و براي بلكه نمونه پروتئيني استانداردي است كه خريداري شده و يا توسط آزمايشگاه تهيه مي

پيـشفرض (شود شود يك ستون آن به كنترل استاندارد اختصاص داده مي هر ژلي كه بارگذاري مي كنترل ). شود قي از آن به يك چاهك منتقل مي اين است كه هميشه و براي هر ژل مقدار كامالً دقي

رود به كار ميبين چند ژلها و انحرافات موجود استاندارد براي اصالح تفاوت

:افزاري كمي سازي باندهاي ژل يا وسترن روش نرم ، از منـوي ImageJدر پنجـره نـرم افـزار براي باز كردن تصوير ذخيره شدة ژل يا وسـترن، - 1

File گزينه Openرا انتخاب كنيد . باشد ابتدا بايد بـه سـياه و سـفيد تبـديل اگر تصوير ذخيره شده به صورت سياه و سفيد نمي – 2

Image از منـوي ImageJبراي تبديل تصوير به حالـت سـياه و سـفيد، در نـرم افـزار . كنيد . تصوير شما مشابه تصوير زير خواهد بود. را انتخاب كنيدbit-8 گزينه Typeزيرمنوي

.ImagJ يك تصوير ساخته شدة وسترن بالت، باز شده در نرم افزار )1شكل توضيح

در نوار عنوان، نام تصوير بازشده، در رديف پايين آن، هشت بيت بـودن تـصوير و طـول و عـرض تبديل شده است كه باندهاي LUTتصوير به حالت (تصوير برحسب پيكسل، نشان داده شده است

LUTتبـديل تـصوير بـه حالـت ). انـد هاي جدول و مستطيلي نمـايش داده شـده به صورت خانه آن . اند سيته بااليي ثبت شدهتر با دان دهد كه باندهاي تيره اطمينان مي


Laneدر اطـراف . را انتخـاب كنيـد Rectangular Selections ابـزار ImageJاز نوار ابزار – 3فوروگرام كه مربوط به بانـدهاي تفكيـك شـده از يـك به هر ستون از الكترو (اول يك مستطيل بكشيد

هـا عمـودي و بانـدهاي Laneكنـد كـه نـرم افـزار فـرض مـي ). شـود گفته مي Laneنمونه است ترسـيم شـده بايـستي ارتفـاع زيـاد و عـرض laneتفكيك شده افقي هستند و بر اين اساس

افقي Lane صورت صورت ممكن است پيشفرض نرم افزار به كمي داشته باشد در غير اين .و باندهاي عمودي تغيير كند و موجب گرفتن نتايج اشتباه گردد

. انتخاب شده استچارگوشانتخاب ستون اول با ابزار ) 2توضيح شكل

را 1، كليـد د ستون اول را مـشخص كرديـ محدودة از آنكه با ابزار انتخاب چارگوش پس – 4 را كليـك Select Fiest Lane گزينـه Gelsمنـوي زيرAnalyzeيـا از منـوي ( يـد دهفشار با اين كـار سـتون اول پـر رنـگ . تا مستطيل رسم شده در جاي خود ميخكوب شود )كنيد . شود در وسط آن ظاهر مي1 يعني عدد Laneشود و شماره مي

بـراي ( دوم بكـشيد Lane از ماوس استفاده كرده و از وسط مستطيل گرفته و آنـرا بـه روي – 5مـستطيل . ).كنند ند عمل ميتوانيد استفاده كنيد منتها كُ دار نيز مي مستطيل از كليدهاي جهت نردجا ك جابه

اما در مورد تنظـيم عمـودي آن نگـران ،را از نظر افقي درست روي ستون دوم تنظيم كنيد . دهد برايتان انجام مي) قبل از مرحلة بعدي(افزار اين كار را ، چون خود نرمنباشيد

را Select Next Lane گزينـة Gels زيرمنـوي Analyzeيا از منوي ( را فشار دهيد 2 كليد– 6 .شود اهر ميظ در ميان ستون دوم 2عدد با اين كار ).كليك كنيد

بعدي نيز تكرار كنيد و فراموش نكنيد كه وقتـي مـستطيل هاي Lane را براي 6 و 5 مرحلة – 7 . را فشار دهيد2عدد فقط ر گرفت هاي مورد نظر قرا در باالي هر يك از ستون

Lane را فشار دهيد آن سـتون بـه عنـوان 2وقتي مستطيل را باالي ستون قرار داده و كليد ) 3شكل .شود جديد ثبت مي

را فـشار بدهيـد 3 تثبيت كرديد آن وقت عـدد 2 را با فشار دادن كليد Lane وقتي آخرين – 8نمــودار تــا ) را انتخــاب كنيــدPlot Lanesنــه گزيGels زيرمنــوي Analyzeيــا از منــوي (

.دن ترسيم شوها ستونيك از براي هر دانسيته


بر اساس تصوير باندهادانسيتهنمودار ) 4شكل

. گــذارد اي بــه نمــايش مــي نمــودار دانــسيته، محتــواي هــر ســتون را بــه صــورت برجــسته – 9هـاي روي نمـودار هـاي منحنـي لهق. اند هاي روي تصوير از باال به پايين رديف شده مستطيل

چـون چهـار سـتون . هـستند ) 3شـكل (متناسب با باندهاي پر رنگ روي تـصوير ) 4شكل (هـاي قلـه . در نمـودار نيـز چهـار ناحيـه مـشخص وجـود دارد ، بنابر اين ،يمرانتخاب شده دا

ند كـه هاي پهن نمايانگر باندهايي هـست منحني. تر هستند تر نمايانگر باندهاي پر رنگ مرتفع . كنند مساحت بيشتري را در ژل اصلي اشغال مي

، معموالً اندكي رنگ زمينـه دارنـد ،هاي واقعي ها يا وسترن بالت تصاوير ثبت شده از ژل – 10 منحني مربوط به 5شكل . شوند از خط صفر زمينه شروع نمي ،دست آمده ههاي ب لذا منحني

بينيد به دليل وجود رنگ زمينه به نظر مي كه چنان .دهد بالت واقعي را نشان مي وسترنيك دست آمده باالتر از خـط زمينـه قـرار گرفتـه اسـت و اگـر نـسبت بـه هرسد كه منحني ب مي

گيـري پيوندنـد و انـدازه منحني كناري آن در نظر بگيريم اين دو ستون از منحني به هم مي كـه ايـن دو روري اسـت ضـ ،بنابر ايـن . پذير نيست امكانارتفاع و حجم آنها در اين حالت .ممكن گرددتك تك آنها گيري منحني از هم سوا شوند تا اندازه

هاي واقعي اندكي رنگ زمينه دارند وسترن بالت ) 5شكل .شوددر آنها نمودار به خط زمينه متصل نشود كه باعث مي

اي كـه در براي هر قلـه ).6شكل ( را انتخاب كنيد Straight Line از نوار ابزار نرم افزار، ابزار – 11) تقريبـاً افقـي (ة منحنـي بكـشيد خواهيد آناليز شـود يـك خـط در قاعـد نمودار موجود است و مي


اين مرحلـه بـه . اي نداشته باشد هاي كناري خود نقطه به هم پيوسته منحني با منحني آن طوري كه بهود و زمينه از كجـا آغـاز ش قضاوت خود شما در اين مورد بستگي دارد كه در كجا منحني تمام مي

.شود مي

. استفاده كنيدStraight Lineها از ابزار هر كدام از منحني پايينيبراي بستن انتهاي ) 6شكل

كه قاعدة است 5همان منحني موجود در شكل ) 7شكل

.خط مسدود شده استترسيم يك آن با

در ايـن صـورت ،نتخاب كرده باشيد هاي زيادي را ا توجه داشته باشيد كه اگر شما ستون – 12بـراي . شـوند نمـايش داده نمـي در نمـودار هاي آخري بـه صـورت مخفـي مانـده و منحني

را فشار داده و پايين نگه داريـد و از مـاوس اسـتفاده Spacebarها كليد مشاهده اين منحني . بكنيدDragكرده و منحني را به طرف باال

از طرف قاعـده مـسدود كرديـد، Straight Lineستفاده از ابزار ها را با ا وقتي همة منحني – 13 ).8شكل ( را انتخاب كنيد Wandابزار

خواهيد پر رنگ كنيد را انتخاب كرده و با آن هر منحني را كه ميWandابزار ) 8شكل

را پايين نگه داشـته و Spacebarشود، كليد اول مشاهده نمي Lane اگر منحني مربوط به – 14 داخـل آن Wandدر اين حالت بـا ابـزار . اول آشكار گرددLaneمنحني را پايين بكشيد تا

كنيـد همـه در حـالي كـه بـه طـرف پـايين نمـودار حركـت مـي ). 9شكل (را كليك كنيد كنيـد ها را كـه كليـك مـي هر كدام از منحني . ها را به حالت انتخاب شده درآوريد منحني .شود نرم افزار نمايش داده مي) نتايجپنجرة (در پنجرة فرعي هاي مربوط به آن گيري اندازه


كليك كنيد آن منخني پر Wandها را كه با ابزار هر كدام از منحني ) 9شكل .شود نتايج وارد ميةهاي مربوط به آن در پنجر گيري رنگ شده و نتايج اندازه

Label گزينـة Gelsمنـوي زيرAnalyzeها پر رنـگ شـدند، از منـوي وقتي همة منحني – 15

Peaks كنـد و انـدازة آن را بـه ها را نامگذاري مـي منحني ةاين انتخاب هم . را كليك كنيد .دهد عنوان درصدي از اندازه كل مناطق پر رنگ شده نشان مي

هـاي صـفحه گـسترده توان به برنامـه را مي ) 10شكل ( نتايج مشاهده شده در پنجرة نتايج – 16 را انتخـاب كنيـد و Copy All گزينة Edit اينكار در پنجرة نتايج از منوي براي. منتقل كرد

. كنيدPasteسپس در برنامه صفحه گسترده مورد نظرتان

. ها گذاري منحني هاي ثبت شده و شماره خروجي منحني ) 10شكل .باشند مي1بااليي در شكل رديف چهار ناحيه مربوط به چهار باند در اينجا

هاي مورد ارزيـابي جاي ديگري به غير از داخل منحني Wandر شما اشتباه كرده و با ابزار اگ: نكتهرا كليك كنيد، نرم افزار بـاز هـم ناحيـه كليـك شـده را بـه عنـوان يـك منحنـي حـساب كـرده و

هاي مربوط به آن ناحيه را ثبت خواهد كرد و در زمرة منـاطق ثبـت شـده وارد خواهـد گيري اندازههاي واقعي كمتر از مقدار واقعي گـزارش ر اين صورت، درصد محاسبه شده براي منحنيكرد كه د

توانيـد ادامـه اگر شما ناحية اشتباهي را كليك كرديـد مـي .ها انحراف پيدا خواهند كرد شده و داده كـه ( را كليك كنيد تا نتـايج فعلـي Label Peaks گزينه Gels زيرمنوي Analyzeدهيد و از منوي

انـدازي ، نمايش داده شوند، اما بهترين كار اين است كه شـما شمارشـگر را از نـو راه ) هستند اشتباه ابـزار وقتي شمارشگر را صفر نموديد به پنجره نمودار برگرديد و از اول شروع بـه كليـك بـا . كنيد

Wand انـد هـا بـوده عـاً جـزو منحنـي شديد كه همه نواحي انتخـاب شـده واق هر گاه مطمئن . نماييد


را انتخاب كنيد تا نتايج صحيح Label Peaksتوانيد به منوي آناليز رفته و از زيرمنوي ژل گزينه مي .را دريافت كنيد

آناليز بيشتر Excelاي ماننـد هاي عددي نمايش داده شده در پنجرة نتايج را كپـي كـرده و در برنامـه وقتي داده

توانيـد چگـالي ي آنها انجـام دهيـد، مـثالً مـي وارد كرديد آماده هستيد كه محاسبات بيشتري بر رو كنـيم كـه اعـداد محاسـبه شـده توسـط يادآوري مـي . دست آوريد ها را به نسبي هر كدام از منحني

هاي انتخاب شـده صرفاً رقم هستند و فقط نشان دهندة مختصات خاصي از منحني ImageJافزار نرمگـرم يـا هـر ي موجود در باندها را برحسب ميلي ها به عبارت ديگر، آنها پروتئين . توسط شما هستند

در اين مرحله، روند معمول اين است كه شما دانـسيتة بانـدهاي . كنند واحد فرضي ديگري بيان نمي ) ايد ها و بر روي يك ژل كار كرده كه همراه با نمونه (مجهول را با دانسيتة باندهاي استاندارد معلوم

:براي اين كار. محاسبه نماييدها را مقايسه كرده و غلظت پروتئين 11 شـكلي مـشابه شـكل Paste و Copyاز طريـق ( وارد كنيد Excelهاي خود را در برنامه داده -1

را اسـتاندارد در نظـر 1در اينجـا مـا قلـه شـمارة . باشـد ها استاندارد مي يكي از قله ). شود حاصل مي .ايم گرفته

دد درصد بدست آمده بـراي هـر يـك از بانـدها را بـه ، ع Percent در ستون خالي بعد از ستون -2 ).ايم تقسيم كرده26.666در اينجا همه را به عدد (عدد باند استاندارد تقسيم كنيد

دهد، اما هنوز دست آمده، دانسيتة نسبي باندها را نسبت به باند استاندارد نشان مي اعداد جديد به -3 .هم نشان دهنده غلظت پروتئيني نيست

.محاسبه دانسيتة نسبي براي چهار منحني انتخاب شده ) 11ل شك

. تقسيم شده است26.666 به عدد percentباشد و همه اعداد ستون در اينجا منحني يك استاندارد ميكه اگر بـه ) 1.86( در اين مثال باند دوم دانسيتة نسبي بيشتري در مقايسه با استاندارد داشته است -4

بـاز هـم يـادآوري . رود توجه كنيد چنين دانسيتة نـسبي انتظـار مـي 1در شكل شدت رنگ اين باند . وارد آناليز شده است1كنيم كه رديف اول از شكل مي

را بـا هـم مقايـسه كنيـد ) يا بـالت ( اگر شما در نظر داريد كه باندهاي موجود در دو يا چند ژل -5در اين صورت است كـه . تفاده شده باشدها اس الزم است كه از يك استاندارد واحد در همه آن ژل

بـراي توضـيح بيـشتر بـه . دانسيتة نسبي محاسبه شده براي هر كدام از باندها قابل مقايسه خواهد بود .ادامة بحث توجه نماييد

دار ناشي از مداخالت انجام شـده در هاي معني دست آوردن تفاوت ه براي ارزيابي اختالفات و ب -6هاي شما توسـط يـك دسـتگاه اسـكن ها و يا بالت ري است كه همه ژل ضروطي تحقيقات اصلي،

هاي كمي استفاده شده باشد و واحـدهاي افزار واحد نيز براي تبديل آنها به داده شوند و از يك نرم


يا براي (گزارش شده نيز بايستي يكسان باشند مثالً براي همة باندها دانسيته نسبي محاسبه شده باشد محاسبه شده باشد مثال اخـتالف ] Relative Density Difference [ف دانسيته نسبياختالهمه آنها

اگر شما ). نشان ميدهد كه بيان پروتئين تست در مقايسه با كنترل دو برابر بوده است 2دانسيته نسبي مطمئن شويد كـه اعـداد دانـسيته در حال مقايسه چند تكنيك براي يك مورد خاص هستيد بايستي

هـاي مختلـف بـا هـم همخـواني دارد يع نرمالي دارد و واريانس مربوط به آن در تكنيـك نسبي توز ).ها بحث آماري هستند خيلي سخت نگيريد ها و هموژن بودن واريانس نرمال بودن توزيع داده(هاي مختلفـي كنند و رقت هاي بيشتري مي گيري بايد خاطر نشان كنيم كه بعضي محققين سخت -7

هـاي سـريال بـه همـراه روش استفاده از منحني رقت. گيرند ا در بالت خود به كار مي از استاندارد ر هـاي كنـد كـه شـما بتوانيـد غلظـت پـروتئين كمي سازي گفته شده در باال اين امكان را فراهم مـي

.موجود در باندها را به صورت پيكوگرم يا نانوگرم بدست آوريد

Loading-Controlsتر استفاده از روش پيچيده در اين بالت ما ادعـا . به عنوان يك وسترن بالت استفاده خواهيم كرد12براي اين روش از تصوير

هــاي كنــيم كــه چهــار نمونــه تكــراري از يــك نمونــه پروتئينــي همــوژن شــده را در چاهــك مــيهاي لهمي. ند باش ها با هم برابر Laneايم، بنابراين انتظار داريم دانسيته همه كرده Loadالكتروفورزي

) Actinمـثال (هاي پاييني نشانگر لودينـگ كنتـرل ميله. باشد بااليي نشانگر پروتئين مورد نظر ما مي ها laneخواهيم مطمئن شويم كه پروتئين كل بارگيري شده براي همه باشند، بدين معني كه مي مي

مـداخالت انجـام رغـم پروتئين مربوط به لودينگ كنترل پروتئيني است كه علي . يكسان بوده است حداقل ادعاي ما ايـن اسـت چـون (شده توسط ما در طي تحقيقات تجربي بيان آن ثابت بوده است

كنند كه از كجا معلوم مواد و داروهـاي اسـتفاده شـده تـأثيري در بيـان اكتـين ها تشكيك مي خيلي .) نداشته است

loading-controlتصوير يك وسترن بالت كـه رديـف پـايين آن مربـوط بـه ) 12شكل اغلب اين پروتئين كنترل علي رغم مداخالت انجـام شـده بيـان ثـابتي دارد مثـل . باشد مي

.اكتين

كرديم مقادير پروتئيني يكـساني را در هـر رغم اينكه ما تصور مي دقت كنيد علي 12اگر به تصوير كنـيم كـه انـدازه و ايم اما بعد از انجام الكتروفورز و وسترن بالت مـشاهده مـي چهار چاهك ريخته

شـود دو چنانكه مشاهده مي . دهند هاي پاييني تفاوت آشكاري با يكديگر نشان مي شدت رنگ ميله و در ) gray value(باند سمت چپ يكسان هستند اما در مورد باند سوم دانسيته نـصف شـده اسـت

ن كنتـرل داخلـي چو. مورد باند چهارم نيز هم دانسيته نصف شده و هم پهناي باند نصف شده است به كار گرفته شده اينقدر نتايج متفاوتي داده است لذا مقادير دانسيته محاسبه شده با استفاده از يـك

بنـابراين، در اينجـا مـا آنـاليز معمـول . استاندارد منفرد صحيح نبوده و مستقيماً قابـل مقايـسه نيـستند


دهيم و سـپس از نتـايج حاصـل از كنتـرل مي انجام ImageJها را با استفاده از دانسيته و اندازه بالت ) بانـدهاي بـااليي (بندي مقـادير مربـوط بـه هـر يـك از پـروتئين براي رتبه )باندهاي پاييني (داخلي

.كنيم استفاده مي . باز كنيدImageJ تصوير وسترن بالت را در -1 .ليك كنيد را كbit-8 گزينة Type زيرمنوي Image اگر تصوير سياه سفيد نيست از منوي -2از بـاالي بـاالترين ( اول را يك مستطيل بكشيد Lane با ابزار انتخاب چارگوش دور تا دور -3

).ترين باند باند تا پايين پايين . در ميانه مستطيل ظاهر شود1 را فشار دهيد تا عدد 1 كليد -4 .جا كنيد جابهLane از ناحيه وسط مستطيل گرفته و آن را به روي -5 . در ميانه ظاهر شود2 را فشار دهيد تا عدد 2 كليد -6 تكرار كنيد و هـر بـار فقـط Lane هاي ديگر تا آخرين Lane را عيناً در مورد 6 و 5 مراحل -7

.)13شكل ( را فشار دهيد 2عدد

جا كردن مستطيل بر روي آن و فشار دادن ها از طريق جابهLaneهر يك از ) 13شكل

.آيد لت انتخاب شده در مي در جاي خود به حا2كليد را فشار دهيد 3 انتخاب كرديد حال كليد 2 را از طريق فشار دادن كليد Lane وقتي آخرين -8

).14شكل ( هاي انتخاب شده ترسيم شود Laneتا نمودار


هـا زيـاد باشـد الزم اگـر تعـداد سـتون ). در پايين4ستون يك در باال و ستون ( ها Laneنمودار دانسيتة همة ) 14شكل .جا شود شود كه براي ديدن نمودارهاي بعدي تصوير نمودار جابه مي

هاي افقي بـراي هـر اساساً نمودار دانسيته نمايانگر ميزان دانسيته متوسط در يك سري برش – 9هـاي بلنـدتري دارنـد و بانـدهايي كـه انـدازه ستند قلـه تر ه باندهايي كه تيره . باشد ستون مي

در نمونـه توضـيح داده شـده بانـدها كـامال . سـازند تـري مـي بزرگي دارند منحنـي عـريض هـاي رسـم شـده داراي شـيب مختـصري كنيد كه منحنـي مستطيلي هستند ولي مشاهده مي

سيته از بـاال بـه پـايين ميـزان دانـ در ImageJافزار نرم تعديلي هستند و اين به خاطر عملكرد در نتيجه عبور تيز از منطقه كامالً سياه به منطقه كامالً سفيد، مشاهده شده در بانـد . باشد مي

افزار به صورت منحني بـا شـيب مناسـب نمـايش داده شـده به دلي اثر تعديلي نرم 1شماره .است

زاحمي وجود ندارد، لذا در تصوير وسترن بالت استفاده شده در اين تمرين، رنگ زمينة م -10هـاي واقعـي رنـگ زمينـه اما در وسترن بـالت . كنند ها با خط زمينه برخورد مي همه منحني

ها با خط و لذا منحني ) رنگ زمينه كامالً سفيد نخواهد بود (مختصري وجود خواهد داشت از زمينه برخوردي نخواهند داشت و بايستي خطي در قاعدة هر منحني رسم شود تا آنهـا را

.پذير نمايد ها را امكان گيري همديگر جدا كرده و اندازههايي كه قـرار را انتخاب كنيد و براي هر يك از منحنيStraight Lineكار ابزار براي اين-11

طـوري كـه مطمـئن است در آناليز وارد كنيد در قاعدة آن يك خط راست ترسيم كنيد بـه ايـن مرحلـه از .)7شـكل (انـد از هم تفكيك شده ) از نظر مكاني (هاي مجاور شويد منحني

كار نيازمند قضاوت شما در اين مورد است كه در كجا منحني پايـان يافتـه و زمينـه شـروع .شود مي

بـا . را انتخـاب كنيـد Wandهـا اطمينـان حاصـل كرديـد ابـزار وقتي از مجزا شدن منحني -12افـزار دانـسيته و كنيـد و نـرم ليك مـي هاي دلخواه را ك داخل منحني Wandاستفاده از ابزار

.گذارد مساحت نسبي را در پنجره نتايج به نمايش مي موجـود در تـصوير وسـترن نمونـه را Loading-control در آغاز مـا بانـدهاي مربـوط بـه -13

Wandاز بـاالي نمـودار دانـسيته شـروع كـرده و بـا ابـزار ). رديف پايين (كنيم انتخاب مي بـه محـض كليـك كـردن، رنـگ آن قلـه تغييـر ). 15تـصوير ( كنيـد داخل قله اول كليك

. باندهاي بعدي مربوط به كنترل داخلي را به ترتيب از باال بـه پـايين كليـك كنيـد . كند ميبـاال با و همزمان Spacebarهايي قابل مشاهده نيست با پايين نگهداشتن كليد اگر قله يا قله

را تـا Wandها را نمايش دهيد بعد كليك كردن با نمودار ،كشيدن از طريق ماوس يا پايين .آخرين باند كنترل ادامه دهيد


Wandكليك در داخل قلة كنترل داخلي با ابزار ) 15شكل هاي مربوط به كنترل داخلي را از باال به پايين كليك كنيد و فعال كاري تك تك منحني

.به باندهاي پروتئيني ديگر نداشته باشيد

زيرمنـوي Analyzeهاي مربوط به كنترل داخلـي انتخـاب شـد از منـوي مه منحني وقتي ه -14Gels گزينة Label Peaksهاي بـر اسـاس انـدازه را كليك كنيد هر كدام از منحني منحني

توانيـد بـه پنجـره در اين مرحلـه مـي شود باشد نامگذاري مي نسبي كه به صورت درصد مي هـا را در برنامـه را انتخاب كرده و سـپس داده Copy All گزينه Editنتايج رفته و از منوي

Excel با انتخاب Paste يا Ctrl+Vگذاريد برجاي مي.

.هاي مربوط به كنترل داخلي رسم شده از تصوير ژل يا بالت مقادير مساحت و درصد براي منحني ) 16شكل با شدت رنگ مشاهده شده در تصوير همخواني مساوي هستند و اين نتيجه2 و 1 هاي Laneكنيد كه مشاهده مي چنان

).12شكل (دارد

مـا . هـاي مربـوط بـه بانـدهاي پروتئينـي تكـرار كنيـد را براي منحني 14 و 13 حاال مراحل -15كنـيم هاي مربوط به كنترل داخلي عمل مي هاي پروتئيني را جداي از منحني انتخاب منحني

هـاي پروتئينـي رل داخلي در محاسـبات منحنـي بنابراين، محاسبات انجام شده در مورد كنت داخل تـك تـك Wandطور كه قبالً نيز انجام داديم با ابزار همان. كنند تداخلي ايجاد نمي

و در مرحله آخـر از هاي اصلي را از باال به پايين كليك كنيد هاي مربوط به پروتئين منحنيدر ايـن مرحلـه نيـز . اب كنيـد را انتخLabel Peaks گزينه Gels زيرمنوي Analyzeمنوي

هـاي قبلـي در برنامـه نتايج نشان داده شده در پنجـره نتـايج را كپـي كـرده و در كنـار داده Excel 17شكل ( جايگذاري كنيد.(


هـاي و نتايج مربوط بـه پـروتئين stdsنتايج مربوط به كنترل داخلي با برچسب ) 17شكل .دان نشان داده شدهsamplesاصلي با برچسب

ها تعيين مقادير نسبي پروتئينهـا را در توانيم مقادير نسبي پروتئين ما ميExcelآوري شده در برنامه هاي جمع اينك براساس داده

حاصـل از برنامـه Percent و Areaبه ياد داشته باشـيد كـه . وسترن بالت انجام شده، محاسبه نماييم ImageJباشند هاي انتخاب شده مي ندة قله به صورت مقادير نسبي هستند و منعكس كن .

در ايـن مثـال . هاي داخلـي شـروع كنيـد آناليز را با محاسبه مقدار دانسيته نسبي براي كنترل -1Laneگــر را نــسبت بــه آن هــاي ســه كنتــرل دي شــود و داده يــك كنتــرل مــا محــسوب مــيتقـسيم كنيـد Lane 1براي اين كار مقدار درصد هر كدام را به مقـدار درصـد . سنجيم مي

).18شكل (

مقدار درصد 1هاي داخلي نسبت به كنترل براي محاسبي دانسيته نسبي كنترل ) 18شكل . تقسيم كنيدLane 1هر كدام را به مقدار درصد

انسيته نسبي براي باندهاي پروتئيني اصلي نيـز همـين كـار را تكـرار حال براي محاسبه مقادير د – 2 .كنيم تقسيم ميLane 1 يعني مقدار درصد هر يك را به مقدار درصد ،كنيم مي

هـاي اصـلي نيـز هـاي مربـوط بـه پـروتئين مقادير دانسيته نسبي را براي منحني ) 19شكل در ( را به عنوان كنترل در نظر بگيريد Lane 1در اين كار درصد مربوط به . محاسبه كنيد

).40.585اين مثال برابر


سان نتـايج گذاري يك به خاطر اينكه باندهاي مربوط به كنترل داخلي در چهار بار نمونه : يادآوريلذا نتايج بدست آمـده از مرحلـه ) است پهناي باند و شدت رنگ متفاوت (يكساني ايجاد نكرده اند

سه باندهاي تست براي مقاي مستقيماً به عنوان نتايج نهايي توانيم را نمي ) در مورد باندهاي تست (دوم ) در هـر سـتون (هـاي داخلـي بلكه الزم است بر اساس مقادير محاسبه شده براي كنترلبه كار ببريم

توجيه ما براي انجام چنين عملكردي اين است كه مـا . ها را اصالح نماييم مقادير حاصل براي تست لـي، نـشانگر هـاي داخ هـاي مـشاهده شـده در درصـد مربـوط بـه كنتـرل كنيم كه تفـاوت فرض مي مثال در همين تـصوير وسـترن .ها بوده است ها در مقدار كل پروتئين وارد شده به آن چاهك تفاوت

هاي واضحي در مقدار پـروتئين كـل لـود شـده بـراي هـر نمونه كه ما در اينجا آناليز كرديم تفاوت .ها باشد پت شود كه شايد به دليل نقص در عملكرد پي ستون مشاهده مي

هـا، دخالـت دادن اخـتالف دانـسيته مـشاهده شـده بـراي كنتـرل آخر در اين تبديل داده مرحله -3) هـا در آن سـتون (هـا بـر دانـسيته نـسبي بدسـت آمـده بـراي تـست ) هاي مختلـف در ستون (داخلي

به دانسيته نـسبي ) در هر ستون ( مقدار دانسيته نسبي تست را Excelبراي اين كار در برنامه . باشد مي .كنيم ه براي كنترل در آن ستون تقسيم ميمحاسبه شد

دانسيته ) هاي زرد خانه(ها ادير دانسيته متعادل شده براي تست براي محاسبة مق ) 20شكل مـثالً . كنـيم ها را به دانسيته نسبي كنترل در همان ستون تقسيم مـي نسبي هر كدام از تست

عــدد (4بــر دانــسيته نــسبي كنتــرل ) 0.1628عــدد (4دانــسيته نــسبي بــراي نمونــه تــست . حاصل شود1.054ادل شده يعني عدد تا دانسيته نسبي متعتقسيم شده است) 0.154379

كنـيم كـه مقـادير تـالش مـي ،هـا و كنتـرل داخلـي به اين دليل كه ما در هنگام لود كردن نمونه -4 بنابراين، انتظار داريم همه باندهاي گرفته ،ها نماييم وارد چاهك ) از نظر غلظت پروتئين (يكساني را

). از نظر شدت رنگ و پهناي باند(اني ايجاد نمايند ها نتايج يكس شده از كنترل داخلي در همه ستون هاي جزئي يا واضح در ميان بانـدهاي رود و در عمل تفاوت بيني ما پيش نمي اما همه چيز طبق پيش

حال بعد از انجـام . افتد اتفاق مي) هاي تست و به همان نسبت در ميان نمونه (مربوط به كنترل داخلي اند لذا نشان نزديك شده 1ها همگي به عدد سيته متعادل شده نمونه دان) از طريق محاسبه (اصالحات

هـا يكـسان بـوده اسـت يعنـي دهد كه نسبت پروتئين تست به پـروتئين كنتـرل داخلـي در نمونـه مي .اند اصالحات انجام شده مفيد فايده و اطمينان بخش بوده

دگيريـ شما تمهيداتي را به كار مـي هاي ارائه شده در باال فقط به عنوان آموزش بود و در عمل مثال BCAمـثالً از طريـق روش . هـا مقـادير يكـساني داشـته باشـند كه پروتئين لود شده به همه چاهـك


. كنيـد ها اضـافه مـي دار مناسبي از نمونه را با دقت به چاهكق و مدگيري ها را اندازه مي غلظت نمونه .كنيد هارت الزم را در اين زمينه كسب ميگيريد و م هاي دقيقي را به كار مي پت ابزارها و پي

چند ژلآناليز استفاده از اين روش متعادل سازي براي الزم اسـت كـه اوالً ) براي انجـام مقايـسه بـين آنهـا (هاي مربوط به چند ژل براي متعادل سازي داده

هـا داشـته هاي همـه ژل روش دقيق و مطمئني براي انتقال مقدار معيني از پروتئين به يكي از چاهك از اول تـا آخـر (هـاي تهيـه شـده باشيم سپس بايستي از يك محلول پروتئيني استاندارد در همـه ژل

براي . استفاده كنيم و يك چاهك را براي آن اختصاص دهيم ) روند الكتروفورز و وسترن بالتينگ هـا در به همـه ژل ميكروليتر 1 انساني تخليص شده براي اينكار استفاده كرد و HSPتوان از مثال مي

توانيد اين اسـتاندارد بـين ژلـي را يا اگر مشكل هزينه مطرح باشد مي . ها منتقل كرد يكي از چاهك . خودتان از طريق مخلوط و هموژن كردن چندين تركيب پروتئيني درست كرده و اليكوت نماييـد

بـود مقـادير يكـساني را قادر خواهيمدانيم اما پروتئين را نمي واقعياگر چه ما در اين حالت غلظت .هاي متفاوت در نظر بگيريم تا عمل متعادل سازي و مقايسه به راحتي قابل انجام باشد براي ژل :هدفبـادي كـارآيي آنتـي : شـود كـه هاي و انحرافات در مقايسه بين چندين ژل از آنجا ناشي مـي تفاوت

مـسائل مـالي مجبـور هـستيد از مثالً اگر به خـاطر (هاي مختلف ممكن است متفاوت باشد براي ژل ها ممكن ، در مراحل شستشو و بلوكينگ ژل )بادي براي چندين ژل استفاده كنيد يك مخلوط آنتي

لومينـسانس مـورد ها به دليل استحالة تدريجي كمي است تفاوت هاي باشد و يا ممكن است تفاوت هـاي هـاي متفـاوت زمـان لهـا اتفـاق بيفتـد و يـا ممكـن اسـت ژ بادي استفاده در آشكارسازي آنتي

هـا منجـر بـه تفـاوت در شـدت و همـه ايـن تفـاوت . انـد متفاوتي را با فيلم اشعه ايكس روبرو شـده اگر از پروتئين استاندارد اسـتفاده شـود . گردد مي مساحت باندهاي ايجاد شده در بين دو يا چند ژل

هـا شوند پـس اخـتالف بـين ژل ابتدا همه باندهاي روي يك ژل نسبت به باند استاندارد سنجيده مي ).21شكل (عمالً حذف خواهد شد

Figure 21. Two example western blots with a common standard sample (Lane 1). The binding/incubation/development steps of these


two blots varied slightly, resulting in a different final exposure which alters the absolute densities on the two blots. Because we have a standard sample on both blots, which is an identical volume of an identical protein sample (i.e. drawn from a common aliquot of homogenate), we can express the densities of the other lanes on each gel relative to the standard sample, eliminating the effects of the differing exposures.

Finally, if you are using a loading-control protein band (lower row on these blots) on each gel, and a standard protein sample on multiple gels, you can correct both for differences in total protein loaded in a lane (using the loading-control band) and for differences in exposure between gels (using the standard sample). For example, consider the two gels in Figure 22. The 1st (white) gel has minimal background noise, and there is some variation the amount of protein loaded in each lane, as revealed by the size and density of the loading control bands of the samples. The 1st lane on the left is our standard sample used on each gel. The 2nd (gray) gel has more background noise due to a different exposure time, poor washing, or any number of possible problems. Again, there are different protein quantities loaded in the 4 lanes, based on the size and density of the loading-control bands on the lower half. The 1st lane on the left is the same standard protein sample as that used on the 1st gel. We would start by analyzing the two gels separately, using the protocol in the loading-control portion of this document.

1. Calculate the relative density of the loading-control bands (lower row on this gel). Use the loading-control band for the standard in lane 1 to do this calculation. 2. Calculate the relative density of the bands for the protein band of interest (upper row on this gel). Use the protein band of interest for the standard in lane 1 to do this calculation. 3. Adjust the relative densities calculated in Step 2 using the relative densities for the loading-control bands calculated in Step 1. Simply divide the relative density from Step 2 for each lane by the corresponding relative density from Step 1.

After you’ve scaled the density of the protein of interest for each sample to the standard sample, and adjusted the relative density based on the loading-control band, you are left with an estimate of the relative density of the protein of interest in each lane on your gel (relative to the standard in lane 1). Repeat this for each separate gel. When finished, you’ll note that because every sample lane is normalized to the standard sample in Lane 1 on that particular gel, and every gel contains the same standard sample, your cross-gel comparison is already accomplished, since every sample is now normalized to the same standard sample (Figure 22).


Figure 22. Example data from two western blots. The Relative Densities of the loading-control bands (lower bands on each gel, red and yellow lines) was calculated, using the value for the standard in Lane 1 (lower band) on each gel. The Relative Densities for the sample bands (upper row on each gel, blue and green lines) were calculated separately, and were normalized relative to the standard in Lane 1 (upper band). The "Adjusted Density" for each sample lane was calculated by dividing the sample relative density by the loading-control relative density for each lane separately (i.e. for sample 3, 0.185796/0.188449 = 0.98592).

After all of this work, you’re left with (adjusted) Relative Densities for each of your samples (the yellow cells in Figure 22). At this point you can ignore the values of the standard samples, since you only needed those to ensure that your cross-gel comparisons were scaled properly. Now you can finally begin calculating average relative density values for your experimental control samples (maybe these are samples 3+6) and your experimental treatment samples (perhaps these are samples 1+4 and 2+5) to carry out the real comparison of protein expression under your treatment conditions. Because your relative density values are all normalized to the standard sample, you may wish to eventually re-scale your relative density values once again using your experimental controls’ average value as a baseline.

A few extra details: With regard to the ImageJ gel analysis routine, there has been some question of what the values reported by ImageJ correspond to. The images below may help illustrate what Image-J is measuring.


Figure 25. A comparison of "area" values returned by ImageJ.

In Figure 25 above, I have drawn out a set of fake “bands” in Adobe Illustrator. The gray value and area of each band are listed above the band (in this case a lower pixel value = darker band). Additionally, I have included the “area” value returned by Image-J after plotting the bands and clicking in each peak with the Wand tool. Note that these “area” values are a RELATIVE measure of the size and density of each peak you clicked with the wand tool. When you halve the area of a band, but maintain the same gray value (compare lanes 1+2), the value reported by ImageJ is half as large. By the same token, if you halve the gray value but maintain the same area (compare lanes 1+5), the value reported by Image-J is halved.

Figure 26. Image-J will return similar area values when bands have equivalent numbers of pixels of equal darkness, but vary in shape.

The same holds true for bands of different shapes. In Figure 26 above, altering the shape of the band, but maintaining the same gray value and area (compare lanes 1+3) yields an equivalent value from ImageJ.

Figure 27. Image-J deals with gaps in bands just fine. Note however that the "area" values returned by ImageJ are different compared to Figure 26 and Figure 27, because the number of lanes, size of the bands, and density of the bands has changed.

Image-J also accounts for gaps in a band, as shown in Figure 27 above. Compare lanes 1+3, which both have an equal number of gray pixels and equal gray values (i.e. equal amounts of protein on the gel). ImageJ reports the same “area” value for both of these lanes. It is worth reiterating that the “area” values and percentages reported by Image-J are always relative to the total size and density of bands that you have selected in a particular image. In the image immediately above, the band in column 1 returns an “area” value of 4000, while in the previous two images column 1 had the same size band, but with twice the gray value, which in both cases also returned a value of 4000. The raw values returned by Image-J are meaningless for


comparing across different gels, since they are only a relative measure of the bands you’ve highlighted on a particular gel image. This is why we need to standardize to some common standard loaded onto all of the gels

ﺖﺳا -ﻲﻤﻠﻋsoleimani.us/paak/imagej_farsi_help.pdf(ﺪﻳﺮﻴﮕﺑ ﻞﻳﻮﺤﺗ...

Documents