hromatografija - 2 - · pdf filepika fenacetina konstruiše se kalibraciona kriva koja...

1

Hromatografija pod visokim pritiskom - HPLC

H High

P Performance (Pressure)

L Liquid

C Chromatography

Hromatografija – metoda

Hromatogram – rezultat

Hromatograf – aparat

Princip: Tečna mobilna faza se pumpa pod visokim pritiskom kroz čeličnu kolonu u kojoj su pakovane čestice stacionarne faze veličine od 3 µm do 10 µm.

2

PRIMENA HPLC

U FARMACEUTSKOJ

ANALIZI

ISTRAŽIVANJA RAZVOJ PROIZVODNJA KONTROLAKVALITETA

1. Novi lek2. Preklinička i

klinička3. Farmakokinetika

1. Nove metode2. Validacija3. Transfer metode

Procesna kontrola

Aktivna supstancaIdentifikacija i određivanjeNečistoćeStabilnost RastvorljivostUjednačenost sadržaja ...

3

Prednosti HPLC metode:

1) Laka za kontrolu i precizna.

2) Tehnika koja je najviše napredovala poslednjih godina u smislu poboljšanja kvaliteta kolona, osetljivosti detektora i softverske kontrole.

3) Zahvaljujući velikom izboru kolona i detektora mogu se podesiti uslovi za analizu veoma velikog broja supstanci.

4) U poređenju sa gasnom hromatografijom smanjen je rizik od degradacije uzorka jer se ne radi na visokim temperaturama.

5) Postupak je automatizovan.

Nedostaci HPLC metode:

1) Nedostatak detektora za supstance koje nemaju hromofore.

2) Pre HPLC analize lek se mora ekstrahovati iz uzorka.

3) Troše se velike zapremine organskih rastvarača.

4

Razdvajanje, kvalitativna i kvantitativna analiza

Kvalitativna analiza – šta su komponente A, B i C?

Kvantitativna analiza – koje su koncentracije komponenti A, B i C?

5

Dobijeni hromatogram komponenti A, B i C

Na osnovu dobijenog hromatograma može se vršiti:

� kvalitativna analiza (identifikacija) i

� kvantitativna analiza (kvantifikacija).

6

Kako je nastao hromatogram?

7

Identifikacija – šta je komponenta A?

Komponenta A se eluira u isto vreme kao kofein.

Komponenta A je kofein.

Kvalitativna analiza se vrši na osnovu retencionog vremena!!!

tr standarda = tr analize Pozitivna identifikacija

8

Kvantifikacija – koja je koncentracija komponente A?

Površina pika (visina pika) srazmerna je koncentraciji komponente.

Koncentracija komponente A (kofeina) dobija se poređenjem površine pika iz uzorka sa površinom pika rastvora standarda

kofeina.

9

Kvantitativna analiza se može vršiti:

1. Metodom normalizacije pikova

2. Metodom eksternog standarda i

3. Metodom internog standarda.

Na primer: izračunavanje koncentracije analita primenom metode internog standarda

�Zasniva se na dodatku odabrane supstance (interni

standard) rastvorima standarda i rastvoru uzorka u potpuno istoj

koncentraciji.

�Izabrani interni standard mora biti dobro razdvojen od

analizirane supstance ali ne i previše udaljen od nje

�Potrebno je da bude slične hemijske strukture kao ispitivana

supstanca kako bi se izbegle razlike u odgovoru detektora i

obezbedila slična ekstrakcija kao za ispitivani analit

�Pripremljeni uzorci se injektuju u HPLC sistem i nakon toga se

izračunava odnos površine pika analizirane supstance i internog

standarda

�Na osnovu koncentracije standarda i odnosa površine pika

standarda i internog standarda konstruiše se kalibraciona kriva

�Ovim postupkom se izbegavaju greške koje nastaju kao posledica

injektovanja različitih zapremina, kao i gubici koji nastaju pri

derivatizaciji

Princip rada

Primer: određivanje sadržaja aspirina sa fenacetinom kao internim standardom

�Pripreme se rastvori standarda aspirina za kalibracionu krivu i rastvor analize

�Svim rastvorima se doda ista količina internog standarda fenacetina

Pripremljeni rastvori injektuju se u HPLC sistem.

Za svaki rastvor se izračuna:

Odnos površina pikova=površina pika aspirina/površina

pika fenacetina

Konstruiše se kalibraciona kriva koja predstavlja zavisnost koncentracije aspirina i odnosa površina pikova aspirina i fenacetina kao internog standarda.

Iz dobijene kalibracione krive izračuna se koncentracija aspirina u ispitivanom uzorku.

Najčešće korišćeni tipovi

hromatografije

Hromatografija reverznih faza

Hromatografija normalnih faza

Uobičajena u farmaceutskoj

analizi

15


Vrsta interakcije Adsorpcija

Pakovanje Polarnosilikagel

silika-amino

silika-cijano

silika-hidroksi

Mobilna faza Smeša organskih rastvarača

Primer Polarna jedinjenja


U hromatografiji normalnih faza stacionarna faza je polarna, mobilna faza je nepolarna a razdvajaju se komponente koje su polarne!!!

16

Najviše korišćeno pakovanje kod hromatografije normalnih faza je silikagel.

Smatra se da su slobodne hidroksilne grupe odgovorne za proces razdvajanja.


Tipovi silika kolona

1. Silika tip A – silika manje čistoće, sadrži tragove metala i na površini ima veliki broj “kiselih” mesta

2. Silika tip B – silika većeg stepena čistoće i na površini ima manji broj “kiselih” mesta. Pogodna za jedinjenja velike polarnosti kao i za bazne supstance.

a) Silika tip A i b) Silika tip B

1. toluen; 2. benzanilid; 3. fenol; 4. benzil alkohol, I. nečistoća


18

Interakcije između komponenti i stacionarne faze mogu se prikazati na sledeći način:


o-nitroanilin

p-nitroanilin

anilin

nitrobenzen

benzen

19

Rastvarači koji se koriste za pripremu mobilnih faza:

Rastvarač Oznaka

n-heksan n-Hex

Izo-oktan izo-Okt

Hloroform CHCl3

Dihlormetan CH2Cl2

Etilacetat AcOEt

Izopropilalkohol IPA

Tetrahidrofuran THF

Dioksan

Acetonitril CH3CN

Etanol EtOH

Metanol MeOH

Amini

Kiseline

Polarnost


20

Polarnost

Polarnost komponenti:

Retenciono ponašanje Hromatografija normalnih faza

Veća polarnost mobilne faze – brže eluiranje!!!

21

Tečna hromatografija reverznih fazaEng. Reverse-Phase High Performance Liquid Chromatography – RP-HPLC

Vrsta interakcije Hidrofobne

Pakovanje Nepolarnosilika – C18

silika – C8

polimeri

Mobilna faza Polarnametanol/voda

acetonitril/voda

metanol/pufer

Primer Supstance koje imaju ugljovodonične lance različite dužine

U hromatografiji reverznih faza stacionarna faza je nepolarna, mobilna faza je polarna a razdvajaju se komponente koje su nepolarne!!!


22

RP-HPLC se koristi u više od 80 % analiza lekova!!!

Prednosti:

Može se koristiti za veliki broj supstanci

Veliki izbor stacionarnih faza

Koriste se relativno povoljni rastvarači.

Brzo uspostavljane ravnoteže između stacionarne i mobilne faze.

Postiže se brzo, jednostavno i reproduktivno razdvajanje.

Ograničenja:

Veliki broj obloženih silika kolona stabilno je samo u opsegu pH od 3,0 do 8,0.

Prisutne slobodne silanolne grupe mogu dovesti do tejlinga pika i produžetka

trajanja hromatografske analize.


23

Najviše korišćeno pakovanje kod hromatografije reverznih faza je silika –C18.

S obzirom da je površina silikagela prekrivena C18 lancima kolona je veoma niske polarnosti. Reverzno-fazne kolone mogu imati i kraće ugljovodonične lance (C8, C4, itd) ali i cikloheksil ili fenil ostatke vezane za silanolne grupe.


24


Interakcije između komponenti i stacionarne faze mogu se prikazati na sledeći način:

25


Rastvarači koji se koriste za pripremu mobilnih faza

Najčešće se koriste:

� metanol – voda

� acetonitril – voda

Mogu se dodavati u manjem procentu:

� etanol

� tetrahidrofuran

� izopropilakohol

Aditivi:

� kiseline

� soli

� jon-par reagensi

Mobilne faze u RP-HPLC uglavnom predstavljaju mešavinu vode (ili vodenog rastvora pufera) sa organskim rastvaračem (najčešće acetonitril, metanol, tetrahidrofuran) koji se dobro mešaju sa vodenom fazom.

26


Retenciono ponašanje u reverzno-faznoj hromatografiji

polarnost

Dužina ugljovodoničnog niza

uzorka:

A – p-hidroksi etilbenzoat

B – p-hidroksi propilbenzoat

C – p-hidroksi butilbenzoat

Primer: uticaj sastava mobilne faze na razdvajanje parabena

Veći sadržaj organskog rastvarača dovodi do bržeg eluiranja komponenti i kraćeg trajanja analize.

Komponenta sa dužim alkil nizom u strukturi kasnije se eluira.

27


Uticaj dužine ugljovodoničnog lanca pakovanja kolone na hromatografsko razdvajanje parabena

Mobilna faza:

acetonitril:voda 40:60 V/V

A – p-hidroksi etilbenzoat

B – p-hidroksi propilbenzoat

C – p-hidroksi butilbenzoat

Što je kolona nepolarnija to se komponente duže zadržavaju i sporije eluiraju.

28

Supresija jona

Dodatkom kisele komponente u vodenu fazu dolazi do supresije jonizacije kiselih supstanci čime se na minimum svodi interakcija sa stacionarnom fazom što za posledicu ima gubitak tejlinga.


29

Primer razdvajanja bez supresije jona i sa supresijom jona:

Kolona: Finepak sil C1

Mobilna faza:

acetonitril:voda (40:60 V/V)

Kolona: Finepak sil C1

Mobilna faza:

acetonitril:0,2 %-tna fosforna kiselina (40:60 V/V)


30

Jon-par hromatografija

Jon-par hromatografija koristi se za razdvajanje slabih kiselina, slabih baza i jona

(katjona i anjona). Dodatak jon para uslovljava duže zadržavanje jonske

komponente dok ne utiče na komponente koje se nalaze u molekulskom obliku.


31

Primer interakcije anjona i jon-par reagensa

Primer interakcije katjona i jon-par reagensa


32

Primer primene jonskog para:

bez jon par reagensa sa jon par reagensom

Najčešće korišćeni jon par reagensi su:

� kiseli joni: tetra alkil amonijum-halogenidi

� bazni joni: l-alkil sulfonati

-neretenciono ponašanje jonske komponente (A)

-dodatkom jon-par reagensa jonska komponenta (A) se kasnije eluira, na komponentu u molekulskom obliku (B) dodatak reagensa ne utiče


33

Size-exclusion hromatografija

Size-exclusion hromatografija u nevodenoj sredini

1. Gel propustljiva hromatografija

Interakcije

Pakovanje

Mobilna faza

Primer

Gel permeacija

Porozni polistiren

Organski rastvarači

Razdvajanje sintetskih oligomera

Size-exclusion hromatografija u vodenoj sredini

2. Gel filtraciona hromatografija

Interakcije

Pakovanje

Mobilna faza

Primer

Gel permeacija

Hidrofilni silikagel ili hidrofilni polimer

Rastvor pufera

Razdvajanje polimera rastvorljivih u vodi (nukleinske kiseline, proteini, šećeri)

Oligomeri

Gel hromatografija

34

GEL – nosač stacionarne faze (porozni polimeri sa porama različitih veličina koje su

ispunjene tečnošću - stacionarnom fazom)

Dekstran-gel (Sephadex)

Poliakrilamidi

Agar-gel

Polistirenski gel

GEL Voda

Vodeni puferovani rastvor


35

Stacionarna faza

Tečnost unutar pora gela

Voda ili puferovani vodeni rastvor(polarni rastvarač – sprečava adsorpciju na pore gela)

Mobilna faza

Tečnost između pora gelaIsta kao stacionarna faza


36


Mehanizam razdvajanja

Molekule se razdvajaju na osnovu veličine, velike molekule ne mogu da uđu u male pore pa se prve eluiraju dok manje molekule se zadržavaju u porama stacionarne faze i eluiraju kasnije.

37

Zapremina eluenta

Koncentracija

Velike molekulske

maseSrednje

molekulske mase

Male molekulske

mase


40

Primena

Određivanje lekova makromolekulske strukture

Određivanje molekula penicilinske i cefalosporinske strukture i njihovih nečistoća

Ispitivanje radiofarmaceutika i njihovih nečistoća

Prečišćavanje i analiza sintetskih i bioloških polimera

(proteini, polisaharidi, nukleinske kiseline)

Isoljavanje proteina

Određivanje molekulskih masa makromolekula

Određivanje fine strukture makromolekula


41


Primer: razdvajanje amino kiselina

Kolona: AApak Na II-H

Mobilna faza: Natrijum-citrat (pufer). Gradijentno eluiranje

Razdvajanje proteina na osnovu njihove razlike u veličinama molekula

Hromatografija zasnovana na razlikama u veličini molekula u analizi proteina

Najpre se eluiraju proteini velike molekulske mase a zatim proteini manje molekulske mase.

Značajni faktori u razvoju metode:

� dodatak soli do određene koncentracije smanjuje interakcije između

proteina i stacionarne faze

� pH vrednost niža od 7,0 smanjuje mogućnost nastajanja silanolnih anjona (uobičajen je dodatak pufera niskog molariteta i pH blizak fiziološkom – 6,8)

� brzina protoka mobilne faze – od 0,5 mL min.-1 do 1,0 mL min-1, pri nižem protoku postiže se bolje razdvajanje pikova

� Injekciona zapremina – do 5% zapremine punjenja kolone

�Koncentracija uzorka – poželjno je injektovati koncentrisane uzorke proteina vodeći računa da ne dođe do precipitacije

Prednost:

Biološka aktivnost proteina ostaje očuvana tokom analize.

hromatografija - 2 - · pdf filepika fenacetina konstruiše se kalibraciona kriva koja...

Documents