Hepatitis C virus production by human hepatocytes dependent on assembly and secretion of very low-density lipoproteins

Hua Huang*, Fang Sun*, David M. Owen ₣, Weiping Li‡, Yan Chen*, Michael Gale Jr. ₣, and Jin Ye*§

Departments of *Molecular Genetics, ₣Microbiology, and ‡Cell Biology, University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, TX 75390-9046

IntroductionIntroduction

Le virus HCVLe virus HCV Virus à ssRNA (+)Virus à ssRNA (+) Sécrété en abondance uniquement par hépatocytesSécrété en abondance uniquement par hépatocytes

Facteurs de spécificité tissulaire ?Facteurs de spécificité tissulaire ? Une partie du virus circule lié aux VLDLUne partie du virus circule lié aux VLDL

Complexe de réplicationComplexe de réplication

Réplication virale a lieu Réplication virale a lieu dans une ultrastructure dans une ultrastructure associée à la membrane : associée à la membrane : « « membranous webmembranous web » »

Visualisé sur HuH7 Visualisé sur HuH7 contenant un réplicon de contenant un réplicon de HCV 1bHCV 1b

Uniquement protéine NSUniquement protéine NS Réplication sans Réplication sans

production de particules production de particules infectieusesinfectieuses

Nature et composition des «membranous web» non étudiée

Synthèse des VLDLSynthèse des VLDL

Particules sphérique de 30 à 80nmParticules sphérique de 30 à 80nmRôle d’export tissulaire des TGRôle d’export tissulaire des TGComposition des VLDLComposition des VLDL

Protéine de structure : apoB-100 et apoEProtéine de structure : apoB-100 et apoE Chargement de TG via MTP dans ER + GolgiChargement de TG via MTP dans ER + Golgi

56% TG56% TG19% PL19% PL12% EC12% EC

Purification des « membranous web »Purification des « membranous web »

Ligné HuH7 – 5A-GFP-6Ligné HuH7 – 5A-GFP-6 NS5A taggé GFP en COOH NS5A taggé GFP en COOH

terminalterminal

Isolation immunomagnétique Isolation immunomagnétique des vésicules par des billes des vésicules par des billes Dynabeads coatées par anti-Dynabeads coatées par anti-GFPGFP

Homogénéisation des cultures Homogénéisation des cultures cellulairescellulaires

Séparation et récupération des Séparation et récupération des vésicules liées et non liéesvésicules liées et non liées

Contenu en protéines viralesContenu en protéines viralesdes « membranous web »des « membranous web »

SDS/PAGE + ImmunoblotEnv 50% NS5A dans

vésicules liées

50% des autres NSP

Pas de contamination

10%

Contenu en HCV RNAContenu en HCV RNAdes « membranous web »des « membranous web »

Signal uniquement dans vésicules extraites par

billes taggés

qRT-PCR

Vésicules purifiées enrichies en RNA viral et en protéines NS

= COMPLEXE de REPLICATION

Caractérisation des protéines associées Caractérisation des protéines associées aux CdR des « membranous web »aux CdR des « membranous web »

Vésicules attachées solubilisées

Extrait analysé par SDS/PAGE

Excision des bandes

Digestion trypsine

Tandem MS

> 30% des protéines identifiées impliquées dans métabolisme

lipidique

Dont MTP et ApoE

Données bibliographiquesDonnées bibliographiques Cliniquement : association dans le plasma VLDL - HCVCliniquement : association dans le plasma VLDL - HCV

ApoB-100 non retrouvéApoB-100 non retrouvé Masse moléculaire élevée (540 kDa)Masse moléculaire élevée (540 kDa) Hydrophobicité globaleHydrophobicité globale

Confirmation de la présence Confirmation de la présence d’ApoB, ApoE et MTP dans d’ApoB, ApoE et MTP dans

les vésiculesles vésicules

50% de MTP30% d’ApoE50% d’ApoB

Colocalisation par Colocalisation par immunofluorescenceimmunofluorescence

Colocalisation ponctiforme de NS5A et ApoB

Vésicules contenant NS5A

et ApoB

Origine des vésicules : ER ou Golgi ?Origine des vésicules : ER ou Golgi ?

Vésicules obtenues après immuno-isolation magnétique solubilisées puis Vésicules obtenues après immuno-isolation magnétique solubilisées puis traitées :traitées :

Endoglycosidase H : hydrolyse liaison N-sucres des protéines de l’ER Peptide N-glycosidase F : hydrolyses toutes les liaison N-sucres

Sensible à Endo H

ApoB sécrétée insensibles à Endo HVésicules contenant le

CdR dérivent de l’ER

Sécrétion des VLDL et réplicationSécrétion des VLDL et réplication

HuH7 – 5A-GFP-6 traitées par inhibiteur de MTP (BMS-2101038)HuH7 – 5A-GFP-6 traitées par inhibiteur de MTP (BMS-2101038) Inhibition chargement VLDL provoque ubiquitinilation ApoB Cellules lavées avant incubation avec inhibiteur : éviter contamination de ApoB

sécrétée

Sécrétion des VLDL non nécessaire à la réplication virale

Sécrétion des VLDL et libération de Sécrétion des VLDL et libération de particules infectieusesparticules infectieuses

Souche HuH7 – GL avec cDNA de HCV 2a intégré dans le génome, Souche HuH7 – GL avec cDNA de HCV 2a intégré dans le génome, produisant constitutivement du virus infectieuxproduisant constitutivement du virus infectieux

Incubation +/- MTP

Diminution HCV dans le milieu n’est pas du à une diminution de synthèse

Sécrétion des VLDL et libération de Sécrétion des VLDL et libération de particules infectieusesparticules infectieuses

Souche HuH7 – GL transfectée avec siRNA dirigé contreSouche HuH7 – GL transfectée avec siRNA dirigé contre ApoB GFP

Immunoblot sur le surnageant de culture

Diminution de 50%

Diminution de 70%

Inhibition importante mais moins efficace que MTP

Purification vésicules caractéristiques de complexe de Purification vésicules caractéristiques de complexe de réplication du HCVréplication du HCV

Ces données + données cliniques suggères que les particules Ces données + données cliniques suggères que les particules de HCV sont incorporées aux VLDL durant l’assemblage des de HCV sont incorporées aux VLDL durant l’assemblage des lipoparticuleslipoparticules

Test d’inhibition au MTPTest d’inhibition au MTP : sécrétion résiduelle de virus (20%) : sécrétion résiduelle de virus (20%) Voie VLDL-indépendante ?Voie VLDL-indépendante ? Faibles quantités de VLDL sous le seuil de détection de Faibles quantités de VLDL sous le seuil de détection de

l’immunoblot suffisantes à la sécrétion ?l’immunoblot suffisantes à la sécrétion ?

Dans intestin ApoB48 participe à formation des chylomicronsDans intestin ApoB48 participe à formation des chylomicrons Pas de sécrétion de HCV par l’intestionPas de sécrétion de HCV par l’intestion Protéines impliquées dans l’assemblage des VLDL responsables Protéines impliquées dans l’assemblage des VLDL responsables

de la spécifité tissulaire ?de la spécifité tissulaire ?

DiscussionDiscussion

Production virale continuelle nécessaire à maintient du virusProduction virale continuelle nécessaire à maintient du virus

Thérapeutique ciblant l’assemblage ou la sécrétion des VLDL Thérapeutique ciblant l’assemblage ou la sécrétion des VLDL pourrait être efficacepourrait être efficace

siRNA dirigé contre ApoB inhibe sécrétion VLDL chez la souris et siRNA dirigé contre ApoB inhibe sécrétion VLDL chez la souris et le primatele primate

RNA antisens dirigé contre ApoB et inhibiteur de la MTP utilisés en RNA antisens dirigé contre ApoB et inhibiteur de la MTP utilisés en essais clinique chez l’homme dans les dyslipidémiesessais clinique chez l’homme dans les dyslipidémies

Traitement à court terme entraîne peut d’effets secondaires, Traitement à court terme entraîne peut d’effets secondaires, avec accumulation de graisse hépatique faible et réversibleavec accumulation de graisse hépatique faible et réversible

DiscussionDiscussion

Test des inhibiteurs de la MTP en traitement à court terme de l’infection à HCV