ifu papillocheck bq-708-02 pt · fabricado na Áustria perigo greiner bio-one gmbh maybachstr. 2...

Fabricado na Áustria PERIGO

Greiner Bio-One GmbHMaybachstr. 2 72636 FrickenhausenAlemanha

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Your Power for Health

Equipamento para diagnóstico para a genotipagem dos tipos do vírus do papiloma humano 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82 (PapilloCheck®) ou dos tipos 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 (PapilloCheck® high-risk) em amostras cervicais

Para utilização em diagnóstico in vitroapenas por pessoal de laboratório profi ssional

PapilloCheck®

PapilloCheck® high-riskInstruções de Utilização

HPV DNA-Chip

Revisão: BQ-708-02 / março 2019



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PapilloCheck® e PapilloCheck® de alto risco – Instruções de UtilizaçãoRevisão: BQ-708-02 / março 2019

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INFORMAÇÕES DE DIREITOS DE AUTORInstruções de Utilização do Equipamento de Ensaio PapilloCheck®

©Copyright 2015 da Greiner Bio-One

Greiner Bio-One GmbHMaybachstr. 2, 72636 Frickenhausen, AlemanhaTelefone: +49 (0) 7022 948-0, Fax: +49 (0) 7022 [email protected], www.gbo.com

AvisoTodos os direitos reservados.

As informações contidas neste documento estão sujeitas a alteração a qualquer momento e sem aviso prévio. É proibido copiar ou reeditar este documento em qualquer forma ou formato sem aprovação por escrito da Greiner-Bio-One GmbH.

Direito de marca comercial registadaOs nomes comercias e as etiquetas utilizados pertencem ao respetivo proprietário.

Informações importantes para o utilizadorPara a correta utilização do Equipamento de Ensaio PapilloCheck®, é necessário que o utilizador leia e siga cuidadosamente este manual de instruções.

O fabricante não assume qualquer responsabilidade por qualquer utilização deste sistema de ensaio que não esteja descrita neste documento, nem por modifi cações que o utilizador possa ter feito ao sistema de ensaio.

UTILIZAÇÃO PREVISTAO PapilloCheck® é um equipamento para diagnóstico e destina-se a ser utilizado para a deteção qualitativa e a genotipagem de 24 tipos do vírus do papiloma humano nas preparações de ADN provenientes de esfregaços cervicais humanos. O equipamento destina-se a ser utilizado apenas por pessoal habilitado.

O PapilloCheck® high-risk é um equipamento para diagnóstico e destina-se a ser utilizado para a deteção qualitativa e a genotipagem de 14 tipos do vírus do papiloma humano high-risk (VPHar) nas preparações de ADN provenientes de esfregaços cervicais humanos. O equipamento destina-se a ser utilizado apenas por pessoal habilitado.

O PapilloCheck® cumpre os requisitos da Diretiva 98/79/CE, relativa aos dispositivos médicos para diagnóstico in vitro, e, portanto, exibe a marca CE de conformidade. Qualquer resultado de diagnóstico obtido utilizando o PapilloCheck® deve ser interpretado em combinação com outros resultados clínicos ou laboratoriais.

Os Equipamentos de Ensaio PapilloCheck® destinam-se apenas a utilização em laboratório, não para utilização como medicamento, em casa ou para outras fi nalidades.Estes produtos destinam-se apenas a utilizadores profi ssionais, como técnicos ou médicos com formação em técnicas de biologia molecular.

Exceto se indicado o contrário nestas Instruções de Utilização, o nome PapilloCheck® é utilizado para ambas as variantes, o PapilloCheck® e o PapilloCheck® high-risk.



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!GLOSSÁRIO DE SÍMBOLOS

pt Código do lote

Não reutilizar

Data de validade

Consultar as Instru-ções de Utiliza-ção

Número de catá-logo

Fabri-cante

Não utilizar caso a emba-lagem esteja danifi ca-da

Limite de tempera-tura

Con-teúdo sufi ciente para <n> ensaios

Pictogramas GHS com as palavras-sinal PERIGO ou

AVISO

pt Marcas CE

Disposi-tivo mé-dico para diagnós-tico in vitro

Conser-var num local escuro

Aviso im-portante

!I V D



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ÍNDICE

1. CONTEÚDO DO EQUIPAMENTO .................................................................................6

2. CONSUMÍVEIS, EQUIPAMENTO E MATERIAL NECESSÁRIOS ................................7

3. ENVIO E CONSERVAÇÃO ............................................................................................9

4. INSTRUÇÕES DE SEGURANÇA ................................................................................10

5. ELIMINAÇÃO DE RESÍDUOS .....................................................................................11

6. INTRODUÇÃO .............................................................................................................12

6.1 Informações Gerais .......................................................................................................... 126.2 Tipos de VPH detetáveis com o PapilloCheck® ............................................................. 126.3 Princípio do ensaio ........................................................................................................... 136.4 Desenho da microplaca PapilloCheck® ........................................................................... 15

6.4.1 Esquema da microplaca PapilloCheck® ..............................................................................15

6.4.2 Controlos na microplaca ......................................................................................................16

7. INSTRUÇÕES DE UTILIZAÇÃO PARA O FLUXO DE TRABALHO DO PAPILLOCHECK® .................................................................... 18

7.1 Instruções gerais .............................................................................................................. 187.2 Separação de salas .......................................................................................................... 187.3 Avisos e precauções ........................................................................................................ 19

7.3.1 Prevenção de contaminação ...............................................................................................19

7.3.2 Instruções de manuseamento de microplacas ....................................................................19

7.3.3 Precauções gerais ...............................................................................................................19

7.3.4 Trabalhar em segurança ......................................................................................................20

8. PROCESSO PAPILLOCHECK® ................................................................................... 21

8.1 Colheita de amostras e extração de ADN ....................................................................... 218.1.1 Colheita de amostras ...........................................................................................................21

8.1.2 Extração de ADN .................................................................................................................23

8.2 Reação em cadeia da polimerase (PCR) ......................................................................... 238.2.1 Preparação do ciclador térmico ..........................................................................................24

8.2.2 Tratamento da Uracilo-N-Glicosilase (UNG) .......................................................................24

8.2.3 Preparação da reação de PCR ............................................................................................25

8.3 Hibridação e lavagem....................................................................................................... 278.3.1 Preparação e confi guração ..................................................................................................27

8.3.2 Hibridação ...........................................................................................................................28

8.3.3 Lavagem e secagem ............................................................................................................30

8.4 Varrimento e avaliação da microplaca PapilloCheck® .................................................... 328.5 Procedimento automático ................................................................................................ 32

9. RESOLUÇÃO DE PROBLEMAS .................................................................................33



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10. ASSISTÊNCIA TÉCNICA ............................................................................................. 34

11. CARACTERÍSTICAS DE DESEMPENHO DO PAPILLOCHECK® ............................. 35

11.1 Desempenho analítico do PapilloCheck® ....................................................................... 3511.1.1 Sensibilidade analítica .........................................................................................................35

11.1.2 Especifi cidade analítica – tipos de VPH ..............................................................................36

11.1.3 Especifi cidade analítica – Organismos não VPH .................................................................36

11.2 Repetibilidade (Intrarreprodutibilidade) ........................................................................... 3611.3 Reprodutibilidade ............................................................................................................. 3711.4 Robustez ........................................................................................................................... 3711.5 Desempenho Clínico do PapilloCheck® .......................................................................... 38

12. PROTOCOLO CURTO PAPILLOCHECK® .................................................................. 40

12.1 Sala 2: PCR - Preparação da mistura de reação ............................................................ 4012.2 Sala 2: PCR - Adição do modelo ADN/reação da PCR .................................................. 4112.3 Sala 3: Hibridação - Preparação/Reação de hibridação ................................................ 4212.4 Sala 3: Lavagem e secagem/Varrimento e avaliação ..................................................... 43



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1. CONTEÚDO DO EQUIPAMENTO

Equipamento de Ensaio PapilloCheck® ePapilloCheck® high-risk1

Conteúdo Quantidade

PapilloCheck® (REF. 465 060)

PapilloCheck® PCR MasterMix 1 x PapilloCheck® PCR MasterMix2 1 x 1200 µl

Caixa de lâminas PapilloCheck®, 4 x 12 Arrays

1 x Caixa de lâminas PapilloCheck®, com 4 microplacas PapilloCheck®3, cada uma com 12 arrays, para 48 amostras

1

Tampão de Hib. PapilloCheck® 2 x Tampão de Hibridação PapilloCheck® 2 x 1000 µl

Conc. TAMP. A PapilloCheck® 2 x Tampão de lavagem A PapilloCheck®, concentrado

2 x 40 ml

Conc. TAMP. B PapilloCheck® 1 x Tampão de lavagem B PapilloCheck®, concentrado

1 x 15 ml

Tubo de preparação de diluição de UNG

Água de grau PCR 1 x 995 µl

MasterMix preparation tube(Só use na combinação com a automação)

vazio 1

Folheto Descarregar Instruções de Utilização 1

PapilloCheck® high-risk (REF. 505 060)

PapilloCheck® high-risk PCR Master-Mix

1 x PapilloCheck® high-risk PCR MasterMix 1 x 1200 µl

Caixa de lâminas PapilloCheck® high-risk, 4 x 12 Arrays

1 x Caixa de lâminas PapilloCheck® high-risk, com 4 microplacas PapilloCheck® high-risk3, cada uma com 12 arrays, para 48 amostras

1

Tampão de Hib. PapilloCheck® high-risk

2 x Tampão de Hibridação PapilloCheck® high-risk

2 x 1000 µl

Conc. TAMP. A PapilloCheck® high-risk

2 x Tampão de lavagem A PapilloCheck® high-risk, concentrado

2 x 40 ml

Conc. TAMP. B PapilloCheck® high-risk

1 x Tampão de lavagem B PapilloCheck® high-risk, concentrado

1 x 15 ml

Tubo de preparação de diluição de UNG

Água de grau PCR 1 x 995 µl

MasterMix preparation tube(Só use na combinação com a automação)

vazio 1

Folheto Descarregar Instruções de Utilização 1

1 Um Equipamento de Ensaio PapilloCheck® ou PapilloCheck® high-risk é sufi ciente para a análise de 48 amostras.2 Contém todos os componentes necessários para PCR, exceto para a Taq Polimerase de ADN e a Uracilo-N-Glicosilase.3 Uma microplaca PapilloCheck® contém 12 microarrays PapilloCheck®. Nestas Instruções de Utilização, as palavras

microplaca(s) e lâmina(s) são utilizadas como sinónimos.



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2. CONSUMÍVEIS, EQUIPAMENTO E MATERIAL NECESSÁRIOS

Recomenda-se a utilização de PapilloCheck® em combinação com os consumíveis, equipamento e material indicados e apenas por pessoal profi ssional.

Consumíveis Cat. Greiner Bio-One N.º Quantidade

Equipamento de Ensaio PapilloCheck® 465 060 1 equipamento para 48 reações

Equipamento de Ensaio PapilloCheck® high-risk 505 060 1 equipamento para 48 reações

PapilloCheck® Collection Kit 465 075 1 equipamento para 50 amostras

Equipamento de Extração de ADN oCheck®/Preparação com Uma Coluna

515 0401 equipamento para 50 prepa-

rações

Pontas com fi ltro sem DNase para micropipetas, esterilizadas4

0,5 µl a 10 µl0,5 µl a 20 µl10 µl a 100 µl10 µl a 200 µl100 µl a 1000 µl

765 288774 288772 288739 288750 288

96/96096/96096/96096/96060/600

Tubo de polipropileno de 50 ml5

Tubo de reação de 1,5 ml 210 261616 201

25/450500/4000

Pipetas de plástico para pipetador

Pipeta de 10 mlPipeta de 25 mlPipeta de 50 ml

607 180 ou 607 160760 180 ou 760 160786 180 ou 768 160

1/2001/2001/200

4 Alguns dos tamanhos de pontas mencionados são opcionais, dependendo das micropipetas disponíveis.5 Apenas necessário se não estiver disponível uma centrifugadora de lâminas.



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Consumíveis Cat. Greiner Bio-One N.º Quantidade

CheckScanner 862 070 1

CheckReport Software Basic 862 080 1

Plug-in do CheckReport Software PapilloCheck® 862 081 1

Plug-in do CheckReport Software PapilloCheck® high-risk 862 088 1

Sistema de PC, incluindo CheckReport Software eplug-in do PapilloCheck® ou PapilloCheck® high-risk

862 910 1

Pacote Inicial CheckScanner (CheckScanner, sistema de PC, CheckReport Software, plug-in do PapilloCheck® ou PapilloCheck® high-risk)

862 170 1

Câmara de Hibridação oCheck® com suporte de lâminas 447 070 1

Pega magnética para suporte de lâminas 447 001 1

Caixa de lavagem oCheck®6 447 020 1

Enzimas necessárias

• Taq Polimerase: 5 U/µl da Polimerase do ADN HotStarTaq® (Qiagen; 203203, 203205, 203207, 203209)• Uracilo-N-Glicosilase: 1 U/µl da Uracilo-ADN Glicosilase (Thermo Scientifi c; #EN0361, #EN0362)

Consumíveis adicionais necessários

• Água de grau PCR• Água purifi cada• Luvas descartáveis• DNA Away™ (Thermo Scientifi c; n.º 7008, n.º 7009, n.º 7010)• Utilize apenas tiras de 8 tubos adequadas e compatíveis com PCR, tubos ou placas simples recomendados pelo

fabricante do ciclador utilizado.• Para otimizar o fl uxo de trabalho recomenda-se a utilização de tiras de 8 tubos.

Equipamento adicional necessário

• Microcentrifugadora para tubos de reação de 1,5 e 2 ml• Centrifugadora para tubos de polipropileno de 50 ml• Microcentrifugadora para tubos de reação simples de 0,2 ml ou tiras de 8 tubos para PCR • Ciclador térmico para PCR: GeneAmp® PCR system 9700 (Applied Biosystems) Ciclador Térmico Veriti™ de 96 Poços (Applied Biosystems) peqSTAR 96X Universal (PEQLAB Biotechnology GmbH)• Banho-maria (50 °C)• Micropipetas (diferentes gamas de 1 a 1000 µl)• Multipipeta de 8 canais (gama: 5 a 50 µl), por ex., Brand Transferpette®-8 (Brand)• Pipetador para pipetas de vidro e de plástico• Agitador vortex• Racks para diferentes tubos de reação• Temporizador• Contentor de resíduos

Material adicional necessário

• Computador (para requisitos do sistema, consulte as Instruções de Utilização do CheckScanner e do CheckReport Software)

6 Para o processo de lavagem de PapilloCheck® são necessárias três caixas de lavagem oCheck®.



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3. ENVIO E CONSERVAÇÃO

O envio do Equipamento de Ensaio PapilloCheck® é efetuado à temperatura ambiente. No entanto, o equipamento tem de ser conservado imediatamente após a receção entre 4 a 8 °C e deve ser protegido da luz. Mantenha a caixa de lâminas com as microplacas PapilloCheck® no saco com fecho com dessecante sempre fechado. Todos os componentes devem ser conservados na embalagem do equipamento original para evitar a mistura de lotes. Sendo conservado corretamente, o Equipamento de Ensaio PapilloCheck® e os seus componentes podem utilizar-se até à data de validade indicada. Além disso, nestas condições, a duração não diverge do prazo de validade após a primeira abertura do equipamento e dos seus componentes.

A conservação do Equipamento de Ensaio PapilloCheck® entre 4 a 8 °C pode resultar na precipitação de sais no Tampão de Hibridação e Tampão B. Os precipitados têm de ser dissolvidos antes da utilização deixando-os equilibrarem à temperatura ambiente (18 a 25 °C) e submetendo o tubo/frasco a mistura e ao agitador vortex.

Conservação do produto

Equipamento de Ensaio PapilloCheck® 4 a 8 °C, protegido da luz

Equipamento de Ensaio PapilloCheck® high-risk 4 a 8 °C, protegido da luz



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4. INSTRUÇÕES DE SEGURANÇA

O Equipamento de Ensaio PapilloCheck® destina-se apenas a utilização no laboratório, não para utilização como medicamento, em casa ou para outras fi nalidades. As microplacas para ADN devem utilizar-se num ambiente sem poeiras. O depósito de poeiras e outras partículas nas lâminas pode originar resultados insatisfatórios ou inválidos.

! Utilize sempre uma bata de laboratório adequada, luvas descartáveis e óculos de proteção e cumpra as instruções de segurança fornecidas nesta secção.

Informação sobre Regulamentação:Os componentes seguintes do Equipamento de Ensaio PapilloCheck® contêm substâncias nocivas e perigosas:

Componente do kit

Quantidade Conteúdo perigoso

Classifi cação em conformi-dade com o regulamento

(CE)N.º 1272/2008

Pictograma GHS e

palavra-sinal

Advertências de perigo e recomendações de prudência

Tampão de HibridaçãoPapilloCheck®, tiocianato de guanidina, 20 a 60%, N.º CAS 593-84-0

toxicidade aguda, oral (categoria 4), toxicidade aguda, inalação (categoria 4), toxicidade aquática crónica (categoria 3), corrosivo para a pele (categoria 1c)

PERIGO

H302H332H314H412P273P280

P305+ P351+P338

EUH032

Nocivo por ingestão.Nocivo por inalação.Provoca queimaduras na pele e lesões oculares graves.Nocivo para os organismos aquáticos com efei-tos duradouros.

Evitar a libertação para o ambiente.Utilizar luvas de proteção/vestuário de proteção/proteção ocular/proteção facial.SE ENTRAR EM CONTACTO COM OS OLHOS: enxaguar cuidadosamente com água durante vários minutos. Se usar lentes de contacto, retire-as, se tal lhe for possível. Continuar a enxaguar.

Informações suplementares sobre os perigos (UE): Em contacto com ácidos liberta gases muito tóxicos.

Tampão B PapilloCheck®, dodecil sulfato de sódio, < 20%, N.º CAS 151-21-3

irritação cutânea (categoria 2), lesões oculares graves (categoria 1)

PERIGO

H315H318P280

P305+ P351+P338

Provoca irritação cutânea.Provoca lesões oculares graves.Usar vestuário de proteção/proteção ocular/pro-teção facial.SE ENTRAR EM CONTACTO COM OS OLHOS: enxaguar cuidadosamente com água durante vários minutos. Se usar lentes de contacto, retire-as, se tal lhe for possível. Continuar a enxaguar.

A versão atual da Ficha de Dados de Segurança para este produto pode ser descarregada a partir do sítio da Internet Greiner Bio-One: www.gbo.com Know-How & Services Download-Center



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5. ELIMINAÇÃO DE RESÍDUOS

Após a lavagem e a secagem da microplaca PapilloCheck®, as soluções de lavagem I e II podem ser eliminadas sem quaisquer precauções especiais. Elimine a microplaca PapilloCheck® utilizada, os componentes não utilizados do equipamento e a mistura de hibridação não utilizada com os resíduos químicos do laboratório.

Siga todos os regulamentos nacionais, estatais e locais relativos à eliminação.



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6. INTRODUÇÃO

6.1 Informações Gerais

A infeção persistente com um vírus do papiloma humano (VPH) cancerígeno verifi ca-se virtualmente em todos os casos de cancro cervical – o segundo cancro mais comum nas mulheres a nível mundial7. Até à data, identifi caram-se mais de 100 tipos de VPH, dos quais cerca de 40 tipos são transmitidos sexualmente e infetam a mucosa genital. Os tipos de VPH cervical estão classifi cados como um grupo high-risk (VPH high-risk, VPHar) e de baixo risco (VPH de baixo risco, VPHbr). Enquanto os tipos de VPH high-risk estão associados a um maior risco de desenvolvimento de cancro cervical, os tipos de VPH de baixo risco causam sobretudo verrugas genitais benignas8. Contudo, mesmo no grupo high-risk, o risco relativo para o desenvolvimento de cancro ou neoplasias intraepiteliais cervicais (CIN) depende do tipo9. Cerca de 70% de todos os casos de cancro cervical estão ligados a uma infeção persistente com VPH 16 ou 18. Os tipos de baixo risco mais predominantes são o VPH 6 e 11. Com base na ligação quase puramente etiológica entre o VPH cancerígeno e o cancro cervical, os testes para o VPHar estão a ser considerados como um rastreio primário do cancro cervical10.

6.2 Tipos de VPH detetáveis com o PapilloCheck®

O PapilloCheck® permite a identifi cação de 18 tipos high-risk e 6 de baixo risco do vírus do papiloma humano (VPH) (Tabela 1), enquanto o PapilloCheck® high-risk permite a identifi cação de 14 tipos high-risk do vírus do papiloma humano (VPHar) (Tabela 2).

Tabela 1: Tipos de VPH detetáveis com o PapilloCheck®

VPH 16 VPH 45 VPH 59 VPH 6





VPH 39 VPH 58 VPH 82 VPH 44/VPH 55*

* O PapilloCheck® não permite a diferenciação entre o VPH 44 e o VPH 55.

Tabela 2: Tipos de VPHar detetáveis com o PapilloCheck® high-risk

VPH 16 VPH 51

VPH 18 VPH 52

VPH 31 VPH 56

VPH 33 VPH 58

VPH 35 VPH 59

VPH 39 VPH 66

VPH 45 VPH 68

7 Walboomers, J. et al (1999). Human papillomavirus is a necessary cause of invasive cervical cancer worldwide. J Pathol. 189(1):12-9., Sexually Transmitted Infections 76:80-87

8 Burd EM. Human papillomavirus and cervical cancer. Clin Microbiol Rev. 2003;16:1–17.9 Bosch F.X. et al. (2008). Epidemiology and natural history of human papillomavirus infections and type-specifi c implications in cervical neoplasia. Vaccine. 26 Suppl 10:K1-16.

10 Meijer, C.J. et al. (2009). Guidelines for human papillomavirus DNA test requirements for primary cervical cancer screening in women 30 years and older. Int J Cancer. 124(3):516-20.



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6.3 Princípio do ensaio

O PapilloCheck® é um equipamento de ensaio baseado em microarray para a deteção e genotipagem de um fragmento do gene E1 do genoma do vírus do papiloma humano (VPH). O processo de ensaio está resumido na Figura 1.

Antes da análise PapilloCheck®, o ADN tem de ser extraído de uma amostra de esfregaço cervical. A colheita de amostras e a extração de ADN não fazem parte do Equipamento de Ensaio PapilloCheck®. Os produtos dedicados para a colheita de amostra (PapilloCheck® Collection Kit) e a extração de ADN (Equipamento de Extração de ADN oCheck®) também estão disponíveis na Greiner Bio-One e têm de ser adquiridos em separado (consulte as informações sobre encomendas no capítulo 2).

Após a extração do ADN genómico viral e humano de uma amostra cervical, um fragmento 350 bp do gene viral E1 é amplifi cado pela reação em cadeia da polimerase (PCR) na presença de um conjunto de iniciadores específi cos do VPH. Na mesma reação, um fragmento do gene humano de cópia simples ADAT1 (adenosina deaminase 1 específi ca de tARN humano) é amplifi cado para vigiar a presença de material de amostra humano na amostra cervical (controlo da amostra) e um modelo de controlo interno presente no PapilloCheck® PCR MasterMix é amplifi cado para vigiar o desempenho da PCR (controlo da PCR). Além disso, o PapilloCheck® PCR MasterMix contém dUTP. Assim, a potencial contaminação cruzada de reações de PCR anteriores pode ser eliminada através da utilização do tratamento com Uracilo-N-Glicosilase (UNG) (consulte o capítulo 8.2.2).

Os produtos para PCR são então hibridados para sondas específi cas de ADN e controlos na microplaca associados à superfície da microplaca PapilloCheck®. Cada microplaca contém 12 microarrays de ADN, que permitem a análise simultânea de 12 amostras cervicais. Durante a hibridação, o ADN ligado é etiquetado fl uorescentemente e o ADN não ligado é removido nos passos de lavagem subsequentes. Controla-se a efi cácia da hibridação (controlo da hibridação).

Por último, a microplaca PapilloCheck® é varrida, analisada e avaliada automaticamente utilizando o CheckScanner e o CheckReport Software, respetivamente (consulte as informações sobre encomenda no capítulo 2). O CheckScanner é um scanner a laser bicolor (comprimentos de onda de excitação de 532 nm e 635 nm), que permite a deteção do sinal fl uorescente gerado pela presença dos produtos de amplifi cação específi cos do VPH bem como dos controlos (consulte o capítulo 6.4.2). O CheckReport Software permite a visualização, a análise e a avaliação dos resultados e mostra automaticamente os valores correspondentes tanto dos tipos de VPH detetados como dos controlos num relatório detalhado.

O relatório indica claramente a presença ou ausência de um ou mais dos 24 tipos de VPH ou14 tipos de VPHar detetáveis e os controlos abrangentes na microplaca tornam a análise altamente fi ável.



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1. Reação da PCR

2. Hibridação

3. Lavagem e secagem

4. Varrimento e análise

ou

Figura 1: Processo do ensaio PapilloCheck®

1. Reação da PCR: após a extração de ADN, um fragmento 350 bp do gene viral E1 e os fragmentos de dois objetivos de controlo são amplifi cados através de PCR. Os produtos de amplifi cação são então hibridados para sondas de ADN complementares na microplaca.

2. Hibridação: cada tipo de VPH é detetado por uma sonda de ADN específi ca presente em cinco réplicas. Durante a hibridação, introduz-se a etiquetagem fl uorescente.

3. Lavagem e secagem: o ADN não ligado é removido nos passos de lavagem subsequentes.4. Varrimento e análise: A microplaca PapilloCheck® é varrida, analisada e avaliada utilizando o CheckScanner e CheckReport

Software. É criado um relatório que indica claramente a presença ou ausência de um ou mais dos tipos de VPH detetáveis.



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6.4 Desenho da microplaca PapilloCheck®

6.4.1 Esquema da microplaca PapilloCheck®

Cada microplaca PapilloCheck® ou PapilloCheck® high-risk contém 12 microarrays designados como poço A1 a B6. Em cada poço, uma microplaca simples que inclui diferentes sondas é colorida. Cada microplaca simples é delimitada por uma borda elevada. Cada sonda é colorida em cinco réplicas. O esquema da microplaca está ilustrado na Figura 2. Os controlos na microplaca descritos são explicados mais à frente no capítulo 6.4.2.

controlo da orientação

HPV 31HPV 18HPV 16HPV 11HPV 6


controlo da hibridação

HPV 44/55HPV 43

Controlo da PCR



controlo da amostra

HPV 82HPV 73

controlo da orientação



controlo da hibridação

HPV 44/55HPV 43

Controlo da PCR



controlo da amostra

HPV 82HPV 73

a) cana

l ver

mel

ho (6

35 n

m)

cana

l ver

de (5

32 n

m)

b)

c)

Figura 2: Desenho da microplaca PapilloCheck®

a) Esquema da microplaca PapilloCheck®. b) e c) Imagens apresentadas pelo CheckReport Software para os dois comprimentos de onda de excitação diferentes utilizados para varrimento (b) do canal vermelho: 635 nm; c) canal verde: 532 nm) e esquemas da disposição do microarray PapilloCheck®. Indicam-se as sondas específi cas para o tipo do VPH e os controlos na microplaca.



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6.4.2 Controlos na microplaca

O desenho da microplaca de ADN PapilloCheck® inclui controlos abrangentes na microplaca. Vários sistemas de controlo vigiam todos os passos mais importantes tanto do ensaio como do processamento da microplaca, incluindo a qualidade das amostras e a extração de ADN (controlo da amostra), a qualidade de reação da PCR (controlo da PCR), a efi cácia da hibridação (controlo da hibridação), bem como a homogeneidade da coloração e a qualidade de impressão (controlo da orientação e controlo da impressão). Para além da presença ou ausência de tipos de VPH, o CheckReport Software mostra automaticamente os valores correspondentes tanto dos controlos como dos tipos de VPH detetados num relatório detalhado. Para a leitura dos diferentes controlos, utilizam-se os dois comprimentos de onda de excitação do CheckScanner. Para o controlo do desempenho do ensaio (controlo da amostra e da PCR), utiliza-se o canal vermelho (comprimento de onda de excitação de 635 nm), enquanto a qualidade da hibridação e da microplaca (controlo da hibridação, da orientação e da impressão) é avaliada no canal verde (comprimento de onda de excitação de 532 nm).

Controlo da amostraO PapilloCheck® vigia a qualidade da amostra e/ou da extração de ADN amplifi cando um fragmento do gene humano de cópia simples ADAT1 (adenosina deaminase 1 específi ca de tARN humano). Se estiver presente ADN humano numa quantidade adequada no ADN extraído da amostra cervical, é gerado um sinal fl uorescente nas colorações de controlo da amostra.

Se não ocorrer amplifi cação de ADAT1 ou esta for insufi ciente, o CheckReport Software indica que o controlo da amostra "falhou". Esta situação tem duas consequências diferentes, dependendo do sinal das colorações específi cas do agente patogénico. Se a amostra for positiva para VPH, a análise permanece válida. Neste caso, o controlo da amostra falhado é um resultado direto da competição entre o ADN concomitante e um excesso do ADN-alvo durante a PCR. Se, por outro lado, a amostra for negativa para o VPH, o CheckReport Software indica que a análise "falhou" devido à fraca colheita da amostra (quantidade insufi ciente de células na amostra) e/ou extração de ADN inefi caz. Neste caso, é recomendável repetir a análise começando com a extração de ADN ou, se necessário, tirar uma nova amostra (consulte o capítulo 9).

Controlo da PCRO PapilloCheck® também vigia o desempenho da PCR. A amplifi cação de um modelo de controlo interno presente no PapilloCheck® PCR MasterMix gera um sinal nas colorações de controlo da PCR na microplaca PapilloCheck®. A qualidade da reação de amplifi cação também é automaticamente avaliada pelo CheckReport Software. Se o desempenho da PCR se situar abaixo de um limite predefi nido, o CheckReport Software indica que o controlo da PCR "falhou" e tem de repetir-se a análise (consulte o capítulo 9).

Se a quantidade de ADN do VPH na amostra for muito elevada, o sinal fl uorescente das colorações de controlo da PCR pode ser baixo ou mesmo não estar presente devido à concorrência durante a reação da PCR. Neste caso, o sinal fl uorescente para, pelo menos, uma sonda de ADN específi ca tem de exceder um limite predefi nido para o ensaio ser considerado válido.

Controlo da hibridaçãoO PapilloCheck® vigia a efi cácia da hibridação através da utilização de uma sonda fl uorescente etiquetada no Tampão de Hibridação PapilloCheck®, que hibrida para sequências específi cas de ADN na microplaca PapilloCheck®. Uma efi cácia de hibridação adequada resulta em sinais fl uorescentes em cada coloração de array. Os resultados de cinco colorações de controlo da hibridação na microplaca PapilloCheck® também são avaliados pelo CheckReport Software.



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Controlo da orientação e da impressãoAs colorações de controlo da orientação da microplaca PapilloCheck® geram sinais fl uorescentes independentemente da efi cácia do processo de hibridação. Estas colorações são utilizadas no CheckReport Software como pontos de orientação para uma deteção correta da coloração, o que é um pré-requisito para a análise correta dos sinais. O controlo de impressão na microplaca PapilloCheck® vigia a presença e a hibridação das colorações. Para além disso, a qualidade do processo de impressão é controlada através da presença de um sinal fl uorescente verde em cada coloração da microplaca (controlo da impressão).



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7. INSTRUÇÕES DE UTILIZAÇÃO PARA O FLUXO DE TRABALHO DO PAPILLOCHECK®

A seguinte descrição do fl uxo de trabalho é igual para a aplicação dos produtos PapilloCheck® e PapilloCheck® high-risk. Siga a descrição para o PapilloCheck® utilizando apenas componentes do Equipamento de Ensaio PapilloCheck®. Siga a descrição para o PapilloCheck® high-risk utilizando apenas componentes do Equipamento de Ensaio PapilloCheck® high-risk.

7.1 Instruções gerais

Quando se implementam as técnicas modernas atualmente utilizadas em biologia molecular num laboratório, devem ter-se em conta as instruções seguintes para garantir a máxima segurança do pessoal do laboratório e resultados de elevada qualidade.

A execução de técnicas de biologia molecular, como extração de ADN, amplifi cação e deteção dos produtos de amplifi cação, requer pessoal devidamente habilitado. Para além disso, é necessário um fl uxo de trabalho limpo e bem estruturado para prevenir resultados errados, tais como os que ocorrem devido à degradação ou contaminação de ADN através dos produtos de amplifi cação. Para garantir isto, é necessário separar as áreas de extração, amplifi cação e deteção conforme descrito no capítulo 7.2.

Cada área deve estar equipada com equipamento, consumíveis, batas e luvas em separado. Nunca transfi ra batas, luvas ou equipamento de laboratório de uma área para outra.

7.2 Separação de salas

A Figura 3 mostra um exemplo de como um laboratório pode ser separado em três secções distintas. Uma utiliza-se apenas para a extração de ADN, outra para a preparação e realização de reações de PCR e a última destina-se a hibridação e análise. Cada sala utiliza-se exclusivamente para a aplicação ou técnica indicada, para evitar a contaminação de amostras. A utilização de codifi cação de cores pode ser vantajosa para evitar a troca acidental de equipamento e consumíveis entre as áreas.

Sala 1 Sala 2 Sala 3

Figura 3: Separação de salas para processamento manualSala 1: Todo o processo de extração de ADN tem de executar-se nesta sala.Sala 2: Nesta sala, prepara-se e divide-se a mistura de reação para PCR em alíquotas (de preferência sob uma proteção para

PCR). A adição das amostras de ADN extraídas na sala 1 tem de efetuar-se num espaço separado dentro da sala 2.Sala 3: Na terceira sala de laboratório, ocorre a reação de hibridação e realizam-se os passos de lavagem e secagem da

microplaca. Para além disso, utiliza-se o CheckScanner em conjunto com o CheckReport Software para a análise fi nal do ensaio PapilloCheck®.

! Não se deve trocar nem equipamento nem consumíveis entre as diferentes salas de laboratório e espaços. Portanto, as duplicações de equipamento e consumíveis são uma necessidade e devem ter sido consideradas ao equipar o laboratório.



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7.3 Avisos e precauções

7.3.1 Prevenção de contaminação

• As batas de laboratório têm de ser usadas durante os procedimentos e são necessários conjuntos diferentes de batas para cada sala de laboratório.

• Limpeza do laboratório: O local de trabalho tem de ser descontaminado com DNA-AWAY™ (Thermo Scientifi c) ou qualquer outra solução de limpeza adequada antes e depois do trabalho.

• As luvas têm de ser usadas durante cada passo da análise e têm de ser mudadas com frequência, especialmente durante a extração de ADN.

• Tubos de amostra: Nunca toque no interior da tampa do tubo de reação. Para evitar contaminação cruzada, abra um tubo de cada vez.

• Pipetagem: Têm de utilizar-se pontas com fi ltro adequadas para micropipetas com proteção contra aerossóis (sem DNase, RNase e ADN humano, esterilizadas). As pontas das pipetas devem ser sempre mudadas entre transferências de líquidos.

7.3.2 Instruções de manuseamento de microplacas

• As microplacas para ADN devem utilizar-se num ambiente sem poeiras. Deve evitar-se a deposição de poeiras e de outras partículas na superfície das microplacas.

• Não toque na zona de hibridação na superfície da microplaca.

• Apenas o lado etiquetado da microplaca se destina a hibridação.

• Não utilize canetas marcadoras para a identifi cação de microplacas de ADN, pois causam fl uorescência não específi ca na microplaca.

• As microplacas de ADN destinam-se a uma única utilização. As microplacas hibridadas não podem ser reutilizadas.

• Guarde as microplacas não utilizadas na caixa original dentro do saco com fecho fornecido com dessecante.

7.3.3 Precauções gerais

• No momento da chegada, verifi que se os componentes do equipamento têm danos. Se um dos componentes estiver danifi cado (por ex., frascos de tampão), contacte o seu distribuidor local Greiner Bio-One. Não utilize componentes do equipamento danifi cados, pois a sua utilização pode levar a um fraco desempenho do equipamento.

• Não utilize o equipamento após o prazo de validade.

• Não misture reagentes de diferentes lotes.

• Não utilize reagentes fora do prazo de validade.

• Utilize apenas equipamento/reagentes fornecidos com o equipamento e os recomendados pelo fabricante.

• Deve efetuar-se uma calibração/manutenção regular em todo o equipamento, como, por exemplo, cicladores de PCR ou pipetas.

• A pipetagem de quantidades pequenas de líquido na gama do microlitro é um desafi o. Portanto, tenha cuidado para pipetar com a maior precisão possível.



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• Para evitar a contaminação microbiana dos reagentes, tenha cuidado ao retirar as alíquotas dos tubos de reagentes.

• Os reagentes não utilizados e os resíduos têm de ser eliminados em conformidade com as diretrizes federais e estatais.

7.3.4 Trabalhar em segurança

• Use sempre uma bata de laboratório adequada, luvas descartáveis e óculos de proteção!

• Os equipamentos destinam-se apenas a diagnóstico in vitro e devem ser utilizados exclusivamente por pessoal treinado na prática de laboratório de diagnóstico in vitro.

• Tenha cuidado quando manuseia amostras biológicas que contêm material humano potencialmente infeccioso. Para minimizar o risco de infeção de material potencialmente infeccioso, recomenda-se trabalhar em condições de fl uxo de ar laminar até a lise das amostras estar concluída. Manuseie e elimine todas as amostras biológicas como se fossem capazes de transmitir agentes infecciosos.

• Evite o contacto direto com as amostras biológicas, bem como salpicar ou pulverizar. Use sempre bata, luvas e óculos de proteção quando trabalha com amostras humanas.

• Nunca pipete soluções com a boca.

• Não coma, beba, fume nem aplique produtos cosméticos nas áreas de trabalho.

• Lave as mãos cuidadosamente após manusear amostras e reagentes.

A versão atual da Ficha de Dados de Segurança para este produto pode ser descarregada a partir do sítio da Internet Greiner Bio-One:www.gbo.com Know-How & Services Download-Center

21PapilloCheck® e PapilloCheck® de alto risco – Instruções de UtilizaçãoRevisão: BQ-708-02 / março 2019

8. PROCESSO PAPILLOCHECK®

O capítulo seguinte descreve pormenorizadamente os diferentes passos de trabalho que, por último, ocasionam a realização de um relatório detalhado, indicando claramente a presença ou ausência de um ou mais dos tipos de VPH detetáveis em cada amostra cervical analisada. A Figura 4 mostra os diferentes passos de trabalho necessários. Também indica o subcapítulo correspondente que descreve o passo do ensaio específico. Os passos de trabalho têm de ser executados pela ordem descrita neste capítulo. Cada passo específico com intervenção é indicado por uma seta azul .

!A colheita de amostras, a extração de ADN e a análise com o CheckReport Software não fazem parte do Equipamento de Ensaio PapilloCheck®. Portanto, a descrição destes passos de trabalho é abreviada neste capítulo. Para informações mais detalhadas, consulte as Instruções de Utilização correspondentes, por exemplo, do PapilloCheck® Collection Kit, do Equipamento de Extração de ADN oCheck® e do CheckReport Software.

8.1 Colheita de amostras e extração de ADN

8.1.1 Colheita de amostras

A colheita de amostras não faz parte do Equipamento de Ensaio PapilloCheck®. Um equipamento de colheita dedicado a amostras cervicais (PapilloCheck® Collection Kit) também está disponível na Greiner Bio-One (consulte as informações sobre encomendas no capítulo 2).

O PapilloCheck® foi validado utilizando o ADN preparado com o Equipamento de Extração de ADN oCheck® proveniente de esfregaços cervicais humanos colhidos através de um dos sistemas ou meios de colheita seguintes:

• PapilloCheck® Collection Kit (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Alemanha)

• PreservCyt® (Hologic, Bedford, MA, EUA)

• Surepath™ (BD, Franklin Lakes, NJ, EUA)

• STM™ (Qiagen, Hilden, Alemanha)

• Easyfix (VWR, Radnor, PA, EUA)

• Cyt-ALL (Alphapath, Mudaison, França)

Para mais informações sobre os meios de transporte adequados ou os sistemas de extração de ADN, contacte o seu distribuidor local Greiner Bio-One ou consulte o sítio da Internet Greiner Bio-One: www.gbo.com Know-How & Services Download-Center


Capítulo 8.1.2 Extração de ADN

Equipamento de

extração de

ADN oCheck®

Capítulo 8.3.2 Hibridação

Capítulo 8.2 PCR

Capítulo 8.4 Varrimento e avaliação

Capítulo 8.3.3 Lavagem e secagem

ou

Figura 4: Apresentação dos diferentes passos de trabalho do PapilloCheck®


8.1.2 Extração de ADN

A extração de ADN não faz parte do Equipamento de Ensaio PapilloCheck®. Deve realizar-se a extração de ADN antes da análise PapilloCheck® utilizando o Equipamento de Extração de ADN oCheck®, também fornecido pela Greiner Bio-One (consulte o capítulo 2). Cumpra rigorosamente as Instruções de Utilização quando utilizar o Equipamento de Extração de ADN oCheck®.

Para a extração de ADN com o Equipamento de Extração de ADN oCheck®, devem utilizar-se 250 µl de solução de amostra.

As amostras de esfregaços cervicais humanos que são colhidas • com o PapilloCheck® Collection Kit (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Alemanha)

• em meio de colheita PreservCyt® (Hologic, Bedford, MA, EUA)

• em Easyfix (VWR, Radnor, PA, EUA) ou

• Cyt-ALL (Alphapath, Mudaison, França)

podem ser processadas diretamente.

As amostras cervicais que são colhidas em • meio de colheita Surepath™ (BD, Franklin Lakes, NJ, EUA) têm de ser lavadas antes da utilização:

centrifugue 250 µl da amostra durante 5 minutos a 11 000 x g e volte a suspender a pellet em 250 µl de água destilada. Posteriormente, podem processar-se os 250 µl com o Equipamento de Extração de ADN oCheck®.

As amostras cervicais que são colhidas em • meio de colheita STM™ (Qiagen, Hilden, Alemanha) têm de ser diluídas: utilize 100 µl da amostra

e adicione 150 µl de água destilada. Podem processar-se os 250 µl de amostra diluída com o Equipamento de Extração de ADN oCheck®.

Regra geral, se a amostra do esfregaço cervical parecer ser muito concentrada e já estiver agregada, a amostra tem de ser diluída e homogeneizada antes de se iniciar a extração de ADN!

As amostras de esfregaços cervicais que sejam muito diluídas e não apresentem células visíveis devem ser concentradas para se obter um rendimento mais elevado de células para extração de ADN: centrifugue até 1000 µl da amostra durante 5 minutos a 11 000 x g e volte a suspender a pellet em 250 µl de água destilada. Posteriormente, podem processar-se os 250 µl com o Equipamento de Extração de ADN oCheck®.

!Este passo de concentração só é adequado para amostras de esfregaços cervicais que foram colhidas com o PapilloCheck® Collection Kit, em meio de colheita PreservCyt®, Easyfix e Cyt-All ou em meio de colheita Surepath™. Se se utilizou o meio de colheita STM™, não é possível uma concentração através de centrifugação.

8.2 Reação em cadeia da polimerase (PCR)

A PCR é um método muito sensível que pode detetar quantidades extremamente pequenas de ADN. Devem tomar-se precauções especiais para evitar a contaminação da reação (consulte o capítulo 7). A Polimerase HotStarTaq® e a Uracilo-N-Glicosilase são necessárias, mas não são fornecidas com o Equipamento de Ensaio PapilloCheck® e têm de ser adquiridas em separado (consulte o capítulo 2).

!O Equipamento de Ensaio PapilloCheck® foi validado utilizando Polimerase HotStarTaq® da Qiagen e Uracilo-N-Glicosilase da Thermo Scientific (consulte o capítulo 2). A utilização destas enzimas é obrigatória para se obter o desempenho reivindicado.


8.2.1 Preparação do ciclador térmico

O Equipamento de Ensaio PapilloCheck® foi validado com os seguintes cicladores térmicos: • GeneAmp® PCR system 9700 (Applied Biosystems)

• Ciclador Térmico Veriti™ de 96 Poços (Applied Biosystems)

• peqSTAR 96X Universal (PEQLAB Biotechnologies GmbH).

! É imprescindível utilizar um dos cicladores térmicos mencionados acima para se obter o desempenho reivindicado.

O programa do ciclador térmico de PCR PapilloCheck® encontra-se resumido na Tabela 3.

Tabela 3: Programa do ciclador térmico de PCR PapilloCheck®

Tempo Temp. °C N.º de ciclos

20 min 37 °C 1

15 min 95 °C 1

30 s25 s45 s

95 °C55 °C72 °C

40

30 s45 s

95 °C72 °C

15

Pausa 10 °C ∞

Para além disso, têm de definir-se os parâmetros de execução seguintes para cada ciclador térmico. Para uma descrição sobre como definir estes parâmetros, consulte as Instruções de Utilização do respetivo ciclador térmico.

GeneAmp® PCR system 9700 (Applied Biosystems)Defina o volume de reação para 26 µl, a velocidade de rampa para "9600" e utilize uma temperatura da tampa de 103 °C.

Ciclador Térmico Veriti™ de 96 Poços (Applied Biosystems)Utilize a ferramenta Método de Conversão do Ciclador Térmico Veriti™ de 96 Poços para entrar no programa PCR PapilloCheck® e selecione "9600 Emulation Mode". Defina o volume de reação para 26 µl e a temperatura da tampa para 103 °C.

peqSTAR 96X Universal (PEQLAB Biotechnologies GmbH)Utilize o programa PCR pré-programado PapilloCheck® “PapilloCheck.js” fornecido em conjunto com o ciclador térmico. Normalmente o programa pode ser aberto usando o seguinte caminho: local/Scripts/GreinerBioOne/PapilloCheck.js.

8.2.2 Tratamento da Uracilo-N-Glicosilase (UNG)

O PapilloCheck® PCR MasterMix contém dUTP que se inclui nos produtos de amplificação durante a PCR PapilloCheck®, tornando os produtos da PCR suscetíveis à degradação pela UNG. A UNG cliva o produto da PCR em locais onde se incluiu um resíduo de desoxiuridilato. Os produtos da PCR clivados não serão amplificados numa reação posterior.

Assim, pode utilizar-se um tratamento da UNG para eliminar a potencial contaminação cruzada de reações de PCR anteriores11.

11 A aquisição de PapilloCheck® faz-se acompanhada de uma licença limitada com os Números de Patente Norte-americanas 5 035 996, 5 683 896, 5 945 313, 6 287 823 e 6 518 026, e as patentes estrangeiras correspondentes.


Dilua a Uracilo-N-Glicosilase 1:200 em água de grau PCR. Para preparação da diluição de Uracilo-N-Glicosilase, pode utilizar-se a água de grau PCR do Tubo de preparação de diluição de UNG, que está incluído no Equipamento de Ensaio PapilloCheck®. Utilize uma diluição fresca de UNG para cada preparação de reação de PCR PapilloCheck® (consulte o capítulo 8.2.3). Não volte a utilizar a UNG diluída.

Misture a diluição de UNG cuidadosamente com o agitador vortex durante 2 segundos, e depois reduzindo a rotação, ou através de pipetagem várias vezes.

A concentração original da Uracilo-N-Glicosilase é 1 U/µl. Portanto, a concentração da diluição é 0,005 U/µl.

! O Equipamento de Ensaio PapilloCheck® foi validado utilizando a Uracilo-N-Glicosilase da Thermo Scientific (consulte o capítulo 2). A utilização desta enzima é obrigatória para se obter o desempenho reivindicado.

Adicione 1 µl desta diluição a cada reação de PCR PapilloCheck® (consulte o capítulo 8.2.3, Tabela 4).

Esta quantidade é suficiente para eliminar a contaminação cruzada de PCR. Tenha cuidado para não utilizar uma solução de UNG concentrada mais elevada, pois isso poderia ter um efeito adverso sobre o desempenho da PCR, resultando numa sensibilidade reduzida do PapilloCheck®.

Regra geral, para o tratamento da UNG, a mistura de reação de PCR é incubada durante 20 minutos a 37 °C. Posteriormente, a UNG é inativada por um passo de incubação adicional de 15 minutos a 95 °C. Estes dois passos já estão incluídos na PCR PapilloCheck® e correspondem aos dois primeiros passos do programa do ciclador térmico (consulte a Tabela 3). Durante o segundo passo (15 minutos a 95 °C) ocorre tanto a inativação da Uracilo-N-Glicosilase como a ativação da Polimerase HotStarTaq®.

!O sistema UNG incorporado da PCR PapilloCheck® eliminará apenas a contaminação cruzada com produtos da PCR provenientes de reações anteriores da PCR. Não se consegue eliminar outra contaminação, por exemplo que ocorra durante a preparação da amostra, extração de ADN ou adição de modelo de PCR. Portanto, ainda é necessário cumprir as instruções e precauções especiais para evitar a contaminação descrita no capítulo 7.

8.2.3 Preparação da reação de PCR

Com a exceção da Polimerase HotStarTaq® e da Uracilo-N-Glicosilase, o PapilloCheck® PCR MasterMix já contém todos os componentes necessários para executar a reação de PCR (tampão de PCR, MgCl2, dNTP, iniciadores, modelo de controlo da PCR).

Geralmente, o processo de preparação da PCR PapilloCheck® pode ser dividido em duas partes: a preparação da mastermix final adicionando enzimas ao PapilloCheck® PCR MasterMix e a preparação da reação de PCR final adicionando ADN extraído como modelo.

! Validou-se o Equipamento de Ensaio PapilloCheck® utilizando a Polimerase HotStarTaq® da Qiagen (consulte o capítulo 2). A utilização desta enzima é obrigatória para se obter o desempenho reivindicado.

A preparação da mastermix final é executada da melhor forma num ambiente protegido, por exemplo, com uma proteção para PCR, para evitar a contaminação da reação.


Prepare a mastermix final (que consiste em PapilloCheck® PCR MasterMix, Polimerase HotStarTaq® e Uracilo-N-Glicosilase) para a quantidade necessária de reações de PCR, conforme descrito na Tabela 4.

Para analisar amostras múltiplas, a mastermix final deve ser preparada num lote (na quantidade necessária para todas as análises). Para ajustar atendendo às variações de volume durante a pipetagem, recomenda-se aumentar o número de reações (n) em 1 por cada microplaca (=n+1), por exemplo, prepare um volume de mastermix final para 13 reações de amplificação se for necessário testar 12 amostras (consulte a Tabela 4).

!Recomenda-se a inclusão de um controlo negativo para cada lote da mastermix final preparada. Como controlo negativo, pode utilizar-se o tampão de eluição de ADN do equipamento de extração de ADN apropriado ou água de grau PCR.

Misture a mastermix final cuidadosamente com o agitador vortex durante 2 segundos e, depois, reduzindo a rotação ou através de pipetagem várias vezes.

Divida a mastermix final em alíquotas através de pipetagem de 21 µl para cada reação de PCR para um tubo de reação de PCR de 0,2 ml de parede fina.

Efetue a adição do ADN modelo num espaço de trabalho separado do da preparação da mastermix final (consulte o capítulo 7.2).

Para a preparação da mistura de reação, adicione 5 µl de extrato de ADN a cada mastermix final e misture com o agitador vortex durante 2 segundos e, depois, reduzindo a rotação ou através de pipetagem várias vezes. O volume total de uma reação de PCR é de 26 µl.

Coloque os tubos de reação no ciclador térmico e inicie a reação de PCR utilizando o programa do ciclador térmico descrito no capítulo 8.2.1 (Tabela 3).

! Após a conclusão da PCR, os produtos de amplificação devem ser utilizados imediatamente para hibridação ou conservados no escuro a ≤ -20 °C durante uma semana.

Tabela 4: Preparação da reação de PCR PapilloCheck®

1 reação13 reações

(1 microplaca)26 reações

(2 microplacas)39 reações

(3 microplacas)52 reações

(4 microplacas)

PapilloCheck®

PCR MasterMix19,8 µl 257,4 µl 514,8 µl 772,2 µl 1029,6 µl

Polimerase do ADN HotStarTaq® (5 U/µl)

0,2 µl 2,6 µl 5,2 µl 7,8 µl 10,4 µl

Uracilo-N-Glicosilase(Diluição de 1:200, 0,005 U/µl)

1 µl 13 µl 26 µl 39 µl 52 µl

Volume total antes da adição da amostra de ADN (mastermix final)

21 µl 273 µl 546 µl 819 µl 1092 µl

Extrato de ADN proveniente da amostra cervical (modelo de ADN)

5 µl

Volume total por reação (reação de PCR final)

26 µl


8.3 Hibridação e lavagem

8.3.1 Preparação e configuração

Comece com os preparativos necessários para a hibridação e os passos de lavagem pelo menos 30 minutos antes do início do processo de hibridação para garantir que todos os componentes necessários são equilibrados à temperatura ambiente.

Para dissolver os potenciais precipitados nos tampões de hibridação e lavagem, exponha-os à temperatura ambiente durante 30 minutos e misture bem antes de utilizar.

Conservar o Equipamento de Ensaio PapilloCheck® entre 4 a 8 °C pode resultar em precipitação de SDS no Tampão de Hibridação e no Tampão B. Deixe as soluções equilibrarem à temperatura ambiente e depois agite o tubo no agitador vortex ou agite o frasco até qualquer precipitado ficar dissolvido.

Prepare a Câmara de Hibridação oCheck®: coloque um toalhete de papel húmido na Câmara de Hibridação e feche a tampa para criar uma atmosfera saturada de humidade.

Para evitar a evaporação do pequeno volume de mistura de hibridação utilizada na microplaca, é necessário executar a hibridação numa atmosfera saturada de humidade. Uma Câmara de Hibridação dedicada para a análise PapilloCheck® está disponível na Greiner Bio-One (consulte o capítulo 2).

Incube a quantidade necessária de microplacas PapilloCheck® na Câmara de Hibridação preparada à temperatura ambiente durante, pelo menos, 10 minutos.

!O suporte magnético de lâminas da Câmara de Hibridação contém um íman apenas numa das duas extremidades. Se menos de quatro microplacas PapilloCheck® forem hibridadas em paralelo, tenha o cuidado de encher o suporte de lâminas com microplacas PapilloCheck® a partir do lado oposto do íman. Caso contrário, as microplacas PapilloCheck® não ficarão cobertas com líquido durante o processo de lavagem.

Prepare as soluções de lavagem I, II e III de acordo com as instruções seguintes.

Preparação das soluções de lavagem I, II e III: Prepare a mistura da solução de lavagem para as soluções de lavagem I, II e III adequada ao

número de microplacas PapilloCheck® que são analisadas, como ilustrado na Tabela 5.

Divida em alíquotas três volumes iguais da mistura da solução de lavagem em três caixas de lavagem separadas oCheck® e identifique-as no rótulo como solução de lavagem I, II e III. Cada caixa de lavagem oCheck® contém uma escala gravada, que indica a quantidade correta de solução de lavagem necessária para até 4 microplacas. Utilize esta escala para verificar a quantidade de tampão.

Pré-aqueça a solução de lavagem II a 50 °C em banho-maria com a temperatura controlada durante, pelo menos, 20 minutos antes de utilizar. Certifique-se de que o nível de enchimento do banho-maria seja igual ao nível de enchimento da solução de lavagem II.

Tabela 5: Preparação da mistura da solução de lavagem

Número de microplacas PapilloCheck®

Componentes 1 2 3 4

Água purificada 140 ml 280 ml 420 ml 560 ml

PapilloCheck® Tampão A 14 ml 28 ml 42 ml 56 ml

PapilloCheck® Tampão B 1,75 ml 3,5 ml 5,25 ml 7 ml

Volume total 155,75 ml 311,50 ml 467,25 ml 623 ml


!Nunca utilize novamente as soluções de lavagem, pois isto pode originar uma acumulação do produto de lavagem da PCR que possivelmente interfere com os resultados do PapilloCheck®. Utilize soluções de lavagem novas para cada ensaio.A mistura da solução de lavagem preparada pode conservar-se até uma semana à temperatura ambiente. Verifique se ocorreu precipitação de SDS. Caso tenha ocorrido, aqueça a mistura da solução de lavagem até que o precipitado esteja dissolvido e novamente equilibrado à temperatura ambiente. Em seguida, prepare a experiência de hibridação seguinte.

8.3.2 Hibridação

A hibridação tem de ser efetuada à temperatura ambiente entre 20 e 25 °C. Os passos de trabalho principais para a hibridação dos produtos da PCR da reação da PCR PapilloCheck® na microplaca PapilloCheck® são apresentados na Figura 5.

Misture os produtos da PCR antes de utilizar. Centrifugue brevemente.

! Se os produtos da PCR foram conservados a ≤ -20 °C até à hibridação, primeiro descongele os produtos da PCR antes de misturar e, em seguida, continue conforme descrito.

Agite o Tampão de Hibridação no agitador vortex antes de utilizar. Centrifugue brevemente.

Transfira 30 µl do Tampão de Hibridação PapilloCheck® para um novo tubo de reação de uma tira para PCR de 8 tubos. Caso seja mais conveniente, também pode ser utilizado um novo poço de uma placa de PCR.

Adicione 5 µl do produto da PCR ao Tampão de Hibridação e misture com o agitador vortex ou através de pipetagem várias vezes.

Centrifugue brevemente.

Transfira 25 µl da mistura de hibridação para cada poço da microplaca utilizando os seis canais de uma pipeta multicanal. Evite a formação de bolhas!

Recomenda-se processar seis amostras em paralelo utilizando uma multipipeta de 8 canais e tiras para PCR de 8 tubos (consulte a Figura 5). Isto aumenta a eficiência de manuseamento, a velocidade, reduzindo, assim, o risco de evaporação. Se for necessário processar mais de uma lâmina de uma vez, é obrigatória a utilização de uma multipipeta para se conseguir um tempo de hibridação correto.

! Evite a formação de bolhas!

Se possível, hibride todos os 12 poços de uma microplaca. Caso se processem menos de 12 amostras, deixe vazios os poços não utilizados. Os poços não utilizados numa microplaca processada não podem ser utilizados para amostras no futuro.

! Manuseie a microplaca cuidadosamente para evitar derramar a mistura de hibridação. O derrame pode originar contaminação cruzada das amostras e resultados falso positivos.

Incube a microplaca durante exatamente 15 minutos à temperatura ambiente entre 20 e 25 °C dentro da Câmara de Hibridação preparada numa atmosfera escura saturada de humidade. Tenha cuidado para não mover a Câmara de Hibridação durante a hibridação.

!Nunca altere o tempo ou a temperatura de incubação da reação de hibridação, pois isso pode ocasionar a perda de intensidade do sinal fluorescente ou um aumento da fluorescência não específica.

Não exponha as microplacas hibridadas à luz solar direta.


Prepare uma atmosfera saturada de humidade na Câmara de Hibridação.

Incube a quantidade necessária de microplacas PapilloCheck® na Câmara de Hibridação preparada à temperatura ambiente (consulte o capítulo 8.3.1).

Misture 30 µl do Tampão de Hibridação PapilloCheck® num tubo de reação de 0,2 ml de uma tira para PCR com 5 µl do produto da PCR. Misture cuidadosamente.

Transfira 25 µl da mistura de hibridação para cada poço da microplaca PapilloCheck® utilizando uma pipeta multicanal.

Feche a Câmara de Hibridação e incube a microplaca PapilloCheck® durante exatamente 15 minutos à temperatura ambiente entre 20 e 25 °C.

Figura 5: Passos de trabalho do processo de hibridação


8.3.3 Lavagem e secagem

O equipamento especial fornecido pela Greiner Bio-One permite a lavagem paralela de até quatro microplacas PapilloCheck® (consulte o capítulo 2). O equipamento adicional necessário para o processamento das microplacas PapilloCheck® inclui três caixas de lavagem oCheck® e uma pega para o suporte magnético de lâminas da Câmara de Hibridação.

Os diferentes passos de trabalho são mostrados na Figura 6.

Retire cuidadosamente o suporte magnético de lâminas que contém as lâminas hibridadas da Câmara de Hibridação.

Coloque o suporte de lâminas diretamente na caixa de lavagem oCheck® que contém a solução de lavagem I. Certifique-se de que o lado magnético fica virado para cima.

Fixe a Pega oCheck® no suporte de lâminas e dê início ao primeiro dos três passos de lavagem.

Lave a microplaca à temperatura ambiente na solução de lavagem I movimentando-a rapidamente para cima e para baixo durante 10 segundos. Os arrays devem permanecer sempre cobertos com solução de lavagem.

Lave a microplaca durante 60 segundos na solução de lavagem II a 50 °C, movimentando vigorosamente para cima e para baixo o suporte de lâminas.

Lave a microplaca à temperatura ambiente na solução de lavagem III movimentando-a rapidamente para cima e para baixo durante 10 segundos.

Retire imediatamente qualquer líquido da superfície da microplaca através de centrifugação. Se utilizar uma microcentrifugadora especial para microarrays, centrifugue durante 1 minuto. Se utilizar uma centrifugadora aplicável aos tubos de 50 ml, coloque cada microplaca PapilloCheck® lavada num tubo de 50 ml e centrifugue à temperatura ambiente durante 3 minutos a 500 x g.

A microplaca PapilloCheck® está, então, pronta para varrimento e deve ser varrida de imediato. Para a limpeza das caixas de lavagem oCheck®, enxague várias vezes com água após cada processo de lavagem e secagem estar concluído.


Primeiro passo da lavagem Retire cuidadosamente o suporte magnético

de lâminas da Câmara de Hibridação.

Coloque rapidamente o suporte de lâminas na caixa de lavagem oCheck® com solução de lavagem I

Fixe a pega oCheck®

Lave a(s) microplaca(s) PapilloCheck® em solução de lavagem I à temperatura ambiente durante 10 segundos movimentando para cima e para baixo o suporte de lâminas

Segundo passo da lavagem Lave a(s) microplaca(s) PapilloCheck® em

solução de lavagem II em banho-maria a 50 °C durante 60 segundos movimentando para cima e para baixo o suporte de lâminas.

Terceiro passo da lavagem Lave a(s) microplaca(s) PapilloCheck®

em solução de lavagem III à temperatura ambiente durante 10 segundos movimentando para cima e para baixo o suporte de lâminas

Secagem Retire imediatamente qualquer líquido da

superfície das microplacas PapilloCheck® através de centrifugação

3 minutos500 g

1 minutovelocidade

máx.

ou

Figura 6: Passos de trabalho do processo de lavagemDiferentes passos de lavagem e processo de secagem antes da análise da microplaca PapilloCheck® com o CheckScanner e o CheckReport Software.


8.4 Varrimento e avaliação da microplaca PapilloCheck®

Coloque a(s) microplaca(s) PapilloCheck® no CheckScanner e continue com o varrimento conforme descrito em detalhe no Guia do Utilizador do CheckReport Software.

Para informações mais detalhadas sobre a instalação do CheckScanner e do CheckReport Software, bem como os requisitos de sistema do computador, consulte as Instruções de Utilização correspondentes do CheckScanner e do CheckReport Software.

Sempre que analisar dados utilizando o CheckReport Software, certifique-se de que a versão do CheckReport Software instalada no seu computador corresponde à versão indicada no equipamento PapilloCheck® utilizado atualmente. Se as versões não corresponderem, atualize o CheckReport Software. A versão mais recente do Software pode ser descarregada a partir do sítio da Internet Greiner Bio-One:www.gbo.com Know-How & Services Download-Center

8.5 Procedimento automático

Em caso de realização da análise PapilloCheck® em combinação com as plataformas CX, CX STARlet / CX STARlet plus ou CX NIMBUS® / CX NIMBUS® plus, siga as respectivas Instruções de uso e, também, as instruções do software fornecidas pelos respectivos dispositivos CX. CX NIMBUS® / CX NIMBUS® plus não possui termociclador integrado. Para realizar a reação PapilloCheck® PCR em combinação com CX NIMBUS® / CX NIMBUS® plus siga as instruções do capítulo 8.2.1.A lavagem das lâminas hibridizadas não é automatizada. Para lavar e secar as lâminas PapilloCheck®

siga as instruções do capítulo 8.3.3.Para solicitar informações sobre os consumíveis e o equipamento adicionalmente requerido consulte as Instruções de uso dos dispositivos CX, CX STARlet /CX STARlet plus ou CX NIMBUS® /CX

NIMBUS® plus ou entre em contato com o seu representante de vendas.



4 °C

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9. RESOLUÇÃO DE PROBLEMAS

Se ocorrer uma das mensagens de erro seguintes durante o varrimento da microplaca ou se a análise PapilloCheck® falhar devido a controlos específi cos na microplaca, continue conforme descrito abaixo. Não hesite em contactar o seu distribuidor local Greiner Bio-One se tiver dúvidas ou difi culdades durante a utilização do PapilloCheck®.

Para a resolução de problemas com outros passos do ensaio como, por exemplo, extração de ADN, consulte as respetivas Instruções de Utilização.

PROBLEMA e causa Comentários e sugestões

MENSAGEM DE ERRO "COULD NOT READ BARCODE" (NÃO FOI POSSÍVEL LER O CÓDIGO DE BARRAS)

Código de barras danifi cado Verifi que se o código de barras está danifi cado. Introduza o código de barras manualmente quando aparecer a janela apropriada.

A microplaca não foi carregada corretamente

Verifi que a orientação da microplaca e faça o varrimento da microplaca na orientação correta.

MENSAGEM DE ERRO "MISSING SPOTS" (COLORAÇÕES EM FALTA), CONTROLO DA IMPRESSÃO FALHOU OU CONTROLO DA ORIENTAÇÃO FALHOU

Poeira na microplaca Repita a hibridação do(s) produto(s) da PCR noutra microplaca.

Formação de bolhas de ar durante a transferência de líquido na microplaca

Repita a hibridação do(s) produto(s) da PCR noutra microplaca. Pipete cuidadosamente para evitar a formação de bolhas.

CONTROLO DE HIBRIDAÇÃO FALHOU

Temperatura incorreta da solução de lavagem II

O segundo passo da lavagem tem de ser realizado a 50 °C. Certifi que-se de que a solução de lavagem II seja aquecida a 50 °C.

Temperatura incorreta do banho-maria

O segundo passo da lavagem tem de ser realizado a 50 °C. Verifi que a temperatura do banho-maria. Certifi que-se de que a temperatura do banho-maria esteja a 50 °C. Se necessário, comprove a temperatura com um termómetro.

Preparação errada da mistura de hibridação

Repita a preparação da mistura de hibridação com os volumes corretos e hibride os produtos da PCR noutra microplaca.



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PROBLEMA e causa Comentários e sugestões

CONTROLO DA PCR FALHOU

Não existe adição da Polimerase do ADN HotStarTaq® ao PapilloCheck® PCR MasterMix

Repita a análise PapilloCheck® começando a preparação da reação da PCR.

Adição de uma Polimerase do ADN HotStarTaq® que não funciona corretamente ao PapilloCheck® PCR MasterMix


Adição da Uracilo-N-Glicosilase não diluída ao PapilloCheck® PCR MasterMix


Mastermix fi nal não foi misturada o sufi ciente

Repita a análise PapilloCheck® começando a reação da PCR. Tenha cuidado para misturar cuidadosamente a mistura de reação.

Inibidores da PCR presentes na amostra

Repita a extração de ADN e a análise PapilloCheck®.

Hibridação executada sem adição de produto da PCR

Repita a hibridação.

Mistura de hibridação fi nal não foi misturada o sufi ciente

Repita a hibridação.

Problemas com o cicladortérmico

Utilize apenas cicladores térmicos validados em combinação com o PapilloCheck®.

CONTROLO DA AMOSTRA FALHOU

Não existe adição de ADN da amostra à mastermix fi nal

Repita a análise PapilloCheck® começando a reação da PCR.

Preparação do ADN falhou Repita a extração do ADN.

Não existe material sufi ciente da amostra

A colheita da amostra falhou. A amostra é muito clara. Concentre a amostra de acordo com a descrição do capítulo 8.1 e repita a extração de ADN ou repita a colheita da amostra.

PCR E/OU CONTROLOS DA AMOSTRA NÃO FALHARAM MAS EXIBEM UM VALOR DE RELAÇÃO SINAL/RUÍDO DE 0

Este resultado é classifi cado como válido se o CheckReport Software detetar pelo menos um tipo de VPH na amostra com um sinal acima de um limite defi nido. A amostra e/ou o controlo da PCR podem então mostrar sinais fl uo-rescentes baixos ou mesmo ausentes devido a competição durante a PCR.

10. ASSISTÊNCIA TÉCNICA

Se tiver dúvidas, ou difi culdades relativamente aos produtos da Greiner Bio-One, não hesite em contactar o seu distribuidor local Greiner Bio-One ou o departamento de assistência té[email protected], composto por cientistas experientes com ampla prática e experiência teórica em biologia molecular.



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11. CARACTERÍSTICAS DE DESEMPENHO DO PAPILLOCHECK®

11.1 Desempenho analítico do PapilloCheck®

11.1.1 Sensibilidade analítica

Para avaliar a sensibilidade analítica, o limite de deteção (LoD95 = número mais pequeno de cópias de ADN-alvo que pode ser detetado em 95% dos casos) foi estabelecido utilizando plasmídeos de referência para cada tipo de VPH detetável que contém a região E1 visada pelo PapilloCheck®. Para a análise do genótipo do VPH, plasmídeos específi cos foram reforçados no meio de transporte, incluindo células de uma linha celular humana (células HEK) como fundo. Foi extraído ADN de cada amostra e posteriormente analisado com o Equipamento PapilloCheck®. O LoD95 foi calculado para cada genótipo do VPH individualmente utilizando 2 séries de diluição independentes e análise Probit. O LoD95 defi nido foi verifi cado com uma terceira série de diluição para cada genótipo do VPH. Os limites de deteção para os diferentes genótipos do VPH são resumidos na Table 6.

Tabela 6: Sensibilidade analítica do PapilloCheck®

Genótipo do VPH*

Limite de Deteção (LoD95) para o PapilloCheck®

[cópias/PCR]**

Limite de Deteção (LoD95) para o PapilloCheck®

[cópias/extração]***

VPH 6 30 600

VPH 11 20 400

VPH 16 10 200

VPH 18 320 6400

VPH 31 50 1000

VPH 33 90 1800

VPH 35 190 3800

VPH 39 50 1000

VPH 40 20 400

VPH 42 50 1000

VPH 43 30 600

VPH 44 20 400

VPH 45 90 1800

VPH 51 20 400

VPH 52 70 1400

VPH 53 60 1200

VPH 55 20 400

VPH 56 50 1000

VPH 58 160 3200

VPH 59 290 5800

VPH 66 40 800

VPH 68 30 600

VPH 70 30 600

VPH 73 2250 45000

VPH 82 40 800

* Plasmídeo específi co do genótipo do VPH com 104 células HEK humanas como fundo em PreservCyt® (Hologic). ** LoD95 por reação da PCR calculado a partir do LoD95 por extração (consulte ***)*** LoD95 com base na análise probit, incluindo o sistema de Extração de ADN oCheck® recomendado da Greiner Bio-One



4 °C

8 °C

48

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11.1.2 Especifi cidade analítica – tipos de VPH

O PapilloCheck® foi testado relativamente à especifi cidade analítica utilizando os plasmídeos de referência específi cos do genótipo do VPH. Os seguintes genótipos do VPH foram testados com 105 cópias/reação da PCR:

VPH 6, VPH 11, VPH 16, VPH 18, VPH 26, VPH 30, VPH 31, VPH 33, VPH 34, VPH 35, VPH 39, VPH 40, VPH 42, VPH 43, VPH 44, VPH 45, VPH 51, VPH 52, VPH 53, VPH 54, VPH 55, VPH 56, VPH 58, VPH 59, VPH 61, VPH 66, VPH 67, VPH 68, VPH 69, VPH 70, VPH 71, VPH 73, VPH 81, VPH 82, VPH 84, VPH 85.

Detetaram-se as hibridações cruzadas seguintes:

O VPH 55 dá um sinal na sonda do VPH 44. Por conseguinte, o CheckReport Software exibe um resultado combinado para VPH 44/VPH 55. O VPH 13 pode reagir de forma cruzada com a sonda do VPH 11, mas não resulta num sinal falso positivo pois o VPH 13 não está presente nas amostras cervicais.

11.1.3 Especifi cidade analítica – Organismos não VPH

O PapilloCheck® foi testado relativamente à especifi cidade analítica utilizando o seguinte organismo não VPH (1 ng de ADN genómico/reação da PCR):

Bacteroides ureolyticus, Bacteroides uniformis, Bifi dobacterium breve, Bifi dobacterium adolescentis, Chlamydia trachomatis, Clostridium diffi cile, Clostridium perfringens, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Enterobacter sakazakii, Enterobacter faecium, Enterobacter durans, Enterobacter faecalis, Escherichia coli, Fusobacterium nucleatum, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae, Neisseria gonorrhoeae, Peptostreptococcus anaerobius, Peptostreptococcus micros, Proteus hauseri, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fl uorescens, Pseudomonas putida, Trichomonas vaginalis, Candida albicans

Não foram detetados sinais não específi cos com o PapilloCheck®

11.2 Repetibilidade (Intrarreprodutibilidade)

A repetibilidade mede a variação de desempenho entre as diferentes execuções num laboratório. Para avaliar a repetibilidade de ensaio, foi extraído ADN de 4 amostras, cada uma com um modelo de VPH diferente (VPH 16, VPH 18, VPH 31 ou VPH 45) num fundo de células humanas, utilizando o Equipamento de Extração de ADN oCheck® manual e analisado com o Equipamento PapilloCheck®. Cada amostra foi analisada em 6 réplicas independentes e em 3 execuções independentes. Por conseguinte, foram testadas 18 réplicas de cada amostra e, no total, 72 amostras por avaliação de repetibilidade. Todas as amostras foram testadas pelo mesmo utilizador, com o mesmo equipamento e respetivos lotes. Adicionalmente, a avaliação de repetibilidade descrita foi efetuada em 3 locais de ensaio, pelo que, no total, foram executadas 216 análises. Foi alcançado um acordo de 100% para cada um dos 3 ensaios de repetibilidade (consulte a Tabela 7).

Tabela 7: Resultados dos ensaios de repetibilidade com o PapilloCheck®

Local do Ensaio Acordo

Local do Ensaio 1 100%





4 °C

8 °C

48

465 060505 060



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11.3 Reprodutibilidade

A reprodutibilidade mede a variação de desempenho entre as diferentes execuções em diferentes laboratórios. Para avaliar a reprodutibilidade de ensaio, mais uma vez, foi extraído ADN de 4 amostras, cada uma com um modelo de VPH diferente (VPH 16, VPH 18, VPH 31 ou VPH 45) num fundo de células humanas, utilizando o Equipamento de Extração de ADN oCheck® manual e analisado com o Equipamento PapilloCheck®. O processo foi executado em paralelo em 3 locais de ensaio diferentes. Cada amostra foi analisada em 6 réplicas independentes e 3 execuções independentes em cada local de ensaio. Por conseguinte, foram testadas 18 réplicas de cada amostra e, no total, 72 amostras por local de ensaio. Cada local de ensaio utilizou equipamento diferente (ciclador PCR, CheckScanner) e diferentes lotes de equipamento. No total, foram testadas 216 amostras. Foi alcançado um acordo de 100% para os resultados dos diferentes locais de ensaio.

11.4 Robustez

Para avaliar a robustez do sistema de ensaio PapilloCheck® consideraram-se variações dos parâmetros seguintes:

• Temperatura de hibridação• Tempo de hibridação• Temperatura de lavagem

Todos os ensaios foram executados em 3 réplicas com elevadas concentrações do modelo (105 cópias/reação da PCR de plasmídeo de referência do VPH) e com uma concentração do modelo próxima do limite de deteção (concentração dependente do genótipo do VPH). Os ensaios foram executados para cada genótipo do VPH detetável com o PapilloCheck®. Os intervalos dos valores dos parâmetros determinados nos quais é possível uma deteção robusta do VPH encontram-se resumidos na Tabela 8.

Tabela 8: Robustez do PapilloCheck®

Parâmetro Intervalo

Temperatura de hibridação 18-25 °C

Tempo de hibridação 13 a 17 minutos

Temperatura de lavagem 48-52 °C



4 °C

8 °C

48

465 060505 060



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11.5 Desempenho Clínico do PapilloCheck®

Para determinar o desempenho clínico do ensaio PapilloCheck® e PapilloCheck® high-risk em termos de sensibilidade e especifi cidade clínicas, realizou-se um estudo comparativo utilizando o PapilloCheck® e o ensaio GP5+/6+-PCR EIA12. Para este estudo, analisaram-se amostras de 1437 mulheres representativas com citologia normal (grupo de controlo) com mais de 40 anos de idade (idade média, 49 anos; faixa etária dos 40 aos 60 anos) e 192 mulheres representativas (idade média, 34 anos; faixa etária dos 30 aos 60 anos) com lesões CIN3+ histologicamente confi rmadas (grupo de casos). Todas as amostras utilizadas neste estudo foram colhidas originalmente durante a fase do estabelecimento da linha de base a partir de mulheres no grupo de intervenção do ensaio de implementação com controlo aleatório baseado na população, POBASCAM13.

Após restringir a análise PapilloCheck® aos 14 tipos de VPH high-risk visados pelo GP5+/6+-PCR-EIA e pelo novo PapilloCheck® high-risk, o PapilloCheck® teve uma sensibilidade clínica para ≥ CIN3 de 95,8% (184/192; 95% IC 92,8-98,8) e uma especifi cidade clínica para ≥ CIN2 de 96,7% (95% IC 95,7-97,7). Em comparação, estes valores foram 96,4 % (185/192; 95 % IC: 93,9-98,9) e 97,7 % (95 % IC: 96,9-98,5), respetivamente, para GP5+6+-PCR-EIA (consulte a Tabela 9 e 10).

Tabela 9: Comparação dos resultados de PapilloCheck® (14 tipos de VPH high-risk visados pelo PapilloCheck® high-risk) e GP5+/6+ PCR-EIA estratifi cados para controlos e casos.

PapilloCheck®

(14 tipos de VPH high-risk)

GP5+/6+-PCR/EIA Total

- + -

Controlos -+

total

1386 (96,5%)18 (1,3 %)

1404 (97,7 %)

4 (0,3 %)29 (2,0 %)36 (2,3 %)

1390 (96,7 %)47 (3,3 %)

1437

Casos -+

total

4 (2,1 %)3 (1,6 %)7 (3,6 %)

4 (2,1 %)181 (94,3 %)185 (96,4 %)

8 (4,2 %)184 (95,8 %)

192

Tabela 10: Sensibilidade e especifi cidade clínicas de PapilloCheck® e GP5+/6+-PCR-EIA (resultados para um ou mais dos 14 tipos de VPH high-risk: VPH 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 ou 68).

14 VPH high-risk PapilloCheck® GP5+/6+

Sensibilidade Clínica para ≥ CIN3 95,8 % 96,4 %

Especifi cidade Clínica para ≥ CIN2 96,7 % 97,7 %

12 Comparison of the clinical performance of PapilloCheck® human papillomavirus detection with that of the GP5+/6+-PCR-enzyme immunoassay in population-based cervical screening. Hesselink AT, Heideman DA, Berkhof J, Topal F, PolRP, Meijer CJ, Snijders PJ. J Clin Microbiol. março de 2010; 48(3):797-801. Epub 30 de dezembro de 2009.

13 Bulkmans, N. W., L. Rozendaal, P. J. Snijders, F. J. Voorhorst, A. J. Boeke, G. R. Zandwijken, F. J. van Kemenade, R.H. Verheijen, K. Groningen, M. E. Boon, H. J. Keuning, M. van Ballegooijen, A. J. van den Brule e C. J. Meijer. 2004. POBASCAM, a population-based randomized controlled trial for implementation of high-risk HPV testing in cervical screening: design, methods and baseline data of 44,102 women. Int. J. Cancer 110:94–101.



4 °C

8 °C

48

465 060505 060



39

Para avaliar a reprodutibilidade do ensaio PapilloCheck® com amostras clínicas, foi realizado um estudo em 2012 nos Países Baixos e na Alemanha. No estudo foram utilizadas amostras cervicais obtidas de uma coorte de 10 000 mulheres que participaram em rastreios regulares de citologia cervical na província de Utrecht dos Países Baixos. Utilizando um conjunto defi nido de 550 amostras pré-testadas, o PapilloCheck® mostrou uma reprodutibilidade intralaboratorial e um acordo interlaboratorial de 97,6% e 94%, respetivamente. Os conjuntos de dados da avaliação de reprodutibilidade foram resumidos nas Tabelas 11 e 12.

Tabela 11: Reprodutibilidade Intralaboratorial

PapilloCheck® 1.ª vez pos.PapilloCheck® 1.ª vez

neg.

PapilloCheck® 2.ª vez pos. 147 6

PapilloCheck® 2.ª vez neg. 7 390

Resultados:Reprodutibilidade [%]: 97,3Intervalo de confi ança inferior [%] = 96,3Kappa = 0,941

Tabela 12: Acordo Interlaboratorial

PapilloCheck® 1.ª vez pos.PapilloCheck® 1.ª vez

neg.

PapilloCheck® 2.ª vez pos. 123 2

PapilloCheck® 2.ª vez neg. 31 394

Resultados:Reprodutibilidade [%]: 94Intervalo de confi ança inferior [%] = 92,1Kappa = 0,842


40

P R O T O C O L O C U R T O

PapilloCheck® e PapilloCheck® de alto risco - Instruções de UtilizaçãoRevisão: BQ-708-02 / março 2019

12. PROTOCOLO CURTO PAPILLOCHECK®

12.1 Sala 2: PCR - Preparação da mistura de reação

Dilua a Uracilo-N-Glicosilase 1:200 em água de grau PCR

Misture cuidadosamente a diluição da UNG

Prepare a mastermix final para a quantidade necessária de reações da PCR

1reação

13reações(1 micro-

placa)

26reações(2 micro-placas)



PapilloCheck®

PCR MasterMix19,8 µl 257,4 µl 514,8 µl 772,2 µl 1029,6 µl

Polimerase HotStar Taq® (5 U/µl)

0,2 µl 2,6 µl 5,2 µl 7,8 µl 10,4 µl

Uracilo-N-Glico-silase(Diluição de 1:200, 0,005 U/µl)

1 µl 13 µl 26 µl 39 µl 52 µl

Volume total an-tes da adição da amostra de ADN

21 µl 273 µl 546 µl 819 µl 1092 µl

Misture cuidadosamente a mastermix final

Divida em alíquotas a mastermix final: adicione 21 µl da mistura de reação a cada reação da PCR num tubo de reação da PCR de 0,2 ml de uma tira para PCR.

PCR

Sala 2


41



12.2 Sala 2: PCR - Adição do modelo ADN/reação da PCR

Adicione 5 µl do modelo de ADN a cada reação da PCR.

Misture cuidadosamente.

Inicie a reação da PCR com o programa do ciclador térmico preparado.

Tempo Temp. °C N.º de ciclos

20 min 37 °C 1

15 min 95 °C 1

30 s25 s45 s

95 °C55 °C72 °C

40

30 s45 s

95 °C72 °C

15

Pausa 10 °C

PCR

Sala 2


42



12.3 Sala 3: Hibridação - Preparação/Reação de hibridação

! Inicie os preparativos pelo menos 30 minutos antes da {1}hibridação.

Dissolva os potenciais precipitados na hibridação e nos tampões de lavagem e misture bem

Prepare a mistura da solução de lavagem para a quantidade de microplacas PapilloCheck® que vão ser analisadas.

Número de microplacas PapilloCheck®

Componentes 1 2 3 4

Água destilada/ desionizada

140 ml 280 ml 420 ml 560 ml

PapilloCheck® Tampão A 14 ml 28 ml 42 ml 56 ml

PapilloCheck® Tampão B 1,75 ml 3,5 ml 5,25 ml 7 ml

Volume total 155,75 ml 311,50 ml 467,25 ml 623 ml

Divida em alíquotas a mistura da solução de lavagem em três caixas de lavagem oCheck®

Pré-aqueça a solução de lavagem II em banho-maria a 50 °C

Incube a quantidade de microplacas PapilloCheck® que vão ser analisadas numa Câmara de Hibridação preparada à temperatura ambiente

Misture os produtos da PCR e centrifugue brevemente

Misture o Tampão de Hibridação e centrifugue brevemente

Misture 30 µl de Tampão de Hibridação PapilloCheck® com 5 µl de produto da PCR

Misture cuidadosamente e centrifugue brevemente

Transfira 25 µl da mistura de hibridação para cada poço da microplaca PapilloCheck® utilizando uma pipeta multicanal

Evite a formação de bolhas

Incube a microplaca PapilloCheck® durante exatamente 15 minutos à temperatura ambiente de 20 a 25 °C

Hibrid. e Lavagem

Sala 3


43



12.4 Sala 3: Lavagem e secagem/Varrimento e avaliação

Retire o suporte magnético de lâminas da Câmara de Hibridação

Coloque o suporte de lâminas na caixa de lavagem oCheck® com solução de lavagem I

Fixe a pega oCheck®

Lave a(s) microplaca(s) PapilloCheck® em solução de lavagem I à temperatura ambiente durante 10 segundos

Lave a(s) microplaca(s) PapilloCheck® em solução de lavagem II pré-aquecida em banho-maria a 50 °C durante 60 segundos

Lave a(s) microplaca(s) PapilloCheck® em solução de lavagem III à temperatura ambiente durante 10 segundos

Retire qualquer líquido da superfície da microplaca PapilloCheck® através de centrifugação

3 minutos500 g

1 minutovelocidade

máx.

ou

Faça o varrimento da(s) microplaca(s) PapilloCheck® com o CheckScanner

Faça o varrimento e a análise conforme descrito no Guia do Utilizador do CheckReport Software

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Hibrid. e Lavagem

Sala 3

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