ĐẠi hỌc quỐc gia hÀ nỘi trƢỜng ĐẠi h c...

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---------------------

Đặng Thị Kim Anh

CẢI BIẾN GEN MÃ HÓA ENZYME PHYTASE TỪ NẤM MỐC

Aspergillus niger NHẰM TĂNG KHẢ NĂNG HỒI TÍNH CỦA

PHYTASE SAU KHI BỊ BIẾN TÍNH Ở NHIỆT ĐỘ CAO

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2015

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---------------------


CẢI BIẾN GEN MÃ HÓA ENZYME PHYTASE TỪ NẤM MỐC

Aspergillus niger NHẰM TĂNG KHẢ NĂNG HỒI TÍNH CỦA

PHYTASE SAU KHI BỊ BIẾN TÍNH Ở NHIỆT ĐỘ CAO

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS. TS. Vũ Nguyên Thành

TS. Trần Văn Tuấn

Hà Nội – Năm 2015

Luận văn thạc sĩ

K21-Sinh học thực nghiệm Đặng Thị Kim Anh

Lời cảm ơn

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Vũ Nguyên Thành,

Thầy đã tận tình chỉ bảo, hƣớng dẫn tôi trong suốt quá trình học tập và thực

hiện luận văn này. Thầy cũng chính là tấm gƣơng đầy nhiệt huyết, say mê

nghiên cứu khoa học giúp tôi tiếp cận, trau dồi kiến thức mới từ đó có thể

định hƣớng, giải quyết các vấn đề trong quá trình nghiên cứu.

Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn TS. Trần Văn Tuấn cùng các thầy, cô

giáo trong Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên đã nhiệt tình

giảng dạy, dìu dắt tôi trong thời gian học tập tại trƣờng.

Trong quá trình thực hiện luận văn, tôi cũng nhận đƣợc rất nhiều sự

quan tâm giúp đỡ của các thầy cô giáo thuộc Bộ môn Sinh lý thực vật và Hóa

sinh. Tôi xin chân thành cảm ơn.

Tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành tới các anh, chị nghiên cứu

viên và các bạn sinh viên làm việc tại Trung tâm Vi sinh vật Công nghiệp,

Viện Công nghiệp Thực phẩm đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong suốt quá

trình học tập và làm việc tại Trung tâm.

Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đình và bạn bè đã luôn ở bên, khích

lệ động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua.

Hà Nội, ngày 25 tháng 06 năm 2015

Học viên




MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 21

CHƢƠNG 1 – TỔNG QUAN ............... ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED.

1.1. AXIT PHYTIC VÀ PHYTATE ...................... ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED.

1.2. ENZYME PHÂN GIảI PHYTATE (PHYTASE) ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED.

1.2.1. Phân loại enzyme phytase ........................... Error! Bookmark not defined.

1.2.2. Nguồn phytase............................................ Error! Bookmark not defined.

1.3. ỨNG DụNG CủA PHYTASE .......................... ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED.

1.3.1. Trong chăn nuôi .......................................... Error! Bookmark not defined.

1.3.2. Trong công nghệ thực phẩm ....................... Error! Bookmark not defined.

1.3.3. Trong công nghiệp giấy .............................. Error! Bookmark not defined.

1.3.4. Trong cải tạo đất......................................... Error! Bookmark not defined.

1.3.5. Trong tổng hợp các dẫn xuất myo-inositol phosphateError! Bookmark not

defined.

1.4. CÁC NGHIÊN CứU TÁCH DÒNG BIểU HIệN PHYTASE TRÊN THế GIớI ........... ERROR!

BOOKMARK NOT DEFINED.

1.5. CÁC NGHIÊN CứU Về ENZYME PHYTASE ở VIệT NAM .. ERROR! BOOKMARK NOT

DEFINED.

1.6. CấU TRÚC PROTEIN LIÊN QUAN ĐếN KHả NĂNG HồI TÍNH CủA PHYTASE Từ A. NIGER

VÀ A. FUMIGATUS ............................................. ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED.

CHƢƠNG 2 – NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ERROR!


2.1. NGUYÊN LIỆU ....................................... ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED.

2.1.1. Hóa chất ...................................................... Error! Bookmark not defined.

2.1.2. Vi sinh vật ................................................... Error! Bookmark not defined.

2.1.3. Thiết bị ........................................................ Error! Bookmark not defined.

2.1.4. Môi trường nuôi cấy ................................... Error! Bookmark not defined.

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............ ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED.

2.2.1. Phương pháp Mega-PCR ............................ Error! Bookmark not defined.

2.2.2. Tinh sạch sản phẩm PCR từ gel agarose bằng bộ kit GenJETTM

Gel

Extraction .................................................................. Error! Bookmark not defined.

2.2.3. Ghép nối plasmid ........................................ Error! Bookmark not defined.



2.2.4. Biến nạp sản phẩm ghép nối plasmid vào E. coli bằng sốc nhiệt ..... Error!

Bookmark not defined.

2.2.5. Tách chiết plasmid từ vi khuẩn E.coli bằng bộ kit GenJETTM

Plasmid

Miniprep .................................................................... Error! Bookmark not defined.

2.2.6. Chuyển gen vào tế bào nấm men Pichia pastoris bằng phương pháp biến

nạp xung điện ............................................................ Error! Bookmark not defined.

2.2.7. Tách chiết DNA tổng số của Pichia pastorisError! Bookmark not defined.

2.2.8. Phương pháp nuôi biểu hiện nấm men Pichia pastoris .. Error! Bookmark

not defined.

2.2.9. Phương pháp điện di protein SDS - PAGE. Error! Bookmark not defined.

2.2.10. Xác định hoạt tính phytase ....................... Error! Bookmark not defined.

2.2.11. Lọc enzyme bằng thiết bị Viva Flow 200 .. Error! Bookmark not defined.

2.2.12. Tinh sạch protein bằng phương pháp sắc ký tương tác kỵ nước ..... Error!


CHƢƠNG 3 – KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬNERROR! BOOKMARK NOT

DEFINED.

3.1. CẢI BIẾN TRÌNH TỰ GEN MÃ HÓA PHYTASE .. ERROR! BOOKMARK NOT

DEFINED.

3.1.1. Phân tích đặc tính các gen phyA đã được tách dòng tại Viện Công nghiệp

Thực phẩm liên quan tới tính bền nhiệt .................... Error! Bookmark not defined.

3.1.2. Tạo đột biến điểm thay thế 4 axit amin bằng Mega-PCRError! Bookmark

not defined.

3.1.3. Tạo plamid chứa gen phyA-P12 mang đột biến điểmError! Bookmark not

defined.

3.2. CHUYỂN GEN PHYA VÀO TẾ BÀO NẤM MEN PICHIA PASTORISERROR!


3.2.1. Chuyển gen vào tế bào Pichia pastoris X33 bằng phương pháp biến nạp

xung điện ................................................................... Error! Bookmark not defined.

3.2.2. Kiểm tra gen mã hóa phytase trong genome của Pichia pastoris ..... Error!


3.2.3. Sàng lọc các thể biến nạp sinh phytase tái tổ hợp .... Error! Bookmark not

defined.

3.3. THU HỒI VÀ TINH SẠCH ENZYME PHYTASE TÁI TỔ HỢP ........ ERROR!




3.4. XÁC ĐỊNH CÁC ĐẶC TÍNH CỦA ENZYME PHYTASE TÁI TỔ HỢP SAU

KHI CẢI BIẾN GEN ....................................... ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED.

3.4.1. Xác định pH tối ưu của phytase tái tổ hợp . Error! Bookmark not defined.

3.4.2. Kiểm tra độ bền với các dải pH của phytase tái tổ hợp . Error! Bookmark

not defined.

3.4.3. Xác định nhiệt độ tối ưu của phytase tái tổ hợp ....... Error! Bookmark not

defined.

3.4.4. Kiểm tra khả năng hồi tính của phytase tái tổ hợp sau khi bị biến tính ở

nhiệt độ cao ............................................................... Error! Bookmark not defined.

KẾT LUẬN ............................................ ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED.

KIẾN NGHỊ ........................................... ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED.

TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 22

PHỤ LỤC ............................................... ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED.



BẢNG KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AOX1 Alcohol Oxidase 1

APS Ammonium Persulfate

BMGY Buffered Glycerol Complex Medium

BMMY Buffered Methanol Complex Medium

cDNA complementary Deoxyribonucleic acid

CNTP Công nghiệp thực phẩm

DNA Deoxyribonucleic acid

EC Enzyme Commission

FTU Đơn vị hoạt tính phytase

HIV Human Immunodeficiency Virus

IU International Unit

kb Kilobase

kDa Kilo Dalton

LB Luria-Bertani medium

NRRL

Northern Regional Research Laboratory

(hiện là National Center for Agricultural Utilization Research)

(Bảo tàng giống Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ)

OD Optical Density

PCR Polymerase Chain Reaction

RNA Ribonucleic acid

rpm Revolutions per minute

SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis

SSC Saline Sodium Citrate

TAE Tris-Acetate-EDTA

TBE Tris-Borate-EDTA

TCA Trichloroacetic acid

TEMED Tetramethylethylenediamine

YPD Yeast Extract-Peptone-Dextrose

YPDS Yeast Extract-Peptone-Dextrose-Sorbitol



DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu ................................................... 19

Bảng 2.2. Danh sách các chủng phục vụ trong nghiên cứu tách dòng gen mã hóa

phyA ......................................................................................................................... 20

Bảng 2.3. Thành phần gel chạy điện di protein ....................................................... 27

Bảng 2.4. Tƣơng quan giữa hàm lƣợng phospho vô cơ và OD700nm........................ 28

Bảng 3.1. Hoạt tính phytase tái tổ hợp của các thể biến nạp nuôi biểu hiện trên vi

đĩa 24 giếng .............................................................................................................. 41

Bảng 3.2. Hiệu suất thu hồi enzyme phytase tái tổ hợp bằng phƣơng pháp lọc luân

hồi Viva Flow 200 với kích thƣớc màng 5 kDa ....................................................... 42



DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Cấu trúc phân tử của myo-inositol - 1, 2, 3, 4, 5, 6 - hexakis dihydrogen

phosphate (axit phytic) ............................................................................................. 3

Hình 1.2. Cấu trúc protein của 4 nhóm enzyme phytase ......................................... 5

Hình 1.3. Cấu trúc tinh thể của enzyme phytase từ Aspergillus fumigatus ............. 14

Hình 1.4. Các cấu trúc đóng vai trò trong khả năng hồi tính của phytase

A. fumigatus .............................................................................................................. 16

Hình 2.1. Sơ đồ cấu trúc của vector pPICZαA, B, C .............................................. 18

Hình 2.2. Phƣơng pháp Mega-PCR cơ bản ............................................................. 22

Hình 3.1. Mô tả thí nghiệm tạo đột biến điểm thay thế 4 axit amin trên gen phyA

.................................................................................................................................. 31

Hình 3.2. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR, Mega – PCR 1 trên gel agarose 1%

trong đệm TAE ×0.5 ................................................................................................ 32

Hình 3.3. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR, Mega – PCR 2 trên gel agarose 1%

trong đệm TAE ×0.5 ................................................................................................ 33

Hình 3.4. Kết quả biến nạp sản phẩm ghép nối gen phyA mang 4 đột biến điểm vào

vector pPICZαA ....................................................................................................... 34

Hình 3.5. Điện di kiểm tra sản phẩm cắt giới hạn trên gel agarose 1% trong đệm

TAE ×0.5 .................................................................................................................. 35

Hình 3.6. Kết quả phân tích trình tự 5 plasmid pPICZαA/phyA/AAS1 - 5 sau khi

tạo đột biến điểm bằng phần mềm Bioedit 7.2.5 ..................................................... 36

Hình 3.7. Trình tự gen mã hóa phyA bền nhiệt từ Aspergillus niger CNTP 5131 và

vị trí liên kết trong pPICZαA của chủng tái tổ hợp Pichia pastoris CNTP 9057 .... 37

Hình 3.8. Kết quả điện di sản phẩm cắt giới hạn bằng MssI trên gel agarose 1%

trong đệm TAE ×0.5 ................................................................................................ 39

Hình 3.9. Kết quả biến nạp vector pPICZαA/phyA/P12 và pPICZαA/phyA/AAS5

vào tế bào Pichia pastoris X33 bằng phƣơng pháp xung điện ................................ 39

Hình 3.10. Kết quả điện di sản phẩm PCR bằng cặp mồi T-phyA-EcoRI-F/ phyA-

Stop-XbaI-R2 trên gel agarose 1% trong đệm TAE ×0.5 ........................................ 40

Hình 3.11. Kết quả điện di phytase tái tổ hợp trên gel SDS – PAGE 12% ............. 43

Hình 3.12. Xác định pH tối ƣu của phytase tái tổ hợp sau khi thay thế 4 axit amin ....

.................................................................................................................................. 45

Hình 3.13. Đánh giá độ bền pH của phytase tái tổ hợp sau khi thay thế 4 axit amin

.................................................................................................................................. 46



Hình 3.14. Xác định nhiệt độ tối ƣu của phytase tái tổ hợp sau khi thay thế 4 axit

amin .......................................................................................................................... 47

Hình 3.15. Đánh giá độ bền nhiệt của phytase tái tổ hợp sau khi thay thế 4 axit

amin .......................................................................................................................... 48



MỞ ĐẦU

Axit phytic (myo-inositol hexakisphosphate) là dạng phospho dự trữ chủ yếu

của thực vật. Axit phytic có thể chiếm 65 – 80% lƣợng phospho trong các loại ngũ

cốc, hạt các cây họ đậu và họ cải. Ngoài chức năng dự trữ phospho, axit phytic còn

liên kết chặt chẽ với các nguyên tố khoáng nhƣ Ca, Mg, Fe, Zn ... Axit phytic có

tính chất kháng tiêu hóa do khả năng liên kết với các protein, enzyme trong dịch

tiêu hóa của động vật.

Enzyme phytase (myo-inositol-1,2,3,4,5,6-hexakisphosphate phospho-

hydrolase) có vai trò quan trọng trong chăn nuôi. Phytase xúc tác cho phản ứng thủy

phân axit phytic thành những gốc phospho đơn vô cơ và các dẫn xuất đơn giản của

myo-inositol. Do vậy, khi bổ sung vào thức ăn chăn nuôi, phytase không chỉ có tác

dụng làm tăng khả năng hấp thu phospho, các nguyên tố khoáng mà còn cải thiện

khả năng tiêu hóa các hợp chất khác, đồng thời làm giảm lƣợng phospho thải ra

ngoài, góp phần bảo vệ môi trƣờng.

Phytase thƣơng phẩm hiện nay đƣợc sản xuất chủ yếu dựa trên nguồn gen từ

nấm mốc Aspergillus niger. Phytase từ A. niger có một số ƣu điểm nhƣ hoạt động ở

pH thấp, phù hợp với môi trƣờng axit của dịch dạ dày, có tính đặc hiệu cơ chất với

phytate cao, và bền với tác động của pepsin. Phytase từ A. niger có nhƣợc điểm là

kém bền nhiệt. Trong công đoạn ép viên, thức ăn chăn nuôi thƣờng đƣợc gia nhiệt

tới 70-80°C để diệt Salmonella. Chính vì vậy, enzyme bổ sung vào thức ăn chăn

nuôi phải đáp ứng yêu cầu về độ bền nhiệt.

Để đáp ứng yêu cầu kỹ thuật ngày càng cao, enzyme công nghiệp thƣờng đƣợc

cải biến theo hƣớng thay đổi cấu trúc nội tại. Một số nghiên cứu cấu trúc của

phytase bền nhiệt từ A. fumigatus cho thấy liên kết hydro và tƣơng tác ion trong cấu

trúc không gian có vai trò đảm bảo khả năng “đàn hồi” nhiệt của enzyme. Phytase

của A. niger không có những liên kết này nên dễ dàng bị bất hoạt và không có khả

năng hồi tính. Việc cải biến trình tự axit amin của phytase có thể gia tăng tính “đàn

hồi” nhiệt của enzyme.

Một trong những hƣớng nghiên cứu đƣợc thực hiện tại Trung tâm Vi sinh vật

Công nghiệp, Viện Công nghiệp Thực phẩm là khai thác nguồn gen thiên nhiên Việt

Nam nhằm tạo enzyme tái tổ hợp phục vụ ứng dụng trong chăn nuôi. Với phytase,

đã có 24 gen từ các loài khác nhau thuộc chi Aspergillus đƣợc tách dòng và nghiên


K21-Sinh học thực nghiệm 22 Đặng Thị Kim Anh

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng việt

1. Nguyễn Thùy Châu, (2009), “Hoàn thiện công nghệ sản xuất enzym phytaza để

bổ sung vào thức ăn chăn nuôi và phục vụ một số ngành công nghiệp”, Báo cáo

dự án khoa học kỹ thuật-Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, Viện Cơ

điện Nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch.

2. Vũ Duy Giảng, (2004), “Enzyme thức ăn”, Đặc san khoa học kỹ thuật thức ăn

chăn nuôi, 3, tr. 11-13.

3. Đỗ Thị Ngọc Huyền, (2007), Nghiên cứu tính chất phytase tự nhiên và tái tổ

hợp của vi khuẩn Bacillus subtilis, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Viện Khoa học và

Công nghệ Việt Nam

4. Đỗ Hữu Phƣơng, (2004), “Vai trò của enzyme trong chăn nuôi”. Đặc san khoa

học kỹ thuật thức ăn chăn nuôi, 1, tr. 25-26.

5. Nguyễn Văn Viết, (2008), Nghiên cứu biểu hiện gene phyC có nguồn gốc từ

Bacillus subtilis trên E. coli BL21 (DE3) và bước đầu ứng dụng enzyme tái tổ

hợp cho chăn nuôi, Luận văn thạc sỹ khoa học sinh học, Trƣờng đại học Sƣ

phạm Hà nội.

6. Ngô Thanh Xuân, Mai Thị Hằng, Nguyễn Phƣơng Linh, Đinh Thị Mỹ Hằng,

Vũ Nguyên Thành, (2012), “Phân tích trình tự gene (phyA) mã hóa phytase

thành thục từ một số chủng Aspergillus niger”, Tạp chí Công nghệ Sinh học,

10(1), tr. 115-122.

Tiếng anh

7. Anderson R. J., (1914), “A contribution to the chemistry of phytin”, J. Biol.

Chem., 17, pp. 171 –190.

8. Anno T., Nakanishi K., Matsuno R., Kamikubo T., (1985), “Enzymatic

elimination of phytate in soybean milk”, J. Japan Soc. Food Sci. Techno.l, 32,

pp. 174-180.

9. Baruah K., Pal A. K., Sahu N. P., Jain K. K., Mukherjee S. C., Debnath D.,

(2005), “Dietary protein level, microbial phytase, citric acid and their



interactions on bone mineralization of Labeo rohita (Hamilton) juveniles”,

Aquacult. Res., 2005, 36, pp. 803–812.

10. Baruah K., Sahu N. P., Pal A. K., Debnath D., Yengkokpam S., Mukherjee S.

C., (2007), “Interactions of dietary microbial phytase, citric acid and crude

protein level on mineral utilization by Rohu, Labeo rohita (Hamilton),

juveniles”, J. W. Aquacult. Soc., 38, pp. 238–249.

11. Billington D. C., (1993), “The Inositol Phosphates. Chemical Synthesis and

Biological Significance”, Verlag. Chemie. Weinheim., 26, pp. 38-42.

12. Cheng C., Lim B. L., Turner B. L., Richardson A. E., Mullaney E. J., (2005),

“Beta-propeller phytases in the aquatic environment: characterization of a

novel phytase from Shewanella oneidensis MR-1. In Inositol Phosphates in the

Soil-Plant-Animal System: Linking Agriculture and Environment”.

Proceedings of the Bouyoucos Conference to Address the Biogeochemical

Interaction of Inositol Phosphates in the Environment; USA, pp. 55–56.

13. Copper J. R., Gowing H. S., (1983), “Mammalian small intestine phytase”, Br.

J. Nutr., 50, pp. 673-678.

14. Correa R. L. T., Queiroz V. M., Araujo F. E., (2014), “Cloning, recombinant

expression and characterization of a new phytase from Penicillium

chrysogenum”, Microbiol. Res., pp. 201-213

15. Craxton A., Caffrey J. J., Burkhart W., Safrany S. T., Shears S. B., (1997)

“Molecular cloning and expression of a rat hepatic multiple inositol

polyphosphate phosphatase”, Biochem. J., 328, pp. 75-81.

16. Dalal R. C., (1978), “Soil organic phosphorus”, Adv. Agronom., 29, pp. 83–

117.

17. Davies N. T., Vahoung G. V. and Kritchevsky D., (1982), “Effects of phytic

acid on mineral availability”, In Dietary Fiber in Health and Disease, Eds.

Plenum Press, New York, pp. 125-138.

18. Dawei F., Huoquing H., Huiying L., Yaru W., Peilong Y., Kun M., (2008), “A

highly pH-stable phytase from Yersinia kristeensenii: Cloning, expression, and

characterization”, Enz. Microbiol. Tech., 42, pp. 499-505.



19. Debnath D., Pal A. K., Sahu N. P., Jain K. K., Yengkokpam S., Mukherjee S.

C, (2005), “Effect of dietary microbial phytase supplementation on growth and

nutrient digestibility of Pangasius pangasius (Hamilton) fingerlings”,

Aquacult. Res., 36, pp. 180–187.

20. Deshpande S. S., Cheryan M., (1984), “Effect of phytic acid, divalent cations,

and their interactions on alpha-amylase activity”, J. F. Sci., 49, pp. 516-524.

21. Ellestad L. E., Angel R., Soares J. H., (2002), “Intestinal phytase II: A

comparison of activity and in vivo phytate hydrolysis in three teleost species

with differing digestive strategies”, Fish. Physiol. Biochem., 26, pp. 259–273.

22. Findenegg G. R., Nelemans J. A., (1993), “The effect of phytase on the

vailability of P from myo-inositol hexaphosphate (phytate) for maize roots”,

Plant Soil, 154, pp. 189-196.

23. Forsberg C. W., Phillips J. P., Golovan S. P., Fan M. Z., Meidinger R. G.,

Ajakaiye A., Hilborn D., Hacker R. R., (2003), “The enviropig physiology,

performance, and contribution to nutrient management advances in a regulated

environment: the leading edge of change in the pork industry”, J. Anim. Sci.,

81, pp. 68–77.

24. Freund W. D., Mayr G. W., Tietz C., Schultz J. E., (1992), “Metabolism of

inositol phosphates in the protozoan Paramecium”, Eur. J. Biochem., 207, pp.

359-367.

25. Greaves M. P., Anderson G., Webley D. M., (1967), “The hydrolysis of inositol

phosphates by Aerobacter aerogenes”, Biochem. Biophys. Acta., 132, pp. 412-

418.

26. Greiner R. and Konietzny U., (1996), “Construction of bioreactor to produce

special breakdown products of phytate”, J. Biotechnol., 1996, 48, pp. 153-159.

27. Hartig, T., (1885), “Uber das Klebermehl”, Bot. Z., 13, 881–882

28. Hartig T., Weitere M., (1856), “das Klebermehl (Aleuron) betreffend”, Bot. Z.,

14, 257 –269



29. Hegeman C. E. and Grabau E. A., (2001), “A novel phytase with sequence

similarity to purple acid phosphatases is expressed in cotyledons of

germinating soybean seedlings”, Plant Physiol., 126, pp. 1598–1608.

30. Hesampour A., Siadat S. E. R., Malboobi M. A., Mohandesi N., Arab S. S.,

Ghahremanpour M. M., (2014), “Enhancement of thermostability and kinetic

efficiency of Aspergillus niger phyA phytase by site direct mutagenesis”,

Appl. Biochem. Biotechnol., pp. 67-81.

31. Howson S. J., and Davis R. J., (1983), “Production of phytate-hydrolysing

enzyme by fungi”. Enzyme Microbiol. Technol., 5, pp. 377-382.

32. Inagawa J., Kiyosawa I., Nagasawa T., (1987), “Effect of phytic acid on the

hydrolysis of lactose with beta-galactosidase”, Agric. Biol. Chem., 51, pp.

3027-3032.

33. Irving G. C. J., Cosgrove D. J., (1971), “Inositol phosphate phosphatase of

microbial origin, Observations on the nature of the active center of a bacterial

(Pseudomonas sp.) phytase”, Austral. J. Biol. Sci., 24, pp. 1559-1564.

34. Jog S. P., Garchow B. G., Mehta B. D., Murthy P. P. N., (2005), “Alkaline

phytase from lily pollen: Investigation of biochemical properties”, Arch.

Biochem. Biophys., 440, pp. 133–140.

35. Laboure A. M., Gagnon J., Lescure A. M., (1993), “Purification and

characterization of a phytase (myo-inositol hexakisphosphate

phosphohydrolase) accumulated in maize (Zea mays) seedlings during

germination”, Biochem. J., 295, pp. 413-419.

36. Li Z., Zhao A., Wang X., Jin X., Li J., Yu M., (2013), “Cloning, expression,

and functional characterization of a phytase from the genus Bacillus”, J. Mol.

Microbiol. Biotechnol., 23, pp.193-202.

37. Liu B. L., Rafiq A., Tzeng Y. M. and Rob A., (1998), “The induction and

characterization of phytase and beyond”. Enzyme Microbiol. Technol., 22, pp.

415-424.



38. Mrudula V. U., Jalaja V., Ashok P., (2014), “Gene cloning and soluble

expression of Aspergillus niger phytase in E. coli cytosol via chaperone co-

expression”, Biotechnol. Lett., 36, pp. 85-91.

39. Mullaney E., Sethumadhavan K., Stephanie B., Lei X. G., Ullah A. H. J.,

(2012), “Elimination of disulfide bridges in Aspergillus niger NRRl 3135

phytase (phyA) enhances heat tolerance and optimizes its temperature versus

activity profile”, Ad. Bio. Chem., 2, pp. 372 – 378.

40. Ngo Thanh Xuan, Mai Thi Hang and Vu Nguyen Thanh, (2009), “Cloning and

over expression of an Aspergillus niger XP phytase gene (phyA) in Pichia

pastoris”, World Academy of Science, Engineering and Technology, 56, pp.

750 – 753.

41. Nwanna L. C., Schwarz F. J., (2007), “Effect of supplemental phytase on

growth, phosphorus digestibility and bone mineralization of common carp

(Cyprinus carpio L)”, Aquacult. Res., 38, pp. 1037–1044.

42. Pandey A., Szakacs G., Soccol C. R., Rodriguez-Leon J. A., Soccol V. T.,

(2001), “Production, purification and properties of microbial phytases”,

Bioresour. Technol., 77, pp. 203-214.

43. Phillippy B. Q., Wyatt C. J., (2001), “Degradation of phytate in foods by

phytases in fruits and vegetable extracts”, J. F. Sci., 66, pp. 535–539.

44. Phillippy, B. Q., Bland, J. M., Evens, T. J., (2003), “Ion chromatography of

phytate in roots and tubers”, J. Agric. F. Chem., 51, 350–353

45. Raboy V., (2003), “myo-Inositol-1,2,3,4,5,6-hexakisphosphates”,

Phytochemistry, 64, 1033–1043

46. Rao D. E., Rao K. V., Reddy T. P., Reddy V. D., (2009), “Molecular

characterization, physicochemical properties, known and potential applications

of phytases: An overview”, Crit. Rev. Biotechnol., 29(2), pp. 182-98.

47. Reddy N. R., Pierson M. D., Sathe S. K., Salunkhe D. K., (1989), “Phytates are

cereals and legumes”, CRC Press. Inc. Boca Raton. Fla, pp. 218-227.

48. Rimbach G., Pallauf J., (1992), “The effect of a supplement of microbial

phytase on zinc availability”, Z. Ernahrungswiss, 31, pp. 269-277.



49. Sajjadi M., Carter C. G., (2004), “Effect of phytic acid and phytase on feed

intake, growth, digestibility and trypsin activity in Atlantic salmon (Salmo

salar, L)”, Aquacult. Nutr., 10, pp. 135–142.

50. Sambrook J, Fritsch E F, Maniatis T., (1989), Molecular Cloning, A

Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New

York, pp. 123-128.

51. Sandberg A. S., Hulthen L. R., and Turk M., (1996), “Dietary Aspergillus

niger phytase increases iron absorption in humans”, J. Nutr., 126, pp. 476-480.

52. Shah V., Parekh L. J., (1990), “Phytase from Klebsiella sp. No. PG-2:

Purification and properties”, Indian J. Biochem. Biophys., 27, pp. 98-102.

53. Shieh T. R., Ware J. H., (1968), “Survey of microorganisms for the production

of extracellular phytase”, Appl. Microbiol., 16, pp. 1348-1351.

54. Shimizu M., (1992), “Purification and characterization of phytase from Bacillus

subtilis (natto) N-77”, Biosci. Biotechnol. Biochem., 56, pp. 1266-1269.

55. Singh M., Krikorian A. D., (1982), “Inhibiton of trypsin activity in vivo by

phytate”, J. Agr. F. Chem., 30, pp. 799-805.

56. Siren M., (1995), “Method of treating pain using inositol triphosphate”, U.S.

Patent 5407924, pp. 23-28.

57. Siren M., (1998), “Use of an ester of inositoltriphosphate for the preparing of

medicaments”, U.S. Patent 5846957, pp. 21-28.

58. Tian S. W., Peng R. H., Xu J., Zhao W., Gao F., Fu X. F., Xiong A. S., Yao Q.

H., (2010), “Mutations in two amino acids in phyI1s from Aspergillus niger

113 improve its phytase activity”, World J. Microbiol. Biotechnol., 26,

pp.903-907.

59. Türk M., Sandberg A. S., Carlsson N., Andlid T., (2000), “Inositol

hexaphosphate hydrolysis from baker’s yeast. Capacity, kinetics, and

degradation products”, J. Agr. F. Chem., 48, pp. 100–104.

60. Ullah A. H. J., (1988), “Aspergillus ficuum phytase: partial primary structure,

substrate selectivity, and kinetic characterization”, Pre. Biochem., 18, pp. 459-

471.



61. Ullah A. H., Sethumadhavan K., Mullaney E. J., Ziegelhoffer T., Austin-

Phillips S., (2003), “Fungal phyA gene expressed in potato leaves produces

active and stable phytase”, Biochem. Biophy. Res. Co., 306(2), pp. 603-609.

62. Van Weerd J. H., Khalaf K. H. A., Aartsen F. J., Tussen P. A. T., (1999),

“Balance trials withAfrican catfish Clarias gariepinus fed phytase-treated

soybean mealbased diets”, Aquacult. Nutr., 5, pp. 135–142.

63. Viveros A., Centeno C., Brenes A., Canales R., Lozano A., (2000) “Phytase

and acid phosphatase activities in plant feedstuffs”, J. Agr. F. Chem., 48, pp.

4009–4013.

64. Vohra A., Satyanarayana T., (2001), “Phytase production by the yeast, Pichia

anomala”, Biotechnol. Lett., 23, pp. 551–554.

65. Volfova O., Dvorakova J., Hanzlikova A., Jandera A., (1994), “Phytase from

Aspergillus niger”, Folia Microbiol, 39, pp. 481-484.

66. Winterstein, E., (1897), “Uber einen phosphorhaltigen Pflanzenbestandteil,

welcher bei der Spaltung Inosit liefert”, Berichte. Deutsch. Chem. Ges., 30,

pp. 2299 –2302

67. Xiang T., Liu Q., Deacon A. M., Koshy M., Kriksunov I. A., Lei G. X., Hao

Q., Thiel D J., (2004), “Crystal structure of a heat-resilient phytase from

Aspergillus fumigatus, carrying a phosphorylated histidine”, J. Mol. Biol., 339,

pp.437-445.

68. Xiong A. S., Yao Q. H., Peng R. H., Han P. L., Li X., Fan H. Q., Guo M. J.,

Zhang S. L., (2004), “Isolation, characterization, and molecular cloning of the

cDNA encoding a novel phytase from Aspergillus niger 113 and high

expression in Pichia pastoris”, J. Biochem. Mol. Biol., 37(3), pp. 282-291.

69. Yan L., Li C., Chen H., Wu Q., Shan Z., Han X., (2013), “Site-directed

mutagenesis improves the thermostability and catalytic efficiency of

Aspergillus niger N25 phytase mutated by I44E, T252R”, Appl. Biochem.

Biotechnol., pp. 25- 37.



70. Yan W., Xiaorong G., Giao S., Wei W., Lijia A., (2007), “Cloning,

expression, and Enzyme characterization of an acid heatstable phytase from

Aspergillus fumigatus WY-2”, Current microbiology, 55, pp. 65-70.

71. Yin H. F., Fan B. L., Yang B., Liu Y. F., Luo J., Tian X. H., Li N., (2006),

“Cloning of pig parotid secretory protein gene upstream promoter and the

establishment of a transgenic mouse model expressing bacterial phytase for

agricultural phosphorus pollution control”, J. Anim. Sci., 84, pp. 513–519.

72. Yoon S. J., Choi Y. J., Min H. K., Cho K. K., Kim J. W., Lee S. C., Jung Y.

H., (1996), “Isolation and identification of phytase-producing bacterium,

Enterobacter sp. 4, and enzymatic properties of phytase enzyme, Enzyme

Microbiol. Technol., 18, pp. 449-454.

73. Zhang W., Mullaney J. E., Lei X. G., (2007), “Adopting selected hydrogen

bonding and ionic interactions from Aspergillus fumigatus phytase structure

improves the thermostability of Aspergillus niger PhyA phytase”, Applied and

enviromental Microbiology, pp. 3069-3076.

74. Zhong Y. M., Shun C. P., Jing J. J., Huang B., Mei Z. F., Zeng Z. L., (2011),

“A novel thermostable phytase from the fungus Aspergillus aculeatus RCEF

4894: gene cloning and expression in Pichia pastoris”, World J. Microbiol.

Biotechnol., 2011, 27, pp. 679-686.

75. http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC3/0103a.html

http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC3/0103a.html

ĐẠi hỌc quỐc gia hÀ nỘi trƢỜng ĐẠi h c...

Documents