Identifizierung und erste Charakterisierung einer neuen Triacylglyceridlipase-Familie aus Arabidopsis thaliana

Dissertation

Zur Erlangung des akademischen Grades

Doctor rerum naturalium (Dr.rer.nat.)

vorgelegt der

Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät (mathematisch-naturwissenschaftlicher Bereich) der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg

von

Frau Martina Körner

geb.: 31.08.1975 in Berlin

Gutachter: 1. Prof. Dr. C. Wasternack 2. Prof. Dr. U. Bornscheuer Halle (Saale), den 09. 11.2005 urn:nbn:de:gbv:3-000009530[http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn=nbn%3Ade%3Agbv%3A3-000009530]

Die Natur ist unerbittlich und unveränderlich und es ist ihr gleichgültig, ob die verborgenen Gründe und Arten ihres Handelns dem Menschen verständlich sind oder nicht

Galileo Galilei, (1564-1642)

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Abkürzungsverzeichnis

A. Arabidopsis Abb. Abbildung APS Ammoniumperoxodisulfat ATP Adenosin-5‘-triphosphat bp Basenpaar bzw. beziehungsweise ca. zirka cDNA komplementäre Desoxyribonukleinsäure C-Terminus Carboxy-Terminus °C Grad (Celsius) d Tag DEPC Diethylpyrocarbonat DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonukleinsäure DTT Dithiothreitol EDTA Ethylendiamintetraessigsäure g Erdbeschleunigung h Stunde HPLC Hochleistungs- Flüssigchromatographie 13-H(P)ODE (13S,9Z,11E)-13-Hydro(pero)xy-9,11-oktadecadiensäure IPTG Isopropyl-ß-thiogalaktopyranosid kDa Kilodalton l Liter min Minute ml Milliliter µg Mikrogramm µl Mikroliter mRNA messenger- Ribonukleinsäure N2 Stickstoff ng Nanogramm nm Nanometer N-Terminus Amino-Terminus OD optische Dichte bezogen auf 1 cm Küvettenbreite PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese PCI Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol PCR Polymerase-Ketten-Reaktion pH negativer dekadischer Logarithmus der Protonenkonzentration pmol Picomol PVP Polyvinylpyrrolidon RNA Ribonukleinsäure RNAi interference-Ribonukleinsäure SDS Natriumdodecylsulfat Tab. Tabelle TAE Tris-Acetat-EDTA TAG Triacylglycerin TBE Tris-Borat-EDTA TCA Trichloressigsäure TEMED N,N,N‘,N‘-Tetramethylendiamin Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan U unit; Einheit der Enzymaktivität [µmol/min] u.U. unter Umständen UV ultraviolett v/v Volumen pro Volumen Vol. Volumen w/v Masse pro Volumen z.B. zum Beispiel

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ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS.............................................................................................................. 3

EINLEITUNG ............................................................................................................................................ 6

1 Triacylglyceridlipasen ........................................................................................... 7 2 Isolierung und Charakterisierung von TGLs ......................................................... 7 3 Substratspezifität von TGLs.................................................................................. 9 4 Physiologische Bedeutung der TGL beim TAG-Katabolismus ........................... 10 5 Physiologische Bedeutung der TGL bei der TAG-Synthese............................... 12 6 Aufgabenstellung dieser Arbeit ........................................................................... 14

MATERIAL UND METHODEN............................................................................................................ 15

1 Chemikalien ........................................................................................................ 15 2 Molekularbiologische Reagenzien ...................................................................... 15 3 Pflanzen.............................................................................................................. 15 3.1 Pflanzenmedien .................................................................................................. 16 3.2 Kultivierung von Arabidopsis thaliana ................................................................. 17 3.3 Kultivierung von Cucumis sativus ....................................................................... 18 3.4 Pflanzentransformation mittels Agrobacterium tumefaciens............................... 18 3.5 Transiente Pflanzentransformation..................................................................... 18 4 Bakterien............................................................................................................. 19 4.1 Kultivierung von Escherichia coli ........................................................................ 19 4.2 Hefen .................................................................................................................. 21 4.3 Klonierungsvektoren ........................................................................................... 22 4.4 Oligonukleotide ................................................................................................... 23 4.5 Nukleinsäureanalysen ........................................................................................ 23 4.6 Proteinanalysen .................................................................................................. 29 4.7 Analyse der enzymatischen Aktivität der Lipase ................................................ 31 4.8 Fettsäureanalyse in Samen und Keimlingen ...................................................... 34

ERGEBNISSE .......................................................................................................................................... 35

1 Identifizierung von putativen TGL aus Arabidopsis thaliana ............................... 35 1.1 Analyse der Expressionsmuster von 33 TGL-Kandidaten .................................. 36 2 Identifizierung einer neuen putativen TGL-Familie ............................................. 38 2.1 Die spezifische Expression der AtTGL–Familie.................................................. 43 3 Enzymatische Aktivität der TGL-Kandidaten ...................................................... 47 3.1 Expression von AtTGL 1 und 2 in E. coli ............................................................ 47 3.2 Expression von AtTGL 1 und 2 in S. cerevisiae ................................................. 51 3.3 Analyse der intrazellulären Lokatisation von AtTGL 1 ........................................ 52 4 Charakterisierung der AtTGL 1 antisense Pflanzen ........................................... 54

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4.1 Expressionsstärke der AtTGL 1 und 2 in den AtTGL 1 antisense Pflanzen ....... 54 4.2 Expressionsstärke von AtTGL 3 - 9 in den AtTGL 1 antisense-Pflanzen ........... 55 4.3 Keimung der AtTGL 1 antisense-Pflanzen ......................................................... 57 4.4 Saatgut und Schotenbildung der AtTGL 1 antisense-Pflanzen .......................... 65 4.5 Einfluss der AtTGL 1 und 2 auf die Fettsäurezusammensetzung in den Samen 67 4.6 Partielle Charakterisierung von AtTGL 1 – Deletionsmutanten .......................... 69

DISKUSSION ........................................................................................................................................... 72

ZUSAMMENFASSUNG.......................................................................................................................... 83

LITERATURVERZEICHNIS ................................................................................................................ 84

ANHANG .................................................................................................................................................. 89