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Identificación de levaduras presentes en el proceso de transformación de polen
corbicular a pan de abejas por métodos tradicionales y moleculares
Carla Yojana Portillo Carrascal
Universidad Nacional de Colombia Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia
Departamento de Producción Animal Bogotá, Colombia
2016
Identificación de levaduras presentes en el proceso de transformación de polen
corbicular a pan de abejas por métodos tradicionales y moleculares
Carla Yojana Portillo Carrascal
Trabajo de investigación presentado como requisito para optar al título de: Magister en Producción Animal
Directora: PhD (c) Judith Figueroa Ramírez
Línea de Investigación: Microbiología de productos de la colmena
Grupo de Investigación: AYNI Grupo en Ciencia y Tecnología Apícola
Universidad Nacional de Colombia Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia
Departamento de Producción Animal Bogotá, Colombia
2016
A Dios Padre Celestial por regalarme siempre
bendiciones a lo largo de mi vida.
A mis hijos por ser mis motores de energía
en este mundo, a mi gran Amor por creer
siempre en mis ideas y su apoyo
incondicional en este camino, a Judith
Figueroa por su ayuda invaluable a lo largo
de este proyecto, a mi mamá porque siempre
me inculcó levantarme, sin importar cuantas
veces fuera necesario.
“Todo tiene su tiempo, y todo lo que se quiere debajo del cielo tiene su hora” Eclesiastés 3:1
Agradecimientos A la Universidad Nacional de Colombia y a la Facultad de Medicina Veterinaria y de
Zootecnia por enseñarme la diferencia entre el valor y el precio de la vida y por
permitirme soñar con un futuro mejor, a todos mis profesores que estuvieron a los largo
de este proyecto, especialmente a Judith Figueroa y Gregorio Piñeros, a todos los que
conforman el grupo AYNI, a Howard Junca por toda su asesoría, a Víctor Manuel Tibata
por el apoyo académico y moral en todo momento, al señor Jacobo Porras por el apoyo
en la obtención de las muestras, a Andrés y Dianita, sin la ayuda de ustedes esto no
sería una realidad hoy. Mil gracias.
Resumen y Abstract IX
Resumen El “pan de abejas” es un producto que las abejas elaboran en el interior de las colmenas
a partir del polen floral, posee características de interés en nutrición humana. Estudios
han demostrado que la transformación del polen apícola a pan de abejas es producto de
la fermentación desarrollada por microorganismos entre los que se destacan bacterias y
levaduras.
Las levaduras ha sido el grupo menos investigado. El presente estudio planteó el
objetivo general de identificar los géneros y las especies de levadura involucradas en la
transformación de polen en pan de abejas por métodos tradicionales y moleculares.
Metodología. Se colectaron muestras de pan de abejas de Apis mellifera a partir de
celdas individuales y se separaron de acuerdo con el nivel aproximado de llenado de los
alveolos, así: 1. ≤ 2 mm de profundidad, 2. ≤10 mm, 3. de ≤15 mm y 4. ≥ 15mm. Se
complementó el estudio mediante un muestreo exploratorio de pan de abejas en pote de
colonias de la Tribu Meliponini, correspondientes a los géneros Scaptotrigona, Plebeia y
Paratrigona, así como de la especie Tetragonisca angustula. Las muestras de pan de
abejas y polen de pote fueron procesadas mediante la técnica de siembra directa. Los
cultivos fueron incubados a 35°C durante 48 horas. Las placas con crecimiento se
resembraron, y se incubaron a 35°C durante 48 horas. Este procedimiento se repitió
hasta obtener colonias en cultivo puro. Las formas levadurales fueron caracterizadas en
cuanto al perfil bioquímico mediante el sistema Vitek2® y técnicas moleculares por
medio de PCR y de la secuenciación del ADN genómico de cada una de las cepas a las
cuales se les amplificó un fragmento ITS de la región 5,8S ribosomal.
Resultados. Se identificó en el pan de abejas de A.mellifera la presencia de los géneros
Candida, Kodamaea Metschnikowia y Zygosaccharomyces. Para los dos últimos se
presentó relación entre la detección y estadios específicos de llenado alveolar. También
se identificaron levaduras relacionadas exclusivamente con el pan de abejas de la Tribu
X Identificación de levaduras presentes en el proceso de transformación de polen corbicular a pan de abejas por métodos tradicionales y moleculares
Meliponini como Starmerella meliponinorun, Candida versatilis y Starmelera bombicola.
Igualmente se presentan levaduras asociadas por primera vez con los productos de las
abejas Yarrowia lipolytica. Los resultados en los perfiles bioquímicos del sistema Viek2®
presentan diferencia en las levaduras para la asimilación de compuestos según el origen
entomológico y según el volumen de llenado alveolar para el caso de la especie Apis mellifera, lo que permite un acercamiento a la cinética ocurrida en la maduración del pan
de abejas.
Como conclusión general del estudio se indica que existen diferencias entre las especies
de levaduras presentes en el pan de abejas de Apis mellifera y abejas de la Tribu Meliponini, asimismo, se identifica la presencia de diferentes tipos de levadura según el
volumen de llenado del alveolo. También se reconoce la importancia del género Candida en el proceso de maduración del pan de abejas, dado se recuperó en un alto número de
casos.
El presente trabajo representa un aporte importante para el entendimiento del proceso
de transformación del polen apícola al pan de abejas.
Palabras Clave: Apis mellifera, pan de abejas, polen, secuenciación, levaduras, abejas
nativas.
Resumen y Abstract XI
Abstract When bees collect pollen, they store it in individual comb cells and this creates a pellet
with layers as different loads are compacted in it. The pollen undergoes a fermentation
process that creates “bee bread” which has been found to have interesting properties for
human nutrition. Previous studies have shown that several bacteria and yeasts mediate
this transformation. Out of these, the yeasts group has been the least investigated.
The aim of the present study was to identify the yeasts genres and species involved in
this process by traditional and molecular means.
Methodology. Apis mellifera bee bread samples were collected from individual comb
cells and were classified according to the height of the pellet (which is interpreted as a
filling level) as follows: 1. ≤ 2 mm deep, 2. From 3 to 10 mm deep, 3. From 11 to 15 mm
deep and 4. Greater than 15 mm deep. The study was complemented using an
exploratory sampling of bee bread from colonies of the Meliponini Tribe (Stingless bees).
The sampled genera were Scaptotrigona, Plebeia and Paratrigona, and the Tetragonisca angustula species. All the bee bread samples were processed using the direct culture
technique. The cultures were incubated at 35ºC for 48 hours. The dishes that showed
growth were cultured again and incubated at the same temperature and for the same
length of time. This process was repeated until colonies in pure culture were obtained.
The yeast forms were characterized according to their biochemical profile using the
Vitek2® system and by means of genomic DNA PCR and sequencing for each one of the
strains obtained. The genome fragment amplified corresponded to the 5,8S – ITS region.
Results. The presence of Candida, Kodamaea, Metschnikowia and Zygosaccharomyces yeast genera in A. mellifera bee bread was found. For the latter two, a relation between
their presence and a specific cell filling level was detected. Yeasts that were exclusively
in the bee bread from colonies of the Meliponini Tribe were also identified. These
belonged to the Starmerella meliponinorun, Candida versatilis and Starmelera bombicola species. Likewise, there was identified for the first time in bee bread the yeast species
Yarrowia lipolytica. The results from the biochemical profiles of Vitek2® show a difference
in the yeasts for the assimilation of compounds according to the entomological origin and
for the cell filling level on A. mellifera, which allows to better understand the kinetics
XII Identificación de levaduras presentes en el proceso de transformación de polen corbicular a pan de abejas por métodos tradicionales y moleculares
involved on the maturation of bee bread.
Discussion. On this study we concluded that there are differences among the yeasts
species present on bee bread from A. mellifera and from colonies of the Meliponini Tribe.
There are also specific yeasts according to the cell filling level. The importance of the
Candida genera on the bee bread maturation process is also recognized, due to the fact
that it was identified in a high number of cases.
The present study represents an important contribution for the understanding of the
transformation process from pollen to bee bread.
Keywords: Apis mellifera, bee bread, pollen, sequencing, yeasts, stingless bees.
Contenido XIII
Contenido Pág.
Resumen ......................................................................................................................... IX
Lista de figuras ............................................................................................................. XV
Lista de tablas ............................................................................................................. XVI
Introducción .................................................................................................................... 1
1. Objetivos ................................................................................................................... 9
2. Generalidades de la actividad productiva con abejas Apis mellifera y abejas sin aguijón de Colombia ..................................................................................................... 11
2.1 Polen apícola .................................................................................................... 14 2.1.1 Producción de polen apícola en Colombia ...................................................... 14 2.1.2 Características del polen apícola ................................................................... 16
2.2 Pan de abejas .................................................................................................... 19 2.2.1 Características del pan de abejas Apis Mellifera ............................................... 20 2.2.2 Características físico–químicas y nutricionales ................................................. 20 2.2.3 Microbiota del pan de abejas ........................................................................... 22 2.2.4. Técnicas de identificación y clasificación de levaduras ................................. 25
3. Identificación de levaduras cultivables presentes en polen alveolar de Apis mellifera y polen de pote de cuatro géneros de abejas nativas de Colombia ........... 35
3.1 Introducción .................................................................................................... 36
3.1.1 Polen corbicular y pan de abejas ............................................................. 36 3.2 Sistemas manuales y automatizados aplicados a la identificación de microorganismos asociados a las abejas ...................................................................................................... 44
3.3. Materiales y métodos .......................................................................................... 46 3.4 Resultados ............................................................................................................ 49 3.5 Discusión .............................................................................................................. 56 3.6 Conclusiones ........................................................................................................ 58 3.7 Referencias ........................................................................................................... 59
4. Identificación de levaduras presentes en el proceso de transformación de polen corbicular a pan de abejas por métodos moleculares ..................................... 67
4.1 Introducción .......................................................................................................... 68 4.2 Materiales y métodos ............................................................................................ 71
4.2.1 Muestreo de pan de abejas de A. mellifera ...................................................... 71
XIV Identificación de levaduras presentes en el proceso de transformación de polen corbicular a pan de abejas por métodos tradicionales y moleculares
4.2.2 Muestreo de pan de abejas nativas ..................................................................71
4.3 Cultivo y aislamiento microbiológico ...................................................................... 71 4.4 Identificación por biología molecular ...................................................................... 72 4.5 Resultados ............................................................................................................ 73 4.6 Discusión ............................................................................................................... 79 4.7 Conclusiones y recomendaciones ......................................................................... 81 4.8 Referencias ........................................................................................................... 83
5. Discusión .................................................................................................................87
6. Conclusiones y Recomendaciones .......................................................................91 6.1 Conclusiones ......................................................................................................... 91 6.2 Recomendaciones ................................................................................................ 92
Contenido XV
Lista de figuras Pág.
Figura 2-1. Exportaciones de polen colombiano, años 2001 a 2007
Figura 3-1. Proceso de colecta del pan de abejas de Apis mellifera Figura 3-2. Proceso de aislamiento de levaduras
Figura 3-3. Relación de las levaduras aisladas de pan de abejas con la respectiva
especie de abeja Figura 4-1. Levaduras aisladas en pan de abejas de apis mellifera según el
volumen de llenado del alvéolo
Figura 4-2. Árbol de distancias (nj tree) resultante del alineamiento de las
secuencias de ITS obtenidas de las cepas de levaduras aisladas a partir de pan de
abejas de apis mellifera y de la tribu meliponini
15
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56
74
76
Contenido XVI
Lista de tablas Pág.
Tabla 2-1. Composición del polen apícola de tres países en América del Sur
Tabla 2-2. Composición proximal del polen apícola en cuatro sub-regiones del
altiplano Cundiboyacense
Tabla. 3-1. Mohos presentes en diferentes etapas del proceso de elaboración del
pan de abejas
Tabla 3-2. Levaduras asociadas con las abejas Apis mellifera
Tabla 3-3. Muestras de pan de abejas colectadas en el estudio
Tabla 3-4. Aislamientos de levaduras de pan de abejas de Apis mellifera
identificadas por el sistema VITEK ® Tabla 3-5. Resultados obtenidos en las pruebas bioquímicas efectuadas por el
sistema Vitek2® para los aislamientos de abejas Apis mallifera y abejas de la Tribu
Meliponini.
Tabla 3-6. Aislamientos de levaduras de pan de abejas en pote de cuatro especies
de abejas sin aguijón, identificadas por el sistema VITEK ®
17
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55
Introducción En Colombia actualmente la apicultura es una actividad productiva en crecimiento
que cuenta con cerca de 90.000 colmenas tecnificadas (CPAA, 2011). La
producción de polen se ha identificado como una importante ventaja comparativa
para Colombia en el sector apícola (Sánchez et al., 2013), dado que en los bosques
altoandinos del país se pueden obtener niveles de producción cercanos a los 40 Kg
por colmena al año (Martínez, 2006), lo que corresponde a más del doble de lo
reportado en otros países de importancia apícola como China, Argentina y Brasil,
que no superan los 15 Kg por colmena al año (Bogdanov, 2011), (Laverde et al.,
2010). Se estima que Colombia produce cerca de 150 toneladas de polen (CPAA,
2011) de las cuales alrededor del 90 % se obtienen en los departamentos de
Boyacá y Cundinamarca (Martínez, 2006).
El polen apícola posee características composicionales que lo hacen un alimento
interesante para la nutrición humana y animal. Estudios realizados específicamente
en polen de los departamentos de Boyacá y Cundinamarca destacan su alto
contenido de proteínas, equivalente al 23.8 %, de carbohidratos 39.8 % y la
presencia de fibra dietaria en un 14.5 % (Dominguez y Quicazán, 2014), sin
embargo existen investigaciones que sugieren que el aparato digestivo humano es
incapaz de utilizar la totalidad de los nutrientes contenidos en el polen, debido a que
estos se encuentran protegidos por una capa exterior o exina. Al respecto, estudios
de simulaciones in vitro muestran que de los nutrientes presentes en el polen se
aprovecharía máximo el 59 % (Campos et al., 2010).
La mencionada riqueza nutricional del polen apícola también lo hace un a limento
susceptible de ser degradado rápidamente por microorganismos cuando no se
realizan procesos de conservación poscosecha, asimismo es un alimento que puede
contaminarse con relativa facilidad al efectuar prácticas de manejo inadecuadas.
2 Introducción
Normalmente el polen es obtenido por medio de dispositivos denominados
“colectores de polen” o “trampas de polen” y posteriormente es sometido a un
proceso de deshidratación en el cual se disminuye su carga microbiológica y se le
confiere una mayor vida útil, sin embargo, investigaciones efectuadas al polen
apícola posterior al proceso de deshidratación demuestran que dicho mecanismo no
garantiza por completo que el polen presente una calidad microbiológica deseable,
por ejemplo, en un estudio efectuado en polen de cuba, de 28 muestras de polen
apícola deshidratado el 100 % presentó recuentos fuera de los límites tomados
como referencia para los microorganismos mesófilos, coliformes totales, hongos
filamentosos y levaduras, adicionalmente, en el 25 % de las muestras se aislaron
coliformes fecales (Leyva et al., 2010); en Colombia se valoró la calidad
microbiológica del polen apícola comercial de 90 muestras procedentes de los
departamentos de Boyacá y Cunidamarca; tomando como referencias las norma de
México 097 de 2007 y el artículo 785 del Código Alimentario Argentino, los análisis
mostraron que el 77 % de las muestras se encontraron por fuera de los valores
establecidos para al menos un parámetro de los estipulados en las normas de
referencia (Sánchez et al., 2013).
La baja digestibilidad de los nutrientes presentes en el polen apícola y los
problemas asociados con la calidad microbiológica del producto, han motivado el
desarrollo de estudios que permitan entender los mecanismos que utilizan las
abejas para mejorar la disponibilidad de los nutrientes y conferirle una mayor
estabilidad al polen, de este modo se sabe que las abejas no consumen el polen de
manera directa, en la forma en que normalmente se comercializa para el consumo
humano, sino que estos insectos transportan el polen al interior de las celdas donde
se mezcla con miel y con las secreciones salivares de las abejas, lo que
proporciona un ambiente anaeróbico que favorece la fermentación del polen hasta
transformarse en el producto denominado pan de abejas, el cual es finalmente
consumido por los insectos (del Risco Ríos, 2004).
Pese a que el pan de abejas se origina a partir del polen apícola, al comparar estos
dos productos como alimentos se observan características que los diferencian; se ha
reportado que el pan de abejas presenta valores de pH de 3.9, en tanto que el polen
apícola presenta valores de pH 4.7, asimismo se reportan variaciones en el contenido de
Introducción 3
proteínas solubles de 837 mg/ml para el polen y de 567 a 577 mg/ml para el pan de
abejas. En cuanto a la presencia de aminoácidos se reporta que de los 10 aminoácidos
esenciales para las abejas, todos a excepción de la histidina se encuentran tanto en el
polen como en el pan de abejas, sin embargo la concentración media de los mismos
varía en cada producto, por ejemplo las concentraciones de leucina y treonina son
aproximadamente 60 % más altas en el pan de abeja comparadas con el polen apícola,
de igual modo se ha encontrado que las concentraciones de valina son
aproximadamente 25 % más altas en el pan de abejas; este patrón se reporta en otros
aminoácidos como la alanina, el ácido aspártico y la glutamina a excepción del triptófano,
el cual presenta mayor concentración en el polen apícola (De Grandi-Hoffman et al.,
2013). En cuanto a la solubilidad de las proteínas, se reporta que el pan de abejas
presenta valores entre 2.9 % - 5.6 % superiores a las obtenidas en el polen apícola
(Campos et al., 2008) e igualmente el pan de abejas posee nutrientes no presentes en el
polen apícola, como vitaminas (Loper et al., 1980).
El proceso de trasformación del polen apícola al pan de abejas se genera por la
intervención de diversos microorganismos, entre estos se han identificado por métodos
tradicionales de cultivo bacilos como B.subtilis, B.megaterium, B.lincheniformis,
B.cirulans y B.pumilus, Lactobacilos como L. kunkeii, L. jenseneii, L.fructosus y L. plantarum así como la presencia de numerosas levaduras como Candida parapsilosis, Candida reukaufii, Candida tenuis, Torulopsis candida, Torulopsis etchellsii, Torulopsis famata, Torulopsis globosa, Torulopsis incospicua, Torulopsis sake, Torulopsis stellata
(Gilliam, 1979). Muchos de estos microorganismos provienen del tracto digestivo de la
abeja y son inoculados en el polen cuando la abeja adiciona el néctar que conserva en el
buche melario. Se sabe que los microorganismos efectúan un proceso de acidificación
que le confiere una mayor vida útil al pan de abejas, asimismo se ha descrito que los
microorganismos efectúan una pre-digestión del polen y que son importantes
generadores de enzimas como pectinasas, celulasas y proteasas, entre otras (del Risco
Ríos, 2004).
El pan de abejas se encuentra dentro de las celdas al interior de la colmena, por lo
tanto su cosecha es compleja y poco eficiente, lo que en consecuencia ha generado
que dicho producto no sea comercializado. Esta limitante ha motivado el desarrollo
de diversos ensayos en búsqueda lo que se ha denominado “pan de abejas artificial”,
4 Introducción
elaborado a partir del polen apícola. Los ensayos mencionados corresponden a
bioprocesos fermentativos que emplearon inóculos de bacterias acidolácticas
comerciales y cepas aisladas directamente del pan de abejas; entre las bacterias
evaluadas se reportan L. plantarum, L. coryniformis y L. delbrueckii L. casei y L. acidophilus (del Risco Rios, et al., 2012) (Fuenmayor et al., 2011). Para el caso
específico de Colombia se han realizado ensayos adicionando las enzimas Protamex,
Suberase y Viscoflow (Castro et al., 2014) y fuentes secundarias de nutrientes como
fosfato y miel (Domínguez et al., 2014).
Específicamente sobre el grupo de las levaduras se han efectuado aislamientos en el
pan de abejas correspondientes a los géneros Candida, Rhodotorula, Cryptococcus, Torulopsis, Zygosaccharomyces, Aureobasidium, Metschnikowia y Trichosporon (Gilliam,
1979b; Carvalho et al., 2010; Nogueira et al., 2012; Sinacori et al., 2014; Cadez et al.,,
2015).
El presente estudio buscó generar aportes en el conocimiento de las levaduras presentes
en el proceso de conversión de polen corbicular de Apis mellifera a pan de abejas,
mediante el uso de técnicas de cultivo tradicionales y técnicas de biología molecular.
Adicionalmente se realizó un trabajo exploratorio con el fin de establecer las levaduras
presentes en potes de pan de abejas de tres géneros de abejas sin aguijón.
La investigación se realizó en el marco del proyecto “Identificación de levaduras
presentes en el proceso de transformación de polen corbicular a pan de abejas por
métodos tradicionales y moleculares para su aplicación en el desarrollo de alimentos
apícolas”, el cual fue financiado por el Departamento Administrativo de Ciencia
Tecnología e Innovación COLCIENCIAS.
En cuanto al enfoque metodológico el estudio presentó una fase cualitativa
correspondiente a la observación en campo de los procesos de llenado de los alveolos
con pan de abejas, y una fase cuantitativa correspondiente al procesamiento en
laboratorio y análisis de las pruebas efectuadas.
Las muestras utilizadas en el estudio provinieron de dos colonias de abejas Apis mellifera
ubicadas en la ciudad de Bogotá (Cundinamarca) y correspondieron a polen alveolar en
Introducción 5
tres niveles de llenado: 1. equivalente a ≤ 2 mm de profundidad, 2. ≤10 mm, 3. de ≤15
mm y 4. ≥ 15mm, que se relacionaron con alveolos con aspecto de llenado completo.
También se colectaron muestras de pan de abejas en pote de cuatro especies
pertenecientes a la Tribu Meliponini: Tetragonisca angustula, Paratrigona spp., Plebeia spp., Scaptotrigona spp, las cuales se encontraban ubicadas en el departamento de
Santander. En total se colectaron 198 muestras de Apis mellifera y 45 muestras
meliponinos. Las muestras de pan de abejas y polen de pote fueron procesadas
mediante la técnica de siembra directa, los cultivos fueron incubados a 35°C durante 48
horas para simular el proceso natural de las colmenas y las placas con crecimiento se
resembraron e incubaron a 35°C durante 48 horas; este procedimiento se repitió hasta
obtener colonias en cultivo puro. Las formas levadurales fueron caracterizadas en cuanto
al perfil bioquímico mediante el sistema Vitek2® y mediante técnicas moleculares por
medio de PCR y secuenciación del ADN genómico de cada una de las cepas a las cuales
se les amplificó un fragmento de la región 5,8S – ITS que codifica para la region rDNA.
El análisis bioinformático efectuado a los aislamientos obtenidos a partir de pan de
abejas de Apis mellifera, permitió establecer que las levaduras presentaron identidades
entre el 92 y el 100 % con cuatro especies diferentes: Candida apicola, Kodamea ohmeri, Mestchikowa pulcherrima y Zygosaccharomyces siamensis. Los tamaños de las
secuencias obtenidas variaron entre 500 pb y 700 pb. Las levaduras K. ohmeri y M. pulcherrima fueron las levaduras que se recuperaron en mayor proporción.
De este modo, se encontraron asociaciones entre levaduras y los volúmenes de llenado
específicos en los estadios de llenado alveolar; del uno al tres se detectó la presencia de
la levadura Zygosaccharomyces siamensis, y la levadura Metschnikowia pulcherrima fue
aislada exclusivamente en los segmentos de llenado alveolar tres y cuatro, cuando el pan
de abejas presenta mayor tiempo de maduración. El estudio también permitió identificar
especies de levaduras presentes solo en pan de abejas en pote de meliponinos, como es
el caso de Candida versatilis y Candida versatilis; para esta última es el primer reporte
que se genera asociado a los derivados de las abejas. Igualmente, para el caso de la
especie Paratrigona spp., abejas presentes de forma importante en los meliponarios del
departamento de Santander, los reportes de levaduras son los primeros generados en la
literatura científica.
6 Introducción
Los perfiles bioquímicos de los aislamientos generados por el Vitek2® ofrecen un primer
acercamiento para entender la cinética entre los microorganismos presentes en el
proceso de maduración del pan de abejas, dado que se encuentran grupos de
compuestos que para el caso de Apis mellifera, presentan asimilación solo en ciertas
etapas de llenado del alveolo, de la misma forma se presentan compuestos que solo
fueron asimilados por aislamientos obtenidos de abejas de la Tribu Meliponini, de lo cual
se infiere que existen diferencias asociadas al origen entomológico.
A partir del estudio se generó una colección de levaduras caracterizadas, las cuales
podrán ser utilizadas en estudios posteriores para la elaboración de pan de abejas
industrial u otras aplicaciones industriales, dado que la mayoría de las especies
identificadas presentan actividades de interés biotecnológico.
El alcance de los resultados obtenidos en el presente estudio se limita al pan de abejas
de las cuatro especies de insectos incluidos en el desarrollo de la investigación, no
obstante son comparables con resultados obtenidos en otros estudios similares en otras
abejas y en otros países, de la misma forma la técnica empleada para la valoración del
estado de maduración, teniendo en cuenta el llenado alveolar, puede ser utilizada en la
valoración de otros grupos de microorganismos o en el desarrollo de estudios asociados
a los compuestos presentes en cada etapa de llenado.
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Sánchez Alarcón , O. A., Castañeda, P. C., Muñoz Puerta, G., & Téllez Iregui, G. (2013).
8 Introducción
Aportes para el análisis del sector apícola colombiano. Cienci Agro Journal of Agricultural
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Sinacori, M., Francesca, N., Alfonzo, A., Cruciata, M., & Sannino, C. (2014). Cultivable
microorganisms associated with honeys of different geographical and botanical origin.
Food Microbiology, 38, 284 – 294.
1. Objetivos
1.1 Objetivo general Identificar géneros y especies de levaduras involucradas en la transformación del polen
en pan de abejas por métodos tradicionales y moleculares.
1.2 Objetivos específicos Aislar mediante métodos microbiológicos convencionales levaduras presentes
durante los 15 días del proceso de transformación de polen en pan de abejas de Apis mellifera.
Identificar las levaduras aisladas, mediante un método bioquímico automatizado y
mediante la secuenciación del gen que codifica para el ARN ribosomal de la
subunidad 18S.
Obtener información sobre las levaduras involucradas en la producion de pan de
abeja de Apis mellifera. con el objeto de contribuir al desarrollo de productos
industriales utilizando como materia prima el polen.
2. Generalidades de la actividad productiva con abejas Apis mellifera y abejas sin aguijón de Colombia
Las abejas son insectos de gran interés para la humanidad, dado que obtiene diversos
beneficios económicos y ambientales a partir de la cría y el manejo de dichos animales. A
nivel mundial se han identificado cerca de 17.000 especies de abejas, pero se estima que
existen más de 25.000 (Michener, 2007). De acuerdo con la clasificación efectuada por
Michener, las abejas se encuentran distribuidas en siete familias (Michener, 2007), de las
cuales cinco se encuentran presentes en Colombia: Colletidae, Andrenidae, Halictidae,
Megachilidae y Apidae (Vélez Ruiz, 2009). A nivel productivo la mayoría de especies de
abejas utilizadas provienen de la sub-familia Apinae, incluidas en la familia Apidae,
específicamente de las tribus Apini y Meliponini (Moure, 2012).
La especie Apis mellifera de la Tribu Apini, denominada comúnmente como abeja
doméstica o melífera, es la abeja más difundida a nivel mundial, ocupando grandes
extensiones en casi todos los continentes dada su alta capacidad de adaptación a los
diversos climas y nichos ambientales. Entre las abejas, Apis mellifera es la de mayor
desarrollo en cuanto a conocimiento de productos, mercado y normatividad, y es la única
especie de abeja que cuenta con norma CODEX internacional para la comercialización de
sus mieles (FAO, 1995), e igualmente es la única especie con parámetros definidos en
cuanto a sanidad animal, de reporte obligatorio ante la OIE (OIE, 2015).
En cuanto a la Tribu meliponini, cuenta con una variedad de especiesconocidas como
abejas sin aguijón, muchas de estas con características productivas de interés zootécnico.
A nivel morfológico poseen tamaños que varían entre los 2 mm y 1.5 cm, poseen aguijón
reducido, alas con venación débil o reducida, ojos desnudos y presentan corbícula aunque
en algunas especies esta estructura es reducida (Nates Parra, 2001). El trabajo productivo
con abejas de la mencionada Tribu ha venido creciendo paulatinamente en los últimos
12 Identificación de levaduras presentes en el proceso de transformación de polen corbicular a pan de abejas por métodos tradicionales y moleculares
años, en lo que se puede denominar como un escenario mundial de expansión de la
meliponicultura (Nates Parra & Rozo Londoño, 2013), nombre con el que se denomina la
actividad productiva con estos insectos. Estas abejas producen miel, cera y otros productos
que pueden ser aprovechados tanto en el campo de la nutrición como en el de la medicina,
además, por su abundancia son especies importantes en los procesos de polinización de
cultivos y de plantas silvestres (González-Acereto & Quezada-Euán, 2010).
Se estima que Colombia posee entre 50.000 y 90.000 colmenas tecnificadas de la especie
Apis mellifera (CPAA, 2011), la mayoría en manos de pequeños productores, de este modo
la media de colmenas por apicultor en el país es de 19 (Martínez, 2006). Debido a que
estas abejas no son nativas y fueron introducidas inicialmente con linajes europeos, pero
posteriormente se dio un proceso de africanización, actualmente se desconoce con
exactitud cómo es la mezcla genética de las abejas Apis mellifera colombianas (Sánchez et
al., 2013), no obstante, un estudio efectuado en 14 departamentos (Antioquia, Bolívar,
Boyacá, Caldas, Cauca, Cesar, Cundinamarca, Huila, Nariño, Santander, Tolima, Valle del
Cauca, Casanare y Meta) concluye que el 90.5 % de las colmenas de Apis mellifera
valoradas poseen haplotipos de linaje africano, el 7,6 % linajes europeos y el 1.9 %
haplótipos de Europa del Este (Salamanca, 2009).
En el país se han identificado 120 especies de abejas sin aguijón, sin embargo sobre la
cantidad de colmenas productivas de estas abejas han sido realizados pocos estudios; se
reporta que para el año 2013 en 17 departamentos fueron identificados un total de 75
productores con abejas sin aguijón o meliponicultores, con un promedio de 12.3 colmenas
por productor, para un total de 927 colmenas, de las cuales el 57 % fueron de la especie
Tetragonisca angustula, el 11 % Melipona spp., el 8 % Scaptotrigona spp., y el 8 %
Nanotrigona spp (Nates Parra & Rozo Londoño, 2013).
En cuanto a los productos derivados de la actividad productiva con abejas, estos se
pueden clasificar en dos tipos, bienes y servicios (Sánchez et al., 2013) en el renglón de
los servicios el de mayor importancia corresponde a la polinización (Michener, 2007)
debido a su relación con la seguridad alimentaria de la humanidad, asimismo se reporta
entre los servicios el uso de abejas como bioindicadores (Reyes et al., 2009). Los bienes
obtenidos del manejo de las abejas se dividen en material biológico como núcleos,
paquetes de abejas y reinas (Laverde et al., 2010), bienes de segregación, que son
Generalidades de la actividad productiva con abejas Apis mellifera y abejas sin aguijón de Colombia
13
aquellos producidos directamente por glándulas propias de las abejas como la jalea real, la
cera y la apitoxina (Vit, 2005) y bienes de recolección-transformación, los cuales provienen
de materias primas colectadas de las plantas ubicadas en el entorno de la colmena, que
son mezcladas con sustancias propias de las abejas, entre este grupo de bienes se
encuentran la miel, el polen y los propóleos (Vit, 2004).
En Colombia el producto de mayor importancia comercial para las abejas Apis mellifera y
las de la Tribu Meliponini es la miel, la cual se encuentra definida en la normatividad del
país como un alimento de consumo humano producido por abejas obreras de diferentes
especies, a partir del néctar de las plantas o de secreciones de partes vivas de plantas o
excreciones de insectos chupadores (Ministerio de Protección Social, 2010). La
composición de la miel varía de acuerdo con la flora en la cual la abeja recolecta el néctar,
no obstante para el caso de las mieles de Apis mellifera se cuenta con parámetros
estándar para las mieles independientemente de su origen geográfico, a diferencia de las
mieles de abejas nativas que muestran variaciones importantes entre especies, lo que ha
demostrado la necesidad de efectuar estudios más específicos para el desarrollo de una
normatividad (Vit et al., 2006; Domíngez et al., 2013). A pesar de ser un alimento, a la miel
se le atribuyen diversas propiedades terapéuticas, como la actividad cicatrizante (Shencke
et al., 2013) y antibacteriana (Gamboa y Figueroa, 2009), entre otras.
Actualmente se desconoce con exactitud el tamaño real del mercado colombiano para la
miel de abejas (Sánchez et al., 2013), se estima que el país produce alrededor de 1.600
toneladas de miel de abejas Apis mellifera (CPAA, 2011), que son consumidas
prácticamente en su totalidad al interior del país y abarcarían como máximo el 20 % del
consumo local, el restante 80 % del mercado es abarcado en su mayoría por mieles falsas
(Martínez, 2006). Para el caso de las mieles de abejas nativas solo se han realizado
estudios de mercado concretos para la especie T. angustula, la cual posee un potencial de
mercado estimado en 800.000 dólares para tiendas naturistas de la ciudad de Bogotá y
cuya miel es utilizada principalmente como tratamiento ocular, con precios hasta 10 veces
superiores que los pagados por la miel de Apis mellifera (Vargas e al., 2015).
Los propóleos corresponden a otro producto de importancia comercial derivado de la cría y
manejo de abejas, este se define como una sustancia resinosa de color pardo rojizo o
amarillo verdoso producido por las abejas a partir de resinas vegetales y que tiende a
14 Identificación de levaduras presentes en el proceso de transformación de polen corbicular a pan de abejas por métodos tradicionales y moleculares
oscurecerse (Bankova, 2005). Su composición se asocia con el origen vegetal de la resina.
En los propóleos se han identificado más de 300 compuestos que incluyen principalmente
grupos químicos como los ácidos aromáticos, ácidos ésteres aromáticos, flavonoides,
terpenoides, ácidos alifáticos (Mani et al., 2006). Se reportan como propiedades biológicas
del propóleo la actividad antibacteriana (Farré et al., 2004), la actividad antifúngica
(Burdock, 1998) y la actividad antiparasitaria (Pires Dantas et al., 2006). El comercio de los
propóleos se ha centrado exclusivamente en la especie Apis mellifera, sin embargo se
desconoce el tamaño de este mercado al interior del país, aunque se observan niveles de
adulteración superiores a los descritos en las mieles de Apis mellifera (Martínez, 2006).
El polen corresponde al segundo producto derivado de las abejas en cuanto a importancia
comercial. Para este, al igual que en el caso de los propóleos, el mercado se centra
exclusivamente en la especie Apis mellifera. Debido a que el polen es de especial interés
en el presente estudio, se hace especial énfasis en este producto.
2.1 Polen apícola El polen es el gameto masculino de las plantas, el cual es colectado por las abejas,
quienes lo transportan al interior de la colmena en estructuras especializadas denominadas
corbículas. Las mayoría de los requerimientos nutricionales de las abejas en cuanto a
proteína, minerales, lípidos y vitaminas, son suplidos mediante el consumo del polen
(Eckholm et al., 2014).
2.1.1 Producción de polen apícola en Colombia A nivel local la apicultura presenta diferentes enfoques productivos que varían de acuerdo
con la región en la cual se desarrolla; de este modo para las zonas cálidas los productores
se han especializado en la obtención de miel. Para las zonas frías como el altiplano
Cundiboyacense, los productores se han centrado en la producción de polen, debido a que
las condiciones medioambientales les permiten obtener producciones del orden de los 36
Kg por colmena/año (Martínez, 2006), siendo estos niveles productivos muy superiores a
los reportados en países como China, Argentina y Brasil que no superan los 15 Kg por
colmena al año (Bogdanov, 2011), dicho nivel productivo se entiende como una ventaja
comparativa del país (Sánchez et al., 2013), lo que en consecuencia promovió la
generación de organizaciones asociativas de productores especializadas en la obtención
Generalidades de la actividad productiva con abejas Apis mellifera y abejas sin aguijón de Colombia
15
del polen, como la Asociación de Apicultores de Cundinamarca ASOAPICUN o la
Asociación de Apicultores de Boyacá ASOAPIBOY (IICA, 2009).
Dado que el polen corresponde a un producto apícola menos desarrollado tanto a nivel
internacional como local comparado con la miel, su especialización ha requerido
desarrollos endógenos, entre los que se destacan los esfuerzos realizados en el diseño de
colectores por apicultores de Cundinamarca, así como los desarrollos en colectores de
techo generados en la Unidad Apícola del Centro Agropecuario Marengo CAM de la
Universidad Nacional de Colombia.
En cuanto al mercado, el polen apícola se puede considerar como un producto emergente,
con potencial de desarrollo (Martínez, 2006), el cual reporta ventas internacionales desde
el año 2004 con notables incrementos, siendo los principales destinos países
centroamericanos, especialmente Costa Rica, como lo muestra la figura 2-1 (Laverde et al.,
2010), y para el año 2010 se reportaron exportaciones de polen por ocho toneladas. Sin
embargo la mayoría del polen apícola producido es comercializado al interior del país, con
precios cercanos a $18.000 por kilogramo (3.17% Salarios Mínimos Legales Vigentes año
2012).
Figura 2-1. Exportaciones de polen colombiano, años 2001 a 2007
Fuente: (Laverde et al. , 2010)
16 Identificación de levaduras presentes en el proceso de transformación de polen corbicular a pan de abejas por métodos tradicionales y moleculares
2.1.2 Características del polen apícola El polen apícola se obtiene a través de colectores o trampas de polen que se ubican
normalmente en la parte inferior de la colmena, estos dispositivos impiden que las abejas
trasladen el alimento al interior de la misma, obligándolas a pasar por pequeños espacios
en los cuales se les desprenden los granos de polen (del Risco Ríos, 2004). Para el
consumo humano, el polen apícola es sometido a procesos de deshidratación, en los
cuales la humedad del producto se reduce a valores cercanos al ocho por ciento; este
proceso reduce la carga microbiana del producto y le proporciona una mayor estabilidad
(Barreto et al., 2005).
En Colombia se ha reportado que la mayoría de los apicultores colectan el polen en
campo cada 5 a 8 días, e inician el proceso de secado como máximo 10 horas
posteriores al proceso de cosecha, sin embargo existen productores que efectúan el
secado entre las 24 y 48 horas posteriores a la cosecha, pero en estos casos el producto
es sometido a un proceso de refrigeración a 4ºC (Sánchez et al., 2011).
Debido a que el polen posee un alto porcentaje de proteína, e igualmente puede
proporcionar carbohidratos, fibra dietaria y ácidos grasos, es considerado como un
alimento complejo con un amplio espectro de propiedades nutricionales y terapéuticas
para el ser humano (Bogdanov, 2011). No obstante, la composición del polen puede
variar de acuerdo con la ubicación geográfica de la de la colmena e incluso pueden
presentarse variaciones composicionales en un mismo espacio geográfico a lo largo del
año, debido a las fuentes florales a las que tienen acceso las abejas pecoreadoras
(Seeley, 2006). Estudios efectuados en Europa evidenciaron que las abejas visitan entre
35 y 56 especies de plantas en el proceso de pecoreo de polen (McLellan, 1976); para el
caso específico de Colombia un estudio realizado en apiarios de la Sabana de Bogotá
permitió establecer que dicho polen procedía de 103 especies de plantas, lo que
demuestra un alta riqueza botánica, siendo las familias de plantas más importantes en
este caso Asteraceae, Fabaceae, Brassicaceae, Rosaceae y Myrtaceae (Montoya
Pfeiffer, 2011).
Análisis proximales efectuados al polen apícola evidencian que los carbohidratos ocupan
un porcentaje importante de los nutrientes del polen, llegando a abarcar hasta el 75 % de
Generalidades de la actividad productiva con abejas Apis mellifera y abejas sin aguijón de Colombia
17
los componentes totales (Mendoza, 2014). De los azúcares presentes en el polen, la
mayoría corresponden a azúcares simples, debido a la agregación de néctar por parte de
la abeja para la formación del pelet (Stanley & Linskens, 1974).
El porcentaje de proteína presente en el polen puede alcanzar valores cercanos al 30 %,
lo que referencia al polen como un alimento altamente proteico (Mendoza, 2014), sin
embargo, de forma similar a lo que ocurre con algunas leguminosas secas, dicha
proteína solo puede ser digerida parcialmente; en cuanto a la presencia de aminoácidos
se reporta que el polen posee al menos 12 de los 20 aminoácidos esenciales para el ser
humano (Talpay, 1978).
Las grasas del polen se encuentran en proporciones que por lo general no superan el 10
% de la composición total (Díaz et al., 2009), el contenido de ácidos grasos libres es
considerable y puede abarcar el 55 % de los lípidos (Talpay, 1978). Las cenizas
representan entre el 2 % al 3.7 % de la composición del polen apícola, y poseen
minerales como el sodio, potasio, cobre y zinc entre otros (Mendoza, 2014). El polen
adicionalmente es una fuente de β-carotenos (Contreras, 2004), vitaminas E, B1 y B2,
ácido fólico y biotina (Oliveira et al., 2009). La Tabla 2-1 presenta la composición del
polen apícola de tres países.
Tabla 2-1. Composición del polen apícola de tres países en América del Sur
PARÁMETRO ECUADOR (Mendoza, 2014)
ARGENTINA (Baldi et al., 2004)
CHILE (Kelina et al., 2013)
Humedad % 6,69 - 9,75 5,82 8,8 - 11,9 Cenizas % 2,7 - 3,62 3,04 2,1 - 3 Proteína % 23,93 - 27,18 24,03 13,7 - 17,3 Grasa % 1,44 - 3,5 4,55 No reporta Fibra % 2,4 - 5,47 No reporta No reporta Carbohidratos % 33,47 - 75,67 No reporta 35 - 49,7 pH 4,93 - 5,79 5,46
Fuente: construcción propia a partir de los trabajos referenciados.
Para el caso específico del polen apícola colombiano se resalta el alto contenido de
proteínas que alcanza valores hasta del 31.2 % (Quicazán, 2010), que superan lo
reportado en la Tabla 1 para el polen de Ecuador, Argentina y Chile. El contenido de
18 Identificación de levaduras presentes en el proceso de transformación de polen corbicular a pan de abejas por métodos tradicionales y moleculares
vitamina E reportado para el polen colombiano es de 39,24 - 116,42 µg de a-tocoferol/g,
superior al reportado para el polen apícola procedente de Brasil, e igualmente supera
ampliamente los contenidos de la mencionada vitamina en otros alimentos como huevos,
cereales, granos, productos lácteos y productos del mar (Pulido et al., 2012).
El aporte de fibra dietaria del polen colombiano en promedio es de 13 %, del cual el
10.63 % es fibra dietaria insoluble y el 2.21 % es fibra dietaria soluble; dicho contenido de
fibra dietaria es similar al de otros alimentos tales como el trigo, el maíz y la avena (Díaz
et al., 2012). La Tabla 2-2 describe la composición proximal de 78 muestras de polen
apícola recolectadas en cuatro sub-regiones del altiplano Cundiboyacense.
Tabla 2-2. Composición proximal del polen apícola en cuatro sub-regiones del
altiplano Cundiboyacense
Sabana de Bogotá* Boyacá centro-oriente* Boyacá occidente* Boyacá sur*
Prom±SD1
2 Min
3 Max
Prom.± SD1
2 Min
3 Max
Prom.± SD1
2 Min
3 Max
Prom.± SD1
2 Min
3 Max
pH 4.77a ± 0.56 2.54 5.22 4.74a
± 0.32 4.23 5.56 4.47a ± 0.34 4.32 5.56 4.68a ±
0.25 4.21 5.37
Acidez (meq/Kg)
237.9a ± 38.7 179.0 317.3 240.1a
± 33.8 192.0 319.1 229.8a ± 45.5 154.5 302.3 258.7a
± 45.5 200.7 348.9
Humedad (g/100 g)
5.9a ± 1.7 3.4 9.7 5.4a ±
1.2 3.4 7.9 4.7a ± 1.7 1.8 8.6 6.0a ±
1.8 2.9 8.8
Cenizas (g/100 g)**
2.31a ± 0.39 1.62 2.93 2.40a
± 0.32 1.72 3.00 2.18a ± 0.45 1.53 2.90 2.51a ±
0.44 1.53 3.04
Grasa (g/100 g) **
5.8a,b ± 1.6 2.2 8.8 4.8b ±
1.6 2.5 7.0 6.3a,b ± 2.4 2.3 12.9 6.7a ±
1.3 4.6 9.2
Proteína (g/100g)**
23.8a ± 3.5 18.2 29.4 23.6a
± 3.6 18.8 30.2 22.5a ± 3.7 16.7 30.7 25.2a ±
3.4 18.7 31.2
Fibra dietaria Insoluble (g/100g)**
13.5a ± 3.0 10.9 18.5 11.8a
± 2.3 9.7 15.7 11.7a ± 3.0 7.5 16.3 13.1a ±
2.8 9.9 17.4
Fibra dietaria Soluble (g/100 g)**
1.83a,b ± 0.71 0.95 2.87 2.89b
± 1.23 0.96 4.26 3.05a,b ± 1.14 1.38 4.09 1.85a ±
0.62 0.51 2.57
1 Promedio, más o menos, desviación estándar, 2 Valor mínimo, 3 Valor máximo, *Número de muestras de la Sabana de Bogotá: 20; centro-oriente Boyacá: 19; Boyacá occidente: 17; Boyacá sur: 22, *Base seca, *** Letras diferentes al lado del promedio indican diferencias significativas.
Fuente: (Quicazán, 2010).
Generalidades de la actividad productiva con abejas Apis mellifera y abejas sin aguijón de Colombia
19
Si se tiene en cuenta la composición nutricional del polen apícola colombiano, así como los altos
volúmenes productivos reportados en los municipios de Boyacá y Cundinamarca, se puede
inferir que el polen apícola es un producto con un alto potencial económico para el país, sin
embargo aún presenta aspectos en el manejo poscosecha que deben ser mejorados (Sánchez
et al., 2013), dado que el proceso de secado convencional no garantiza en su totalidad la calidad
microbiológica del producto final, por ejemplo un estudio realizado en polen de Cuba mostró que
de 28 muestras de polen apícola deshidratado, el 100 % se encontró por fuera de los límites
tomados como referencia para los microorganismos mesófilos, coliformes totales, hongos
filamentosos y levaduras (Leyva et al., 2010). En Colombia el análisis de 90 muestras de polen
procedentes de los departamentos de Boyacá y Cundinamarca reportó que el 77 % de las
muestras se encontraron por fuera de los valores establecidos para al menos un parámetro de
los estipulados en la norma de México 097 de 2007 y el artículo 785 del Código Alimentario
Argentino, específicas para el polen apícola. Dichas limitantes han promovido el desarrollo de
estudios encaminados a mejorar los procesos poscosecha de polen, variando la posición del
colector en la colmena, valorando el efecto de la refrigeración, aplicando protocolos de limpieza
(Sánchez et al., 2011) y variando la temperatura de secado (Durán et al., 2014).
Una de las alternativas recientemente valoradas para superar los aspectos de calidad del polen
apícola, así como para mejorar la biodisponibilidad de los nutrientes en este producto, es la
aplicación de bioprocesos que simulen el manejo que le dan las abejas al polen en el interior de
la colmena para transformarlo en otro producto, denominado pan de abejas.
2.2 Pan de abejas El polen ingresado a la colmena por las abejas pecoreadoras no es consumido directamente,
sino que es transportado e introducido en celdas para el caso de las abejas Apis mellifera; allí el
polen es dispuesto en capas las cuales se mezclan con néctar transportado en el buche melario,
adicionando de este modo microorganismos propios de su tracto digestivo (Garcia et al., 2006).
Finalmente la celda es sellada con una capa delgada de miel (Gilliam, 1979) y de este modo se
genera al interior de esta un ensilaje anaerobio, a una temperatura aproximada de 35°C.
Después de 15 días de fermentación se presenta la conversión de polen a pan de abejas o polen
alveolar, donde cesa la actividad aparente de los microorganismos y se observa estabilidad en el
producto (Pain & Maugenet, 1966) (Loper et al., 1980).
20 Identificación de levaduras presentes en el proceso de transformación de polen corbicular a pan de abejas por métodos tradicionales y moleculares
Para el caso de las abejas de la Tribu Meliponini el polen colectado es almacenado en potes de
cera donde sufre un proceso de maduración similar al descrito para el pan de abejas de Apis mellifera, aunque se presentan diferencias en los microorganismos reportados (González-
Acereto & Quezada-Euán, 2010), asimismo existen algunas especie que no utilizan el polen
como fuente de alimento y suplen dicho producto con tejidos animales (Gilliam et al., 1985).
2.2.1 Características del pan de abejas Apis Mellifera Este producto es consumido por las abejas y es de suma importancia debido a que provee a
la colmena los requerimientos necesarios desde la etapa larvaria para el desarrollo y
funcionamiento metabólico de las abejas (Ament et al., 2008).
2.2.2 Características físico–químicas y nutricionales
El pan de abejas ha sido reconocido por muchas culturas ancestrales como una fuente
importante de alimento y de medicina alternativa, haciendo que los investigadores revaliden
su actividad nutricional y terapéutica. En general la composición nutricional del pan de abejas
es similar a la del polen. Sin embargo se espera que este último tenga un valor nutricional
más elevado debido a los cambios bioquímicos ejercidos por la acción microbiana durante
su almacenamiento (Gilliam, 1979) (Human & Nicolson, 2006).
Como alimento para el humano, el pan de abejas es considerado rico en proteínas de alto
valor biológico, y provee aminoácidos esenciales. Es también una buena fuente de potasio y
vitaminas del grupo B (Fuenmayor et al., 2011), asimismo se sabe que posee un contenido
de fenoles estimado entre 6.7 a 10.1 g/kg de materia seca (Tavdidishvili et al., 2014). Las
características nutricionales identificadas en el pan de abejas le confieren el potencial para
ser reconocido como un alimento funcional, capaz de servir como suplemento dietario e
incluso como nutracéutico (Fuenmayor et al., 2011).
Pese a que el pan de abejas se origina a partir del polen apícola, al comparar estos
dos productos como alimentos se observan características que los diferencian, por
ejemplo se reporta que el pan de abejas contiene comparativamente más azucares
reductores que el polen apícola procedente de un mismo origen floral (Gilliam, 1979),
de igual manera la acción de los microorganismos genera un descenso en el pH
(Foote, 1957), que le confiere al pan de abejas un pH de 3.9 en tanto que el polen
Generalidades de la actividad productiva con abejas Apis mellifera y abejas sin aguijón de Colombia
21
apícola presenta valores de pH 4.7 (DeGrandi-Hoffman et al., 2013).
La cantidad de agua presente en el polen apícola y el pan de abejas también presenta
variaciones: Para el caso del polen apícola se reportó un porcentaje de materia seca de 67.4
% y el pan de abejas colectado de las mismas colmenas presentó un porcentaje de materia
seca de 78.8 %, lo que corresponde a una disminución en la cantidad de agua del 11 %
(sobre la composición total), asimismo se observa que la materia seca del polen apícola
presenta variaciones significativas a través del año y alcanza valores entre 55.65 % a 74.31
%, en tanto que la materia seca del pan de abejas se mantiene estable durante todo el año y
solo presenta pequeñas variaciones de 78.2 % a 79.46 % (Hatsue Modro, 2010).
En cuanto a la cantidad de proteína del polen apícola y el pan de abejas, se reporta que en
dichos productos de un mismo origen floral, este último posee un mayor contenido de
proteínas (Songokun et al., 2015), sin embargo para un estudio efectuado en Brasil no se
observaron diferencias significativas entre la cantidad de proteína presente en el polen y el
pan de abejas (Hatsue Modro, 2010). Así también se reportan variaciones en el contenido de
proteínas solubles de 837 mg/ml para el polen y de 567 a 577 mg/ml para el pan de abejas.
También se encuentran reportes que indican que las proteínas de pan de abejas presenta
valores entre 2.9 - 5.6 % superiores a las reportadas en el polen apícola (Campos et al.,
2008).
En cuanto a la presencia de aminoácidos se reporta que de los 10 aminoácidos esenciales
para las abejas, todos a excepción de la histidina se encuentran tanto en el polen como en el
pan de abejas, sin embargo la concentración media de los mismos varía en cada producto,
por ejemplo las concentraciones de leucina y treonina son aproximadamente 60 % más altas
en el pan de abeja comparadas con el polen apícola, asimismo se ha encontrado que las
concentraciones de valina son aproximadamente 25 % más altas en el pan de abejas, este
patrón se reporta en otros aminoácidos como la alanina, el ácido aspártico y la glutamina a
excepción del triptófano, el cual presenta mayor concentración en el polen apícola
(DeGrandi-Hoffman et al., 2013).
La presencia de vitaminas también puede variar entre el polen apícola y el pan de abejas, de
este modo un estudio efectuado en Chile que comparó los niveles de vitaminas en los dos
22 Identificación de levaduras presentes en el proceso de transformación de polen corbicular a pan de abejas por métodos tradicionales y moleculares
productos, reportó para las muestras de pan de abeja contenidos de vitamina A entre 1,3 –
9,7 μg/g y para las muestras de polen multifloral de 0,6 – 3,5 μg/g. El contenido de vitamina
E en las muestras de pan de abeja varió entre 65,0 – 1046,6 μg/g, que superó
significativamente los valores obtenidos en polen multifloral de 40,6 – 166,0 μg/g (López
Casanova, 2013), sin embargo también existen reportes que indican para pan de abejas de
almendras una disminución de las vitaminas C, B3, B5, B6 y B8 frente a polen corbicular de
la misma procedencia botánica (Loper et al., 1980).
Desde la perspectiva de alimento humano el pan de abejas también representa una fuente
interesante de ácidos grasos, pues se reporta en este producto la predominancia del ácido
araquidónico, equivalente al 16 % y, la presencia del ácido α-linolenico en proporción del 8 %
de los ácidos grasos, ambos del grupo de los omega 6 (Čeksterytė et al., 2008).
Pese a que el pan de abejas presenta un valor nutricional más elevado que el polen apícola,
no es comercializado con regularidad en ninguna parte del mundo debido a que el proceso
de extracción se realiza de forma manual, siendo dispendioso y de alto costo (Domínguez et
al., 2014), existen algunas investigaciones orientadas a facilitar la extracción del pan de
abejas (Akhmetova, et al., 2012) sin embargo la mayoría de estudios recientes se centran en
comprender el proceso de maduración del pan de abejas para poder simular dicho proceso a
partir de polen apícola como materia prima.
Al igual que en el caso de las abejas melíferas, las abejas sin aguijón colectan el polen
directamente de las anteras de las flores, el polen se aglutina con néctar y sustancias
salivares hasta formar gránulos (cargas de polen) que son depositadas en las corbículas
para su transporte hacia la colmena, en donde son utilizados como alimento para las mismas
abejas (Menezes et al., 2013).
2.2.3 Microbiota del pan de abejas Los miroorganismos hacen parte fundamental del ciclo de vida de los animales, incluidas las
abejas, e influyen sobre el desarrollo y la salud de las mismas. Se conoce que en el tracto
digestivo de las abejas existen nueve filotipos de bacterias los cuales se reportan en estudios
de diversos orígenes geográficos, lo que sugiere que estos han sido mantenidos por la
transmisión entre individuos y no por la adquisición del ambiente (Martinson et al., 2012). Un
Generalidades de la actividad productiva con abejas Apis mellifera y abejas sin aguijón de Colombia
23
estudio efectuado sobre los microorganismos del tracto digestivo de las abejas
evidenció que el 63 % de las bacterias aisladas correspondieron a Lactobacillus, de las
cuales el 28 % fueron L. Kunkeei; el segundo género de microorganismos aislados, con
una frecuencia de 23 %, fueron las Acetobacterias; en tercer lugar se encontraron los
Fructobacillus y en menor proporción bacterias del género Bacillus y Bifidobacterium
(Vojvodic et al., 2013). Estudios efectuados sobre las heces de las abejas reportan la
presencia de bacterias, de las cuales la mayoría corresponden a bacilos, aunque
también se reportó la presencia de mohos y levadura entre otros microorganismos
(Gilliam & Prest, 1987).
El proceso que se da para la transformación del polen en pan de abejas implica la
presencia de múltiples géneros microbianos que cumplen diferentes funciones, ya sea
como responsables directos de la fermentación o como proveedores del medio
necesario para la misma, entre estos microorganismos se han identificado por métodos
de cultivo los Lactobacillus, Streptococcus, Pseudomonas, Escherichia, Bacillus y en
los grupos levadurales Torulopsis y Sacharomyces, dentro de los más importantes
(Guillian, 1979).
La microbiota presente en el pan de abejas puede provenir de la floración de la cual
procede el polen, o del medio de la colmena, pero mayoritariamente es inoculada por
las abejas durante el proceso de pecoreo e introducción del polen en las celdas (Pain
& Maugenet, 1966). Gilliam en 1979 reportó que la única especie de Bacillus que
obtuvo del polen floral (almendra) fue Bacillus subtilis y sin embargo en el polen apícola
y pan de abejas de la misma procedencia floral aisló Bacillus subtilis, B. megaterium, B. licheniformis, B. pumilus y B. circulans, lo que implica que las abejas pueden haberlos
agregado al polen., De esta forma, los microorganismos reportados en el polen apícola
y en el pan de abejas, no están presentes en el polen floral, por tanto se asume que
son el resultado de la inoculación microbiana por las abejas. (Gilliam, 1979), sin
embargo estudios moleculares efectuados recientemente establecieron que solo el 10%
de las bacterias presentes en el pan de abejas fueron comunes con bacterias del tracto
digestivo, equivalentes a 207 especies de bacterias (Mattila et al., 2012)
Se reporta que los géneros Lactobacillus y Streptococcus son considerados como
24 Identificación de levaduras presentes en el proceso de transformación de polen corbicular a pan de abejas por métodos tradicionales y moleculares
importantes en la fermentación láctica, Pseudomonas probablemente contribuyen al
requerimiento anaeróbico para el proceso (Pain & Maugenet, 1966). Un estudio
efectuado por técnicas moleculares identificaron en el pan de abejas, bacterias
reportadas como importantes en procesos de fermentación las cuales fueron
Succinivibrio asociado al rumen de los bovinos Oenococcus, importante para la
fermentación del vino; Paralactobacillus, importante en la fermentación de los alimentos
y Bifidobacterium, asociado con yogur; estas bacterias representaron más del 67 % de
la comunidad activa de bacterias, siendo las ácido lácticas Oenococcus y
Paralactobacillus los microbios más activos en el pan de abejas, pues comprendieron el
52 % y 60 % las bacterias representadas en esas comunidades (Mattila et al., 2012).
Entre el grupo de lactobacilos aislados en el pan de abejas, se destaca la presencia del
L. kunkeei, dicho microorganismo se reporta como uno de los responsables de la
fermentación del polen apícola, adicionalmente desde una perspectiva de alimento para
el humano, este lactobacilo ha demostrado características que le confieren potencial
como probiótico (Moreno, 2012), y se ha demostrado que su presencia promueve la
producción de inmunoglobulina A (Asama et al., 2015).
En especies de abejas que no realizan procesos fermentativos del polen como los
abejorros (Bombus spp.), se han descrito menos filotipos de bacterias
comparativamente con abejas Apis mellifera, por lo que se infiere que tienen menor
necesidad que las abejas de una extensa flora bacteriana del ácido láctico (Olofsson &
Vásquez, 2009).
Los estudios de identificación de microorganismos en el pan de abejas se han centrado
en el grupo de bacterias, sin embargo en dicho proceso también intervienen levaduras,
éstas proporcionan factores de su propio metabolismo que contribuyen a las
características organolépticas del producto (Pain & Maugenet, 1966). Gilliam, en su
trabajo de 1979, así como en el realizado en conjunto con sus colaboradores en 1989,
encontró que a medida que aumentaba el tiempo de almacenamiento del polen en las
celdas disminuía el número de microorganismos aislados, y que asimismo la mayor
parte de las especies de levaduras provenientes del polen floral no se encontraron en
el pan de abejas. Entre las especies de levaduras reportadas se encuentran Candida parapsilosis, Candida reukaufii, Candida tenuis, Torulopsis candida, Torulopsis
Generalidades de la actividad productiva con abejas Apis mellifera y abejas sin aguijón de Colombia
25
etchellsii, Torulopsis famata, Torulopsis globosa, Torulopsis incospicua, Torulopsis magnoliae, Torulopsis sake y Torulopsis stellata (Guillian, 1979).
Para el caso del polen de pote de las abejas nativas, se conoce la presencia de diez
géneros de levaduras, de las cuales las de mayor relevancia son Candida y Starmerella
(Menezes et al., 2013) (Teixeira et al., 2003). Un estudio orientado a la identificación de
la microbiota con potencial toxigénico presente en el polen de abejas de la especie
Tetragonisca angustula, evidenció la presencia de 124 cepas pertenecientes a seis
géneros, Aspergillus spp., Cladosporium sp., Penicillium ssp., Mucor sp., Curvularia sp.
y Fusarium sp (Andrade et al., 2008).
También se reportan especies de abejas que efectúan cultivos de hongos, los cuales
consumen como parte de su dieta pese a que los mismos presentan un menor valor
proteico que el polen (Menezes et al., 2013).
De acuerdo con las investigaciones realizadas, se plantea de forma universal que el
proceso de transformación de polen alveolar a pan de abejas está dado por la dinámica
propia de los microorganismos que interactúan durante el almacenamiento del polen en
los alveolos de la colmena.
2.2.4. Técnicas de identificación y clasificación de levaduras
Las levaduras se definen en términos amplios como hongos unicelulares que se
reproducen predominantemente de forma asexual por gemación. Forman un complejo y
heterogéneo grupo formado por tres clases de hongos, que se clasifican según su
modo de reproducción: Ascomycetes, Basidomycetes y Deuteromycetes u hongos
imperfectos.
La mayoría de los organismos levaduriformes crecen fácilmente en un gran número de
medios de cultivo usados rutinariamente en el laboratorio de microbiología (agar
sangre, agar chocolate, agar Cled, etc.). Sin embargo, existen agares nutritivos como el
Agar nutritivo Walerstein Laboratory (WL) (Condalab ®), que permiten observar más
detalladamente diferencias macroscópicas entre las colonias (Freydière & Guinet,
1997).
26 Identificación de levaduras presentes en el proceso de transformación de polen corbicular a pan de abejas por métodos tradicionales y moleculares
No existen criterios estáticos acerca de la taxonomía y entre un grupo de
microorganismos, como las levaduras, con una asombrosa variedad de propiedades
fisiológicas y taxonomía diferente a pesar de morfologías similares, aún los nombres de
géneros y especies bien conocidos pueden cambiar al descubrirse nuevas
características (Cárdenes Perera, 2000). El desarrollo de la taxonomía de las levaduras
ha sido vertiginoso, el número de especies aprobadas se ha incrementado de 700
agrupadas en 93 géneros a cerca de 1500 en 148 géneros en los reportes taxonómicos
emitidos entre 1998 y 2011 (Deák & Péter, 2013).
Tradicionalmente, las levaduras han sido clasificadas e identificadas según sus
características morfológicas y sus propiedades fisiológicas y bioquímicas. Entre los
criterios morfológicos se contaba con su reproducción vegetativa, sexual, esporulación,
morfología celular y aspecto de colonia. Entre los criterios fisiológicos y bioquímicos, la
fermentación y asimilación de azúcares, el poder fermentativo, y la asimilación de
nitratos (Giusiano & Mangiaterra, 1998). Estas técnicas se basan principalmente en el
estudio del fenotipo y este depende de las condiciones ambientales del desarrollo y del
estado vegetativo o amorfo.
La identificación de las levaduras según sus condiciones morfológicas es laboriosa,
pues debe estudiarse el estado vegetativo (anamorfo) y el estado sexual (teleomorfo),
lo cual ha generado para algunas levaduras la llamada dualidad de la nomenclatura
binomial, lo que genera dúos como Bullera/Bulleromyces, Cryptococcus/Filobasidiella y
Brettanomyces/Dekkera,
complejo (Ratón, 2004).
En relación con aspectos fisiológicos, se ha podido determinar que los caracteres de
fermentación y asimilación de fuentes de carbono, asimilación de compuestos
nitrogenados, requerimientos vitamínicos, resistencia a cicloheximida y termotolerancia,
no siempre son estables ni reproducibles. Estas dificultades han hallado soluciones con
la aplicación de las técnicas moleculares para la identificación de especies levadurales
(Ratón, 2004).
Actualmente la descripción de los microorganismos experimenta un gran avance
Generalidades de la actividad productiva con abejas Apis mellifera y abejas sin aguijón de Colombia
27
gracias a la utilización de la información que proporcionan los genes que codifican para
RNA ribosomal, y en particular el gen que codifica para la subunidad menor del
ribosoma bacteriano, 16S rRNA (y su equivalente en eucariotas, 18S rRNA). Este
marcador molecular presenta una serie de ventajas para su utilización, complementaria
a diferentes, técnicas permitiendo el estudio en profundidad de la diversidad, estructura
y dinámica de comunidades microbianas en general. Su aplicación como herramienta
molecular fue propuesta por Carl Woese a principios de la década de los 70. Los
análisis de ARNr se han utilizado ampliamente para establecer las relaciones
filogenéticas dentro del mundo procariota y eucariota, causando un profundo impacto
en nuestra visión de la evolución y, como consecuencia, en la clasificación e
identificación de microorganismos (Ferrer et al., 2009).
Los eucariotas tienen ribosomas de 80S con una subunidad de 40S y otra de 60S. La
subunidad de 40S está formada por 33 proteínas y un RNA ribosómico de 18S (18S
rRNA). La subunidad de 60S consiste de 49 proteínas y 3 tipos de moléculas de rRNA:
5S, 5.8S y 28S (5S rRNA, 5.8S rRNA y 28S rRNA). Para el estudio de los eucariotas
es muy utilizada la región intergénica ITS entre 18 y 28S, que presenta más variabilidad
y permite diferenciar especies más cercanas, pero para la descripción taxonómica de
levaduras diversas se realizan también estudios sobre 18S permitiendo una
especificidad mayor.
El desarrollo de las técnicas moleculares para el análisis de genomas completos vino
aparejado con un desarrollo igualmente importante en el área bioinformática, este
desarrollo implicó la creación de software adecuado para editar, alinear, analizar,
ensamblar y anotar los genomas. Los progresos en la biología molecular han
proporcionado un gran número de marcadores para la caracterización e identificación
de levaduras. Esta técnica se basa en la identificación rápida y precisa por análisis de
secuencias de ADN que sirvan como indicadores y clasificadores taxonómicos (Ferrer
et al., 2009); estos métodos han demostrado ser una técnica para una identificación
precisa de muchos microorganismos, incluyendo bacterias, levaduras, algas, hongos,
virus, etc.
28 Identificación de levaduras presentes en el proceso de transformación de polen corbicular a pan de abejas por métodos tradicionales y moleculares
2.3 Referencias
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3. Identificación de levaduras cultivables presentes en polen alveolar de Apis mellifera y polen de pote de cuatro géneros de abejas nativas de Colombia
Carla Portillo Carrascal 1, Judith Figueroa Ramírez 2
1 Zootecnista, candidata MC, Universidad Nacional de Colombia.
[email protected] 2 Microbiologa MC. Docente Universidad Nacional de Colombia Facultad de
Medicina Veterinaria y de Zootecnia
- Grupo de Investigación en Ciencia y Tecnología Apícola AINY.
Resumen En el proceso de maduración del polen colectado por las abejas en las flores, hasta
transformarlo en pan de abejas, producto que finalmente es consumido por dichos
insectos, intervienen una variedad de microorganismos que interactúan en cinéticas
complejas. Con el objetivo de realizar aportes para comprender este proceso de
maduración, se aislaron en cultivos in vitro levaduras a partir de alveolos con
presencia de polen en cuatro estadios de llenado, provenientes de colmenas de
Apis mellifera ubicadas en el departamento de Cundinamarca (Colombia). También
fueron colectadas muestras de pan de abejas en polen de la tribu Meliponini,
conocidas como abejas sin aguijón, correspondientes a los géneros Tetragonisca, Paratigrona, Plebeia y Scaptotrigona, presentes en meliponarios del departamento
de Santander (Colombia). Las muestras de polen de abejas sin aguijón provenían
de potes cerrados. Los aislamientos de levaduras fueron identificados por perfiles
bioquímicos empleando 46 sustratos del sistema Vitek2 ®. Las levaduras más
frecuentes en los aislamientos, identificadas por el sistema para Apis mellifera,
36 Identificación de levaduras presentes en el proceso de transformación de polen corbicular a pan de abejas por métodos tradicionales y moleculares
fueron Kodamaea ohmeri, Candida pulcherrima y Candida famata; para los
aislamiento de abejas nativas las cepas de levaduras encontradas fueron Candida famata, Kodamaea ohmeri y Candida parapsilosis.
Palabras Claves: Pan de abejas, ensilaje, perfil bioquímico, levaduras
fermentadoras, polen de abejas.
3.1 Introducción 3.1.1 Polen corbicular y pan de abejas El polen alveolar o pan de abejas de la especie Apis mellifera y el pan de abejas en
pote de las abejas de la Tribu Meliponini pertenecen al grupo de productos de
recolección y transformación de las abejas, son elaborados a partir de polen floral y
corresponden a la principal fuente de proteínas, minerales y grasas dentro de la
dieta de las abejas (Vit, 2004). Para el caso de la especie Apis mellifera existen
colectores capaces de atrapar los granos de polen antes de que la abeja los ingrese
al interior de la colmena, estos granos son cosechados y comercializados como
complemento nutricional bajo el nombre de polen apícola (Durán et al., 2014). Para
el polen de las abejas de la tribu Meliponini no se reportan colectores de polen.
La composición del pan de abejas es similar a la del polen apícola y se sabe que es
rico en proteínas de alto valor biológico, en carbohidratos e igualmente es una
fuente de potasio y vitaminas del grupo B (Fuenmayor et al., 2011), sin embargo,
debido a los cambios bioquímicos causados por el efecto de enzimas aportadas por
la abeja y por la acción de microorganismos en el proceso de maduración del
producto al interior de la colmena, el pan de abejas presenta mayor
biodisponibilidad y por ende un mejor valor biológico que el polen apícola (Gilliam,
1979a; Domínguez et al., 2014).
El alto valor biológico observado en el pan de abejas ha promovido el interés en su
valoración como alimento funcional, pese a esto, el producto no ha sido
comercializado regularmente debido a que la extracción es dispendiosa y en
Colombia se realiza de forma manual (Domínguez et al., 2014). Esta limitante ha
generado el desarrollo de estudios orientados a simular el proceso de maduración
Identificación de levaduras cultivables presentes en polen alveolar de Apis mellifera y polen de pote de cuatro géneros de abejas nativas de Colombia
37
del polen en condiciones controladas con la inclusión de bacterias acido-lácticas
comerciales utilizadas en la industria láctea (Fuenmayor et al., 2011), bacterias
nativas aisladas a partir de polen corbicular (del Risco-Ríos et al., 2012) así como la
inclusión de cepas puras de los microorganismos Lactobacillus plantarum (ATCC
14917) y Lactobacillus acidophillus (ATCC 43
comercial CHOOZIT MY800, el cual contenía Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii sub sp. Lactis y Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus
(Domínguez et al., 2014).
Dado que en el proceso de maduración del polen interviene una amplia variedad de
microorganismos con diversas funciones, ya sea como responsables directos de la
fermentación o como proveedores del medio necesario para la misma (Gilliam, 1979a;
del Risco-Ríos et al., 2012) se hace necesario desarrollar investigaciones encaminadas a
la comprensión de la microflora responsable de este proceso.
La mayoría de los estudios reportados en la literatura corresponden a pan de
abejas o polen alveolar de la especie Apis mellifera, en los cuales se ha observado
una disminución en la variabilidad de microorganismos a medida que el polen se
madura en el interior de la colmena, coincidiendo con un proceso de acidificación
del sustrato (Babendreier et al., 2007; Gilliam, 1979a).
La caracterización de la microflora presente en el pan de abejas se ha centrado en
la identificación de las especies bacterianas, encontrándose principalmente cepas
pertenecientes a los géneros Lactobacillus, Streptococcus, Pseudomonas, Escherichia y Bacillus, (Moreno & Figueroa, 2012; Gilliam, 1979a). De estos
géneros los que se consideran de mayor importancia son los Lactobacillus y los
Streptococcus, responsables de la fermentación láctica. A las Pseudomonas se les
atribuye la contribución al requerimiento anaeróbico para el proceso (Audisio et al.,
2011).
El origen de la microflora presente en el polen alveolar es diverso, pues se
encuentran especies de origen floral y del medio ambiente, sin embargo, con el
proceso de maduración tienden a prevalecer los microorganismos aportados por la
38 Identificación de levaduras presentes en el proceso de transformación de polen corbicular a pan de abejas por métodos tradicionales y moleculares
abeja; esto fue demostrado en un estudio efectuado en colonias de Apis mellifera
ubicadas en cultivos de almendros. En la investigación se observó para el pan de
abejas maduro la presencia de las bacterias B. subtilis, B. megaterium, B. licheniformis, B. pumilus y B. circulans, las cuales también habían sido aisladas del
intestino de abejas obreras, a diferencia de las cepas de origen floral, de las cuales
solo perduró la bacteria B.subtilis (Gilliam, 1979a). En un estudio reciente realizado
en Colombia, se identificó en el pan de abejas a la bacteria Lactobacillus kunkei como una de las cepas de mayor persistencia durante el proceso de maduración del
producto, con características que la hacen candidata para ser empleada como
probiótico (Moreno & Figueroa, 2012).
En cuanto al grupo de los hongos, se han detectado mohos y levaduras asociados a
las abejas Apis mellifera y sus productos, sin embargo, los mohos se aíslan con
menor frecuencia (Gilliam, 1997). Se conoce que estos microorganismos generan
compuestos antimicrobianos importantes en el proceso de maduración del polen
(Gilliam, 1997), y estos se han asociado a las abejas A. mellifera y a sus productos,
entre estos se encuentran mohos principalmente de los géneros Penicillium, Mucor y Aspergillus (Gilliam et al., 1988). La Tabla 3-1 presenta las especies de mohos
identificadas en polen floral, polen corbicular y pan de abejas de una, tres y seis
semanas de almacenamiento.
Identificación de levaduras cultivables presentes en polen alveolar de Apis mellifera y polen de pote de cuatro géneros de abejas nativas de Colombia
39
Tabla. 3-1. Mohos presentes en diferentes etapas del proceso de elaboración del pan de
abejas
De los microorganismos presentados en la anterior tabla, estudios efectuados en mieles
procedentes de Arabia Saudita identificaron la presencia de los mohos A.flavus, A. niger,
PROCEDENCIA DE LA MUESTRA
MOHO Polen floral
Polen corbicular
Pan de abejas 1*
Pan de abejas 3*
Pan de abejas 6*
Mucor sp. Mucor racemosus Alternaria tenuis Cladosporium cladosporioides Cladosporium herbarum Cladosporium sphaerospermum Aspergillus niger Aspergillus versicolor Aspergillus flavus Aspergillus amstelodami Aspergillus ustur Penicilium brevi–compactum Pinicilium cyclopium Penicilium corylophilum Penicilium crustosum Penicilium chrysogenum Penicilium janthinellum Aureobasidum pullulans Rhizopus nigricans Peyronelia sp. Scytalidium sp. Arthrinium phaeospermun Scopulariopsis brevicaulis Paecilomyces varioti Thielavia sepedonium Xylohypha bantiana Chaetomium elatum Chaetomidum pilosum
Presencia del microorganismo.* =Semana
40 Identificación de levaduras presentes en el proceso de transformación de polen corbicular a pan de abejas por métodos tradicionales y moleculares
A. versicolor, C. cladosporioides, y P. corylophilum (Nasser, 2004).
El grupo de las levaduras se encuentra altamente relacionado con todos los procesos
efectuados por las abejas. Se ha comprobado que la presencia de levaduras en el néctar
floral puede alterar la composición y concentración tanto de azúcares como de
aminoácidos del néctar, e igualmente contribuyen a la emisión de volátiles florales
(Herrera, 2014). De este modo, un estudio reciente efectuados con abejorros de la
especie Bombus terrestris comprobó que la presencia de levaduras en el néctar floral
generaba alteraciones en el comportamiento de dichos insectos, de tal forma que
mostraban preferencia por el néctar con presencia de levaduras sobre el néctar sin
formas levadurales, lo cual se explica por los cambios bioquímicos en el sustrato (Herrera
et al., 2013).
En el pan de abejas se reporta la presencia de levaduras en todo el proceso de
maduración al interior de la colmena. Se sabe que un gran número de las especies de
levaduras del pan de abejas son capaces de fermentar la glucosa y la sucrosa y que
proporcionan factores de su propio metabolismo, los cuales contribuyen a las
características organolépticas del producto (Gilliam, 1979b), igualmente se reconoce que
intervienen en el proceso de deshidratación del polen, lo cual tiene implicaciones sobre la
estabilidad del producto (Camargo et al., 1992).
Coincidiendo con lo ocurrido con las bacterias, las levaduras del origen floral disminuyen
a medida que el polen se madura al interior de la colmena. Estudios efectuados entre
1967 y 1979 detectaron en el pan de abejas de Apis mellifera con una semana de
almacenamiento en la colonia, la presencia de las levaduras Torulopsis magnoliae,
Cryptococcus flavus, Cryptococcus laurentii y Rhodotorula glutinis, pero a las tres y seis
semanas de almacenamiento se aislaron solamente las especies Torulopsis magnoliae y
Cryptococcus albidus; estas levadura no fueron aisladas del polen floral del cual se formó
el pan de abejas, lo que sugiere que fueron inoculadas por los insectos (Gilliam, 1979b).
La Tabla 3-2 presenta un resumen de las especies de levaduras asociadas a las abejas
Apis mellifera.
Identificación de levaduras cultivables presentes en polen alveolar de Apis mellifera y polen de pote de cuatro géneros de abejas nativas de Colombia
41
Tabla 3-2. Levaduras asociadas con las abejas Apis mellifera
LEVADURA
PROCEDENCIA DE MUESTRA
FUENTE N PF P
C PA M IA
Candida humícola (Nasser, 2004) Candida parapsilosis (Gilliam, 1979b) (Carvalho et al., 2010) Candida guillermondii (Gilliam M., 1979b) Candida magnoliae
(Carvalho et al., 2010; Nogueira et al.,
2012) Candida sorbosivorans (Carvalho et al., 2010)
Candida blankii (Dhanwant & Manjit, 1985) Candida cacaoi (Dhanwant & Manjit, 1985)
Candida gelsemii (Manson et al., 2007) Candida racoensis (Manson et al., 2007) Candida tropicalis (Misra et al., 2012)
Candida norvegensis (Nogueira et al., 2012) Candida tilneyi
(Lachance et al., 2001)
Candida powellii (Lachance et al., 2001) Rhodotorula glutinis (Gilliam, 1979b) Rhodotorula rubra (Gilliam, 1979b) Rhodotorula palida (Gilliam, 1979b)
Rhodotorula pilimanae (Gilliam, 1979b) Rhodotorula mucilaginosa
(Carvalho et al, 2012)
Cryptococcus albidus (Gilliam, 1979b) Cryptococcus laurentii (Gilliam, 1979b) Cryptococcus flavus (Gilliam, 1979b)
Cryptococcus humicola
(Nogueira et al., 2012)
Cryptococcus uzbekistanensis
(Sinacori et al., 2014)
Torulopsis novergica (Gilliam, 1979b) Torulopsis magnoliae (Gilliam, 1979b) Zygosaccharomyces
rouxii (Carvalho et al., 2010; Sinacori et al.,
2014) Zygosaccharomyces
melis (Carvalho et al., 2010; Nogueira et al.,
2012; Sinacori et al., 2014) Zygosaccharomyces
favi
(Cadez et al., 2015) Aureobasidium
pullulans
(Sinacori et al., 2014) Kloeckera apiculata (Gilliam, 1979b) Hansenula anómala (Gilliam, 1979b)
42 Identificación de levaduras presentes en el proceso de transformación de polen corbicular a pan de abejas por métodos tradicionales y moleculares
Metschnikowia
pulcherrima
(Gilliam, 1979b) Metschnikowia
reukaufii
(Manson et al., 2007) Saccharomyces
cerevisiae (Carvalho et al., 2010; Nogueira et al.,
2012; Dhanwant & Manjit, 1985) Trichosporon
mucoides
(Carvalho et al., 2010) Pichia
membranifaciens
(Carvalho et al., 2010) Debaryomyces
hansenii
(Sinacori et al., 2014) N=Néctar, PF= Polen floral, PC=Polen corbicular, PA= Pan de abejas, IA= Tracto
digestivo de abejas. Fuente: Construcción propia, 2015, a partir de las fuentes citadas.
El pan de abejas en potes corresponde al sistema de maduración del polen utilizado por la
mayoría de las abejas de la tribu Meliponini o abejas sin aguijón, en el cual el producto es
obtenido por los insectos de forma similar al polen apícola, mediante la colecta del polen
floral, al cual la abeja le adiciona sustancias propias y lo traslada a la colmena. Pero para
este caso el polen es depositado en vasijas o potes de cera que están dispuestos de forma
horizontal en la colonia, los que son finalmente sellados para el proceso de maduración.
El polen de pote ha sido un producto poco estudiado, no obstante, en cuanto a su
composición se reportan algunos casos con porcentajes de proteína y cenizas mayores con
respeto al pan de abejas de A. mellifera. En relación con sus usos, para el caso colombiano
es popularmente empleado para el tratamiento de enfermedades respiratorias, migrañas y
como afrodisiaco (Cepeda, 2009).
La composición microbiana del pan de abejas en pote no ha sido determinada
completamente, sin embargo se sabe que el producto final difiere en sus características
organolépticas dependiendo de la especie de abeja (Camargo et al., 1992), lo cual sugiere
una vía de fermentación diferente. Igualmente se ha podido establecer que algunos hongos
son esenciales para la supervivencia de las abejas, por ejemplo para las especies
Scaptotrigona aff. depilis, Scaptotrigona bipunctata y Scaptotrigona postica, se presenta un
hongo filamentoso que crece en la provisión del alimento larval, el cual es consumido por las
larvas y que al ser retirado disminuye drásticamente la supervivencia de las mismas
(Menezes, 2010).
Identificación de levaduras cultivables presentes en polen alveolar de Apis mellifera y polen de pote de cuatro géneros de abejas nativas de Colombia
43
Las especies de levaduras Aureobasidium pullulans, Pseudozyma antarctica y Starmerella meliponinorum se han asociado con la microflora presente en los intestinos de abejas de las
especies Frieseomelitta varia (Rosa et al., 2003), Teragonisca angustula, Melipona quadrifasciata y Melipona rufiventris. En especial S. meliponinorum fue detectada
adicionalmente en el pan de abejas, miel, propóleos y desechos de las abejas T. angustula,
M. quadrifasciata y M. rufiventris (Teixeira et al., 2003; Rosa & Lachance, 2005). Las
especies de levaduras Candida etchellsii, Cryptococcus albidus, Issatchenkia scutulata, y
Zygosaccharomyces bisporus se han identificado en intestinos de abejas T. angustula,
asimismo la Zygosaccharomyces machadoi se aisló en las heces obtenidas de esta abeja.
(Rosa & Lachance, 2005).
Las levaduras Candida apicola, Candida catenulata, Candida floricola, Cryptococcus laurentii, Cryptococcus macerans, Kodamaea ohmeri y Starmerella meliponinorum, fueron
detectadas en muestras de intestino de la especie de abejas Melipona quadrifasciata, de las
cuales C. apicola y K. ohmeri también fueron aisladas del pan de abejas. En abejas de la
especie Melipona quinquefasciata y su pan de abejas se aisló la levadura Starmerella neotropicalis (Daniel et al., 2013). La levadura Candida versatilis fue identificada en el
intestino de la abeja Frieseomelitta (Rosa et al., 2003).
Se han efectuado aislamientos de levaduras para el caso de las abejas solitarias, es así como
se ha asociado la levadura Candida cellae con la abeja Centris tarsata (Pimentel et al., 2005), y
la levadura Candida batistae con las especies de abejas Diadasina distincta y Ptilotrix plumata. También se asocian las levaduras Candida riodocensis y Moniliella megachiliensis con abejas
del género Megachile (Pimentel et al., 2005; Douglas & Lyne, 1992).
Para el caso de los abejorros de origen europeo Bombus terrestris y Bombus pascuorum, se
conoce que las especies de levaduras Metschnikowia reukaufii, Metschnikowia gruessii, Metschnikowia pulcherrima, Candida bombi, Zygosaccharomyces rouxi y Debaryomyces maramus se encuentran asociadas con los tractos digestivos y el alimento de dichos
insectos. La levadura Metschnikowia kunwiensis se detecta en los tractos digestivos de los
abejorros (Brysch-Herzberg, 2004). Asi como Candida kunwiensis se ha detectado en
Bombus terrestris, Bombus cryptarum, Bombus hortorum, Bombus lapidarius y Bombus pascuorum (Gyu Hong et al., 2003).
44 Identificación de levaduras presentes en el proceso de transformación de polen corbicular a pan de abejas por métodos tradicionales y moleculares
Los trabajos citados anteriormente demuestran la importante relación que existe entre las
abejas y los microorganismos, en específico con las levaduras, sin embargo para
Colombia no se reportan investigaciones que identifiquen dichos organismos.
3.2 Sistemas manuales y automatizados aplicados a la identificación de microorganismos asociados a las abejas Convencionalmente la caracterización de las levaduras se realiza a partir de la morfología y
la fisiología de los aislamientos, no obstante estos métodos pueden requerir la
implementación de hasta 90 pruebas, proceso que puede resultar dispendiosos y demorado
(Deák, 1995). La complejidad de estos mecanismos se ha simplificado mediante el desarrollo
de sistemas que permiten la aplicación simultánea de pruebas bioquímicas de fácil lectura;
los sistemas se clasifican de manera general en sistemas de identificación manual, del cual
se resalta el API 20C AUX de BioMerieux y por otro lado existen los sistemas de
identificación automatizada, entre los que se destacan los sistemas Vitek de BioMerieux y
MicroScan de Qumilab (Truant, 2002). De este modo los sistemas de identificación han sido
importantes para el desarrollo de estudios relacionados con los microorganismos asociados
a los insectos (Giliam, 1997; Mankowski & Morrel, 2004) y la tipificación de microorganismos
de importancia médica, utilizados en la valoración de las propiedades antibióticas de mieles
de abejas Apis mellifera (Kwakman et al., 2014; Brudzynski & Lannigan, 2012) así como de
mieles de abejas de la tribu Meliponini (Kwapong et al., 2013; Gabriel et al., 2015).
Específicamente el sistema Vitek de BioMerieux utiliza una placa o tarjeta con
pequeños compartimientos en los que se encuentran sustratos deshidratados para una
amplia variedad de pruebas bioquímicas (Truant, 2002). De tal forma, para la
identificación de un microorganismo, este se debe preparar en una suspensión que se
dispone en ductos de la tarjeta, y posteriormente es succionado al interior de la misma
por vacío, a través de un conducto estéril. La tarjeta es luego introducida en un equipo
que se constituye en la unidad de incubación-lectura, la cual mantiene un ambiente
controlado y rota las tarjetas para que pasen por la unidad láser y el fotodetector, los
resultados luego son analizados por comparación frente a una base de datos interna,
que arroja la identificación del microorganismo en un periodo de 24 a 48 horas (Rangel,
2011). El sistema Vitek cuenta con la tarjeta YST, diseñada para la identificación de
levaduras mediante la aplicación de 47 pruebas bioquímicas fluorescentes que incluyen
Identificación de levaduras cultivables presentes en polen alveolar de Apis mellifera y polen de pote de cuatro géneros de abejas nativas de Colombia
45
la asimilación de carbohidratos, ácidos orgánicos y la detección de oxidasas y
arilamidasas (Ochiuzzi et al., 2014).
Debido a que la capacidad de identificación acertada del sistema Vitek® se limita a la
serie de combinaciones alojada en su base de datos, para el caso del Vitek2® se
presenta una base de al menos 51 especies de levaduras, y algunas requieren el
desarrollo de pruebas adicionales para la identificación (Linares & Solís, 2007), sin
embargo en la base de datos se prioriza la identificación de microorganismos
relacionados con la salud humana (Arias et al., 2002), en consecuencia, la probabilidad
de tipificar adecuadamente un microorganismo depende en gran medida del origen del
mismo, por ejemplo un estudio reportó que para la identificación de 178 levaduras con
importancia clínica de aislamiento frecuente, el sistema Vitek2 ® presentó concordancia
con la identificación por los método tradicionales para el 90 % de los aislamientos, en
tanto que para 20 levaduras con importancia clínica pero de aislamiento poco
frecuente, la concordancia entre el sistema Vitek2 ® y la identificación por métodos
tradicionales se redujo al 75 % de los aislamientos (Ferrara et al., 2014).
En cuanto al uso de los sistemas de identificación manuales y automatizados para la
caracterización de microorganismos relacionados con las abejas o sus productos, se
reporta que la aplicación del sistema permitió la caracterización parcial del hongo
Trichosporonoides megachiliensis, posteriormente clasificado como Moniliella megachiliensis
(Rosa et al., 2009), el cual fue detectado como asociado al polen de la especie de abeja
Megachile rotundata. En la descripción inicial del hongo se empleó el sistema de clasificación
Vitek ®, lo que permito obtener un perfil fisiológico (Douglas & Lyne, 1992).
Sistemas de identificación similares, como el API 20C AUX, fueron utilizados para la
identificación de bacterias asociadas con la especie de abeja Melipona fasciata, lo que
permitió detectar en muestras de abejas, miel y pan de abejas, los microorganismos Bacillus alvei, Bacillus circulan y Bacillus megaterium (Gilliam et al., 1990).
Para el caso de las abejas de la especie Apis mellifera, el sistema API fue utilizado para la
valoración de levaduras de mieles con Denominación de Origen Protegida, procedentes de
Portugal, y permitió identificar con éxito las especies de levaduras del género Rhodotorula,
46 Identificación de levaduras presentes en el proceso de transformación de polen corbicular a pan de abejas por métodos tradicionales y moleculares
Candida y Saccharomyces, sin embargo, el sistema no tuvo la capacidad de detectar
aislados del género Zygosaccharomyces, que fueron posteriormente identificados por
técnicas moleculares, asimismo clasificó erróneamente las especies de levaduras
Trichosporom mucoides, Candida magnoliae, Pichia membranifaciens y Candida sorvosivorans (Carvalho et al., 2010). El sistema API también fue utilizado en la
clasificación de 28 mohos aislados a partir de muestras de polen floral, polen corbicular
y pan de abejas de una, tres y seis semanas de almacenamiento (Gilliam et al., 1988).
Actualmente no se han efectuado estudios relacionados con la cinética microbiana del
proceso de transformación de polen corbicular a pan de abejas mediante la utilización
de sistemas de clasificación automatizados como el Vitek, sin embargo, el sistema se
ha utilizado para la comprensión inicial de la microbiota en diversos procesos de
fermentación, como es el caso del Zhijiang-flavor liquor, originario de China (Chen et
al., 2010), de cereales fermentados tradicionales de origen búlgaro (Gotcheva et al.,
2000) y de embutidos de origen español (Encinas et al., 2000), entre otros.
Con este estudio se buscó establecer las cepas de levaduras cultivables presentes en
el pan de abejas alveolar de Apis melliferas y pan de abejas en pote de especies
pertenecientes a la tribu Meliponini de Colombia.
3.3. Materiales y métodos El estudio se realizó a partir de muestras de pan de abejas de Apis mellifera y pan de
abejas en pote, de abejas de la Trubu Meliponini. Para el primer caso, las muestras
provenían de un apiario ubicado en el Campus de la Universidad Nacional de Colombia
en la ciudad de Bogotá (Cundinamarca), perteneciente al Laboratorio de Abejas de la
Universidad Nacional LABUN. En las colmenas se identificaron panales que tuvieran al
menos el 50 % de los alveolos con pan de abejas, los cuales fueron depositados en
bolsas estériles y trasladados al laboratorio de microbiología para la extracción del
producto bajo condiciones controladas. El traslado de los panales de la colmena al
laboratorio se realizó de forma inmediata, con un intervalo de tiempo máximo de una
hora entre la apertura de la colonia y la extracción del pan de abejas en laboratorio
(Figura 3-1).
Identificación de levaduras cultivables presentes en polen alveolar de Apis mellifera y polen de pote de cuatro géneros de abejas nativas de Colombia
47
Figura 3-1. Proceso de colecta del pan de abejas de Apis mellifera
Fuente: Portillo, C. 2012
Para la extracción de las muestras de pan de abejas en los panales se tuvo en cuenta el
proceso que realizan las abejas para fermentar el polen, y se estandarizó el muestreo a
partir del nivel de llenado del alveolo como un indicador del estado de maduración del
producto; de este modo se emplearon cuatro niveles, así: 1. equivalente a ≤ 2 mm de
profundidad, 2. ≤10 mm, 3. de ≤15 mm y 4. ≥ 15 mm, que correspondió a alveolos con
aspecto de llenado completo. En total se valoraron 198 muestras. El pan de abejas fue
extraído de los alveolos empleando una cucharilla de uso odontológico en cabina de flujo
laminar, y posteriormente fue procesado.
Para el caso del pan de abejas en pote se incluyeron muestras provenientes de colonias
de abejas nativas de cuatro especies, dispuestas en cajas racionales y pertenecientes a
meliponicultores de la Asociación Apícola Comunera ASOAPICOM, ubicados en el
departamento de Santander. La muestra fue una sección completa de potes con pan de
abejas sellado, que fueron dispuestos en frascos de vidrio estériles y posteriormente
trasladados bajo refrigeración hasta el laboratorio donde se efectuó la apertura del pote y
la extracción del pan de abejas bajo cabina de flujo laminar. La identificación de las
abejas empleadas en el estudio fue realizada por el LABUN mediante claves
taxonómicas, de este modo las especies de abejas fueron Tetragonisca angustula,
Paratrigona spp., Plebeia spp., Scaptotrigona spp. La Tabla 3-3, resume el muestreo
efectuado en el estudio.
48 Identificación de levaduras presentes en el proceso de transformación de polen corbicular a pan de abejas por métodos tradicionales y moleculares
Tabla 3-3. Muestras de pan de abejas colectadas en el estudio
ESPECIE DE ABEJA
NIVEL APROXIMADO DEL LLENADO DEL ALVEOLO (mm) O
ESTADO DEL POTE No. DE
MUESTRAS
Apis mellifera ≤ 2 31 ≤10 40 ≤15 55 ≥ 15 72
Tetragonisca angustula Pote cerrado 21 Paratrigona spp. Pote cerrado 15
Plebeia spp. Pote cerrado 6 Scaptotrigona spp. Pote cerrado 4
TOTAL 244 Fuente: Construcción propia, 2015.
Las muestras de pan de abejas fueron procesadas en laboratorio mediante la técnica de
dilucion y siembra directa por agotamiento, en el proceso se empleó 0,5 g de cada
muestra. Se empleron los agares Papa Dextrosa Agar (PDA) (Oxoid ®) y Agar nutritivo
Walerstein Laboratory (WL) (Condalab ®) para detección de organismos fermentadores.
Los cultivos fueron incubados a 35°C durante 48 horas, para simular el proceso natural
de temperatura fisiologica de la colmena; pasado este tiempo, las placas con crecimiento
se resembraron en agar Sabouraud cloranfenicol (Oxoid ®) mediante el método de
agotamiento en estrías, y fueron incubadas a 35°C duante 48 horas, este proceso se
efectuó de forma repetitiva hasta lograr obtener colonias aisladas en cultivo puro (Figura
3-2).
Figura 3-2. Proceso de aislamiento de levaduras
Fuente: Portillo, 2016.
Identificación de levaduras cultivables presentes en polen alveolar de Apis mellifera y polen de pote de cuatro géneros de abejas nativas de Colombia
49
Las colonias puras fueron resembradas en el medio WL y observadas en láminas teñidas
con Gram al microscopio, con el objeto de definir si correspondían a formas levadurales y
si eran diferentes entre sí. Las características morfológicas macroscópicas que se
tuvieron en cuenta fueron: textura, color, intensidad del color y presencia de halo micelial.
Cada colonia morfológicamente distinta (Macro y microscópicamente) fue preservadas
mediante congelación (- 70oC) en caldo Sabouraud (Oxoid).
Los aislamientos obtenidos a partir del de pan de abejas fueron caracterizados en cuanto a
su perfil bioquímico frente a 46 compuestos, mediante el sistema Vitek ® 2 Systems: 04.01.
3.4 Resultados A partir del pan de abejas de Apis mellifera fueron obtenidos inicialmente 198
aislamientos de levadura, sin embargo despues de efectuar el segundo repique solo
sobrevivieron 29 aislamientos de levaduras, muy posiblemente debido a requerimientos
nutricionales exixtentes en su medio natural y que nos estaban presentes en el cultivo
invitro. De las levaduras cultivables el 14 % provenían del nivel de llenado uno, el 24 %
del dos, el 28 % del tres y el 34 % del cuatro.
La valoración del perfil bioquímico de las levaduras procedentes del pan de abejas de
Apis mellifera efectuada por el sistema Vitek 2® evidenció que ninguna de las levaduras
aisladas presenta resultados positivos frente a la presencia de las enzimas L-Lisina-
arilamidasa y Tirosina-arilamidasa, capaces de catalizar la hidrólisis de un aminoácido N-
Terminal de péptidos (Acosta & Tabatabi, 2001). Sin embargo se presentaron respuestas
positivas en los aislamientos de los cuatro estadios de llenado alveolar valorados ante la
presencia de la enzima Leucina-arilamidasa.
Frente a la presencia de las enzima Ureasa, Gamma-Glutamil-Transferasa, Beta-n-acetil-
Glucosaminidasa y PNP-N-acetil-BD-galactosamidasa, todos los aislamientos
presentaron resultados negativos. Lo mismo se evidenció frente a la asimilación del
Monosacárido L-Ramnosa, los disacáridos D-Melibiosa y Lactosa, y el alcohol Eritritol, e
igualmente las levaduras no presentaron asimilación de Nitratos, Lactato, Amigdalina y
del compuesto Metila-A-D-glucopiranósido. La asimilación del monosacárido L-Arabinosa
se presentó solamente en un aislamiento que provenía de pan de abejas en el segundo
50 Identificación de levaduras presentes en el proceso de transformación de polen corbicular a pan de abejas por métodos tradicionales y moleculares
estadio de llenado.
La mayoría de los aislamientos obtenidos en los cuatro estadios de llenado fueron
capaces de asimilar los monosacáridos D-glucosa y D-galactosa, los alcoholes Xilitol y D-
Sorbitol, así como el compuesto L-Malato. El disacárido Sacarosa fue asimilado por el 80
% de las levaduras aisladas.
Los azúcares D-Rafinosa, D-Turanosa, D-Trehalosa, D-Xilosa, D-Manosa, D-Celobiosa,
D-Melocitosa, Gentiobiosa, D-Maltosa y L-Sorbosa, fueron asimilados de forma exclusiva
en aislamientos de muestras de pan de abejas provenientes de alveolos con niveles con
estadios de llenado alveolar tres y cuatro, en los cuales el pan de abejas presenta
mayores procesos de maduración. La asimilación de los compuestos acetato, 2-Acetado-
D-Gluconato, Arbutina, N-Acetil-Glucosamina, D-Gluconato, Citrato de sodio, Glicerol, así
como la valoración de la presencia de la enzima Alfa Glucosidasa, también presentaron
resultados positivos en los segmentos de llenado mencionados.
Todos los aislamientos obtenidos en los estadios de llenado uno y dos mostraron
resultados positivos frente a la presencia de Arginina GP y la asimilación de Glucuronato
y D-Galacturonato, sin embargo este valor se redujo al 50 %, 25 % y 25 %
respectivamente en los aislamientos obtenidos en los segmentos de llenado tres y cuatro.
La asimilación de Prolina se presentó en alrededor del 80 % de los aislamientos en los
estadios de llenado tres y cuatro, así como en el 14 % de los aislamientos obtenidos en
estadio de llenado dos.
Las correlación de las pruebas bioquímicas efectuada por el sistema Vitek ® permitió
identificar el 31 % de los aislamientos con nivel de confianza excelente (91% al 96%) y el
24% con nivel de confianza bueno (85% al 90%), el restante 45 % de los aislamientos no
fue identificado.
Para los alveolos con pan de abejas correspondientes al segmento de llenado uno se
obtuvieron cuatro aislamientos de levaduras, de las cuales el sistema Vitek ® identificó una
con nivel de confianza bueno y tres no fueron identificadas. En los alveolos con volumen de
llenado en el estadio dos fueron aisladas siete levaduras, de las cuales seis fueron
agrupadas como una sola especie y un aislamiento no fue identificado. Las muestras
Identificación de levaduras cultivables presentes en polen alveolar de Apis mellifera y polen de pote de cuatro géneros de abejas nativas de Colombia
51
provenientes de alveolos con volumen de llenado en el nivel tres presentaron ocho
aislamientos de levaduras, de las cuales dos fueron agrupadas como una sola especie y seis
no fueron identificadas. En los alveolos con el mayor grado de maduración se efectuaron 10
aislamientos de los cuales el perfil bioquímico permitió identificar tres aislamientos como una
sola especie y tres aislamientos como diferentes especies; cuatro aislamientos no fueron
identificados.
A partir de los aislamientos obtenidos fue posible establecer por el sistema Vitek ®. la
presencia de cuatro especies de levaduras, de las cuales dos pertenecen al género
Candida, una al género Kodamaea y una al género Rhodotorula. La Tabla 3-4 describe los
resultados obtenidos en la identificación de los aislamientos mediante el sistema Vitek ®.
Tabla 3-4. Aislamientos de levaduras de pan de abejas de Apis mellifera identificadas por
el sistema VITEK ® NIVEL DE
LLENADO DEL ALVEOLO
CEPA IDENTIFICADA PROBABILIDAD DE IDENTIFICACIÓN
NIVEL DE CONFIANZA
≤ 2 mm Rhotodorula glutinis 89 % Bueno 2.1-10 mm Rhotodorula glutinis 89 % Bueno
10.1-15 mm Candida pulcherrima 96 % Excelente Candida famata 91 % Excelente
≥ 15.1 mm
Kodamaea ohmeri 91 % Excelente Candida pulcherrima 96 % Excelente Rhodotorula glutinis 89 % Bueno Candida famata 91 % Excelente
Fuente: Elaboración propia, 2016.
Para el caso del pan de abejas en pote, las pruebas bioquímicas evidenciaron que los
aislamientos de las cuatro especies de meliponinos incluidos en el estudio presentan
levaduras con resultados negativos para las valoraciones ante la presencia de las enzimas L-
lisina-arilamidasa, Beta-N-acetil-glucosaminidasa y Gamma-glutamil-transferasa, e
igualmente presentaron resultados negativos para la asimilación del Monosacárido L-
Ramnosa, el alcohol Eritritol, así como los compuestos DL-Lactato y Glucuronato. Estos
resultados son similares a los obtenidos en los aislamientos obtenidos a partir de pan de
abejas de Apis mellifera. La asimilación de los monosacaridos D-Xilosa y L-Sorbosa tampoco
se presentó en los aislamientos obtenidos a partir del pan de abejas en pote, a diferencia de
52 Identificación de levaduras presentes en el proceso de transformación de polen corbicular a pan de abejas por métodos tradicionales y moleculares
lo observado en los aislamientos de pan de abejas de Apis mellifera, que presentaron
asimilación del azúcar.
Un aislamiento procedente de pan de abejas de la especie Tetragonisca angustula se
comportó de forma atípica con respecto a los resultados de las demás levaduras, dado que
correspondió al único aislamiento que presentó resultados positivos para la valoración ante la
asimilación de L-malato, Lactosa, Arbutina, Nitrato, D-Melocitosa y D-Melibiosa, así como la
presencia de las enzimas Tirosina-arilamidasa y Ureasa. El mencionado aislamiento también
fue la única levadura de pan de abejas en pote incapaz de asimilar Metil-A-D-
Glucospiranósido, D-Manosa, Sacarosa, D-Maltosa y Gricerol, e igualmente presentó
resultados negativos ante la presencia de Arginina GP.
La totalidad de los aislamientos levadurales obtenidos en el pan de abejas en pote asimilaron
los compuestos D-Glucosa, D-Turanosa, L-Glutamato, L-prolina, D-Trealosa, 2-Ceto-D-
Gluconato, D-Sorbitol, Acetato y Citrato de sodio, e igualmente fueron positivos ante la
presencia de Leucina arilamidasa.
Resultados positivos frente a la asimilación de N-acetil-Glucosamina y la presencia de la
enzima Alfa-glucosidasa se presentaron en más del 80 % de los aislamientos obtenidos en el
pan de abejas en pote de las cuatro especies incluidas en el estudio. La asimilación del
azúcar L-arabinosa se presentó en más del 85 % de los aislamientos para las especies de
abejas Tetragonisca angustula, Paratrigona spp., y Plebeia spp. Para la especie
Scaptotrigona spp. la asimilación del compuesto se presentó en el 75 % de los aislamientos.
La asimilación de D-Galactosa se presentó en el 77 % de los aislamientos obtenidos de pan
de abejas en pote de la especie Teragonisca angustula, el 83 % de los aislamientos de
Paratrigona spp., 71 % de los aislamientos de Plebeia spp., y el 100 % de los aislamientos
de Scaptotrigona spp. La asimilación de D-rafinosa se presentó entre el 42 % y 75 % de los
aislamientos y la asimilación de D-galacturonato se presentó entre 25 % y el 38 % de los
aislamientos dependiendo de la especie de abejas. Se obtuvieron resultados positivos frente
a la presencia de la enzima PNP-N-acetil-BD-galactosaminidasa en el 38 % de los
aislamientos obtenidos en muestras procedentes de colonias de Tetragonisca angustula, 50
% de Paratrigona spp., 43 % de Plebeia spp., y 25 % de Scaptotrigona spp.
Identificación de levaduras cultivables presentes en polen alveolar de Apis mellifera y polen de pote de cuatro géneros de abejas nativas de Colombia
53
Los aislamientos obtenidos en el pan de abejas en pote de las especies Plebeia spp., y
Scaptotrigona spp. no presentan asimilación de los compuesto Xilitol y Amigdalina. Para las
especies Tetragonisca angustula y Paratrigona spp. se presenta asimilación de los
compuestos en el 8 % de los aislamientos.
La asimilación de D-Celobiosa solo se presentó en el 15 % de los aislamientos de la especie
de abeja Tetragonisca angustula y el 14 % de los aislamientos obtenidos de la especie de
abeja Plebeia spp. La asimilación de D-gluconato solamente de presentó en un aislamiento
de las especies de abeja T.angustula y Scaptotrigona spp.
La Tabla 3-5., resume los resultados obtenidos en las pruebas bioquímicas efectuadas por el
sistema Vitek2® para los aislamientos de abejas Apis mallifera y abejas de la Tribu
Meliponini. Apis mellifera (nivel de
llenado) ABEJAS SIN AGUIJÓN
C TEST 1 2 3 4 T.A Pa Pl Sc A L-Lisina-ARILAMIDASA 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0%
Asimilación de L-RAMNOSA 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% BETA-N-ACETIL-
GLUCOSAMINIDASA 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0%
Asimilación de DL-LACTATO 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% Asimilación de ERITRITOL 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0%
GAMMA-GLUTAMIL-TRANSFERASA
0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0%
B Asimilación de D-XILOSA 0% 0% 25% 30% 0% 0% 0% 0% Asimilación de
GLUCURONATO 100% 100% 0% 30% 0% 0% 0% 0%
Asimilación de L-SORBOSA 0% 0% 25% 30% 0% 0% 0% 0% C Tirosina ARILAMIDASA 0% 0% 0% 0% 15% 0% 0% 0%
Asimilación de LACTOSA 0% 0% 0% 0% 8% 0% 0% 0% PNP-N-acetil-BD-
galactosaminidasa 1 0% 0% 0% 0% 38% 50% 43% 25%
Asimilación de METIL-A-D-GLUCOPIRANÓSIDO
0% 0% 0% 0% 8% 100% 100% 100%
Asimilación de AMIGDALINA 0% 0% 0% 0% 8% 8% 0% 0% Asimilación de D-
MELIBIOSA 0% 0% 0% 0% 8% 0% 0% 0%
Asimilación de NITRATO 0% 0% 0% 0% 8% 0% 0% 0% UREASA 0% 0% 0% 0% 8% 0% 0% 0%
D Asimilación de D-GLUCOSA 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% Asimilación de L-
GLUTAMATO 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100%
Asimilación de D-SORBITOL 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% E Asimilación de L-MALATO 100% 100% 100% 100% 8% 0% 0% 0%
54 Identificación de levaduras presentes en el proceso de transformación de polen corbicular a pan de abejas por métodos tradicionales y moleculares
Asimilación de D-
GALACTOSA 100% 100% 100% 100% 77% 83% 71% 100%
Asimilación de XILITOL 100% 100% 50% 100% 8% 8% 0% 0% ARGININA GP 100% 100% 50% 50% 92% 100% 100% 100% Leucina ARILAMIDASA 100% 86% 100% 100% 100% 100% 100% 100% Asimilación de D-
GALACTURONATO 100% 86% 0% 30% 31% 38% 29% 50%
Asimilación de SACAROSA 25% 71% 88% 80% 92% 100% 100% 100% F Asimilación de L-PROLINA 0% 14% 75% 70% 100% 100% 100% 100%
Asimilación de L-ARABINOSA
0% 14% 0% 0% 85% 92% 100% 75%
Asimilación de D-RAFINOSA 0% 0% 50% 30% 69% 42% 43% 75% Asimilación de D-
TURANOSA 0% 0% 88% 70% 100% 100% 100% 100%
Asimilación de D-TREALOSA 0% 0% 50% 70% 100% 100% 100% 100% Asimilación de 2-CETO-D-
GLUCONATO 0% 0% 88% 70% 100% 100% 100% 100%
Asimilación de D-CELOBIOSA
0% 0% 88% 70% 15% 0% 14% 0%
Asimilación de D-MANOSA 0% 0% 75% 70% 8% 100% 100% 100% Asimilación de ACETATO 0% 0% 75% 70% 100% 100% 100% 100%
Asimilación de D-MALTOSA 0% 0% 88% 80% 92% 100% 100% 100% ALFA-GLUCOSIDASA 0% 0% 88% 70% 92% 92% 100% 100%
Asimilación de ARBUTINA 0% 0% 25% 30% 8% 0% 0% 0% Asimilación de GLICEROL 0% 0% 50% 70% 92% 100% 100% 100% Asimilación de CITRATO
(SODIO) 0% 0% 50% 30% 100% 100% 100% 100%
Asimilación de D-GLUCONATO
0% 0% 35% 30% 8% 0% 0% 50%
Asimilación de D-MELOCITOSA
0% 0% 35% 30% 8% 0% 0% 0%
Hidrólisis de ESCULINA 0% 0% 35% 30% 8% 0% 14% 25% Asimilación de GENTIOBIOSA
0% 0% 25% 30% 8% 0% 0% 0%
Asimilación de N-ACETIL-GLUCOSAMINA
0% 0% 0% 30% 92% 83% 86% 100%
Fuente: Elaboración propia, 2016.
Especies de abejas sin aguijón T.A= Tetragonisca angustula, Pa= Paratrigona spp.,
Pl= Plebeia spp., Sc=Scaptotrigona spp. C= clasificación del aislamiento según perfil
bioquímico. A= Pruebas bioquímicas con resultados negativos para la totalidad de los
aislamientos del estudio. B= Pruebas bioquímicas con resultados positivos
exclusivamente para aislamientos de Apis mellifera. C= Pruebas bioquímicas con
resultados positivos exclusivamente para aislamientos de abejas de la Tribu
Meliponini. D= Pruebas bioquímicas con resultados positivos para la totalidad de los
aislamientos del estudio. E= Pruebas bioquímicas con al menos un aislamiento
positivo para abejas Apis mellifera y de la tribu Meliponini. F= Pruebas bioquímicas
Identificación de levaduras cultivables presentes en polen alveolar de Apis mellifera y polen de pote de cuatro géneros de abejas nativas de Colombia
55
con resultados negativos de Apis mellifera en el estadio de llenado alveolar uno, con
resultados positivos para estadios superiores y que también fueron positivos para
aislamientos de abejas de la tribu Meliponini.
Para las abejas de la tribu Meliponini, la correlación de los resultados de las pruebas
bioquímicas aplicadas a las levaduras obtenidas del pan de abejas en pote mediante
el sistema Vitek ® identificaron nueve de los 12 aislamientos asociados con las
colonias de la especie T. angustula, los cuales fueron agrupados como tres especies
de levaduras. Para el pan de abejas en pote de la especie de abeja Paratrigona spp., se aislaron 16 levaduras, de las cuales 12 se agruparon como tres especies
diferentes de acuerdo con el perfil bioquímico y cuatro no fueron identificadas. En el
pan de abejas de la especie Plebeia spp. se aislaron siete levaduras cuyo perfil
bioquímico agrupó seis levaduras en dos especies y una no fue identificada. Para la
especie de abeja Scaptotrigona spp. fueron aisladas cuatro levaduras agrupadas en
dos especies. Los aislamientos obtenidos a partir del pan de abejas en pote se
resumen en la Tabla 3-6.
Tabla 3-6. Aislamientos de levaduras de pan de abejas en pote de cuatro especies de
abejas sin aguijón, identificadas por el sistema VITEK ®
ESPECIE CEPA IDENTIFICADA PROBABILIDAD
DE IDENTIFICACIÓN
NIVEL DE CONFIANZA
Tetragonisca angustula
Candida parapsilosis 95 % Excelente
Candida famata 93 % Excelente
Kodamaea ohmeri 94 % Excelente
Paratrigona spp. Candida parapsilosis 95 % Excelente
Candida famata 93 % Excelente
Kodamaea ohmeri 94 % Excelente
Plebeia spp. Candida parapsilosis 95 % Excelente
Candida famata 93 % Excelente
Scaptotrigona spp. Candida famata 93 % Excelente
Kodamaea ohmeri 94 % Excelente
Fuente: Elaboración propia, 2016.
56 Identificación de levaduras presentes en el proceso de transformación de polen corbicular a pan de abejas por métodos tradicionales y moleculares
En total fueron identificadas por el sistema Vitek ® cinco especies de levaduras, de las
cuales el 50 % pertenecen al género Candida. La levadura Candida famata estuvo
presente en el pan de abejas de todas las especies de abejas incluidas en el estudio, la
especie Kodamaea ohmeri fue detectada en el pan de abejas de Apis mellifera y en el
pan de abejas en potes de todas las especies de abejas incluidas en el estudio, a
excepción de la Plebeia spp. La levadura Candida parasilopsis se aisló exclusivamente
de pan de abejas en pote de abejas de la tribu Meliponini. La levadura Rhodotorula glutinis fue aislada exclusivamente en pan de abejas de la especie Apis mellifera y la
levadura Candida pulcherrima se aisló exclusivamente de pan de abejas en pote de la
especie Tetragonisca angustula. Los resultados obtenidos se resumen en la Figura 3-3.
Figura 3-3. Relación de las levaduras aisladas de pan de abejas con la respectiva
especie de abeja
Fuente: Elaboración propia, 2016.
3.5 Discusión Los hallazgos obtenidos en el estudio muestran la diversidad de formas levadurales que
utilizan las abejas para transformar el polen floral al pan de abejas que emplea en su dieta.
En el sistema Vitek ® se identificó solamente el 60 % de los aislamientos procesados
con un nivel de confianza excelente, por lo cual se puede inferir que la capacidad de
identificación del sistema es reducida para levaduras presentes en pan de abejas si se
compara con estudios efectuados en aislamientos clínicos, en los cuales se tienen
niveles de identificación entre el 70 % y el 90 % (Ferrara et al., 2014). Dicho
comportamiento se presenta debido a que la base de datos alojada en el sistema prioriza
los microorganismos relacionados con la salud humana, lo que limita su capacidad en
Identificación de levaduras cultivables presentes en polen alveolar de Apis mellifera y polen de pote de cuatro géneros de abejas nativas de Colombia
57
muestras de otras procedencias (Arias et al., 2002).
Pese a que las pruebas bioquímicas efectuadas por el Sistema Vitek2® no permitieron
identificar la totalidad de los aislamientos, el perfil fisiológico obtenido en las pruebas es
importante para el entendimiento de la cinética microbiana durante el proceso de
maduración del pan de abejas, pues de este modo es posible evidenciar que la presencia
de levaduras con asimilación específica de ciertos compuestos solo se presenta al final
del proceso de maduración del pan de abejas. Asimismo el estudio permitió detectar
diferencias grandes en cuanto a la asimilación de los compuestos L-malato, L-arabinosa,
L-sorbosa, D-Melocitosa, Gentiobios, Xilitol, Metil-A-D-Glucopiranósido y Glucuronato
entre los aislamientos obtenidos de pan de abejas de Apis mellifera y el pan de abejas en
pote de especies de abejas de la tribu Meliponini.
El pan de abejas de la especie Apis mellifera presentó variabilidad en la flora microbiana
a medida que se registran cambios en la altura de llenado de las celdas, donde el polen
es procesado hasta la obtención de un producto estable. La especie de levadura
Rhotodorula glutinis fue detectada en el pan de abejas maduro, dicho microorganismo
fue aislado de polen floral, polen corbicular y pan de abejas (Gilliam, 1979b), otros
reportes de aislados del género Rhotodorula se asocian al intestino abejas adultas de T. angustula y de Mellipona cuadrifeciata, así como también se ha hallado su presencia en
mieles de T. angustula (Rosa et al., 2003). La especie Rhodotorula muscilaginosa (muy
cercana bioquímicamente a R. Glutinis) se ha aislado en mieles de Apis mellifera con
denominación de origen procedentes de Portugal (Carvalho et al., 2010).
La levadura Kodamaea ohmeri estuvo presente en el pan de abejas de Apis mellifera y de
abejas de la tribu Meliponini; dicha levadura se ha asociado con abejas en diversos estudios
y ha sido aislada de intestinos de abejas de la especies Melipona cuadrifasciata (Daniel et
al., 2013; Rosa et al., 2003), Apis cerana (Basikriadi et al., 2012), Bombus impatiens y
Bombus pensylvanicus (Graham et al., 2011). K ohmeri también fue asociado con la plaga
Aethina tumida, que afecta las colonias de Apis mellifera (Benda et al., 2008).
El 50 % de las levaduras identificadas por el sistema Vitek2® pertenecen al género
Candida, el cual ha sido ampliamente reportado en diversos estudios asociados con las
58 Identificación de levaduras presentes en el proceso de transformación de polen corbicular a pan de abejas por métodos tradicionales y moleculares
abejas Apis mellifra (Nasser, 2004; Gilliam, 1979b; Carvalho et al., 2010; Dhanwant &
Manjit, 1985; Manson et al., 2007; Nogueira et al., 2012; Lachance et al., 2001) y abejas
de la tribu Meliponini (Rosa et al., 2003; Daniel et al., 2013). La levadura Candida famata
fue aislada del pan de abejas de todas las especies de abejas incluidas en el estudio;
esta levadura ha sido aislada frecuentemente de muestras medioambientales, se ha
reportado como productora de riboflavina y se asocia a la producción industrial de esta
vitamina (Stahmann et al., 2000).
La levadura Candida parapsilosis estuvo presente en el pan de abejas en pote de las
especies de abeja Paratrigona spp., Plebeia spp., y T. angustula. Esta levadura ha sido
reportada como asociada a Apis mellifera, en pan de abejas por Egorora en 1967 citada
por Gilliam, 1979b, en polen floral (Gilliam, 1979b), en el intestino de abejas adultas
(Giliam, 1997) y en mieles (Carvalho et al., 2010).
A partir del pan de abejas de Apis mellifera se aisló la levadura Candida pulcherrima, la
cual no fue detectada en el pan de abejas en pote de la tribu Meliponini. La presencia de
la levadura se observó en el pan de abejas en estadios con alto grado de maduración.
Esta levadura fue aislada de polen corbicular de Apis mellira (Gilliam, 1979b) y se
reconoce como un microorganismo de utilidad en los proceso de fermentación para la
producción de vinos (Zohre & Erten, 2002; Jolly et al., 2003) con efectos sobre su aroma
(Rodríguez et al., 2010).
La variabilidad de levaduras cultivables presentes en los pólenes acondicionados por las
abejas y los cambios en los perfiles bioquímicos muestran la importancia que tienen los
mencionados microorganismos sobre el proceso de maduración, de los cuales se conoce
que aportan factores antimicrobianos, vitaminas y otros componentes de importancia
nutricional. También muestra una compleja cinética microbiana al interior de los alveolos
y los potes en las distintas especies de abejas estudiadas.
3.6 Conclusiones La totalidad de las levaduras cultivables presentes en el pan de abejas de Apis mellifera y
abejas de la tribu Meliponini presentan coincidencias en cuanto a la asimilación de D-
glucosa, L-Glutamato y D-Sorbitol, e igualmente coinciden en la no asimilación de L-
Identificación de levaduras cultivables presentes en polen alveolar de Apis mellifera y polen de pote de cuatro géneros de abejas nativas de Colombia
59
Ramnosa, DL-Lactato y Eritritol.
La asimilación de D-Xilosa, Glucuronato y L-Sorbosa se presenta exclusivamente en
aislamientos provenientes de Apis mellifera.
Se presentan cambios de las respuestas a las pruebas bioquímicas entre los
aislamientos obtenidos en los diferentes niveles de llenado alveolar del pan de abejas de
la especie Apis mellifera.
A partir del pan de abejas de Apis mellifera y del pan de abejas de potes de las especies
T. angustula, Paratrigona spp., Scaptotrigona sp y Plebeia sp, se aislaron e identificaron
por perfiles bioquímicos cinco levaduras diferentes.
El género Candida estuvo presente en las muestras de todas las especies de abejas del
estudio, particularmente C. famata. La levadura C. parapsilosis correspondió a abejas
nativas y C. pulcherrima a Apis mellifera.
Rhodotorula glutinis estuvo presente solo en aislamientos provenientes de pan de abejas
de Apis mellifera.
Kodamaea ohmeri se halló en muestras de Apis mellifera y abejas nativas con excepción
de Plebeia spp.
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4. Identificación de levaduras presentes en el proceso de transformación de polen corbicular a pan de abejas por métodos moleculares
Portillo CY, V. Tibata, Figueroa J, Junca H
Resumen El presente estudio se propuso aislar por el método molecular de secuenciación del ADN
de la región ARNr 5.8S-ITS que codifica para la región rDNA, las levaduras cultivables
presentes en el proceso de transformación de polen corbicular a pan de abejas en Apis mellifera y en cuatro especies de abejas nativas de Colombia pertenecientes a la tribu
Meliponini (Tetragonisca angustula, Paratrigona sp., Plebeia sp. y Scaptotrigona sp). De
A. mellifera, se analizaron 198 muestras de polen tomadas de los alvéolos de la colmena
a cuatro diferentes porcentajes de llenado. El estudio permitió la identificación de cuatro
especies de levaduras del pan de abejas de A. mellifera: Zygosaccharomyces mellis, Candida apicola, Metschnikowia pulcherrima y Kodamea ohmeri. Sobre las abejas
nativas se colectaron 48 muestras de polen de pote, a partir de las cuales fueron aisladas
y caracterizadas seis especies de levaduras, entre estas Starmerella bombicola, Kodamea ohmeri, Metschnikowia pulcherrima, Candida magnoliae, Candida apícola, y Candida cellae; estas dos últimas especies fueron predominantemente aisladas en
Plebeia sp y Scaptotrigona sp., mientras que los otros cuatro géneros de levaduras solo
fueron aisladas en T. angustula y Paratrigona sp. Los resultados obtenidos amplían la
información sobre la microbiota responsable del proceso natural de maduración del polen
al pan de abejas como un aporte al desarrollo de alimentos apícolas para el consumo
humano.
Palabras Claves: Abejas, Abejas nativas, levaduras, secuenciación, polen y pan de
abejas.
68 Identificación de levaduras presentes en el proceso de transformación de polen corbicular a pan de abejas por métodos tradicionales y moleculares
4.1 Introducción Colombia es un país que presenta condiciones botánicas favorables para la obtención de
altas cantidades de polen apícola (Martínez, 2006), producto cuya composición nutricional
lo hace un alimento interesante para el consumo humano.Se resalta su alto porcentaje de
proteína, así como la presencia de vitaminas y de minerales (Domínguez et al., 2014). No
obstante, las abejas no consumen el polen de forma directa, estos insectos lo utilizan
como materia prima para la elaboración de otro producto denominado pan de abejas, el
cual presenta mejor estabilidad y mayor disponibilidad de los nutrientes (Fuenmayor et al.,
2011). Los altos volúmenes productivos de polen por colmena que presenta Colombia
pueden ser aprovechados para su transformación en pan de abejas industrial (Fuenmayor,
2009).
El pan de abejas es la única fuente de proteínas y ácidos grasos de la colonia, es un
producto de fermentación elaborado por las abejas en alveolos o potes de cera dentro de
la colmena a partir del polen colectado de las flores, con participación de una simbiosis de
levaduras y bacterias lácticas (Moreno, 2012).
Para simular el proceso de maduración del polen al interior de la colmena en condiciones
industriales, es necesario comprender la compleja cinética de los microorganismos
involucrados en dicha transformación, entre los que se destacan las bacterias acidolácticas
y las levaduras (Gilliam, 1979).
Investigaciones recientes han buscado establecer la microbiota presente en el pan de
abejas de Apis mellifera por técnicas moleculares, lo cual ha permitido identificar las
bacterias ácidolacticas Oenococcus y Paralactobacillus como los microorganismos más
activos en el pan de abejas (Mattila et al., 2012) Asimismo se destaca la presencia del L. kunkeei como uno de los microorganismos responsables de la fermentación del polen
apícola (Asama et al., 2015; Moreno, 2012). Para el caso de las formas levadurales
actualmente los estudios de identificación y filogenia utilizan técnicas mediante la región
del rDNA 5,8S y los espaciadores transcritos internos ITS 1 e ITS 2 (5,8S – ITS). La región
5.8S es codificadora y conservada, por lo tanto muestra una baja variabilidad que no
permite la delimitación entre cepas de una misma especie; sin embargo la zona de los ITS,
que es una región no codificadora, sí es hipervariable y por tanto permite el reconocimiento
Identificación de levaduras presentes en el proceso de transformación de polen corbicular a pan de abejas por métodos moleculares
69
a nivel interespecífico; por tal razón ha sido empleada para la identificación y diferenciación
de especies de levaduras en diferentes substratos, alimentos y bebidas. Una de las
técnicas más empleadas es la PCR – RFLP, que consiste en la amplificación enzimática
del ADN de esta región por la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa;
posteriormente los amplificados se someten a digestión con enzimas de restricción y son
visualizados en geles de agarosa (Esteve-Zarzoso et al., 1999).
La mayoría de los estudios moleculares efectuados en el pan de abejas se han centrado
en la valoración de los grupos de bacterias, sin embargo se sabe de la existencia de
levaduras asociadas con el proceso de maduración del polen, que proporcionan factores
de su propio metabolismo, los cuales contribuyen a las características del producto (Pain &
Maugenet, 1966). Los métodos tradicionales de cultivo han permitido la clasificación de
levaduras, como especies de los géneros Candida y Torulopsis, entre otras (Guilliam,
1979).
En relación con estudios específicos de levaduras asociadas a las abejas y sus productos
mediante técnicas moleculares, se cuenta con pocos reportes al respecto. Existen
valoraciones mediante técnicas que utilizaron la secuencia parcial del gen rRNA 26S
(rDNA) y los patrones de restricción generados
internos (ITS1 e ITS2) del gen rRNA 5.8S (rDNA), permitieron identificar en las mieles de
abejas Apis mellifera originarias de Portugal, la presencia de las especies de levaduras
Candida magnoliae Candida sorbosivorans, Rhodotorula mucilaginosa, Zygosaccharomyces rouxii, Zygosaccharomyces melis, Saccharomyces cerevisiae, Trichosporon mucoides y Pichia membranifaciens (Carvalho et al., 2010). Otro estudio
efectuado en mieles de abejas Apis mellifera de diversos orígenes que empleó la
secuencia parcial de los genes rRNA 26S (rDNA) y rRNA 16S describió la presencia de las
especies Cryptococcus uzbekistanensis, Aureobasidium pullulans y Debaryomyces hansenii (Sinacori et al., 2014). Un estudio reciente efectuado por técnicas moleculares
asoció la levadura Zygosaccharomyces favi con la miel y el pan de abejas de Apis mellifera
(Cadez et al., 2015).
La aplicación de técnicas moleculares también se ha utilizado para identificar aislamientos
de levaduras provenientes de abejas de la tribu Meliponini. Específicamente en la especie
70 Identificación de levaduras presentes en el proceso de transformación de polen corbicular a pan de abejas por métodos tradicionales y moleculares
Tetragonisca angustula, permitió detectar en tracto digestivo las levaduras Aureobasidium pullulans, Pseudozyma antárctica, Starmerella meliponinorum (Rosa, et al., 2003), Candida etchellsii, Cryptococcus albidus, Issatchenkia scutulata, y Zygosaccharomyces bisporus
(Rosa & Lachance, 2005). En la miel y el pan de abejas en pote de la misma especie se
detectó la levadura S. Meliponinorum (Teixeira et al., 2003) y en los desechos se aisló la
especie Zygosaccharomyces machadoi.
Para las especies de abejas del género Melipona, M. quadrifasciata y M. Rufiventris fueron
aisladas del tracto digestivo las levaduras Aureobasidium pullulans, Pseudozyma antárctica
y Starmerella meliponinorum. Para M. quadrifasciata, adicionalmente se aislaron las
especies Candida apicola, Candida catenulata, Candida floricola, Cryptococcus laurentii, Cryptococcus macerans y Kodamaea ohmeri (Rosa, et al., 2003). Para esta especie de
meliponino también se detectaron las formas levadurales C. Apicola y K. Ohmeri en el pan
de abejas. La levadura Starmerella neotropicalis fue aislada de tractos digestivos y pan de
abejas de la especie Melipona quinquefasciata (Daniel et al., 2013).
En tractos digestivos de la especie de abejas Frieseomelitta varia fue posible establecer
mediante técnicas de identificación molecular, la presencia de las levaduras Aureobasidium pullulans, Pseudozyma antárctica, Starmerella meliponinorum y Candida versatilis (Rosa et
al., 2003). Para abejas del género Bombus la aplicación de técnicas moleculares ha permitido asociar
con tracto digestivo de estos insectos, las levaduras Metschnikowia reukaufii, Metschnikowia gruessii, Metschnikowia pulcherrima, Candida bombi, Zygosaccharomyces rouxi Debaryomyces maramus (Brysch-Herzberg, 2004) y Metschnikowia kunwiensis (Gyu
Hong et al., 2003).
En Colombia no existe a la fecha ningún reporte de caracterización de levaduras presentes
en el pan de abejas por secuenciación del ADN, ni aún por PCR-RFLP, que permita su
identificación; por tal razón este estudio se propuso aislar por cultivo e identificar por
secuenciación de la región ARNr 5.8S-ITS, las levaduras presentes en el proceso de
transformación de polen corbicular a pan de abejas en Apis mellifera y en especies de
abejas nativas de Colombia.
Identificación de levaduras presentes en el proceso de transformación de polen corbicular a pan de abejas por métodos moleculares
71
4.2 Materiales y métodos
4.2.1 Muestreo de pan de abejas de A. mellifera Los análisis fueron efectuados a partir de 198 muestras de polen alveolar de Apis
mellifera, colectadas en un apiario ubicado en las ciudad de Bogotá (Cundinamarca),
propiedad del Laboratorio de Abejas de la Universidad Nacional LABUN. En la obtención
de estas muestras, se efectuó el seguimiento del proceso que realizan las abejas para
madurar el polen alveolar y se estandarizó el muestreo, teniendo en cuenta el volumen
de llenado del alveolo como un indicador del estado de maduración del producto, de este
modo se tomaron muestras de cuatro niveles de llenado de los alveolos, así: 1.
equivalente a ≤ 2 mm de profundidad, 2. ≤10 mm, 3. de ≤15 mm y 4. ≥ 15 mm. La
extracción del pan de abejas de los alveolos se realizó en cabina de flujo laminar con una
cucharilla de uso odontológico estéril.
4.2.2 Muestreo de pan de abejas nativas Para la toma de las muestras de abejas nativas correspondientes a la tribu Meliponini, el
estudio se realizó en seis meliponarios ubicados en el departamento de Santander
(Colombia), pertenecientes a productores de la Asociación Apícola Comunera
ASOAPICOM. La identificación de las abejas empleadas en el estudio fue realizada por
el LABUN (Laboratorio de Biología Universidad Nacional de Colombia) mediante claves
taxonómicas. Se obtuvo un total de 46 muestras de polen en pote provenientes de
colonias de cuatro especies de abejas nativas: 21 muestras de T. angustula, 15 de
Paratrigona sp., seis de Plebeia sp., cuatro de Scaptotrigona sp. Para la colecta de la
muestra se retiraron los potes con polen completos y se depositaron en frascos estériles
refrigerados hasta su transporte al laboratorio donde se realizó la apertura del pote y la
extracción del polen bajo cabina de flujo laminar.
4.3 Cultivo y aislamiento microbiológico Las muestras de pan de abejas fueron procesadas en laboratorio mediante la técnica de
dilucion y siembra directa por agotamiento, en el proceso se empleó 0,5 g de cada
muestra. Se empleron los agares Papa Dextrosa Agar (PDA) (Oxoid ®) y Agar nutritivo
Walerstein Laboratory (WL) (Condalab ®) para detección de organismos fermentadores.
72 Identificación de levaduras presentes en el proceso de transformación de polen corbicular a pan de abejas por métodos tradicionales y moleculares
Los cultivos fueron incubados a 35°C durante 48 horas, para simular el proceso natural
de temperatura fisiologica de la colmena; pasado este tiempo, las placas con crecimiento
se resembraron en agar Sabouraud cloranfenicol (Oxoid ®) mediante el método de
agotamiento en estrías, y fueron incubadas a 35°C duante 48 horas, este proceso se
efectuó de forma repetitiva hasta lograr obtener colonias aisladas en cultivo puro. Una
porción de cada cepa aislada fue teñida con Gram y observada al microscopio, con el
objeto de definir si correspondían a formas levadurales y si eran diferentes unas de otras.
Las características morfológicas macroscópicas de las colonias que se tuvieron en
cuenta fueron: textura, color, intensidad del color y presencia de halo micelial. Las
especies levadurales fueron caracterizadas en cuanto a su perfil bioquímico frente a 46
compuestos, empleando el sistema Vitek2® Systems: 04.01. Las colonias
morfológicamente distintas (macro y microscópicamente) fueron preservadas mediante
congelación (-70oC) en caldo Sabouraud (Oxoid).
4.4 Identificación por biología molecular Las levaduras aisladas fueron identificadas molecularmente por medio de la técnica de PCR
y secuenciación, en la que a partir de ADN genómico de cada una de las cepas de levaduras
se amplificó un fragmento de la región 5,8S – ITS. La extracción de ADN se realizó mediante
el método de ebullición de una colonia de cada levadura en 100 uL de agua destilada estéril
(Colony – PCR). Esta suspensión de levadura fue calentada a 100°C durante 10 minutos en
un termociclador PxE 0.2 (ThermoElectron Corporation, USA).
Para la PCR, los iniciadores usados fueron ITS1 (5'TCCGTAGGTGAACCTGCGG3') e
ITS4 (5'TCCTCCGCTTATTGATATGC3') (White y col. 1990). Se tomaron 5 μL de ADN
extraído y se suspendieron en 45 uL de la mezcla de PCR que contenía: 1X de solución
tampón de PCR, 1.5 mM de MgCl2, 0.8 μM de cada iniciador IST1 e ITS4, 10 μM de
dNTPs, 1 unidad de Taq ADN polimerasa (TucanTaq ADN polimerasa, Corpogen, Bogotá
Colombia) y agua destilada ultrapura hasta completar un volumen final de 50 uL. La PCR
se realizó en un termociclador PxE 0.2 (ThermoElectron Corporation, USA) con las
siguientes condiciones: Desnaturalización inicial a 94°C durante 3 minutos, seguidos de
30 ciclos de desnaturalización a 94°C durante 30 segundos, apareamiento de los
iniciadores a 57°C durante 1 min, extensión 72°C durante 1 minuto y extensión final 72°C
durante 3 min (Esteve-Zarzoso et al., 1999).
Identificación de levaduras presentes en el proceso de transformación de polen corbicular a pan de abejas por métodos moleculares
73
Alícuotas de 5 uL de cada amplificado fueron mezclados con 5 uL de solución tampón de
carga y sometidos a electroforesis en geles de agarosa al 1 %, teñidos con bromuro de
etidio, en solución tampón TBE 1X (90 mM Tris, 90 mM Borato y 2 mM EDTA, pH 8.3).
Los fragmentos fueron corridos a 70 voltios en una hora y luego visualizados en un
transiluminador UV (Spectroline USA). El tamaño de los amplificados fue comparado con
un marcador molecular de 100 pb (Promega WI, USA). El volumen restante de todos los
productos de PCR (45 uL), fueron enviados a MACROGEN (Corea del Sur) para que
fueran secuenciados por el método capilar. Una vez obtenidas las secuencias se
compararon con la base de datos del GenBank, usando la herramienta BLASTn, y se
recuperaron aquellas secuencias de referencia encontradas que estuvieran más
relacionadas con las secuencias obtenidas. Con las secuencias de las cepas
identificadas se realizó un análisis basado en similitud por medio de alineamientos
múltiples sobre cepas de referencias relacionadas utilizando el programa MUSCLE en el
servicio online del EMBL http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/en y se utilizó
paralelamente un método de asociación taxonómica bayesiano (Liu, Porras-Alfaro, kuske,
Eichorst, & Xie, 2012): Fungal LSU
Classifierhttps://rdp.cme.msu.edu/classifier/classifier.jsp.
4.5 Resultados De las 48 muestras que se tomaron de polen alveolar de colmenas de A. mellifera, se
aislaron 29 levaduras a partir de los diferentes tipos de llenado. A cada levadura se le
extrajo el ADN genómico y posteriormente se amplificó un fragmento de la región 5.8s-
ITS del ARNr. Los amplificados obtenidos fueron polimórficos en tamaño, obteniéndose
bandas entre 400 y 750 pb, lo cual indicaba la presencia de levaduras que pertenecían a
géneros diferentes. De los 29 aislamientos cinco presentaron secuencias de baja calidad,
por lo cual no se incluyen en el reporte de resultados. El análisis bioinformático, realizado
por alineamiento de las secuencias obtenidas en el programa BLASTn del Genbank,
permitió determinar que los 24 aislamientos presentaron identidades entre el 92 y el 100
% con cuatro especies diferentes de levaduras: Candida apicola (diez aislamientos),
Kodamea ohmeri (ocho aislamientos), Mestchikowa pulcherrima (tres aislamientos) y
Zygosaccharomyces siamensis (tres aislamientos). Los tamaños de las secuencias
obtenidas variaron entre 500 pb y 700 pb.
74 Identificación de levaduras presentes en el proceso de transformación de polen corbicular a pan de abejas por métodos tradicionales y moleculares
Respecto a la relación de las levaduras aisladas con el nivel de llenado del alvéolo, en el
estadio de llenado uno se obtuvieron cuatro aislamientos de los cuales el 50 %
correspondieron a la especie C. apícola, el 25 % a K. ohmeri y el 25 % a Z. siamensis. En
el nivel de llenado dos se obtuvieron seis aislamientos de los cuales el 83 % se
identificaron como C.apicola y el 17 % como Z. siamensis. Para el tercer estadio de
llenado se obtuvieron cinco aislamientos de los cuales el 40 % correspondieron a K. ohmeri, el 40 % a M. Pulcherrima y el 20 % a Z. siamensis. De los alveolos con volumen
de llenado completo se obtuvieron nueve aislamientos de los cuales el 56 % fueron
identificados como K. ohmeri, el 33 % como C. Apícola y el 11 % como M. pulcherrima.
La Figura 4 resume las especies de levaduras obtenidas en cada etapa de llenado del
alveolo.
Figura 4-1. Levaduras aisladas en pan de abejas de apis mellifera según el volumen de
llenado del alveolo
Fuente: Construcción propia, 2016.
≤ 2 mm
≤10 mm
≤15 mm
≥ 15mm Candida apicola
Candida apicola
Kodamaea ohmeri
Kodamaea ohmeri
Kodamaea ohmeri
Metschnikowia pulcherrima
Metschnikowia pulcherrima
Zygosacharomyces siamensis
Zygosacharomyces siamensis
Zygosacharomyces siamensis
VOLU
MEN
APR
OXI
MAD
O D
E LL
ENAD
O D
EL
ALVE
OLO
ESPECIE DE LEVADURA AISLADA
Identificación de levaduras presentes en el proceso de transformación de polen corbicular a pan de abejas por métodos moleculares
75
A partir de las 48 muestras de pan de abejas en pote procedentes de los meliponinos, T. angustula, Paratrigona sp., Plebeia sp. y Scaptotrigona sp., fueron aisladas y
caracterizadas 43 levaduras. La amplificación de la región 5.8s-ITS del ARNr de los
aislamientos generaron diferentes tamaños de bandas entre 400 y 800 pb.
Mediante el alineamiento de las secuencias de las 43 especies de levaduras de abejas
nativas, se pudo establecer que había identidad entre el 91 y el 100 %, con seis especies
de levaduras reportadas en GenBank: Candida apícola (21 cepas, 49 %), Candida cellae
(10 cepas, 23 %), Starmerella bombicola (7 cepas, 16 %), Kodamea ohmeri (2 cepas, 5
%), Candida magnoliae (2 cepas, 5 %) y Metschnikowia pulcherrima (1 cepa, 2 %).
En cuanto a una posible asociación entre géneros de abejas nativas y de levaduras, se
estableció que para las muestras analizadas las dos especies de Candida (apícola y cellae), fueron predominantemente aisladas en el polen de pote de los géneros Plebeia sp y Scaptotrigona sp., mientras que los otros cuatro géneros de levaduras (S. bombicola, K. ohmeri y M. pulcherrima) solo fueron aisladas en muestras de abejas T. angustula y Paratrigona sp.
Para describir las relaciones representadas en un dendrograma resultante de las
distancias calculadas entre las secuencias alineadas, se realizó un alineamiento conjunto
de las secuencias obtenidas a partir de las levaduras aisladas de pan de abejas de A. mellifera y de abejas nativas. Como se pudo observar, existen levaduras que representan
grupos solo encontrados en la colección proveniente de los panes de abejas nativas,
dichos aislamientos presentan una similitud y tamaño relacionados con los ITS
encontrados en cepas de referencia de cultivos de diversas especies del género
Zygosaccharomyces spp. Sin embargo, los resultados muestran que no presentan la
misma relación con las cepas reportadas en bases de datos, y por lo tanto pueden ser
aislados de especies aún no descritas dentro de este género. No obstante, las
secuencias dentro de dicho género de la familia Saccharomycetaceae son las más
cercanas, y dada la distancia observada, es incluso equivalente a la observada entre
representantes de distintos géneros, por lo tanto, la taxonomía de esa levaduras
exclusivamente encontradas en abejas nativas, pueden también estar representando
aislamientos de cepas en géneros no reportados (Figura 4-2).
76 Identificación de levaduras presentes en el proceso de transformación de polen corbicular a pan de abejas por métodos tradicionales y moleculares
Figura 4-2. Árbol de distancias (nj tree) resultante del alineamiento de las secuencias de its obtenidas de las cepas de levaduras aisladas a partir de pan de abejas de apis mellifera y de la tribu meliponini
Identificación de levaduras presentes en el proceso de transformación de polen corbicular a pan de abejas por métodos moleculares
77
Apis mellifera= A, en azul seguido del número de la cepa y del porcentaje de llenado de
la celda en porcentaje, 25 %, 50 %, 75 % o 100 %) y del tamaño del ITS comparado.
Abejas de la tribu Meliponini = N, en color rojo, seguido del número asignado a la cepa
aislada, y del tamaño del ITS comparado. Para abejas nativas las siglas corresponden a
TA= Tetragonisca angustula, P= Paratrigona sp, Pl= Plebeia sp. y S= Scaptotrigona sp.
Ambigüedades no resueltas (N), se indican con MQ (calidad media) o LQ (baja calidad).
Para corroborar los resultados obtenidos por métodos de distancia (alineamiento de las
secuencias y matriz de similitud), adicionalmente se realizó la clasificación de cada uno
de los datasets de secuencias de levaduras de pan de Apis mellifera o de abejas nativas,
utilizando la nueva herramienta disponible en RDP Classifier
https://rdp.cme.msu.edu/classifier/classifier.jsp (Liuet al., 2012; Wanget al., 2007).
Para tal fin, se utilizó la base de datos Warcup ITS fungal training set. Los resultados con
el set UNITE de Kessy Abarenkov fueron idénticos (Australian Bioinformatic Network,
2014).
Los resultados de clasificación por este método se muestran a continuación:
Clasificación de secuencias de levaduras de pan de abejas A. mellifera» »
domain Fungi (24)
» » » phylum Ascomycota (24)
» » » » subphylum Saccharomycotina (24)
» » » » » class Saccharomycetes (24)
» » » » » » subclass Saccharomycetidae (24)
» » » » » » » order Saccharomycetales (24)
» » » » » » » » family Metschnikowiaceae (1)
» » » » » » » » » genus Metschnikowia (1)
» » » » » » » » » » species Metschnikowia pulcherrima (1)
» » » » » » » » family Saccharomycetaceae (3)
» » » » » » » » » genus Zygosaccharomyces (3)
» » » » » » » » » » species Zygosaccharomyces siamensis (3)
» » » » » » » » family Saccharomycetales_Incertae sedis (18)
78 Identificación de levaduras presentes en el proceso de transformación de polen corbicular a pan de abejas por métodos tradicionales y moleculares
» » » » » » » » » genus Candida (10)
» » » » » » » » » » species Candida apicola (10)
» » » » » » » » » genus Kodamaea (8)
» » » » » » » » » » species Kodamaea ohmeri (8)
» » » » » » » » unclassified_Saccharomycetales (2)
Clasificación de secuencias de levaduras de pan de abejas nativas » » domain Fungi (46)
» » » phylum Ascomycota (45)
» » » » subphylum Saccharomycotina (42)
» » » » » class Saccharomycetes (42)
» » » » » » subclass Saccharomycetidae (42)
» » » » » » » order Saccharomycetales (42)
» » » » » » » » family Saccharomycetaceae (4)
» » » » » » » » » genus Zygosaccharomyces (4)
» » » » » » » » » » species Zygosaccharomyces mellis (3)
» » » » » » » » » » species Zygosaccharomyces siamensis (1)
» » » » » » » » family Saccharomycetales_Incertae sedis (36)
» » » » » » » » » genus Kodamaea (2)
» » » » » » » » » » species Kodamaea ohmeri (2)
» » » » » » » » » genus Candida (24)
» » » » » » » » » » species Candida metapsilosis (3)
» » » » » » » » » » species Candida versatilis (1)
» » » » » » » » » » species Candida apicola (19)
» » » » » » » » » » unclassified_Candida (1)
» » » » » » » » » genus Starmerella (6)
» » » » » » » » » » species Starmerella bombicola (1)
» » » » » » » » » » unclassified_Starmerella (5)
» » » » » » » » » unclassified_Saccharomycetales_Incertae sedis (4)
» » » » » » » » unclassified_Saccharomycetales (2)
» » » » unclassified_Ascomycota (3)
» » » unclassified_Fungi (1)
Los resultados sugieren que existe una relación entre la presencia de un determinado
Identificación de levaduras presentes en el proceso de transformación de polen corbicular a pan de abejas por métodos moleculares
79
género de levaduras y el nivel de llenado de los alvéolos en colonias de A. mellifera,
como es el caso de M. Pulcherrima, lo cual puede ser generado por cambios en el
microambiente de cada etapa de llenado, que conllevarían a favorecer el crecimiento de
un tipo en particular de levadura. De forma similar, los datos generados en este estudio
permiten suponer que se presenta una asociación entre el género de abeja nativa y las
especies de levaduras presentes en el proceso de transformación de polen a pan de
abejas. Estos hallazgos deben ser corroborados y tenidos en cuenta, para imitar el
proceso de elaboración de pan de abejas con fines industriales.
4.6 Discusión En el caso de Apis mellifera para la colección de aislamientos generada, se observó una
mayor recuperación de levaduras altamente relacionadas con la especie Candida apicola, especialmente en la tercera etapa de llenado alveolar. Dicha levadura fue aislada
inicialmente en tractos digestivos de la mencionada especie de insecto (Hajsig, 1958;
citado por Vega y Blackwell, 2005) y se ha aislado también en el intestino de abejas del
género Melipona (Rosa et al., 2003). C. apícola es una levadura osmotolerante
reconocida como productora de ácidos grasos y enzimas de interés biotecnológico como
reductasas y proteasas (Vega-Alvarado et al., 2015).
La especie Kodamaea ohmeri se presentó como la segunda levadura con mayor
frecuencia de recuperación. K. ohmeri se aisló de intestinos de abejas de la especie
Melipona cuadrifasciata (Daniel et al., 2013; Rosa et al., 2003), Bombus impatiens y Bombus pensylvanicus (Graham et al., 2011). Esta levadura se ha reportado como un
patógeno emergente en humanos inmunocomprometidos, y sus hábitats o muestras
desde donde se ha aislado son muy variados: sedimentos marinos, chiles, pepinos en
conserva, escarabajos, entre otros, y de hecho, su presencia en miel o en derivados de
abejas se asocia con afectaciones por invasión de escarabajos predadores de abejas y
sus productos (Torto et al., 2007).
En los estadios de llenado alveolar del uno al tres se detectó la presencia de la levadura,
Zygosaccharomyces siamensis, la cual fue reportada en mieles procedentes de Tailandia
(Saksinchai et al., 2012), aislamientos del género Zygosaccharomyces se ha asociado a
la miel y el polen corbicular de abejas Apis mellifera (Carvalho et al., 2014) y de intestinos
80 Identificación de levaduras presentes en el proceso de transformación de polen corbicular a pan de abejas por métodos tradicionales y moleculares
de abejas de la especie T.angustula; igualmente levaduras del género
Zygosaccharomyces se asocian con procesos de producción vinagres tradicionales de
Italia (Solieri et al., 2013).
La levadura Metschnikowia pulcherrima fue aislada exclusivamente en los segmentos de
llenado alveolar tres y cuatro, en los cuales el pan de abejas presentaba mayor grado de
maduración. La levadura se ha reportado en muestras de polen corbicular de Apis mellifera (Guillian, 1979) y en tractos digestivos de los abejorros de origen europeo
Bombus terrestris y Bombus pascuorum (Brysch-Herzberg, 2004). M. pulcherrima corresponde a una especie con alta capacidad de colonización, lo que ha generado su
utilización como biocontrolador de hongos entomopatógenos (David et al., 2002),
adicionalmente se ha comprobado que esta forma levadural presenta actividad
antagonista frente a una diversidad de levaduras, entre estas Brettanomyces,
Hanseniaspora y del género Pichia, sin embargo no muestra ningún efecto sobre
aislamientos del género Saccharomyces. Debido a este comportamiento la levadura es
utilizada en los primeros estadios de los procesos de fermentación de mostos, como un
organismo co-fermentador (Oro & Comitini, 2014). Para el caso del pan de abejas,
posiblemente la M. pulcherrima desempeña un papel similar, facilitando el crecimiento de
un grupo específico de levaduras.
También se encontraron de manera específica aislamientos exclusivos de pan de abejas
en pote de la tribu Meliponini, como es el caso del aislado N24 obtenido de Plebeia spp.,
altamente relacionado con una cepa de referencia de Yarrowia lipolytica, especie
importante en procesos de fermentación de productos lácteos; La muestra N15 obtenida
exclusivamente de abejas T. Angustula, se encuentra altamente relacionada con cepa
tipo de Candida versatilis un arquetipo de levadura resistente a condiciones halófilas e
importante por esa característica en procesos de fermentación y curado (Hou et al.,
2014), con importancia industrial por su capacidad de degradar compuestos hidrofóbicos.
Dicha levadura, no presenta reportes que la asocien con aislamientos desde abejas o
derivados, como en este caso.
Los aislamientos N26 y N27 de pan de pote de Plebeia spp., así como el aislado N21 de
T. angustula, se asociaron con el clúster de Candida ortho-, meta- y parapsilosis, que se
Identificación de levaduras presentes en el proceso de transformación de polen corbicular a pan de abejas por métodos moleculares
81
relacionan con procesos infecciosos con diferentes grados de virulencia (Vega &
Blackwell, 2005), pero que también se han encontrado en suelos y asociadas a insectos,
e incluso se plantea su uso como biocontroladores. Si bien hay otros casos de tipos de
cepas exclusivas de pan de abejas nativas, como N25 y N28, obtenidos de colonias de
Plebeia spp., con ITS altamente relacionados con C. stigmatis y C. atakaporum; o N14,
asociado con ITS reportados para cepas de M. pulcherrima, hay casos de alta repetición
y mayor abundancia, notablemente las cepas que presentan ITS idénticos en la
secuencia comparada (10 aislamientos de levaduras de abejas nativas), que pueden ser
clasificados como de la especie Starmerella meliponinorum (Teixeira et al., 2003), dado
que no presentan diferencias con el ITS reportado para las cepas de referencia. Esta
levadura fue inicialmente aislada y fue la primera especie reportada a partir de cepas
aisladas de material proveniente de abejas sin aguijón, tanto de material fecal, como de
polen y miel. Asimismo, para el caso de cepas relacionadas con C. apícola, aunque se
presenta una microheterogeneidad del ITS, se observa una clara afiliación de un número
alto de levaduras provenientes de polen de pan de abejas tanto de Apis mellifera como
de nativas; sin embargo, se ven que son poblaciones altamente relacionadas pero con
una separación intraespecie que diferencia aquellas que provienen de Apis mellifera de
aquellas que provienen de las abejas nativas. La diferencia en ITS sugiere que no son
exactamente el mismo tipo de C. apícola, por lo cual es posible que existan diferencias
funcionales y de adaptación a cada tipo de abeja o a la asociación con el polen de
preferencia, situaciones que no son evidenciables por los métodos genéticos.
4.7 Conclusiones y recomendaciones Como se puede observar en estas clasificaciones, los resultados de afiliación son
análogos a los que se pueden concluir a partir de los resultados del árbol de
distancias, esto es, similitud entre secuencias obtenidas de ITS vs. secuencias
reportadas para las cepas de referencia. Esto da soporte a las observaciones que
sugieren: 1. Presencia de tipos específicos de mayor abundancia de las levaduras
aisladas a partir de cada tipo de pan de abeja, ya sea originario de Apis o de
nativas. 2. Grupos de levaduras que son compartidos en los procesos de
fermentación y maduración que ocurren en el pan de abejas. 3. Posible evidencia de
levaduras introducidas por predadores escarabajos en el caso de apicultura con
Apis mellifera, que adicional al efecto sobre la producción de miel, son reportados
82 Identificación de levaduras presentes en el proceso de transformación de polen corbicular a pan de abejas por métodos tradicionales y moleculares
como patógenos oportunistas de humanos. 4. La presencia de levaduras que de
acuerdo con la evidencia de variabilidad de ITS con respecto a las cepas de
referencia, pueden representar nuevas especies o incluso géneros no reportados. 5.
La posibilidad de contar con una colección caracterizada de cultivos de levaduras
con identidad genética conocida, lo cual permite diseñar modelos mixtos de
inoculación que podrían iniciar el desarrollo de fermentaciones aceleradas de polen
con cepas seguras y en condiciones controladas. 6. La presencia generalizada de
C. apícola con cepas que presentan un patrón de selección intraespecie según el
tipo de abeja, nativa o Apis, de la que provenga el material del pan de abeja.
La utilidad de la colección de cepas caracterizadas puede ser evaluada con la
experimentación de material polínico de composición constante y de fácil
recolección, que permita evaluar fermentaciones controladas para obtener
sucesiones de poblaciones de levaduras que logren las propiedades del pan de
abejas de una manera estandarizada. El conocimiento de las nuevas variedades de
cepas que posiblemente representan nuevos géneros o especies puede ser
profundizado para llegar a esa descripción completa. La util idad del uso de
clasificación por secuencias que sirven de barcoding molecular en la colección de
las cepas permite tener una mayor discriminación y precisión en la agrupación de
los fenotipos observados en la colección de levaduras. Este camino puede ser
extendido a más microorganismos de aislamientos nuevos. Asimismo, esta
información permitirá tener una línea base desde la cultivabilidad de levaduras en
estudios posteriores que se realicen por métodos independientes de cultivo
evaluando las poblaciones eucariotas totales en los productos y subproductos de
abejas. Adicionalmente, dadas las características, usos y bioactividades de los
productos derivados de la apicultura, y la influencia en su generación por parte de
los microorganismos asociados con la abeja y el polen, esta colección cuenta como
un insumo inicial para propuestas que busquen bioprospecciones específicas a
partir de este recurso de diversidad, de una manera sistemática y
compartimentalizada, iniciando por organismos aislados a partir de dichas
relaciones.
Identificación de levaduras presentes en el proceso de transformación de polen corbicular a pan de abejas por métodos moleculares
83
4.8 Referencias Asama, T., Arima, T. H., Gomi, T., Keishi, T., Tani, H., Kimura, Y., ... & Hashimoto, K.
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5. Discusión
Al analizar los resultados obtenidos por los dos sistemas de identificación de levaduras
empleados en el estudio se observan coincidencias en algunos aspectos generales, por
ejemplo en los dos métodos se identificaron especies de levaduras exclusivas de las
abejas nativas y de Apis mellifara lo que soporta la hipótesis de que se presentan
asociaciones específicas entre levaduras y géneros o especies de abejas. Para el caso
de las abejas Apis mellifera, los dos métodos de identificación empleados, coinciden en
detectar especies de levaduras que aparecen solo en etápas específicas del llenado
alveolar. Igualmente los dos sistemas de identificación coinciden en presentar a las
levaduras del género Candida como el aislado más frecuente.
La identificación de las especies de las levaduras cultivables presentes en los procesos
de conversión del polen floral, en el alimento finalmente consumido por las abejas, no
resultó ser idéntica por los dos métodos empleados en el estudio.
En la caracterización de los aislamientos por métodos bioquímicos mediante el uso del
Sistema automatizado Vitek2 ®, se reportó la presencia de tres especies de candidas, C. pulcherrima, C. parasilopsis y C. famata, así como también de Rhodotorula glutinis y Kodamaea ohmeri; de estas levaduras, se confirmaron por métodos moleculares, la
presencia de C. pulcherrima, C.parasilopsis y K.ohmeri. Para los aislamintos identificados
inicialmente por el Vitek2 ® como C. famata y R. glutinis el análisis molecular presentó
diferencias, al ser identificadas como Candida apicola. El 45% de las levaduras aisladas
en el pan de abejas de Apis mellifera no fueron clasificadas por el sistema Vitek2 ®, entre
las cuales el método molecular detectó la presencia de Candida apicola, y Zygosacharomyces siamensis.
Para las muestras de pan de abejas de meliponinos, el Vitek2 ® detectó la presencia de
las levaduras Candida pulcherrima, Candida Parapsislosis y Kodamaea ohmeri que
fueron confirmadas por el método molecular utilizado en el estudio. Adicionalmente el
88 Identificación de levaduras presentes en el proceso de transformación de polen corbicular a pan de abejas por métodos tradicionales y moleculares
sistema detecto la presencia de aislamientos de Candida famata, que posteriormente se
identificaron por el método molecular como Candida apícola, Starmerella meliponinorum y Starmerella bombicola, igualmente se presentaron aislamientos no identificados por el
sistema Vitek2 ® , los cuales fueron detectados por el método molecular como Candida apícola, Candida pulcherrima, Starmerella meliponinorum, Zigosaccharomyces mellis,
Zigosaccharomyces siamensis y Yarrowia lipolytica.
Las diferencias en la identificación de las levaduras por los dos métodos utilizados,
evidencian que, si bien el sistema Vitek2®, es un método de gran valor, para la
detección de levaduras de interes en salud humana, presenta limitantes para el
desarrollo de estudios efectuados en otro tipo de muestras como el pan de abejas, dado
que en la base de datos de éste sistema de identificación solo se encuentran alojados
patrones para la detección de 51 levaduras de origen clínico. Al comparar la base de
datos de todas las levaduras identificadas por técnicas moleculares en el estudio, contra
la base de datos del Sistema Viek2®, se evidencia en el pan de abejas, la presencia de
los géneros Starmerella, Zigosaccharomyces y Yarrowia, los cuales no se encuentran en
la base de datos del sistema bioquímico, asimismo al efectuar la misma comparación a
nivel de especies se observa que solo el 27% de las levaduras detectadas por métodos
moleculares se encuentran en el sistema Vitek2®.
Los resultados obtenidos bajo los dos métodos de identificación utilizados en el estudio,
muestran claramente las ventajas del uso de técnicas moleculares, sobre los métodos
bioquímicas en cuanto a la capacidad de identificación de los aislamientos procedentes
de pan de abejas, dado que dicha técnica permitió reconocer la totalidad de las levaduras
obtenidas en el estudio, así mismo, se presenta coherencia entre la identificación
molecular y las características morfológicas de las colonias, lo que no ocurrió en todos
los casos con la identificación efectuada por el sistema Vitek2®.
Para la levadura C. apícola el análisis molecular identificó un alto número de
aislamientos, sin embargo existen diferencia que sugieren que no son exactamente el
mismo tipo, por lo cual es posible que existan adaptaciones funcionales a cada tipo de
abeja o a la asociación con el polen de preferencia, situaciones que no son evidenciables
por los métodos moleculares, pero que indican que aún con la misma especie del
hospedero hay variedad específica seleccionada intraespecie de levadura, en
consecuencia se hace relevante el análisis bioquímico efectuado por el sistema Vitek2 ®,
Discusión 89
dado que dichos resultados permiten inferir diferencias en la fisiología de los
microorganismos independientemente del nivel de certeza en la identificación, lo que
genera aportes importantes para el entendimiento del proceso de transformación del
polen corbicular a pan de abejas.
A pesar de las ventajas descritas para los métodos moleculares en cuanto a
identificación de los aislamientos, estos ofrecen poca información sobre el
entendiemiento del metabolismo de las levaduras asociadas al proceso de maduración
del polen, lo cual correspondió a un hallazgo relevante detectado en el presente estudio,
al encontrarse por el sistema Vitek2 , sustratos que eran asimilados por levaduras
obtenidas solo en etapas específicas del llenado o sustratos asimilados por levaduras de
una especie de abeja en particular, en consecuencia se puede inferir que para el
entendimiento del proceso de transformación del polen corbicular al pan de abejas, se
requiere del uso conjunto de técnicas macroscópicas, microscópicas, moleculares y de
actividad metabólica en un sustrato de prueba, que permitan identificar los aislamientos,
también es deseable incluir estudios de metagenómica y metabolómica que permitan
comprender que microorganismos participan en el proceso, incluidos los no cultivables y
cómo ocurre el proceso fermentativo al interior de las colmenas en las diferentes
especies de abejas.
Le metodología empleada para valorar las levaduras presentes en la transformación de
polen a pan de abejas en Apis mellifera, mediante la separación de las muestras en
diferentes etapas de llenado del alveolo, aporta información anteriormente no descrita
para el proceso de maduración del polen, y por lo tanto puede ser utilizada como
metodología para entender los cambios en la microflora durante el mencionado proceso,
dado que existen estudios previos efectuados incluso por técnicas de metagenómica, que
reportan una variedad de microflora asociada al pan de abejas, pero se desconoce si los
microorganismos aperecen o desaparecen en una etapa específica del proceso de
maduración.
Los resultados obtenidos en el presente estudio confirman la presencia de las levaduras
en los procesos de transformación del polen a pan de abejas, tanto en la especie Apis mellifera como en abejas de la tribu Meliponini. Sin embargo, se desconoce cuál es la
actividad particular que ejerce cada especie de levadura dentro del polen; el
90 Identificación de levaduras presentes en el proceso de transformación de polen corbicular a pan de abejas por métodos tradicionales y moleculares
entendimiento de su metabolismo sobre este sustrato vegetal puede posibilitar el uso de
estos microorganismos para la elaboración de pan de abejas industrial, y la
transformación de materiales vegetales que se destinen a consumo animal e incluso
otros usos industriales, dado que entre las levaduras obtenidas del pan de abejas,
diversas especies reportan actividades de interés en procesos aplicados a la industria,
principalmente en fermentación.
6. Conclusiones y Recomendaciones
6.1 Conclusiones La metodología de muestreo utilizando cuatro niveles de llenado de los alveolos en el
proceso de conversión del polen a pan de abejas de Apis mellifera, permitió diferenciar
los microorganismos durante los 15 días que se realiza el proceso de fermentación de
forma natural.
Se identificó la presencia de levaduras asociadas a etapas específicas de llenado del
alveolo en pan de abejas de Apis mellifera, como Z. siamensi, que se detectó en los
tres primeros estadios de llenado, y Metschnikowia pulcherrima, que fue aislada
exclusivamente en los dos estadios finales de llenado.
La presencia de diversos tipos de levadura en las etapas de llenado del polen alveolar
probablemente indican variadas funciones de las mismas en el proceso de conversión
del polen corbicular al pan de abejas.
La identifiacación mediante el sistema automatizado Vitek2®, no permitio la
caracterización de todos los aislamientos obtenido a partir del pan de abejas de Apis mellifera y el polen de pote de abejas de la tribu Meliponini., debido a que este
sistema solo cuenta hasta el momento con una base de datos de 51 especies de
levaduras principalmente de interés clínico.
Los resultados obtenidos a partir de los análisis bioquímicos efectuados por el sistema
Vitek2® aportaron información importante para entender la cinética del proceso de
maduración del polen corbicular a pan de abejas.
92 Identificación de levaduras presentes en el proceso de transformación de polen corbicular a pan de abejas por métodos tradicionales y moleculares
Para Apis mellifera se aisló mayor diversidad de levaduras en los estadios de mayor
maduración del polen apícola.
Se presentaron aislamientos frecuentes de la especie Candida apícola en pan de
abejas de Apis mellifera y pan de abejas en pote de la tribu Meliponini, lo que sugiere
que es de gran importancia para el proceso de maduración del polen.
La especie de levadura Starmerella meliponinorun se identificó en el polen de pote de
abejas de las especies T.angustula, Paratrigona sp., y Plebeia sp; la especie de
levadura Yarrowia lipolytica se encontró de forma exclusiva en el polen de potes de
abejas de la especie Plebeia sp., mediante la identificación molecular.
Las levaduras Candida versatilis y Starmelera bombicola fueron identificadas de forma
exclusiva en el polen de pote de abejas de la especie Tetragonisca angustula. Para el
caso de C. versatilis, este reporte corresponde al primero conocido que asocia dicha
levadura con los productos de las abejas, por lo cual se sugiere realizar estudios
evaluando otro métodos fenotípicos y moleculares.
Las levaduras Candida metasilosis, Candida orthopsilosis y Candida Parasilopsis se
encuentran asociadas con el pan de abejas en pote de la tribu Meliponini T.angustula
y Plebeia sp.
La existencia de levaduras exclusivas del polen de pote en abejas de la tribu
Meliponini indican que se presentan procesos fermentativos diferentes entre estas
abejas y las Apis mellifera.
6.2 Recomendaciones A partir de los hallazgos del presente estudio se recomienda ampliar la investigación en
los siguientes aspectos.
Evaluar otros metodos de identificación fenotipos y genotípicos de levaduras
obtenidas a partir de pan de abejas de Apis mellifera y polen de pote de abejas de la
tribu Meliponini, así como en las diferentes etapas de llenado durante el proceso de
Conclusiones y Recomendaciones 93
transformación natural de polen a pan de abejas para garantizar la identificación
completa de los aislamientos, en consideración al posible potencial de uso de estos
microorganismos en la transformación de polen a pan de abejas de forma industrial.
Caracterizar la función de las levaduras reportadas, para conocer el rol que estas
desempeñan en las las diferentes etapas de la fermentación natural del polen, con el
objeto de poder generar estudios encainados al aislamiento de procesos industriales
para la elaboración del pan de abejas, utilizando las levaduras que se encuentran
presenten naturalmente en el proceso.