how can you explain human complexity when we have so few protein coding genes, e.g. about 5,000 less...
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How can you explain human complexity when we have so few protein
coding genes, e.g. about 5,000 less than a
cucumber?
Isabella CeccheriniUOC Genetica Medica, IGG
17 Febbraio2015
C-value* paradoxnon vi è relazione tra il C-value di un organismo e la sua
complessità biologica
* C-value=quantità di DNA in un set aploide
G-value* paradoxnon vi è relazione tra il G-value di un organismo e la sua
complessità biologica
* G-value=numero di geni presenti in un corredo aploide
C. elegans = 959 o 1031 cellule ma stesso numero di geni che nell’uomo
Pulce d’acqua e afide del pisello = molte migliaia di geni più che nell’uomo (≥35.000)
Perché organismi tanto semplici necessiterebbero di tanti geni?1. Pressione selettiva per l’adattamento a
ambienti e predatori diversi
2. Espansione di famiglie di geni tipicamente coinvolti nella risposta a stimoli ambientali es.: roditori hanno più recettori olfattivi (cambio adattativo), primati hanno più geni codificanti miRNA (hanno contribuito allo sviluppo cerebrale)
Come fanno organismi tanto complessi con un numero di geni relativamente basso?
Se non è il numero di geni il determinante primario della complessità di un organismo, cosa è allora?
Proporzione di DNA non codificante, aumenta dai Metazoi semplici a quelli complessi (es.: da 75Mb in C. elegans a 3070Mb nell’uomo)
Tra il DNA non codificante si trovano aumentate:
- le regioni non tradotte di geni codificanti proteine (5’ UTR e 3’ UTR), sede di sequenze regolatorie
- le regioni altamente conservate (es.: si equivalgono alla porzione codificante in Drosophila, 4 volte la porzione codificante nell’uomo)
Splicing alternativo, raro nei Metazoi semplici ma presente nella maggioranza (>80%) dei geni umani
Poliadenilazione alternativa
Regolazione dell’espressione
genica
considerata quale responsabile di
molte delle differenze fenotipiche tra
specie
comparando l’espressione genica genome-
wide in tessuti equivalenti da DNA umani e da
DNA di primati non umani è emerso che sono
i geni codificanti fattori di trascrizione quelli
che mostrano con più alta probabilità
differenze tra le due specie
Cellule
umane
specializza
te
mostrano
patterns
distinti di
espression
e genica
La regolazione dell’espressione
genica prevede il
coordinamento di una serie di
eventi che dall'attivazione della
trascrizione di un gene,
conducono alla produzione
della proteina corrispondente.
Il controllo di questi processi è
molto fine e la sua complessità
aumenta salendo lungo la scala
evolutiva.
Check
points
I geni sono inizialmente trascritti come lunghi mRNA precursori che vanno incontro ad una serie di modificazioni nucleari (aggiunta del 5’cap, poliadenilazione e splicing) prima di essere esportati nel citoplasma.
Modificazioni post-trascrizionali dell’RNA
Splicing alternativo (AS) dell’RNAPermette ad un singolo gene di codificare isoforme multiple di trascritti, un modo per generare diversità funzionale nel proteoma cellulare
Avviene in quasi ogni gene umano e, mentre in alcuni casi deriva da imprecisioni nel complesso macchinario, in numerosi altri è chiaramente funzionale
Nei Vertebrati gli esoni sono molti più corti degli introni. Prima che gli introni vengano rimossi dal trascritto
primario, ogni esone è inizialmente riconosciuto da fattori proteici.
Meccanismo dello splicing
Meccanismo dello splicing
Meccanismo dello splicing
Meccanismo dello splicing
“U” factors: small nuclear ribonucleoprotein particles (snRNPs)
In funzione dello splicing si possono avere 4 tipi di esoni
Splicing alternativo (AS) dell’RNALo spliceosoma si assembla in base al bilanciamento tra fattori proteici che lo promuovono e fattori proteici che lo sopprimono. Tali fattori possono avere una diversa distribuzione tissutale. Inoltre, i siti di splicing stessi possono essere deboli o forti; gli esoni alternativi possiedono siti di splicing più deboli
Controllo dello splicing
alternativo
Controllo dello splicing
alternativo
Binding of U2 snRNP to the branch site is promoted by the binding of an alternating arginine/serine (RS) domain-containing factor (U2AF) to the polypyrimidine tract (PPT). The
large RS domain protein (green oval) represents an SR-related splicing coactivator protein that serves to bridge crossintron, and possibly crossexon, interactions involving snRNPs and ESE
bound SR proteins.
Risultati dello splicing alternativo
Insieme ad esoni alternativi si possono introdurre: codoni di stop prematuri*, frameshifts*, siti per modificazioni post-traduzionali siti per la localizzazione subcellulare
* Splicing alternativo & evoluzione
Legano l’apparizione e la moltiplicazione degli introni nei genomi agli effetti benefici del “nonsense mediated decay” (NMD): NMD avrebbe agito come selezionatore degli introni
di nuova insorgenza, permettendo che rimanessero nei genomi solo quelli non deleteri
Osservano che l’AS e l’NMD sono strettamente accoppiati. Infatti riportano che 1/3 delle varianti AS che esaminano
contengono PTCs (premature truncating codons), ossia sono targets di NMD. Questo fenomeno non va visto come uno
spreco cellulare ma piuttosto come mezzo per le cellule di regolare l’espressione genica a livello post-trascrizionale in
una maniera tempo– e tessuto-specifica
Risultati dello splicing alternativo
Insieme ad esoni alternativi si possono introdurre: codoni di stop*, frameshifts*, siti per modificazioni post-traduzionali siti per la localizzazione subcellulareAlcuni recettori di membrana hanno isoforme di membrana e isoforme solubili a seconda dell’inclusione o meno di un dominio TM
Due diverse isoforme possono competere, ad esempio per un ligando, determinando conseguenze funzionali
Un gene più prodotti genicialternative splicing
splicing alternativo della Tropomiosina
Lo splicing alternativo può aver generato durante l’evoluzione nuovi geni con nuove combinazione di esoni che
specificherebbero per domini diversi a partire dalla ricombinazione tra introni di geni diversi
Risultati dello splicing alternativo
AS può anche risultare in: diverse sequenze al 5’UTR e 3’UTR diversi segnali di poliadenilazione in esoni alternativi
5’UTR è principalmente coinvolto nel controllo della traduzione. 3’UTR regola aspetti multipli del metabolismo dell’mRNA (esporto nucleare, localizzazione citoplasmatica, efficienza della traduzione e stabilità dell’mRNA)
Gli mRNA acquisiscono una coda di poli(A) all’estremità 3’-terminale in un processo noto come poliadenilazione
Poliadenilazione costitutiva: il gene contiene solo un sito poli(A)
Regione codificante non tradotta (UTR)-APA: il gene contiene siti poli(A) multipli localizzati nel 3’UTR. APA risulta in mRNAs con diverse lunghezze del 3’UTR, ma che producono la stessa proteinaRegione codificante (CR)-APA: il gene contiene siti poli(A) aggiuntivi localizzati in esoni e introni. APA risulta in mRNAs con diversi 3’UTRs and regioni codificanti C-terminali, che producono isoforme proteiche distinte
Uso alternativo di 3’UTR e di siti di poliadenilazione genera un altissimo grado di variabilità di isoforme
≤1/3 geni
≥2/3 genei
Sito poli(A) prossimale, normalmente non-canonico e debole. Usato durante la proliferazione, dedifferenziamento e trasformazione cellulare, quando fattori PA up-regolati
Sito poli(A) distale, normalmente canonico e forte. Usato durante il differenziamento, quando fattori PA down-regolati
Pattern di poliadenilazione in diversi contesti cellulari
Siti di legame per diversi fattori di trascrizione coinvolti nella proliferazione/differenziamento (E2F, c- myc, and p53) si trovano arricchiti nei promotori di geni codificanti per fattori di poliadenilazione
CITOPLASMAmRNA nel citoplasma
traduzioneDegradazione dell’mRNA
Polipeptide
Proteina attivaDegradazione della proteina
Processamento della proteina (es.
Cleavage, modificazioni
chimiche)
Trasporto alla destinazione
cellulare
Funziuone cellulare (es. attività enzimatica, supporto strutturale)
Ulteriori Controlli Post-trascrizionali
Stabilità dell'RNA Inibizione della traduzione di RNA specifici Regolazione dell'efficienza della traduzione Controllo della localizzazione citoplasmatica degli RNA
Ancora un supplemento di spiegazione nelle prossime diapositive ………
La concentrazione di un mRNA è una funzione del suo grado di sintesi e di degradazione
Quando la sintesi è favorita, l’mRNA resterà disponibile più a lungo per essere tradotto, risultando in un più alto livello di prodotto genico
La stabilità degli RNAs è regolata fa fattori che agiscono in trans come proteine che legano gli mRNA, miRNA e lncRNA
Tutti questi fattori sono regolatori genici post-trascrizionali che legano gli mRNA e possono regolare sia la stabilità dei trascritti che la loro traduzione
Regolazione della stabilità dell’mRNA
della caseina
Elementi AU-rich (AREs) sono
elementi destabilizzanti che
agiscono in cis (cis-acting),
localizzati nel 3’UTR di una
varietà di mRNAs a vita corta
come quelli per le citochine e
i proto-oncogeni.
AREs sono riconosciuti da
fattori trans-acting alcuni dei
quali promuovono mentre
altri inibiscono la
deadenilazione e la
degradazione degli mRNA
La selezione dei siti poli(A) genera isoforme di mRNA con diversa localizzazione subcellulare e funzioneEventi nucleari (a) e/o citoplasmatici (b) inducono il rimodellamento del 3’UTR e influenzano la traduzione di isoforme specifiche
Meccanismi di localizzazione dell’mRNA e traduzione controllata dal rimodellamento del 3’UTRI trascritti maturi vengono esportati dal nucleo e una volta giunti nel citoplasma: se l’mRNA è attivamente tradotto, la coda di poli(A) è progressivamente scorciata ad una velocità specifica per ciascun mRNA, determinante la sua emivita gli mRNAs che devono essere silenziati (non tradotti) sono deadenilati, “decapped “ e avviati all’ mRNA decay
In alcuni casi, gli mRNAs che devono essere mantenuti in uno stato dormiente vengono deadenilati e vanno incontro a poliadenilazione citoplasmatica successivamente, ossia quando tornano ad essere traducibili
Una isoforma del BDNF con un lungo 3’UTR è trasferita ai dendriti e la sua traduzione in loco è necessaria per manifestare i suoi effetti sulla sfrondatura e la morfologia delle spine dendritiche, oltre che per la plasticità sinaptica
Esempi di sintesi proteica locale in neuroni di mammifero
Segnali-guida attrattivi o repulsivi dirigono la crescita assonale attraverso riarrangiamenti del cono di crescita. Il riarrangiamento del citoscheletro è indotto, almeno in parte, da traduzioni locali di b-actin (ACTB) o RHOA mRNAs
Degradazione dell’mRNA
Traduzione
Processamento e degradazione delle proteine
Modificazioni della cromatina
trascrizione
Processamento dell’RNA
degradazione dell’mRNA
traduzione
Processamento e degradazione delle proteine
Ulteriori Controlli Post-trascrizionali
ogni mRNA ha una caratteristica emi-vita, determinata in parte da sequenze al 5’UTR e 3’UTR
L’iniziazione della traduzione può essere controllata mediante la regolazione dei fattori di inizio
Anche il processamento e la degradazione delle proteine mediante proteasoma (UPS) sono soggetti a regolazione
Cytoplasmic Polyadenyla
tion Promotes
Translation in Some mRNAsIn immature oocytes,
many mRNA containing U rich and short poly
(A) are inactive for translation. These mRNAs have to be
polyadenylated in the cytoplasm before they
can be activated for translation.
The best-characterized cytoplasmic polyadenylation element, CPE, whose consensus U(4–5)A(1–2)U is highly conserved, binds the CPE binding protein (CPEB) and recruits its interacting partners, the poly(A) ribonuclease (PARN) and the poly(A) polymerase GLD2. As PARN activity is higher than GLD2, in the cytoplasm, the poly(A) tails of CPE-containing RNAs are shortened and translation is repressed. Extracellular stimuli that activate protein synthesis induce phosphorylation of CPEB, resulting in dissociation of PARN from the ribonucleoprotein complex and GLD2-dependent elongation of mRNA poly(A) tails