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IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS MEDIANTE
ESPECTROMETRÍA DE MASAS.
ANÁLISIS BIONFORMÁTICO
Mª Luisa Hernáez
ESTRATEGIAS PROTEÓMICAS
Proteómica TradicionalEscuela Europea
en gel
Proteómica ¨Shotgun¨Escuela Americana
En solución
–Separación de Proteínas (1D-2D)
–Digestión de cada proteína
–MS y MS/MS
–Digestión de las proteínas
–Separación cromatográfica de péptidos
–LC-MS/MS
Muestras complejas. Extractos proteicos: proteomas, subproteomas...
Espectrometría de masas
MALDI-TOF
Matrix-assisted laser desortion-ionization (MALDI).
Time of flight (TOF).
Identificación de proteínas mediante
huella peptídica (MS, PMF)
MassAnalysis
peptidesprotein peptides+
+
+
+
++++
IonizationDigestion
m/z
MS
Single Stage Mass Spectrometry
Identificación de proteínas por huellapeptídica
Enzymaticdigestion
In-silicodigestion
Protein Peptides840.6950861676.960631498.82831045.5642171.967066861.107346842.514581456.727405863.268365
Mass spectrumPeaklist
…MAIILAGGHSVRFGPKAFAEVNGETFYSRVITLESTNMFNEIIISTNAQLATQFKYPNVVIDDENHNDKGPLAGIYTIMKQHPEEELFFVVSVDTPMITGKAVSTLYQFLV …
- MAIILAGGHSVR- FGPK- AFAEVNGETFYSR- VITLESTNMFNEIIISTNAQLATQFK- YPNVVIDDENHNDK…
Sequence database entry
861.107346838.6950861676.960631498.82831045.5642171.967066842.514581457.827405863.268453
Theoretical peaklist
Theoretical proteolytic peptides
MatchResult:
ranked list of protein candidates
699.0 1459.4 2219.8 2980.2 3740.6 4501.0
Mass (m/z)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% I
nten
sity
1243.6374
1096.5587
1016.4729
1743.8941
1236.2092
1516.72922877.4563
877.02261264.6347 3072.5583
2200.1761716.38223229.66131079.5393 1843.8121 2520.2926
804.3498 2860.98972134.09591566.7863
Separation of proteins by 2-D gel electrophoresis.Excision of protein spots from 2 -D gel
PROTEIN IDENTIFICATION BY MALDI-TOF MS
In-gel trypsin digestionExtraction of peptides mixture
Peptide mass fingerprint byMALDI-TOF Mass Spectrometry
Database searching
Protein identification:triose phosfate isomerase
?
Tratamiento de las manchas proteícas
Destinción
Reducción y alquilación
Deshidratación
Hidratación con tripsina y digestión
Extracción de los péptidos
¿Concentración y limpieza?
Corte del gel
• Evitar contaminaciones• Digerir la proteína eficientemente• Recuperar la mayor cantidad de péptidos• Minimizar las pérdidas por manipulaciones
?
IODOACETAMIDADTT
37ºC O/N
Espectro de MALDIA
bund
anci
a re
lativ
a
Masa (m/z)
1981.84
1982.84
1983.84
No 13C atoms (all 12C)
One 13C atom
Two 13C atoms
“Masa monoisotópica”
Resolución isotópica: Capacidad para separar dos picos quese diferencian en una unidad de masa.
Tolerancia: es la diferencia entre el valor de la masa medidaexperimentalmente y el valor teórico
absoluta (Da) = [M exp-M teórica]
relativa ( %, ppm) = [M exp-M teórica]/ M teórica
Análisis de péptidos trípticos
TRIPSINA: corte muy específico (lisina y arginina)
K-X, R-X excepto K-P, R-P
En proteínas de mamífero el contenido en Arg es 6% y en Lys es un 5%, (cada 100 aminoácidos hay 11 sitios de corte de tripsina)
Tamaño medio de los péptidos trípticos es de 9 aminoácidos: fácil extracción de péptidos del gel.
En este intervalo de masas (800 Da –2000 Da) la resolución es buena
Más restrictivos en la búsqueda para que aumente la puntuación
No hay éxito en la identificación?????
1. Número de péptidos en la huella peptídica es insuficiente para una coincidencia estadística (digestión, glicosilación)
2. Mezcla de proteínas: supresión iónica, HPLC acoplado a MALDI-TOF
3. No está anotada en la base de datos de proteínas
Necesitamos más información
Tandem Mass Spectrometry
Ionization Isolation Fragmentation MassAnalysis
proteinpeptide
fragments
Digestion
peptides++
+
+
++
++ ++
+++
++
++++ +
m/zm/z
MS MS/MS
m/z
Isolation
MS/MS usa 2 analizadores de masa (combinados en un instrumento) para seleccionar un analito (ion) de una mezcla, entonces genera fragmentos del ion aislado para obtener información estructural.
799.0 1441.8 2084.6 2727.4 3370.2 4013.0Mass (m/z)
3.9E+4
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% In
tens
ity4700 Reflector Spec #1[BP = 1101.6, 38875]
1101
.553
7
987.
5242
849.
3844
2140
.083
0
1973
.013
7
929.
4982
1592
.735
4
1115
.620
0
2509
.260
0
1044
.549
6
832.
3645
970.
4844
1224
.587
611
58.5
745
M,a
lf,p
1764
.900
0
tbp 1429
.712
9
2216
.106
9
1514
.734
1
2096
.083
7
2376
.157
0
p 1826
.840
2
3025
.460
0
tb1656
.809
115
76.2
291
kab
2889
.547
9
2744
.417
0
2566
.279
1
3222
.707
8
2800
.486
6
3077
.677
7
3325
.762
0
69.0 287.8 506.6 725.4 944.2 1163.0Mass (m/z)
2.5E+4
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% In
tens
ity
4700 MS/MS Precursor 1101.55 Spec #1[BP = 701.4, 24936]
701.39
175.09
473.28159.07
72.05
286.1486.07401.17
1101.54
258.15112.06170.0587.06130.05
303.16
269.11 602.31456.26 816.41272.15 399.22
987.51
Fragmentación del ión precursor:
288.14
H 2 N CH
R1
NH CH C
OCH2CH C
OR2
y3
b3
C NH NH CH COOH
R4 H+
H+
b1b2
y1y2
Los iones se fragmentan frecuentemente por los enlaces peptídicos dando lugar a una “escalera” de iones peptídicos característica de la secuencia del péptido. La diferencia de masa entre iones consecutivos define un residuos aminoacídico.
b1y3
y2
y1
b2 b3
Peptide Identification by MS/MS
340.695086676.96063498.8283545.5641171.967066261.107346342.51458456.727405363.268365
…MAIILAGGHSVRFGPKAFAEVNGETFYSRVITLESTNMFNEIIISTNAQLATQFKYPNVVIDDENHNDKGPLAGIYTIMKQHPEEELFFVVSVDTPMITGKAVSTLYQFLV …
- MAIILAGGHSVR- FGPK- AFAEVNGETFYSR- VITLESTNMFNEIIIK- YPNVVIDDENNDK…
361.107346338.695086676.96063498.82831045.5641171.967066342.51458457.827405263.268453
-MAIILAG-MAIILA-MAIIL-MAII-MAI-M-M-AIILAG
Enzymaticdigestion
In-silicodigestion
Protein(s) Peptides MS/MS spectra of peptides
Ions peaklists
Sequence database entry Theoretical
peaklistTheoretical
proteolytic peptides
Match
Result: ranked list of peptide and
protein candidates
Theoretical fragmented peptides
In-silicofragmentation
MS/MS database matching using fragment ion masses
IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS MEDIANTE ESPECTROMETRÍA DE MASAS
?
699.0 1459.4 2219.8 2980.2 3740.6 4501.0
Mass (m/z)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% I
nten
sity
1243.6374
1096.5587
1016.4729
1743.8941
1236.2092
1516.72922877.4563
877.02261264.6347 3072.5583
2200.1761716.3822 3229.66131079.5393 1843.8121 2520.2926804.3498 2860.98972134.09591566.7863
69.0 287.8 506.6 725.4 944.2 1163.0Mass (m/z)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% In
tens
ity
701.39
175.09
473.28159.07
72.05
286.1486.07401.17
1101.54
258.15112.06170.0587.06130.05
MPGDVEGLR
Separación y excisiónde la proteina
Digestión con tripsina en gel.Extracción de péptidos.
Búsqueda en bases de datos
Búsqueda en bases de datos
Obtención de la huella peptídica por espectrometría de masas MALDI-TOF
Espectrometría de masasen tandem
Fragmentación del ión peptídico precursor
Secuenciación de novo
La información de la secuencia es más discriminatoriaque la masa molecular.
Un único péptido de una determinada longitud es suficiente para identificaruna proteína de un genoma secuenciado.
Secuencia de novo, se pueden identificar proteínas homólogas de otrosorganismos.
Ventajas de espectrometría de masas en tandemrespecto a huella peptídica.