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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIACENTRO DE EDUCAÇÃO SUPERIOR NORTE – RSDEPARTAMENTO DE ENGENHARIA AMBIENTAL

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA(HPLC)

RELATÓRIO DE AULA LABORATORIAL DE QUÍMICA

Andrise Janaína FollmannJoseane Kolzer Schroeder

Frederico Westphalen, RS, Brasil

2010



CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (HPLC)

por

Andrise Janaína FollmannJoseane Kolzer Schroeder

Relatório de aula em laboratório de Química Geral, apresentado para

análise e aprovação. Curso de Engenharia Ambiental. Universidade

Federal de Santa Maria (UFSM) – Centro de Educação Superior NorteRS (CESNORS).

Professora: Eliane Pereira dos Santos

Frederico Westphalen, RS, Brasil

2010



SUMÁRIO

INTRODUÇÃO....................................................................................................................3

2 REFERENCIAL TEÓRICO.............................................................................................42.1 Classificação da Cromatografia......................................................................5

2.1.1 Classificação pela forma física.............................................................5

2.1.2 Classificação pela fase móvel empregada...........................................5

2.1.3 Classificação quanto ao mecanismo de separação.............................6

2.2 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência .....................................................6

2.2.1 Componentes e funcionamento da CLAE ...........................................7

2.2.2 Detectores de Absorção no UV- Vísível ..............................................82.2.3 Fases Móveis e Estacionárias usadas na CLAE .................................9

2.2.4 Cromatografia em Fase Normal (NPC) e em Fase reversa (RPC)......9

2.2.5 Vantagens e Desvantagens da CLAE................................................10

3 METODOLOGIA ...........................................................................................................11

3.1 Material ...........................................................................................................11

3.2 Métodos ..........................................................................................................11

4 RESULTADOS E DISCUSSÕES .................................................................................135 CONCLUSÃO ...............................................................................................................15

6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................16



INTRODUÇÃO

A cromatografia é um método físico-químico de separação no qual os

constituintes da amostra são particionados em duas fases, uma estacionária e aoutra móvel. A grande variedade de combinações entre fases móveis e estacionárias

a torna uma técnica extremamente versátil e de grande aplicação Collins et al. (1993

apud SILVA, 2009, p.1).

São vários os critérios usados para a classificação das diferentes

modalidades de cromatografia, sendo os mais comuns relacionados à técnica

empregada, ao mecanismo de separação envolvido e aos diferentes tipos de fases

utilizadas Collins et al. (1997 apud TÔRRES, 2009, p.9).Dentre os vários métodos cromatográficos, a cromatografia líquida de alta

eficiência (CLAE) do inglês High Performance Liquid Chromatography (HPLC), é o

mais novo e mais importante membro de uma família inteira de técnicas de

separação. Por meio da CLAE pode-se detectar a maioria dos compostos e analisar

traços de compostos em amostras complexas, como sangue, urina, solo, alimentos e

petróleo.

Deste modo, o objetivo deste relatório é descrever a técnica de Cromatografialíquida de alta eficiência utilizada para determinação da concentração de uma

amostra desconhecida a partir de uma amostra padrão.



2 REFERENCIAL TEÓRICO

A cromatografia foi descoberta em 1903 pelo botânico italiano Mikahail

Tswett, que separou pigmentos de plantas usando um hidrocarboneto como solvente

e a inulina (carboidrato) em pó como fase estacionária. A separação das bandas

coloridas fez com que a técnica fosse chamada de cromatografia, a partir da palavra

grega cromatos, que significa “cor” (HARRIS, 2005).

A cromatografia é um método de análise que ocupa um lugar de destaque em

vários campos da Ciência devido à sua capacidade de identificação e purificação de

compostos, por comparação com padrões preexistentes, separando as substâncias

indesejáveis e os componentes de uma mistura (FRACETO; LIMA, 2003).

O processo cromatográfico consiste na separação dos componentes de uma

mistura, realizada através da distribuição destes componentes em duas fases, uma

permanecendo estacionária e a outra se movendo através dela. A fase móvel (o

solvente se movendo através da coluna), pode ser um líquido ou um gás, e a fase

estacionária (fixa dentro da coluna) é normalmente um líquido viscoso quimicamente

ligado a superfície de partículas sólidas empacotadas dentro da coluna (HARRIS,

2008).A distribuição dos solutos entre as fases móvel e estacionária provoca a

separação dos componentes de uma mistura. A passagem de um líquido ou de um

gás por uma coluna cromatográfica é chamado de eluição, desse modo, o fluído que

entra na coluna é o eluente e o fluído que emerge pelo final da coluna e chamado de

eluato (HARRIS, 2005)

São as forças físicas e químicas que atuam entre os solutos, e as duas fases

são responsáveis pela retenção dos solutos sobre a coluna cromatográfica. Adiferença na magnitude dessas forças que determina a resolução e portanto a

separação dos solutos individuais (CEFET, 2008).

A informação obtida de um ensaio cromatográfico é dada num cromatograma,

isto é, um registro da concentração ou da massa dos componentes da amostra em

função do tempo ou do volume de fase móvel. A informação obtida de um

cromatograma inclui uma indicação da complexidade da amostra com base no

número de picos ou manchas, informação qualitativa com base na posição nadeterminação da posição dos picos ou manchas, informação quantitativa com base

no valor do integral da variação da concentração do componente em função do

4



tempo (área do pico ou intensidade da mancha) e ainda uma indicação do estado de

conservação do sistema cromatográfico (TÔRRES, 2009).

2.1 Classificações da cromatografia

A cromatografia é classificada de acordo com vários critérios sendo os maiscomuns relacionados à forma física, aos diferentes tipos de fases utilizadas e ao

2.1.1 Classificação pela forma física

Em relação à forma física do sistema, a cromatografia pode ser subdividida

em cromatografia em coluna, onde a fase estacionária é colocada em um tubocilíndrico, e cromatografia planar, disposta sobre uma superfície planar. Enquanto a

cromatografia planar resume-se à cromatografia em papel

(CP) e à cromatografia em camada delgada (CCD). A cromatografia em coluna é

mais entendida quando classificada quanto à outro critério Neto e Nunes (2003 apud

TÔRRES, 2009 p. 4).

2.1.2 Classificação pela fase móvel empregada

Quanto à fase móvel, existem três tipos de cromatografia: gasosa, líquida e

supercrítica (CSC). No entanto há uma importante subdivisão dentro da

cromatografia líquida: cromatografia líquida clássica (CLC) e a cromatografia líquida

de alta eficiência (CLAE).

Na fase gasosa também ocorre uma subdivisão, e os métodos podem ser

classificados em: cromatografia gasosa (CG) e cromatográfica gasosa de alta

resolução (CGAR).

A classificação da cromatografia está melhor representada a seguir pela

figura 1:

5

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FIGURA 1. Representação esquemática dos diferentes tipos de cromatografia

2.1.3 Classificação quanto ao mecanismo de separação

Por este critério, separações cromatográficas se devem à adsorção, partição,troca iônica, exclusão ou afinidade.

2.2 Cromatografia Líquida de alta Eficiência

A cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) é um processo de análise de

separação física, que permite a análise qualitativa e quantitativa dos componentes

de uma amostra em poucos minutos, com alta resolução, eficiência e sensibilidade

(OLIVEIRA et al., 2007).

A CLAE utiliza instrumentos muito sofisticados que podem ser totalmente

automatizados, mas foi somente a partir dos anos 70 que se conseguiu um avanço

considerável da técnica. O avanço foi gradual e atingiu o atual nível de sofisticação

que a CLAE apresenta, devido ao revolucionário desenvolvimento tecnológico deste

tipo de cromatografia (PERES, 2002).

A cromatografia a líquido de alto desempenho é um tipo de cromatografia queemprega uma fase móvel líquida e uma fase estacionária finamente dividida e que,

para ter um fluxo razoável, opera a pressões elevadas. Originalmente chamava-se

cromatografia líquida de alta pressão e esta terminologia foi abandonada quando se

constatou que o diferencial de comportamento desta para as demais cromatografias

líquidas não era a maior pressão, mas sim o melhor desempenho cromatográfico

(SILVA, 2009).

2.2.1 Componentes e funcionamento da CLAE

7



A CLAE emprega um conjunto de equipamentos especiais, que poderão

diferir em características e grau de automação, no entanto são necessários para

uma execução correta do cromatógrafo líquido (TÔRRES, 2009).

Os cromatógrafos líquidos se caracterizam por apresentarem os seguintes

componentes (Figura 2):

Reservatório e sistema de bombeamento da fase móvel (bomba);

Sistema de introdução da amostra (injetor);

Sistema analítico – coluna cromatográfica e termostato das colunas (coluna);

Sistema de detecção (detector);

Sistema de registro e tratamento de dados (registrador);

Figura 2. Componentes da CLAE

Fonte: Adaptado de: Cromatografia Líquida de Alta Eficiência- Instituto de Química UNICAMP.

De acordo com a Figura 2, o solvente que se encontra no reservatório, é

bombeado com a ajuda da bomba através do sistema de introdução da amostra até

a coluna cromatográfica, que é geralmente recoberta por sílica. Após a chegada do

solvente na coluna, ocorre a separação dos componentes da mistura de acordo com

a natureza da fase móvel, fase estacionária e dos componentes analisados. Sendo

8



assim, a fase móvel sai da coluna e passa pelo sistema de detecção onde as

alteraçãoes de físicas de alguma propriedade da mistura são identificadas. Essas

alterações são transformadas em um sinal elétrico, que é registrado e tratado em um

processador de dados (TÔRRES, 2009).

A partir dos dados registrados pelo processador é gerado um gráfico,

chamado de cromatograma. Para avaliar os cromatogramas, existem fórmulas pré-

estabelecidas, como para calcular o número de pratos teóricos, eficiência e

resolução. Os pratos teóricos estão relacionados ao equilíbrio entre as fases móvel e

estacionária, e entre o componente analisado, assim, quanto maior o número de

pratos teóricos maior o equilíbrio existente. A eficiência de uma coluna está

relacionada com o alargamento dos picos, pois quanto maior o alargamento dos

picos, menor será a eficiência na separação. Um cromatograma com boa resolução

é caracterizado pelos picos separados, sendo ideais picos finos e altos, e todos os

picos finalizados na linha da base antes de iniciar outro pico (COLLINS et al., 1997).

2.2.2 Detectores de absorção no UV-Visível

Um detector é um transdutor que converte uma mudança de concentração na

fase móvel eluente num sinal, que é registrado num processador de dados (CEFET,

2008)

Nos detectores de absorção no UV-visível, o funcionamento se baseia na

absorbância da luz por parte da amostra ao passar através dela qualquer

radiação eletromagnética (ultravioleta até o infravermelho), em um dado

comprimento de onda (TÔRRES, 2009).

A resposta deste detector será seletiva, porque só detectará os compostos

que absorvem no comprimento de onda em que opera o detector (PATONAY, 1992).

2.2.3 Fases Móveis e Estacionárias usadas na CLAE

Na CLAE e em todos as cromatografias líquidas, a fase móvel deve ser um

líquido, e deve apresentar as características: alto grau de pureza ou de fácil

purificação, dissolver a amostra sem decompor seu componentes, não dissolver ou

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decompor na fase estacionária, ter baixa viscosidade, ser compatível com o tipo de

detector utilizado e ter polaridade adequada para permitir a separação dos

componentes da amostra (AQUINO-NETO, 2003).

As fases estacionárias na CLAE devem ser os materiais ideais, ou seja,

aqueles que em menor tempo possuem a máxima capacidade de dar a resolução na

separação da mistura, sejam de fácil introdução na coluna, produzam o mínimo de

pressão possível e possuam menos custo. As fases móveis e estcionáris devem ser

de polaridades opostas, para que o analito possa passar pela coluna sendo

conseqüentemente separado, já que interage mais com a fase estacionária.

(TÔRRES, 2009).

Por mais de 30 anos a sílica tem sido o material preferido para a preparação

das fases estacionárias, sendo que é mecanicamente estável à altas pressões, pode

ser facilmente modificada, existe um vasto conhecimento de sua estrutura e suas

propriedades e é comercialmente disponível em uma grande variedade de tamanho

de partículas, formas e tamanhos de poros (TONHI et al., 2001).

2.2.4 Cromatografia em Fase Normal (NPC) e em Fase Reversa (RPC)

As separações em CLAE podem se dar por adsorção, partição ou ambos,

sendo que o suporte mais utilizado para esse tipo de cromatografia é a sílica. Essas

fases, dependendo da modificação feita ao suporte podem atuar no modo normal ou

reverso (DEGANI; CASS; VIEIRA, 1998)

A cromatografia em fase reversa é caracterizada por apresentar a fase

estacionária mais apolar do que a fase móvel, e no entanto a cromatografia líquida é

chamada de fase normal.

Cromatografia em fase inversa permite separar moléculas com base na sua

polaridade, sendo a fase estacionária quimicamente modificada com sílica

hidrocarbonetos saturados, insaturados ou tipos aromáticos. Isso faz com que a fase

estacionária seja uma matriz apolar. Portanto, para este tipo de cromatografia é

utilizada misturas de solventes polares como a água, acetonitrila, acetato de etila,

entre outros (OLIVEIRA et al., 2007).

2.2.5 Vantagens e Desvantagens da CLAE

10



A CLAE possui muitas vantagens significativas, onde sua fase estacionária

pode ser utilizada várias vezes, possui um menor tempo de análise e eficiente

precisão, tendo uma alta resolução (picos cromatográficos mais separados). É uma

boa técnica para análises quantitativas e qualitativas, onde a segunda se baseia em

parâmetros de identificação como, o tempo de retenção e o espectro de absorção no

UV, já a análise quantitativa apresenta desvios inferiores a 5%. Tem também pontos

positivos como a boa detectabilidade da absorção UV-Visível e de fluorescência.

Outra importante vantagem é a sua automação, devido o autosampler e o

computador, pois o uso deste tem aumentado a capacidade de utilização dos

aparelhos para a preparação da amostra, a injeção, o controle, aquisição e

tratamento de dados (BOTTOLI, 2008).

Em contrapartida, tem como uma vantagem bastante significativa o alto custo

do equipamento, assim como alto custo para mantê-lo em situações normais para

uso. Não existe um detector universal que possua boa detectabilidade e baixo custo

respectivamente (BOTTOLI, 2008).

3 METODOLOGIA

3.1 Material

11



Os materiais utilizados para a análise das amostras, e determinação da

concentração da amostra desconhecida, através da Cromatografia Líquida de Alta

Eficiência (CLAE), foram os seguintes:

Cromatógrafo Líquido de Alta eficiência (CLAE);

Amostra padrão de 2,4-D (2,4 dicloro-fenóxiacético);

Amostra desconhecida;

Fase móvel: Aceto Nitrila (60%) e água (40%);

Fase estacionária: Sílica recoberta com LC-C18 (octadecil silano);

Computador para processamento de dados;

3.2 Métodos

O CLAE é um equipamento muito desenvolvido e como o próprio nome diz,

trabalha com uma alta eficiência, dessa forma não há a necessidade de outros

materiais para realizar a separação e classificação da amostra, a não ser o próprio

equipamento.

O procedimento de análise das amostras iniciou-se com a explicação teórica

sobre o funcionamento do equipamento.

Dessa forma, ocorreu a injeção da amostra padrão de 2,4-D, injeção essa que

foi feita através de um autosampler , o qual possui uma válvula de injeção que puxou

a amostra.

Posteriormente a amostra padrão passou por um detector, neste caso UV –

visível, que possui uma pequena célula de fluxo conectado na saída da coluna e que

monitora a concentração dos analitos, este detector detecta a sensibilidade e a

especificidade da amostra.

Por fim, ocorreu o tratamento de dados, feito através de um computador que

possui um software específico que coletou os dados e os processou na forma de

cromatogramas.

Em seguida, todo esse processo foi feito para determinar a concentração da

amostra desconhecida, a qual gerou novamente um cromatograma que foi

comparado à amostra padrão.

12



4 RESULTADOS

No CLAE utilizado, a cromatografia foi em coluna RP, ou seja, de fase reversa

com 15 centímetros, com um suporte contendo partículas de sílica (superfície polar),

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as quais são revestidas por um grupo funcional C18 (octadecil silano), que possui

uma superfície apolar, dessa maneira, as cadeias carbônicas atraíram substâncias

apolares, deixando as substâncias polares passarem com mais facilidade. A coluna,

continha aceto nitrila e água como fase móvel e, sílica como fase estacionária.

O equipamento possui também um bujão (cartucho) que forma uma pré-

coluna, o qual retém impurezas protegendo a coluna e também possibilitando a ela

uma vida útil e mais longa.

Todo esse processo de cromatografia resultou em um cromatograma que

formou picos de detecção. Sendo assim, no primeiro cromatograma, ou seja, da

amostra padrão, injetada com um volume de 0,01 mL, o tempo de retenção em que

a amostra passou pelo detector foi de 4,83 min. A detecção emitiu duas luzes, uma

azul claro, com 230 nanômetros e a outra, azul escuro, com 280 nanômetros.

A velocidade do fluxo foi de 1 mL/min., com concentração de 25 µg/mL, uma

área de 323,696 [mV.s] e altura de 42,848 [mV]. Dessa maneira, segue abaixo o

gráfico 1 referente a amostra padrão:

Gráfico 1. Cromatograma de uma amostra padrão de 2,4 dibromofenóxiacético

A segunda amostra foi injetada com um volume de 0,01 mL, apresentando

uma área de 55,88 [mV.s] e altura de 7,445 [mV]. A área do pico foi proporcional a

concentração da amostra, porém como a concentração da amostra não era

conhecida, foi comparada à amostra padrão. Desta forma, para encontrar a

14



concentração, foi calculada através de regra de três resultando em uma

concentração de 4,3 µg/mL.

O gráfico 2, da amostra desconhecida, esta apresentado a seguir:

Gráfico 2. Cromatograma da amostra desconhecida

5 CONCLUSÃO

15



Através da prática realizada, foi possível concluir que a amostra “dois”, de

concentração antes desconhecida, apresentou 4,3 µg/mL de concentração. Quanto

maior a área do pico, maior a concentração da substância.

A aplicabilidade da CLAE é ampla em vários setores áreas, como na química,

indústria, saúde e meio ambiente, porém ainda é pouco explorada, provavelmente

por falta de conhecimento de suas utilizações.

Para utilização da CLAE, é necessário conhecimento e estudo prévio de todos

os mecanismos e fatores que estão relacionados à técnica, pois apesar de os

equipamentos cromatográficos serem aparelhos automatizados, o manejo e a

padronização para cada amostra é diferente e necessita de experiência.

A CLAE apresenta várias vantagens, a principal delas é a sua capacidade de

separação e quantificação de compostos presentes em uma determinada mistura.

Indubitavelmente, a prática serviu para adquirirmos um maior conhecimento

na área da cromatografia, e conseqüentemente suas aplicações na Engenharia

Ambiental.

6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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AQUINO-NETO, F.R; NUNES, D.S.S. Cromatografia: princípios básicos etécnicas afins. Rio de Janeiro:Interciência, 2003, 187p.

BOTTOLI, C. B. G. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência. Instituto de Química – UNICAMP, 2008.

CENTRO FEDERAL DE EDUCAÇÃO TECNOLÓGICA. Cromatografia líquida dealta resolução. Rio de janeiro, 2008. Disponível em:<http://www.ifrj.edu.br/aluno/a/instrumental/CLAE.pdf>. Acesso em: 10 jun. 2010.

COLLINS, C. H.; BRAGA, G. L.; BONATO, P.S. Introdução a métodos

cromatográficos. 5ª ed. Campinas, SP, 1993.

DEGANI, A. L. G.; CASS, Q. B.; VIEIRA, P. C. Cromatografia: um breve ensaio. 7ed. 1998. Disponível em: <http://qnesc.sbq.org.br/online/qnesc07/atual.pdf>. Acessoem: 14 jun. 2010.

FRACETO, L. F.; LIMA de, S. L. T. Aplicação da cromatografia em papel naseparação de corantes em pastilhas de chocolates. 18 ed. p. 46, 2003.Disponível em: < http://qnesc.sbq.org.br/online/qnesc18/A10.PDF>. Acesso em: 10 jun. 2010.

HARRIS, D. C. Análise química Quantitativa. Rio de Janeiro: Focus, 6 ed. 2005.

NETO, F. R. A.; NUNES, D. S. S. Cromatografia: Princípios básicos e técnicas afins.Rio de Janeiro, RJ, 2003.

OLIVEIRA, R. F.; SIQUEIRA,A. K. P. B.; FERREIRA, A. L. O.; GONÇALVES, L. R. B.Departamento de Engenharia Quimica - Universidade Federal do Ceara. Disponívelem: < http://www.ufscar.br/cobeqic07/pdf/poster_i/pi103.pdf>. Acesso em: 17 jun.2010.

PATONAY, G. HPLC Detection: Newer methods. New York: VCH, 1992,236p.

PERES, T.B. Noções básicas de cromatografia. Biológico. São Paulo, 2002,

v.63, n.2, p.227-229.

17



SILVA da. D. S. M. Cromatografia Líquida de alta eficiência (HPLC). 2009.Disponível em: <http://www.webartigos.com/articles/19831/1/Cromatografia-Liquida-de-Alta-Eficiencia-HPLC-/pagina1.html>. Acesso em: 14 jun. 2010.

TONHI, E.; COLLINS, K.E.; JARDIM, I.C.S.F.; COLLINS, C.H. Fases estacionáriaspara cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa (CLAE-FR)baseadas em superfícies de óxidos inorgânicos funcionalizados. São Paulo,2001.

TÔRRES, A. C. B. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência. Goiânia, 2009.

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