identificacion restos oseos pablo

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LA IDENTIFICACION GENÉTICA DE RESTOS CADAVÉRICOS

Pablo Martín Martín

Instituto Nacional de Toxicología y Ciencias ForensesDepartamento de Madrid

ÍNDICE: 1. INTRODUCCIÓN.–2. PRINCIPALES ÁREAS DE APLICACIÓN DE LA IDENTIFICACIÓN GENÉTICA: 2.1 IDENTIFICACIÓN GENÉTICA DE RESTOS CADAVÉRICOS. 2.2 IBP CUANDO EL PRESUNTO PADRE HA FALLECIDO. 2.3 IDENTIFICACIÓN DE RES-TOS FETALES. 2.4 ANÁLISIS DE ADN DE RESTOS ANTIGUOS. 2.5 IDENTIFICACIÓN DE VÍCTIMAS DE CONFLICTOS BÉLICOS.–3. METODOLOGÍA DEL ANÁLISIS: 3.1 PROCESOS DESTRUCTORES DEL CADÁVER Y SELECCIÓN DE LA MUESTRA. 3.2 EXTRACCIÓN DEL ADN. 3.3 CONTROLES DE CALIDAD: CUANTIFICACIÓN DE ADN HUMANO. 3.4 AMPLIFICACIÓN GÉNICA. 3.5 POLIMORFISMOS ANALIZADOS: 3.5.1 ADN nuclear (autosómico y de cromosoma Y). 3.5.2 ADN mitocondrial.–4. PROBLEMÁTICA ASOCIADA AL ANÁLISIS: 4.1 CANTIDAD Y CALIDAD DEL ADN DE RESTOS ANTIGUOS. 4.2 DAÑOS MOLECULARES EN EL ADN. 4.3 CONTAMINACIÓN. 4.4 INHIBICIÓN.–5. IDENTIFICACIÓN DE RESTOS CADAVÉRICOS: AÑOS 2002/

2003.–6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. INTRODUCCIÓN

Desde la aparición de las técnicas de amplificación génica (PCR: Polymerase Chain Reaction) hace ya casi 20 años (1,2), se han producido importantes avances en el campo de la Biología Molecular y en concreto en su aplicación en el campo de la Genética Forense que nos permiten en la actualidad abordar y resolver casos cada día más complejos, en concreto en el campo de la identificación genética de restos cadavéricos se han mejorado los procesos desde la recogida y tratamiento de las muestras más idóneas hasta la obtención de perfiles genéticos a partir de estos restos que será el objetivo de nuestro trabajo de identificación.

En la década de los años 80, han sido importantes también, los avan-ces en las técnicas de extracción de ADN a partir de distintos tejidos como restos óseos, tejidos momificados, etc (3,4,5), así como el descu-brimiento de los marcadores genéticos analizados (6,7) y su progresiva

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aplicación de forma cada vez más optimizada , por ejemplo aumentando el número de marcadores que se realizan en una sola reacción de ampli-ficación, así como la tendencia a reducir el tamaño de los productos de la amplificación. A finales de los años 80 se reporta por primera vez (9) la amplificación de ADN proveniente de huesos antiguos y se desarrolla el estudio del ADN mitocondrial, a partir de su secuenciación (10). En las siguientes décadas la unión de los esfuerzos de distintos campos de investigación ha servido para el desarrollo de lo que podríamos denomi-nar una tecnología del ADN antiguo y degradado (11), que es una ver-dadera rama de investigación que da apoyo a su vez a distintos campos científicos.

En definitiva, la identificación genética de restos óseos humanos de distinta antigüedad es una herramienta utilizada por muy diversos campos científicos entre los que cabe destacar la biología evolutiva, la ecología, la antropología, la arqueología, la paleontología o la genética forense.

A lo largo de este tema, revisaremos los principales campos en los que es requerida una identificación: la identificación genética de restos cadavéricos propiamente dicha, es decir, cuando se produce la aparición de un cadáver ó resto cadavérico en que se hace necesaria su identifica-ción genética, la Investigación Biológica de Paternidad (IBP) cuando el presunto padre ha fallecido, la identificación de restos fetales, así como el análisis de restos antiguos por los conocimientos que nos aportan y dedicaremos un apartado especial a la identificación de víctimas de con-flictos bélicos, tanto por el gran número de casos que realizamos como por la gran diversidad de estrategias que utilizamos en su resolución.

A continuación veremos como estamos supeditados para la obtención de la muestra más adecuada al estado de los restos cadavéricos, por lo tanto hablaremos de la selección de las muestras y de las herramientas que se utilizan para abordar este tipo de análisis: las principales técnicas de extracción de ADN, la amplificación génica, así como los polimorfis-mos genéticos estudiados y los controles de calidad que se realizan a lo largo del proceso

Revisaremos por último la problemática más frecuente de este tipo de análisis que viene determinada fundamentalmente por los daños mole-culares que se producen en el ADN como consecuencia de la muerte celular así como los fenómenos de contaminación y la inhibición.

PABLO MARTÍN MARTÍN

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2. PRINCIPALES ÁREAS DE APLICACIÓN DE LA IDENTIFICACIÓN GENÉTICA

En la actualidad y gracias a la mejora de las técnicas usadas en el laboratorio, así como la mayor experiencia y formación en la resolución de este tipo de casos, es posible abordar con mayores garantías de éxito los casos de identificación genética y cada vez es menor el porcentaje de casos en el ámbito forense que se quedan sin resolver. A comienzos de los años 90 aparecen publicados los primeros casos de identificaciones genéticas de individuos a partir de restos óseos (12,13), el Instituto de Toxicología resuelve los primeros casos de identificación de individuos por ADN en el año 1994 (14).

A continuación presentamos algunas de las áreas de aplicación en la identificación genética de restos cadavéricos centrándonos fundamental-mente en las más relevantes por el número de casos que se realizan.

2.1 Identificación Genética de Restos Cadavéricos

Cuando se produce la aparición de un cadáver o restos cadavéricos cuya identidad se sospecha (por circunstancias tales como tiempo y lugar de la desaparición, estado del cadáver, rasgos morfológicos, objetos per-sonales, etc.) pero no se pueda establecer con total seguridad por méto-dos tradicionales (antropológicos, odontológicos, etc.), se puede recurrir a un estudio genético como complemento ó como única vía posible de identificación.

Los cadáveres de los que no haya sospechas sobre quién se trata deben ser igualmente analizados y sus perfiles genéticos deben ser almacenados en una base de datos anónima que permita su comparación con muestras de referencia de personas que tengan familiares desaparecidos. Estas bases de datos deberían ser únicas y coordinadas por algún organismo capaz de centralizar los datos. No obstante, en países como el nuestro el número de cadáveres que quedan sin identificar es muy escaso.

Los casos en los que es necesario recurrir a una identificación gené-tica, presentan una mayor o menor complejidad en función de las mues-tras cadavéricas de que se disponga para realizar la investigación, así como por la disponibilidad de muestras de referencia para poder identi-ficar los restos, estas dos circunstancias nos harán decidirnos por una u otra estrategia de resolución.

Como consecuencia de la gran variedad de situaciones con las que nos podemos encontrar, vamos a tratar de ordenar ó clasificar los casos que pueden ser resueltos primero en función del tipo de muestra que


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debemos analizar, segundo en función del análisis comparativo y tercero en función del tipo de caso.

A. Atendiendo al estado de conservación de la muestra, los casos más típicos son:

• Restos cadavéricos en buen estado de conservación. En estos casos en los que la recogida de muestras se realiza inmediatamente después de la muerte, las muestras más adecuadas son sangre y/o músculo. La obtención de ADN en buen estado de conservación de estas muestras no suele representar un problema. Un grupo muy importante de casos que se englobarían en este primer apartado son los restos cadavéricos carbo-nizados. En los casos en los que se producen víctimas carbonizadas, el ADN es muy estable a las altas temperaturas a las que se ve sometido y en general es posible obtener ADN de alta calidad de aquellos tejidos que no hayan sido destruidos incluso para realizar el estudio por VNTRs.

• Restos cadavéricos con un avanzado estado de putrefacción ó esqueletizados. Se trata de restos en los que la toma de muestras se realiza después de un periodo de tiempo largo tras la muerte, en este caso las muestras más adecuadas son piezas dentales ó huesos largos. Son los casos que entrañan mayor dificultad en cuanto a la obtención y el análisis del ADN.

• Restos cadavéricos embalsamados. Normalmente son los casos que entrañan la mayor dificultad puesto que lo más común es que la conservación del cadáver se realice mediante formol ó derivados y está demostrado que el formol produce grandes modificaciones de los áci-dos nucleicos, de tal forma que incluso es posible la no obtención de resultados de amplificación. Varía en función de las concentraciones y cantidades usadas, del tiempo que transcurra desde la muerte hasta el embalsamamiento, y del tiempo en que la muestra esté en contacto con el formol. Lo mismo ocurre cuando se trata de muestras conservadas en formol (biopsias) para realizar estudios anátomo-patológicos.

• Restos cadavéricos momificados. En ciertos cadáveres se producen fenómenos naturales de momificación como consecuencia de la rápida evaporación del agua del cuerpo, con lo que se detiene el desarrollo de microorganismos y por tanto la putrefacción y por tanto el material genético de los tejidos blandos momificados se preserva en condiciones que permiten su análisis, que en condiciones habituales no sería posible debido a los procesos destructivos del cadáver. Se trata de fenómenos excepcionales de preservación cadavérica que no son frecuentes en nuestra casuística.


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B. Atendiendo al tipo de análisis genético comparativo, según las muestras de referencia:

• Identificación a través de una IBP directa: como muestras de refe-rencia utilizaremos a sus hijos biológicos. En la experiencia de nuestro centro, aproximadamente un 20% de los casos de identificación se resol-vieron mediante esta estrategia.

• Identificación a través de una IBP reversa: como muestras de refe-rencia utilizaremos a sus progenitores. Un 60% de los casos son resueltos a través de una maternidad, de una paternidad ó de una paternidad/maternidad.

En determinados casos no disponemos de ascendientes ó descen-dientes directos del individuo a identificar, cuando esto sucede es posible el estudio de otros familiares como hermanos u otros parientes, depen-diendo de los familiares de que dispongamos, podemos utilizar otras dos estrategias de estudio:

• Identificación a través del ADN mitocondrial: como muestras de referencia utilizaremos a parientes que compartan la línea materna.

• Identificación a través del ADN de cromosoma Y: como muestras de referencia utilizaremos a parientes que compartan la línea paterna. Aproximadamente un 18-20% de los casos de identificación se resolvie-ron mediante alguna de estas estrategias.

• Identificación a través de muestras biológicas del individuo falleci-do, que hayan sido obtenidas antes de su muerte.

C. Atendiendo al tipo de caso.

Más que una clasificación de lo que se trata es de mostrar la enor-me variedad de situaciones con las que nos podemos encontrar que dependerán de los antecedentes ó circunstancias que han provocado la identificación:

• Identificación de personas desaparecidas: en este apartado se pueden agrupar una gran variedad de casos, como personas que des-aparecen de forma accidental, personas víctimas de hechos criminales, personas víctimas de conflictos bélicos ó políticos, etc.

• Identificación de personas víctimas de accidentes. Se trata de un grupo con una gran variedad de situaciones como accidentes de tráfico, domésticos, grandes catástrofes, etc.

A veces no se puede diferenciar si la muerte es accidental ó intencio-nada, así como es complejo conocer en ciertas situaciones las circunstan-cias que han motivado la muerte.


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La antigüedad y condiciones de conservación de los restos suelen ser muy variables, por ejemplo, si se trata de identificar a personas falleci-das en accidentes de tráfico, las muestras normalmente tienen una anti-güedad que oscila entre unas horas y varios días; en otro tipo de casos como por ejemplo cuando se trata de una persona desaparecida, la data puede oscilar desde días hasta varios años. Conocer la antigüedad y las condiciones de conservación de los restos es un dato valioso para el investigador que realiza la identificación.

2.2 Investigación biológica de la paternidad cuando el presunto padre ha fallecido

En casos en los que existe una reclamación de filiación y el supuesto padre ha fallecido, se presentan diversas estrategias de análisis para res-ponder a la pregunta de la filiación:

A. Proceder a la exhumación del cadáver.

B. Recurrir a familiares vivos del supuesto padre, para intentar deducir su patrimonio genético.

C. Utilizar muestras biológicas del individuo fallecido, que hayan sido obtenidas antes de su muerte.

En nuestro centro se analizaron en los dos últimos años un total de 54 casos de paternidad cuando el presunto padre ha fallecido, de los cuales en 17 se realizó un preinforme y se custodió la muestra del padre. En 37 casos se realizó el análisis completo. En todos los casos de inclusión la probabilidad de paternidad superó el 99,8% aunque se hicieran los análisis en ausencia de la madre, debido al alto número de marcadores analizados y por tanto al alto poder de discriminación combinado.

De las muestras procedentes de los padres fallecidos, las que se usa-ron para el análisis fueron: un 53% sangres ó músculos, un 23% restos óseos, un 13% piezas dentales y un 9% otro tipo de muestras entre las que cabe destacar muestras recibidas de centros hospitalarios. Como vimos en el área de las identificaciones, en el caso de las paternidades de padres fallecidos el porcentaje de restos óseos y piezas dentales es muy importante, en este caso es el 36% del total.


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2.3 Identificación de restos fetales

Resolución de casos de abortos ó infanticidios a través de una IBP reversa.

2.4 Análisis de ADN de restos antiguos

El análisis de este tipo de restos tiene un gran interés en el campo forense, como hemos visto en las dos primeras áreas de aplicación, un gran porcentaje de casos son resueltos a través de restos óseos y piezas dentales y son precisamente este tipo de muestras unas de las más uti-lizadas en estudios de restos antiguos. La genética forense ha aplicado técnicas desarrolladas en otros campos como la antropología molecular (15), sobre todo en lo que se refiere a métodos de purificación de ADN y a ciertas medidas para evitar la contaminación .

Nuestro centro ha colaborado en trabajos de investigación con la Universidad Autónoma de Madrid para el estudio de restos humanos antiguos de excavaciones de asentamientos de hace aproximadamente 4000 años. De la misma forma ha participado en proyectos de estudio de muestras antiguas (de más de 1500 años) con gran valor antropológico con la Universidad del País Vasco. Hemos participado en la replicación de algunos resultados obtenidos por otros centros de investigación, que es una de las condiciones indispensable para la aceptación de resultados en este tipo de muestras.

En el estudio de restos antiguos, el análisis de ADN nuclear se encuentra muy restringido, ya que la posibilidad de obtención de resul-tados es mínima como consecuencia de la degradación del ADN, casi todos los estudios se basan en el ADN mitocondrial.

2.5 Identificación de víctimas de conflictos bélicos

La identificación de personas muertas como consecuencia de conflic-tos bélicos requiere una consideración especial. Como ejemplos citar que el Instituto está participando en dos proyectos de identificación de vícti-mas civiles de la guerra de la antigua Yugoslavia a petición del Tribunal Internacional de La Haya, así como en algunos procedimientos abiertos para la identificación de víctimas de la Guerra Civil Española.

Durante 1999 se realizó la identificación de 15 personas proceden-tes de nueve fosas comunes excavadas en Prijedor. Se trataba de restos


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con una antigüedad de aproximadamente 8 años. En todos los casos se partió de restos óseos (12 huesos largos y uno plano) y cuatro muestras de piezas dentales. Los resultados fueron de seis cadáveres identificados mediante IBP reversa, siete cadáveres excluidos de la misma forma, 1 cadáver excluido mediante IBPM reversa y un cadáver sin resultados de tipaje

Durante 2002, 2003 y 2004 se realiza la identificación de restos pro-venientes presumiblemente de 56 personas procedentes de una fosa común cercana a Belgrado que habían sido masacradas e inhumadas en Kosovo, trasladadas y hundidas en camiones en el río Danubio y vueltas a inhumar. En todos los casos se partió de restos óseos. Para realizar el análisis genético comparativo se nos remiten 13 muestras de referencia y cuatro árboles genealógicos que incluyen a 44 personas fallecidas en la matanza. Los resultados fueron la identificación de 32 muestras de varo-nes y 24 de mujeres. De 8 cuerpos había muestras por duplicado y de dos cuerpos por triplicado. Así mismo 16 cuerpos han sido identificados utilizando todo tipo de estrategias de análisis y comparaciones: ADN nuclear (autosómico y de cromosoma Y), ADN mitocondrial, compara-ciones con muestras de referencia y entre los propios restos.

Por último estamos participando en la identificación de cadáveres de la Guerra Civil española, se trata de restos óseos de 20 varones de los que hemos obtenido 30 extractos de ADN de piezas dentales y 6 extractos de ADN de huesos largos. Hasta ahora 3 individuos han sido identificados mediante IBP, y en 15 individuos tenemos una identificación preliminar (ADN mitocondrial y STRs de cromosoma Y) y en 2 cadáveres no han sido analizadas las muestras. Hasta ahora se han excluido a 10 individuos en análisis genéticos comparativos. En estos casos la mayor dificultad es el tiempo transcurrido desde que sucedieron los hechos (cerca de 70 años), lo que condiciona desde el punto de vista del laboratorio el estado de los restos cadavéricos que debemos analizar, y por otro lado origina cierta confusión en lo que respecta a las circunstancias de lo sucedido.

Una vez repasados los posibles campos de aplicación de las técni-cas de amplificación génica en la resolución de casos de identificación, vamos a pasar a ver cómo se realizan y qué problemática plantea este tipo de análisis.

3. METODOLOGÍA DEL ANÁLISIS

A lo largo de este apartado vamos a centrarnos en cómo afectan los procesos destructores en la selección de la muestra, la extracción del


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ADN, y la amplificación génica, y recordaremos los marcadores que más se utilizan en la actualidad así como las técnicas de análisis.

3.1 Procesos destructores del cadáver y selección de la muestra

Inmediatamente después de la muerte se ponen en marcha los proce-sos autolíticos y de putrefacción cadavérica que dan lugar a la completa destrucción de los tejidos blandos. Los procesos destructores del cadáver son fundamentalmente autolíticos y de putrefacción. En los fenómenos de autolisis están implicadas gran número de enzimas, las que producen el mayor daño al ADN son las nucleasas. Los mecanismos de autolisis son diferentes en cada tejido y variables en función de condiciones tanto intra- como extracelulares, como la cantidad de agua, la temperatura, etc.

La putrefacción es un fenómeno de fermentación de la materia orgá-nica mediante procesos de reducción y oxidación como consecuencia de la actuación de los microorganismos. Las bacterias existentes en la flora intestinal son las principales responsables de la putrefacción.

En el proceso de destrucción cadavérica, no sólo intervienen las enzimas de las propias células y los microorganismos, si no que también intervienen algunas especies de insectos y si se trata de cadáveres que permanecen a la intemperie o en el agua actúan otro tipo de animales de orden superior. Bajo determinadas circunstancias es posible que los fenómenos de putrefacción se detengan y se produzcan procesos de conservación cadavérica, entre los que cabe destacar: la momificación, la saponificación y la corificación.

Las muestras que mejor resisten los fenómenos de destrucción cadavéri-ca y por tanto las que mantienen su estructura celular más intacta son por un lado los restos óseos y por otro las piezas dentales, fundamentalmente debi-do a su estructura histológica que proporciona un aislamiento a sus compo-nentes celulares mayor que el que se produce en los tejidos blandos.

En el caso del tejido óseo, éste se compone fundamentalmente de una matriz orgánica calcificada impregnada de sales minerales, con una alta concentración de fibras de colágeno que representa aproximada-mente un 95% del peso de la matriz orgánica del hueso. En cuanto a las sales minerales, éstas se encuentran en forma de fosfato cálcico y de cristales de hidroxiapatita. Esta matriz está recorrida por un sistema de cavidades (lagunas u osteoplastos) que comunican entre sí y que encierran las células óseas (osteocitos) y por los canalículos óseos, una característica interesante es que en los espacios extracelulares apenas hay líquido intersticial, con lo que la cantidad de agua en el tejido óseo


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es muy baja. Las células que componen el tejido óseo son los osteoblas-tos, que al rodearse de la matriz y madurar se denominan osteocitos y los osteoclastos.

En los dientes, la capa de esmalte en la corona y el cemento en la raíz recubren a la dentina que es tejido conectivo especializado que forma la masa principal del diente y presenta una estructura similar a la del hueso. La dentina ofrece protección física a la pulpa que tiene una gran densidad celular. Las células que se encuentran en los distintos tejidos del diente son: los cementoblastos, cementocitos y odontoblastos, así como las células de la pulpa que en ocasiones se preservan de manera excepcional. Todos estos factores explicarían también la razón por la cual el recuperación de ADN es mayor a partir de dientes y diáfisis de hue-sos largos (tejido óseo compacto) que a partir de tejido óseo esponjoso, donde la protección del ADN seria mucho menor.

Por tanto, dependiendo del estado de conservación del cadáver, seleccionaremos sangre ó tejidos blandos si los procesos de putrefacción no se han instaurado y si estos procesos están avanzados las muestras más adecuadas serán los restos óseos y piezas dentales.

3.2 Extracción del ADN

En este tipo de muestras es muy importante la preparación previa antes de proceder a la extracción del ADN, con el fin de evitar la posible contaminación de la muestra con material celular de fuentes exógenas, ya que si se produce cualquier tipo de contaminación celular se detectará en el análisis posterior. La preparación de la muestra consiste básicamen-te en la limpieza de las superficies externas y las internas en el caso de huesos largos: los métodos de limpieza más habituales son el limado de superficies y los lavados.

El método de extracción más utilizado consiste en una digestión proteica, seguida de una extracción orgánica del ADN mediante fenol-cloroformo-isoamílico y un lavado, purificación y concentración del ADN mediante membranas que retienen el ADN de un determinado tamaño. En determinadas ocasiones este tipo de extractos deben ser purificados por otros métodos porque mediante el método expuesto se coextraen inhibidores que no permiten la obtención de resultados de amplificación como veremos con posterioridad. Los métodos más usados son los basa-dos en la purificación mediante membranas de sílica, con los que a veces conseguimos eliminar los posibles inhibidores sin perder ADN.


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3.3 Cuantificación del ADN

Una vez aislado el ADN, tenemos que realizar una serie de controles de calidad, que nos permiten por un lado evaluar la presencia de ADN total y su estado de degradación en el extracto de ADN obtenido, para ello se realiza una electroforesis submarina en gel de agarosa y posterior tinción con bromuro de etidio y por otro lado necesitamos conocer la cantidad de ADN humano , ya que normalmente, al mismo tiempo que extraemos ADN humano se extrae también ADN de microorganismos.

Hay varios métodos de cuantificación, en nuestro centro hasta ahora se ha realizado mediante una técnica basada en la hibridación de una sonda específica de primates superiores con las muestras de ADN y una posterior detección de una señal de emisión quimioluminiscente que será comparada con otras señales de cantidad conocida, así mediante una comparación de intensidades se establece la cantidad aproximada de ADN humano.

Actualmente la cuantificación se realiza mediante una reacción de PCR cuantitativa a tiempo real, mediante el uso de primers y sondas específicas que no solo nos van a dar una cantidad exacta del ADN humano de que disponemos en cada muestra, si no que además nos determina el sexo de la muestra puesto que se amplifica una zona del gen del la Amelogenina, así como nos puede indicar el estado de degra-dación del ADN si lo que analizamos es el ADN mitocondrial, puesto que se han diseñado dos zonas específicas con una longitud de unas 100 y 300 pares de bases (16,17)

La problemática asociada a este tipo de controles fundamentalmente viene asociada a la extracción de ADN procedente fundamentalmente de microorganismos ya que en el minigel nos enmascara el estado de degradación del ADN humano y lo mismo ocurre en la detección de ADN humano, ya que la gran cantidad de ADN proveniente de los micro-organismos puede interferir en la cuantificación.

3.4 Amplificación génica

Una vez que hemos extraído el ADN de las muestras procedemos a su análisis mediante técnicas de amplificación génica, que nos va a per-mitir la obtención de grandes cantidades de las regiones específicas de ADN que nos interesa estudiar. La técnica de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), es un método automatizado de síntesis enzimática in vitro de secuencias de ADN, la especificidad de la reacción se consigue


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usando un par de pequeños segmentos de ADN (de 15 a 30 pares de bases) que son complementarios a las secuencias que rodean al segmen-to de ADN que se desea amplificar y que actuarán como iniciadores ó cebadores de la replicación.

El método de la reacción en cadena de la polimerasa se basa en la repetición de un ciclo de tres etapas, cada una de las cuales se realiza a una temperatura determinada. En la primera etapa (desnaturalización), la doble cadena de ADN se desnaturaliza como consecuencia de apli-car una alta temperatura (92-95 ºC), en la segunda etapa (anillamiento) se reduce la temperatura para permitir la unión de los cebadores a las secuencias homólogas del ADN genómico monocatenario y en la tercera etapa (extensión), tiene lugar la síntesis de la región que flanquean los cebadores gracias al ajuste de la temperatura óptima de la ADN polime-rasa que se utilice.

Cuando amplificamos ADN de restos antiguos es muy probable que se produzcan fallos en la amplificación, es frecuente que cuando disponemos de un número pequeño de copias de ADN y el ADN se encuentra muy fragmentado se produzcan fenómenos de anillamientos inespecíficos entre las cadenas de ADN, así como con los primers que darán errores en la repli-cación y es posible que se amplifiquen fragmentos inespecíficos además de los propios que se amplifican de los fragmentos intactos de ADN.

Una vez concluida la amplificación debemos evaluar si los fragmentos de ADN se han amplificado con eficiencia, para ello se realiza una elec-troforesis submarina en gel de agarosa y posterior tinción con bromuro de etidio.

3.5 Polimorfismos analizados

Los polimorfismos más utilizados en este momento en los laborato-rios de genética forense son los STRs tetraméricos de autosomas y de cromosoma Y, ambos forman parte de ADN nuclear. Por otro lado se estudia el ADN mitocondrial, concretamente la región más estudiada es la conocida como región de control del ADN mitocondrial.

3.5.1 Evolución del estudio de amplificación de STRs y caracterización de productos

Los STRs son regiones de ADN repetitivo que se encuentran repartidas a lo largo de todo el genoma, existiendo, como media, un microsatélite


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cada 5000-10000 pares de bases y están compuestos por una secuencia de 2-7 pares de bases que se repite en tandem. Un gran número de estas regiones STR presenta un alto grado de polimorfismo genético de lon-gitud cuya base molecular es la variación en el número de unidades de repetición. El alto grado de polimorfismo de algunas de estas pequeñas regiones del genoma (100-400 pares de bases), la posibilidad de analizar-los mediante técnicas de muy alta sensibilidad (PCR) (incluso a partir de muestras antiguas que contienen ADN en un avanzado estado de degra-dación) y la posibilidad de realizar un tipaje genético de alta resolución que permite una asignación inequívoca de los alelos, son las razones fundamentales que han convertido a estos marcadores genéticos en los más utilizados en la actualidad en el campo de la genética forense.

La amplificación y caracterización de los STRs ha seguido una evolu-ción paralela, cuando se comenzó a usar la técnica de la PCR, se anali-zaban de forma individual con reacciones simples de amplificación y del mismo modo su caracterización se realizaba de forma individual en geles de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes y tinción con nitrato de plata. Con posterioridad, se amplificaban en reacciones múltiples STRs que no solapasen en tamaño (2, 3 ó 4 loci simultáneamente) debido a que la caracterización se realizaba de la misma forma. Actualmente, se amplifican hasta 16 loci en la misma reacción, gracias al marcaje de uno de los primers en el extremo 5’ con fluorocromos, lo que nos permite mezclar en la reacción de amplificación y caracterizar STRs que tengan el mismo tamaño, puesto que los que coinciden se marcan con fluoro-cromos que emiten a distinta longitud de onda y por tanto se detectan con un color distinto. Esta tecnología permite que la caracterización de productos se realice mediante un análisis automatizado que convierte en alelos los picos que detecta en función de su movilidad asignándoles un tamaño, gracias a la incorporación de un estándar interno con fragmen-tos de longitud conocida.

En cuanto a los STRs de cromosoma Y, en la actualidad se realiza una amplificación simultánea de 12 STRs, con lo que se ha aumentado de una forma considerable el poder de discriminación de la técnica al contar con un número considerable de marcadores, son muy útiles en la resolución de casos en los que únicamente se dispone de parientes por vía paterna como muestras de referencia, debido a su herencia paterna.

Se muestra a continuación una lista de las reacciones de amplificación múltiples más usadas en la actualidad:

– Identifiler: Amelogenina, D8S1179, D21S11, D18S51, TH01, TPOX, CSF1PO, D3S1358, VWA, FGA, D5S818, D13S317, D16S539, D7S820, D2S1338 y D19S433


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– Power Plex 16: Amelogenina, D8S1179, D21S11, D18S51, TH01, TPOX, CSF1PO, D3S1358, VWA, FGA, D5S818, D13S317, D16S539, D7S820, Penta E y Penta D

– Power Plex Y: DYS391, DYS389I, DYS439, DYS389II, DYS438, DYS437, DYS19, DYS392, DYS393, DYS390 y DYS385a/b

La determinación de sexo se realiza en todas las muestras que se analizan amplificando una corta secuencia del gen de la amelogenina que en el cromosoma X tiene una longitud de 106 pares de bases y en el cromosoma Y de 112 pares de bases.

3.5.2 Evolución del estudio de amplificación del ADN mitocondrial y estudios de secuenciación de productos

Muchos casos de identificación genética de restos cadavéricos sólo se pueden resolver mediante el análisis de pequeños fragmentos del geno-ma mitocondrial, ya que en ocasiones se trata del único ADN que puede recuperarse de forma reproducible de un gran número restos humanos. Esto se debe fundamentalmente a que el ADN mitocondrial (ADNmt) es un genoma circular pequeño (16559 pb) que, en contraposición al geno-ma nuclear, se encuentra en un gran número de copias (100 –1000 copias por célula) y que debido a su compartimentación dentro de la célula y a su propia estructura circular podría estar mas protegido de la acción destructiva de las nucleasas. Tiene algunas características que lo hacen especialmente útil en la resolución de ciertos casos: su herencia exclu-sivamente materna hace del ADNmt un marcador ideal para estudios en los que sólo se disponga de la línea materna. Se usa fundamentalmente la región no codificante de aproximadamente 1100 pb conocida como región de control que contiene el origen de replicación de la cadena pesada y los dos promotores de trascripción y donde se localizan dos subregiones de aproximadamente 400 pb cada una (regiones hipervaria-bles I y II: HVI y HV2) que presentan una alta tasa de mutación y, por tanto, una gran variabilidad de secuencia entre los individuos.

4. PROBLEMÁTICA ASOCIADA AL ANÁLISIS

En general en el análisis del ADN proveniente de restos antiguos los mayores problemas con los que nos vamos a enfrentar son: la degrada-ción, las cantidades límites del ADN que se extrae, la contaminación con ADN moderno y las sustancias inhibidoras que pueden ser co-extraídas


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con el ADN. Uno de los problemas fundamentales de la investigación del ADN antiguo es poder demostrar la autenticidad de los perfiles genéticos que se generan en este tipo de estudios. La posibilidad de obtener resul-tados que nada tienen que ver con el vestigio arqueológico en estudio (cuyo ADN se encuentra degradado y dañado molecularmente) y, por el contrario, obtener resultados a partir de pequeñas trazas de un ADN moderno que contamina nuestra muestra es una situación más frecuente de lo que en un principio se pensó.

4.1 Cantidad y calidad del ADN de restos antiguos

Aunque los ácidos nucleicos preservan su estructura durante cierto tiempo, en general a partir de restos antiguos el material genético que se obtiene se encuentra bastante deteriorado y presenta distintos grados de degradación y modificación. Las cantidades de ADN humano obtenidas suelen ser muy pequeñas (del orden de subnanogramos), en cambio se extraen altas concentraciones de ADN total (del orden de picogramos). Normalmente, el ADN proveniente de los microorganismos suele superar más del 90% del ADN total (12).

Si nos referimos a la calidad, en muchos restos biológicos, especial-mente si la muestra es antigua, el ADN se encuentra degradado y como consecuencia es muy frecuente que sólo sea posible la extracción de fragmentos muy pequeños (menores de 500 bases) de ADN. El grado de degradación del ADN va a limitar la obtención de resultados; en general los marcadores genéticos de mayor tamaño se amplificarán con menor eficiencia que los más pequeños, incluso en ocasiones, debido a la falta de templado de una determinada longitud, no se obtendrán resultados o se producirán fenómenos de pérdidas de alelos que pueden condicionar la fiabilidad de los resultados en estos marcadores. Por lo tanto, una de las características que van a condicionar la eficiencia de amplificación de los STRs es su tamaño.

4.2 Daños moleculares en el ADN

Dependiendo del grado de los daños producidos en el ADN y por tanto de la modificación que haya sufrido, podremos ó no acceder al estudio de ese material genético mediante técnicas de amplificación génica.


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¿Cuáles son los principales factores que causan las modificaciones o daños moleculares en el ADN? Fundamentalmente los agentes oxidantes, las radiaciones (en especial las ultravioletas), la temperatura, la humedad, el pH, los procesos mecánicos (18,19,20), y las enzimas; tanto las proce-dentes de las propias células, como las procedentes de microorganismos, en ambos casos, cabe destacar a las nucleasas.

En el material genético se están produciendo de manera continua daños que principalmente afectan a los enlaces entre las bases nitrogena-das y los azúcares y a los enlaces fosfodiéster internucleotídicos, pero al mismo tiempo actúan los mecanismos correctores, después de la muerte estos efectos correctores se detienen.

Los principales cambios ó modificaciones que se producen en la estructura del ADN son cambios que afectan a los enlaces químicos y son debidos fundamentalmente a fenómenos de hidrólisis y fenómenos oxidativos, éstos últimos afectan en especial a las bases derivadas de la pirimidina (timina y citosina) (21,22). Los fenómenos de hidrólisis y las oxidaciones lo que provocan son roturas de enlaces, que nos conducen en líneas generales a la fragmentación de la cadena nucleotídica y por tanto a la degradación del ADN.

Un fenómeno importante que tiene gran importancia en este tipo de material genético es la aparición de uniones inespecíficas entre cadenas de ADN (cross-linking), que pueden llegar a formar estructuras com-plejas por condensación de esas dobles cadenas de ADN y afectan a la amplificación génica. Las radiaciones de la luz ultravioleta provocan la formación de dímeros de pirimidina.

Las modificaciones de las bases nitrogenadas son un hecho común en el ADN, como mínimo 1 de cada 10 pirimidinas se encuentra modificada (21) y por último apuntar que las principales enzimas que degradan el ADN son las nucleasas tanto del propio organismo como las procedentes de microorganismos.

Todos estos daños en el ADN, van a dar lugar a que en último tér-mino nos encontremos con un ADN muy degradado; la mayoría de los fragmentos tendrá un tamaño de 100-200 pb, aunque algunas moléculas pueden alcanzar tamaños de hasta 1000-2000 pb y éstos serán las que nos permitan la obtención de resultados para los marcadores STRs que analizamos en la actualidad, y que no superan los 350 pb de longitud.


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4.3 Contaminación

En todas las muestras de restos cadavéricos va a haber contaminación producida por microorganismos, debido a ella además de extraer el ADN humano correspondiente a la muestra se co-extrae ADN proveniente de microorganismos y en general en unas cantidades mucho mayores que las de ADN humano. Esta contaminación puede tener efectos negativos en el análisis en el sentido de enmascarar la cantidad y calidad de ADN humano y en la amplificación de algunos marcadores pueden aparecer productos inespecíficos. En los STR que se utilizan en este momento se ha realizado un estudio previo de especificidad frente a templados bacte-rianos obteniéndose resultados negativos en todos los marcadores y para todos los microorganismos probados (23,24).

Uno de los mayores problemas al que nos enfrentamos cuando estu-diamos restos antiguos mediante técnicas de amplificación génica es la contaminación con ADN humano exógeno. Si la muestra a analizar pre-senta cantidades límites de ADN (del orden de subnanogramos) o este ADN se encuentra en un avanzado estado de degradación, lo que es muy frecuente cuando trabajamos con restos cadavéricos, una contaminación con ADN moderno exógeno por muy pequeña que ésta sea, puede traer graves consecuencias en el análisis.

La contaminación que se puede considerar como más grave de las descritas pues, es la producida por ADN humano y moderno, en primer lugar porque no puede diferenciarse del ADN antiguo y en segundo lugar porque al tratarse de ADN moderno y en buen estado, se amplifica con mayor eficiencia.

La contaminación puede producirse tanto en el laboratorio como antes de que las muestras lleguen a él. A continuación se exponen una serie de recomendaciones para evitar la contaminación durante el proce-so de análisis en el laboratorio:

• Separación de las áreas de trabajo dedicadas a:

– Toma y preparación de muestras

– Extracción de ADN

– Amplificación génica

– Detección de los productos de amplificación

• Los procesos de extracción y amplificación deben realizarse en campanas de seguridad biológica con flujo laminar provistas de luz ultravioleta, utilizando material y reactivos estériles. Es necesario el uso de puntas de pipeta estériles con filtro y que las pipetas sean específicas


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para cada proceso. Los operarios deben ir provistos de guantes, masca-rilla y bata desechables.

• Los reactivos utilizados en la extracción deben ser preparados en condiciones de esterilidad y deben estar separados de los reactivos utili-zados en la amplificación.

• Separación obligatoria del análisis de las muestras dubitadas y las muestras de referencia, así como sus extractos y en la medida de lo posi-ble deben estar separados en función de la cantidad de ADN .

Por otro lado deben establecerse una serie de medidas de monitori-zación de la contaminación, entre las que destacaremos:

• Es obligatorio el uso de controles negativos en los procesos de extracción y amplificación. Se deben usar controles positivos de amplifi-cación para controlar el correcto funcionamiento de la reacción.

• Debemos conocer los perfiles genéticos de todo el personal de laboratorio para los marcadores que se analizan.

• En caso de muestras con cantidades mínimas de ADN (con menos de 100 picogramos), los análisis deben ser realizados al menos por dupli-cado y por dos operarios distintos.

A pesar de las medidas que se establecen con el fin de evitar la con-taminación, en ocasiones ésta se produce y en nuestra experiencia suele ocurrir que es el operador que manipula la muestra en los procesos de preparación y extracción el que más posibilidades tiene de contaminarla. Cuando el extracto de ADN está contaminado, es posible detectar sola-mente el perfil genético de la persona que ha contaminado la muestra ó detectarlo en mezcla con el perfil propio de la muestra, en ambos casos la solución es la repetición de la extracción. Esto no suele representar un problema si estamos trabajando con restos óseos puesto que suele haber bastante material de partida, en cambio si trabajamos con un número limitado de piezas dentales se podrían agotar y habría que recurrir a otra muestra si ello fuera posible.

4.4 Inhibición

Debido a la presencia de inhibidores de la polimerasa en el soporte o en la propia muestra que no conseguimos eliminar en el proceso de extracción, es posible la no obtención de resultados de amplificación.

En las muestras de restos antiguos es frecuente la co-extracción de inhibidores. Se sabe por ejemplo que residuos de porfirinas y el colágeno


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de tipo I actúan como inhibidores de la polimerasa, así como algunos componentes del suelo como ácidos húmicos ó fórmicos (25).

La inhibición se puede controlar primero con experimentos específi-cos y una vez establecida la presencia de inhibidores, se pueden tomar medidas para tratar de evitarla, entre las que destacan:

1. Aumentar la cantidad de polimerasa en la reacción de amplifica-ción.

2. Volver a extraer la muestra cambiando el método de extrac-ción; por ejemplo, si se ha realizado una extracción orgánica mediante fenol/cloroformo es posible extraer el ADN mediante resinas quelantes o purificarlo mediante otras técnicas como puede ser la utilización de membranas de sílica que retienen de forma específica los ácidos nuclei-cos y no así los posibles inhibidores, según se describió en el punto de extracción de ADN.

3. Diluir el extracto de ADN si la cantidad que se extrae es sufi-ciente, de tal forma que se diluye el inhibidor hasta que no afecte a la polimerasa.

5. IDENTIFICACIÓN DE RESTOS CADAVÉRICOS: AÑOS 2002/2003

Durante los años 2002 y 2003 se realizaron 126 casos de identifica-ción genética de restos cadavéricos sin incluir los casos de IBP cuando el supuesto padre ha fallecido. En 17 casos se nos encomendó la custo-dia de la muestra, en 38 casos únicamente se realizó un preinforme, es decir se procedió a la extracción de la muestra y a comprobar que se obtenían resultados de amplificación, en los otros 71 casos se realizó la identificación genética completa de los restos. El 93% de los casos fueron identificaciones positivas y sólo un 7% resultaron exclusiones. Más de un 60% de los casos fueron resueltos utilizando STR autosómicos y en aproximadamente un 40% de los casos hubo que recurrir al estudio de ADN mitocondrial y/o STR de cromosoma Y, casi siempre determinado por los familiares disponibles para realizar la identificación.

En cuanto a las muestras analizadas, fueron en total casi 200 muestras dubitadas y unas 70 de referencia. Las muestras más comunes fueron las de restos óseos y dientes que superaron el 55% del total, las muestras de tejidos blandos (fundamentalmente músculo esquelético), y fluidos (sobre todo sangre), rondaron el 40%, el 5% restante fue de otro tipo de muestras como biopsias, útiles personales de la persona fallecida, etc. La muestra depende como ya se ha comentado del estado en que aparece


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el cadáver que normalmente es un factor determinante; más de un 30% de los cadáveres aparecieron en fase de esqueletización, un 25% fueron cadáveres carbonizados, un 17% eran cadáveres en buen estado de con-servación, un 12% eran cadáveres en estado de putrefacción y en otro 12% de los casos se desconoce cómo se encontraban los restos.

El tipo de investigación, así como la situación del cadáver fuero muy variables, las muertes abarcan todas las posibilidades. Muertes acciden-tales ó intencionadas y cadáveres enterrados, a la intemperie, dentro de vehículos, edificios, sumergidos, y un porcentaje muy importante de ori-gen no especificado y por tanto desconocido para el laboratorio.

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identificacion restos oseos pablo

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