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HOLOTYPEHLA™CONFIGURAZIONE96/7A&CE

E96/7B&CE(REF:H32EH34)ISTRUZIONID'USO

VERSIONE92017/08/21

PerUsoDiagnosticoInvitro

V1

0086PreparazionedellalibraryDNAperanalisidisequenziamentosuMiSeq

Illumina

OmixonHolotypeConfigurazioneHLA-96/7A&CEe96/7B&CEIstruzionid'usoV9.Perusodiagnosticoinvitro.Copyright©2015,OmixonBiocomputingLtd.Confidential&Proprietary Pag.2│47

IndiceINFORMAZIONISULPRODUTTORE.......................................................................................................................6

SIGNIFICATODEISIMBOLI....................................................................................................................................6

KITHOLOTYPEHLA-96/7CONFIGURAZIONEA1&CE............................................................................................7

SCATOLACOMPONENTIPRIMER.......................................................................................................................................7SCATOLACOMPONENTIREAGENTIPERPREPARAZIONELIBRERIE.............................................................................................7PIASTRAA96POZZETTICONADATTATORI..........................................................................................................................7WORKBOOKEXCEL........................................................................................................................................................8SOFTWARE–OMIXONHLATWIN....................................................................................................................................8

TRASPORTOECONSERVAZIONE...........................................................................................................................8

AVVERTENZEEPRECAUZIONI...............................................................................................................................8

INFORMAZIONIPERLASICUREZZA.......................................................................................................................9

PARAMETRIDIPRESTAZIONE...............................................................................................................................9

ASSISTENZATECNICA...........................................................................................................................................9

SupportoTelefonico...............................................................................................................................................10

APPARECCHIATURE,REAGENTIEFORNITURE.....................................................................................................10

RACCOMANDAZIONITECNICHESULLEAPPARECCHIATURE....................................................................................................10RACCOMANDAZIONISUIREAGENTIASSOCIATI...................................................................................................................10CapacitàKitReagentiMiSeq.................................................................................................................................11FORNITURERACCOMANDATE.........................................................................................................................................11

AVVISOLEGALE..................................................................................................................................................13

DESTINAZIONED'USO.........................................................................................................................................13

OSSERVAZIONEIMPORTANTEPRIMADIINIZIARE..............................................................................................14

RACCOMANDAZIONECIRCAL'ESTRAZIONEDIDNAGENOMICO.............................................................................................14

PRINCIPIODELMETODO.....................................................................................................................................14

SOMMARIODELLEFASI......................................................................................................................................16

GLOSSARIO/DEFINIZIONI....................................................................................................................................17

FASE1–PREPARAZIONEMASTERMIXPERAMPLIFICAZIONEHLA......................................................................18

ELENCOREAGENTI.......................................................................................................................................................18PROTOCOLLO..............................................................................................................................................................18MasterMix:HLA-A,B,C,DRB1,DPB1eDQA1......................................................................................................19MasterMix:HLA-DQB1Set1(Opzionale)eDQB1Set2(Necessario)...................................................................19

FASE2–AMPLIFICAZIONEHLACLASSEIEII.......................................................................................................20

ELENCOREAGENTI.......................................................................................................................................................20PROTOCOLLO..............................................................................................................................................................20MasterMixpiùEnzima:HLA-A,B,C,DRB1,DPB1eDQA1....................................................................................20MasterMixpiùEnzima:HLA-DQB1Set1(Opzionale)eHLA-DQB1Set2(Necessario).........................................20AmplificazioneClasseI(HLA-A,BeC)....................................................................................................................21AmplificazioneClasseII(HLA-DRB1,DQB1set1,DQB1set2,DPB1eDQA1).......................................................21DimensioniPrevisteAmpliconi...............................................................................................................................22


FASE3–QUANTIFICAZIONEAMPLICONIENORMALIZZAZIONE(UTILIZZANDOUNFLUORIMETROPERPIASTRE)23

ELENCOREAGENTI.......................................................................................................................................................23PROTOCOLLO..............................................................................................................................................................23PurificazionePCRExoSAP-IT..................................................................................................................................25

FASE4–PREPARAZIONELIBRERIA......................................................................................................................26

ELENCOREAGENTI.......................................................................................................................................................26PROTOCOLLO..............................................................................................................................................................26MasterMixFrammentazione................................................................................................................................27ProgrammaFrammentazione................................................................................................................................27MasterMixRiparazioneEstremità........................................................................................................................28ProgrammaRiparazioneEstremità.......................................................................................................................28MasterMixLigazione............................................................................................................................................29ProgrammaLigazione............................................................................................................................................30

FASE5–SELEZIONEDIMENSIONALELIBRERIA....................................................................................................32

ELENCOREAGENTI.......................................................................................................................................................32PROTOCOLLO..............................................................................................................................................................32

FASE6–QUANTIFICAZIONELIBRERIA.................................................................................................................33

ELENCOREAGENTI.......................................................................................................................................................33PROTOCOLLO..............................................................................................................................................................33PrimerMixqPCR....................................................................................................................................................33MasterMixqPCR...................................................................................................................................................34

FASE7–SEQUENZIAMENTOSUMISEQILLUMINA..............................................................................................35

ELENCOREAGENTI.......................................................................................................................................................35CapacitàKitReagentiMiSeq.................................................................................................................................35PROTOCOLLO..............................................................................................................................................................35

FASE8–ANALISIDATIDISEQUENZIAMENTOHLA.............................................................................................37

PROTOCOLLOAUTOMATIZZATO......................................................................................................................................37InstallazioneITeConfigurazione...........................................................................................................................37ProtocolloperAnalisi.............................................................................................................................................37PROTOCOLLOSERVERMANUALE....................................................................................................................................37InstallazioneITeConfigurazione...........................................................................................................................37ProtocolloperAnalisi.............................................................................................................................................37PROTOCOLLODESKTOPMANUALE..................................................................................................................................37InstallazioneITeConfigurazione...........................................................................................................................37ProtocolloperAnalisi.............................................................................................................................................38

FIGURESUPPLEMENTARI....................................................................................................................................39

ESEMPIODIPIASTRAPERPIASTRAAMPLICONI,PIASTRAAMPLIFICAZIONE,PIASTRADILUIZIONE,PIASTRAQUANTIFICAZIONEAMPLICONI(PERUNLOCUSINDIVIDUALE)EPIASTRAREAZIONE............................................................................................................39ESEMPIODIPIASTRAQUANTIFICAZIONESTANDARD..........................................................................................................40ESEMPIODIPIASTRAQPCR...........................................................................................................................................40

APPENDICE1:PIPPINPREP.................................................................................................................................41

PROGRAMMAZIONEPIPPINPREP....................................................................................................................................41ESECUZIONEDIUNACORSASUPIPPINPREP......................................................................................................................41

APPENDICE2:FOGLIOCAMPIONE......................................................................................................................43


APPENDICE3:QUANTIFICAZIONEAMPLICONIUTILIZZANDOUNOSTRUMENTOPERQPCR.................................46

ELENCOREAGENTI.......................................................................................................................................................46PROTOCOLLO..............................................................................................................................................................46


CronologiaRevisioni– NoteeAggiornamentiImportanti

Versione Data Autore Sommariodellemodifiche Autorizzatada

V1 5/12/2015 Robert

PollockPrimastesuraversione Gergely

Tölgyesi

V2 18/01/2016 RobertPollock

Secondastesura,correzionidipiccolaentità

GergelyTölgyesi


Terzabozza,aggiornamentospiegazionesimboli,raccomandazioneciclocongelamento/scongelamentoedestinazioned'uso

GergelyTölgyesi


Quartabozza,aggiornamentisezioneinformazioniperlasicurezza

GergelyTölgyesi


Quintaversione,raccomandazionealternativaperquantificazioneampliconi

EfiMelista

V6 09/04/2016 EfiMelista Cambiamentoformulazioneminoreda"enzimaLR-PCR"a"Taqpolimerasi"basatosulcambiamentodidocumentazionediQiagen

GergelyTolgyesi

V7 23/04/2016 EfiMelista DQB1set1eset2aggiornamentodichiarazione

GergelyTolgyesi

V8 07/10/2016 EfiMelista Metrichediperformanceaggiornati,Libreriaaggiornatavolumipreparazionedireagenti

GergelyTolgyesi

V9 21/08/2017 EfiMelista AggiuntadellaconfigurazionedellapiastradiadattamentoB

GergelyTolgyesi

Liberatoria

Omixon ha compiuto il massimo sforzo per garantire l’accuratezza delle presenti Istruzionid'Uso (IFU), tuttavia Omixon esclude qualsiasi responsabilità per eventuali imprecisioni od


omissioni. Le informazioni nelle presenti IFU sono soggette a modifiche senza preavviso.Omixonnonsiassumealcunaresponsabilitàpereventuali imprecisionichepotrebberoesserecontenutenellepresentiIFU.Omixon si riserva il diritto di apportare miglioramenti alle presenti IFU e/o ai prodotti quidescrittiinqualsiasimomentosenzapreavviso.Qualora nel presente manuale si rilevassero informazioni non corrette, ingannevoli oincomplete, vi saremo grati per qualsiasi commento e suggerimento. Vogliate inviarceliall'[email protected].

InformazionisulProduttoreRagionesociale:OmixonBiocomputingLimited

Indirizzo:Fehérváriút50-52/6

Città:Budapest

Codicepostale:H-1117

Paese:Ungheria

SignificatodeiSimboli

LOTTO/NumeroLottoNumerodiriferimento/catalogoConsultareleIstruzioniD’UsoContienereagentepernumeroNditestDichiarazionedelProduttorelegale.LadataindicatainsiemealsimbolosiriferiscealladatadiproduzioneTemperaturadiconservazioneraccomandataDatadiscadenza

DispositivoMedicoperUsoDiagnosticoInVitroContienecomponentesostitutivo


KitHolotypeConfigurazioneHLA-96/7A&CEE96/7B&CE

ScatolaComponentiPrimerLa scatola componenti primer contiene soluzioni di primer specifici pronte all’uso perl'amplificazionemiratamedianteLongRangePCRdeigeniHLAA,B,C,DPB1,DQA1eDQB1,eDRB1.Inaggiunta,essacontieneduetipidiadditiviperPCR(Enhancer1eEnhancer2).

Miscelaprimer N.RIF. Reaz. Vol/prov. N.prov. Codif.coloreHLA-A P013 96 220μL 1 GialloHLA-B P023 96 220μL 1 RossoHLA-C P033 96 220μL 1 ArancioHLA-DRB1 P043 96 220μL 1 VerdeHLA-DQB1(Serie1) P053 96 220μL 1 BluHLA-DQB1(Serie2) P063 96 220μL 1 NeroHLA-DQA1 P073 96 220μL 1 MarroneHLA-DPB1 P083 96 220μL 1 PorporaEnhancer1 E01 96 1100μL 1 TrasparenteEnhancer2 E02 96 300μL 1 Trasparente

ScatolaComponentiReagentiperPreparazioneLibrerieLa scatola componenti preparazione librerie fornisce reagenti per la preparazione di librerie(frammentazione, riparazione blunt-end ed adenilazione delle estremità degli ampliconi,ligazionediadattatoriedindici)apartiredagliampliconiHLA.

Reagente N.RIF. Reaz. Vol/prov. N.diprov. Codif.coloreEnz.Framment.(A) R12 96 278μL 1 GialloTamponeFramment.(B) R22 96 278μL 1 RossoEnz.Riparaz.Estrem.(C) R32 96 162μL 1 VerdeTamp.Riparaz.Estr.(D) R42 96 324μL 1 ArancioEnz.Ligazione(E) R52 96 324μL 1 BluTamp.Ligazione(F) R62 96 1800μL 2 Nero

Piastraa96pozzetticonAdattatoriIl terzo componente è la piastra a 96 pozzetti che contiene adattatori con indici per NGS(oligonucleotidiDNAadoppiofilamento)in5μLdisoluzionepergeneraresingolelibrerieper


NGS.Questapiastracontieneunnumerosufficientediadattatoriconindiciper96pozzettialloscopodigenerarelibrerieNGSper96campioniel'identificazioneavalledeicampionistessi.Reagente N.RIF. Reaz. Vol/pozzetto N.diPiastrePiastraAdattatoriA(i1-96)

N1 96 5μL 1

PiastraAdattatoriB(i97-192)

N2 96 5μL 1

WorkbookExcelPer facilitare il protocollo Holotype HLA 96/7 viene fornito unWorkbook Excel completo dicalcoli,layoutpiastre,registrazionedati,generazionedelsamplesheetperMiSeqemoltoaltro.Senonneaveteunacopia,[email protected].

Software–OmixonHLATwinContattatesales@omixon.compericreditiOmixonHLATwinassociaticonilvostroacquistodelkitHolotypeHLA96/7.Notaimportante:Siraccomandal’impiegocombinatodelkitOmixonHolotypeHLA96/7conilsoftwareOmixonHLA Twin per garantire il massimo risultato diagnostico in vitro. Consultate la SezioneAvvertenzaeprecauzionicircalelimitazionid'usodelprodotto.Sonodisponibilisingolireagentidiricambiopreviaappositarichiestadapartedell'utilizzatore.Omixonfornisce leconfezionicompletedi tutti icomponenti,nonflaconisingoli.Permaggioriinformazionicontattatesales@omixon.com.

TrasportoeConservazione• Ilprodottovienespeditoinscatoled’imballoinStyrofoamconghiaccioseccoeall'arrivo

dovrà essere conservato a -20°C. Siete pregati di convalidare regolarmente il vostroprocessodicontrolloemonitoraggiodella temperaturadeicongelatoriedieffettuareinterventidimanutenzioneregolari.

• Se conservati a -20°C, i kit non aperti sono stabili fino alla data di scadenza (indicatasull'etichettadelkit).

• Dopo l'apertura, si raccomandano max. quattro (4) cicli dicongelamento/scongelamentopergarantire la stabilitàdelprodotto. Se conservati a -20°C,ikitapertisonostabilifinoa3mesi.

Avvertenzeeprecauzioni


Limitazionid'UsodelProdotto

• Pergarantireprestazioniottimali,usate il kitHolotypeHLA96/7e il softwareOmixonHLATwinper la tipizzazionedell'HLAmedianteNGS con i componenti, i reagenti e leapparecchiatureraccomandatinellasezione“ApparecchiatureeReagenti”.

• L'impiego di componenti e reagenti diversi da quelli specificati in questa sezione vaaccuratamenteverificatoevalidatodall'utilizzatore.

• Non ricostituirenédiluire i reagenti in volumidiversi daquelli descritti nelle presentiIFU. Non utilizzare volumi dei reagenti minori di quelli specificati. In caso contrario,potrannoverificarsideglierroridiprestazione.

• Omixonnonpuò fornirealcun supportopereventualiproblemi risultantidalmancatorispettodellefasiprevistenelprotocollodescrittonellepresentiIFU.

• Incasodidannivisibiliai suoicomponenti,nonutilizzare ilprodotto (flaconiopiastradanneggiati,tappiallentati,ecc.).

Informazioniperlasicurezza• Primadi iniziare, leggere lesezioni“Informazioniper lasicurezza”e“Noteimportanti”

circareagentiokitspecificatiin“Apparecchiature,ReagentieForniture”.• Quando si lavora con sostanze chimiche, indossare sempre camici, guantimonouso e

occhiali protettivi adatti. Permaggiori informazioni, consultare le Schede di Sicurezza(SDS)reperibilipressoirispettivifornitori.

• UnapanoramicadeicomponentichimicideireagentidelprodottopuòesseredesuntadagliSDSdelkitHolotypeHLA96/7,disponibilisurichiesta.

• Icomponentidelprodottovannosmaltiticomerifiutimedicigenerici.

ParametridiprestazionePrincipaliparametridiprestazionestabilitiinbaseallavalidazionedelprodotto.

HLA-A HLA-B HLA-DRB1 HLA-C HLA-DPB1 HLA-DQA1 HLA-DQB1

Sensibilità99.054% 99.171% 98.335% 96.310% 98.818% 98.927% 95.724%

Specificità99.966% 99.982% 99.956% 99.863% 99.946% 99.881% 99.775%

Precisione99.054% 99.171% 98.335% 96.310% 98.818% 98.927% 95.724%

Accuratezza99.935% 99.965% 99.915% 99.736% 99.897% 99.785% 99.572%

Riproducibilità 100.00% 100.00% 99.28% 100.00% 99.28% 100.00% 99.28%

Ripetibilità 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% 100,00%

Ripetibilità 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% 100,00%

AssistenzaTecnica


Perassistenzageneralesuquestoprotocollocontattatesupport@omixon.com

SupportoTelefonico:StatiUniti|+1(617)500-0790Europa|+36705748001RestodelMondo|+1(617)500-0790

Apparecchiature,ReagentieForniture

RaccomandazioniTecnichesulleApparecchiature§ Termociclatoreconbloccoa96pozzetti§ Fluorimetro per piastre (o qualsiasi strumento in grado di rilevare fluorescenza da

piastraa96pozzetti,dautilizzareincombinazioneconilsistemaPromegaQuantiFluordsDNA)

§ PippinPrep(Cat#PIP0001)oBluePippin(Cat#BLU0001)dellaSAGEScience§ StrumentoperqPCRconformatoperpiastrea96o384pozzetti§ MiSeqIllumina(Cat#SY-410-1003)§ PC64-bitconmin.4coree16GBdiRAM§ Spaziodiarchiviazionedatialungotermine(circa2TBdidatiperMiSeqall'anno)

RaccomandazionisuiReagentiAssociati§ KitperLongRangePCRdellaQiagen(Cat#206401,206402o206403)

§ Ciascuncampionerichiede4μLdiTaqpolimerasi§ KitperLongRangePCRCat#206401(20)contiene8μLdiTaqpolimerasi§ KitperLongRangePCRCat#206402(100)contiene40μLdiTaqpolimerasi§ KitperLongRangePCRCat#206403(250)contiene100μLdiTaqpolimerasi

§ ExoSAP-ITdellaAffymetrix(Cat#78200,78201,78202,o78205)§ Ciascuncampionecombinatoinpoolrichiede4μLdienzimaExoSAP-IT§ Cat#78200contiene200μLdienzimaExoSAP-IT§ Cat#78201contiene1mLdienzimaExoSAP-IT§ Cat#78202contiene4mLdienzimaExoSAP-IT§ Cat#78205contiene10mLdienzimaExoSAP-IT

§ Kit per Quantificazione Libreria – Illumina/Universal della KAPA Biosystems (Cat#KK4824)

§ QuantiFluordsDNASystemdellaPromega(Cat#E2670)§ BiglieAgencourtAMPureXPdellaBeckmanCoulter(Cat#A63880,A63881oA63882)

§ CiascunacorsaHolotypeHLArichiedeunmassimodi900μLdibiglieAMpureXP§ Cat#A63880contiene5mLdibiglieAMPureXP§ Cat#A63881contiene60mLdibiglieAMPureXP§ Cat#A63882contiene450mLdibiglieAMPureXP

§ Cassettagel,1.5%diagarosio,senzacoloranteconstandardinterno(MarkerK/R2),perPippinPrep/BluePippin(Cat#CDF1510perPippinPrepeBDF1510perBluePippin)


§ Etanoloperusoinbiologiamolecolare(alcolanidro)§ Acquaperusoinbiologiamolecolare(privadiDNasieRNasi)§ Idrossidodisodio§ TamponeTE1×(pH8.0)§ KitReagentiMiSeqdellaIllumina:

§ ReagentikitMiSeqv2(500-ciclo)Cat#MS-102-2003§ ReagentikitMiSeqNanov2(500-ciclo)Cat#MS-103-1003§ ReagentikitMiSeqv2(300-ciclo)Cat#MS-102-2002§ ReagentikitMiSeqMicrov2(300-ciclo)Cat#MS-103-1002§ ReagentikitMiSeqNanov2(300-ciclo)Cat#MS-103-1001

CapacitàKitReagentiMiSeqKitreagentiMiSeqIllumina

TempoOre

X2-96/7Campioni

Std500Cycle(MS-102-2003) ~39 96

Std300Cycle(MS-102-2002) ~24 80

Micro300Cycle(MS-103-1002) ~19 28

Nano500Cycle(MS-103-1003) ~28 12

Nano300Cycle(MS-103-1001) ~17 6

FornitureRaccomandate§ Provettepermicrocentrifugada1.5mL§ Provettelow-bindpermicrocentrifugada1.5mL§ Provettelow-bindpermicrocentrifugada2.0mL(raccomandataEppendorfDNALoBind

Cat#022431048)§ Pipetteavolumeregolabile(capacità1.0–1000μL)§ Pipette8canaliavolumeregolabile(capacità2.0–500μL)§ Piastrea96pozzetticompatibiliconiltermociclatore§ Piastreottichea96pozzetticompatibiliconfluorimetroperpiastre§ Piastrea96pozzetticompatibiliconstrumentoqPCR§ Piastrea96pozzettideep-well(capacità>1000μL)§ Pellicolesigillantiperpiastreperusogenerale§ Pellicole sigillanti per piastre compatibili con i termociclatori (testate per long range

PCR)§ PellicolesigillantiperpiastreottichecompatibiliconstrumentoqPCR§ Supportomagneticoperprovettedamicrocentrifugada2mL§ Rackrefrigerantia96pozzetti(2pezzi)§ Provetteconicheda50mL


§ Rerservoirda50mL


AvvisoLegaleLe IFU relative a Holotype HLA 96/7 e il rispettivo contenuto sono di proprietà di OmixonBiocomputingLimited ("Omixon"),esonodestinatiunicamenteall'usodell'unoopiùprodottiividescrittidapartedelclientecomeprevistodalcontrattoeanessunaltroscopo.Ilpresentedocumento e il suo contenuto non dovranno essere utilizzati né distribuiti per nessun altroscoponé/odivulgati,descrittio riprodotti inaltromodo senza il consenso scrittodiOmixon.Con il presente documento, Omixon non trasferisce alcuna licenza di sfruttamento del suobrevetto,marchio,copyright,néalcundirittotutelatodallaleggeodirittisimiliditerzeparti.OmixonHLA Twin (“Software”) è concesso in licenza al cliente nei termini e condizioni dellaOmixonHLATwinEULA(www.omixon.com/hla-twin-eula/).Incasodimancataaccettazionedeitermini e delle condizioni qui riportati, Omixon non vi rilascia la licenza e non vi autorizza autilizzare,néainstallareilSoftware.Le istruzioni fornite nel presente documento devono essere osservate scrupolosamente edesplicitamente da personale qualificato e opportunamente addestrato per garantire l'usocorretto e sicuro dei prodotti qui descritti. Prima di utilizzare tali prodotti, il presentedocumentodev'esserelettoecompresointuttelesueparti.QUALORA IL DOCUMENTO NON VENGA LETTO INTEGRALMENTE E OSSERVATOESPLICITAMENTE, TUTTE LE ISTRUZIONI IN ESSO CONTENUTE POSSONO COMPORTAREDANNEGGIAMENTO DEI PRODOTTI, LESIONI ALLE PERSONE, INCLUSI UTILIZZATORI O TERZEPERSONE,EDANNIADALTREPROPRIETÀ.OMIXONNONSIASSUMEALCUNARESPONSABILITÀDERIVANTEDAUNUSO IMPROPRIODEIPRODOTTIDESCRITTIQUI (INCLUSE LOROPARTIO SOFTWARE)ODAQUALSIASIUSODI ESSINON PREVISTO DALLE AUTORIZZAZIONI E PERMESSI SCRITTI ED ESPLICITI CONCESSI DAOMIXONINRELAZIONEALL'ACQUISIZIONEDITALIPRODOTTIDAPARTEDELCLIENTE.PERUSODIAGNOSTICOINVITRO©2015OmixonBiocomputingLtd.Tuttiidirittiriservati.

Destinazioned'usoIl prodotto Holotype HLA in Configurazione 96/7 –A & CE (designato“Holotype HLA) è unacombinazionedireagentipertestdiagnosticiin-vitroeunsoftwareperl'analisididati(OmixonHLA Twin™) ed è destinato all'identificazione e la definizione di Antigeni Leucocitari Umani(HLA)diClasseIeIIelatipizzazioneHLAconimpiegodellapiattaformadiSequenziamentodiNuovaGenerazione(NextGenerationSequencing,NGS)MiSeqIllumina®.HolotypeHLAfornisce


informazionisullatipizzazionedeilociHLAdiClasseI(A,B,eC)eII(DPB1,DQA1,DQB1eDRB1)impiegandoDNAgenomicoumano.

Il software Omixon HLA Twin™ incluso nel prodotto Holotype HLA è destinato allainterpretazioneedall’esecuzionedelconfrontodeidatidisequenziamentogeneratisulsistemaMiSeqIllumina®,consentendounaprecisatipizzazioneHLAalivelloallelicoinunsolopassaggio,conpercentualediambiguitàmoltobassaal2°campo.

IlprodottoHolotypeHLAèprevistoperusodiagnostico invitrodapartedioperatori sanitari,come tecnici di laboratorio emedici, preparati nel campodella tipizzazioneHLA in laboratoridiagnosticiaccreditatiEFIoASHIoingradodilavorareinaccordoconlespecificheEFIoASHI.

Osservazioneimportanteprimadiiniziare

Raccomandazionecircal'estrazionediDNAgenomicoIl DNAGenomicoUmano dovrà essere preparato utilizzando kit per la preparazione del DNAben collaudati, disponibili in commercio, per garantire una corretta preparazione.Indipendentementedall'approccio,perottenereunabuonaprestazionedeltest,ènecessarialadeterminazioneaccuratadiconcentrazioneepurezza.

IlDNAdev'essereprivodi contaminanti chepossono influenzare le successiveamplificazione,preparazione di librerie e fasi di sequenziamento (es. alcol, sali, tensioattivi, formaldeide edeparina). Il sangue non va raccolto in provette eparinizzate, e non si dovranno utilizzarecampioni di sangue provenienti da pazienti in terapia con eparina né campioni lipemici oemolizzati.

Il DNA genomico estratto può essere usato immediatamente se disciolto in acqua priva dinucleasi, o conservato per lunghi periodi a -20oC o a temperature inferiori se conservato intamponeTE.Perridurreladegradazionevannoevitaticicliripetutidigelo-disgelo.

Alfinediottenere100-150ngdiDNAgenomicoditemplatoperl’amplificazionemediantePCR,èaltamenteraccomandataunaconcentrazioneparia20-30ng/µldiDNA.

Sono altamente raccomandati valori del rapporto di assorbanze 260nm/280nm e260nm/230nmparia1.7–2.

PrincipiodelmetodoPermoltianni, lacomunitàHLAhalavoratoallosviluppodiunmetodopercaratterizzareconprecisione l'elevato polimorfismo dei geni HLA e dei loro prodotti. L'avvento della PCR,combinataconaltretecnologie(sequenziamentodiSanger,SSOP,SSP,Luminex),haconsentitodi migliorare significativamente il rilevamento di polimorfismi HLA, sebbene con diverselimitazionichecontinuanoadinibirelanostracapacitàdicaratterizzareesaurientementeigeniHLA. Le tecnologie sviluppate nel corso degli ultimi anni, designate collettivamente NextGeneration Sequencing (NGS), hanno offerto nuove opportunità che consentono lacaratterizzazione completa dei geni HLA in modalità aploide. L'NGS ha due caratteristiche


distinte,1)sequenziamentoclonalediframmentidiDNA,e2)throughputelevatissimo.L'NGSconsentedistabilirelafasedeipolimorfismi,eliminandocosìtutteleambiguità,econsentelatipizzazione HLA al 3° o 4° campo senza test reflex, in talmodo introducendo un approcciopotenzialmente risolutivo al problema della tipizzazione HLA. Il protocollo descritto qui traevantaggio da questa tecnologia e combina l’amplificazionemediante long-range PCR di geniHLAconilsequenziamentosullapiattaformaMiSeqIllumina.Piùinparticolare,igeniHLAA,B,C,DQA1eDQB1vengonoamplificatiperl'interalunghezzacodificante,incluseleestremitàUTR5’e3’,mentreilgeneDRB1vieneamplificatodall'introne1all'introne4eilgeneDPB1vieneamplificato dall'introne 1 alla regione UTR 3’. Gli ampliconi vengono quindi processatiattraversounaseriedifasi:

1. frammentazionedegliampliconiaunadimensioneappropriataperilsequenziamentosullapiattaformaIllumina,

2. riparazioneblunt-endedadenilazionedelleestremitàdegliampliconiframmentati

3. ligazione di sequenze adattatrici che vengono usate nell'intero processo sul MiSeq percatturare,amplificareesequenziareilDNA.Gliadattatoriincludonoancheunindicecheèunabrevesequenza,univocaperciascunadattatore,cheidentificailmaterialedipartenzadellalibreria(campione/locus).

Dopolacombinazionedellelibrerieindicizzateinununicopool,laselezionedimensionaleelaquantificazione,ilcampionevienecaricatosulMiSeqperilsequenziamento.L'interoprocessorichiede 3-5 giorni, a seconda della del tipo di flowcell per piattaforma Illumina che vieneimpiegata.Ilsommariodellefasidelprotocolloèriportatonellafigurasotto:


SommariodelleFasi


Glossario/Definizioni§ PiastraDiluizioneAmpliconi–Unapiastraa96pozzettideepwellusataperdiluiregli

ampliconiperlaloroquantificazione.§ PiastraAmpliconi–Nomealternativoperlapiastradiamplificazione;nelcasodiDQB1

viene combinato il contenuto di due Piastre per Amplificazione (Set 1 e Set 2) per laPiastraAmpliconi

§ PiastraQuantificazioneAmpliconi–piastraa96pozzetticompatibileconilfluorimetroperpiastreincuigliampliconidiluitivengonoquantificati.

§ PiastraAmplificazione–Piastraa96pozzettiperPCRusataperamplificareilociHLA.§ Libreria Finale – Libreria che include tutte le Librerie Campioni pronte per essere

sequenziateinunasingolacorsasuMiSeq.§ Piastra di Reazione – Piastra in cui vengono condotte le successive reazioni di

frammentazione,riparazioneblunt-end/adenilazioneeligazionegliadattatoriconindicialleLibrerieCampioni.

§ PiastraReagenti–ServeperaliquotareivarireagentiusatiperpreparareleLibrerie§ LibreriaCampioni –Una libreria preparata combinando inpool tutti i lociHLAperun

datocampione.§ Piastra Librerie Campioni: Piastra contenente una libreria campioni (tutti i loci

combinati)perpozzetto.§ PiastraQuantificazioneStandard–Piastraa96pozzetti compatibile con il fluorimetro

per piastre in cui vengonoposti gli standarddiDNAper consentire la quantificazionedegliampliconi.


Fase 1 – Preparazione Master Mix per AmplificazioneHLA

Durata:~2oree10minutiLo scopo di questa fase è preparare Master Mix locus-specifiche per amplificareindividualmenteciascunlocusHLAtarget.IlociamplificatipermezzodiquestoprotocollosonoHLA-A,HLA-B,HLA-C,HLA-DRB1,HLA-DQB1,HLA-DPB1eHLA-DQA1.PerHLADQB1,vengonoforniti2setdiprimer:Set1amplificaesoni1-4eSet2amplificaesoni2-5.Inentrambiisetèsufficiente per ottenere risultati accurati genotipizzazione, assumendo l'amplificazione disuccesso.Set1hauntassodifallimentodiamplificazionesuperioreaquelloconsigliatoperlagenotipizzazioneaffidabileclinica,inmodoOmixonconsigliadiutilizzareSet2dasolodurantel'esecuzione di genotipizzazione clinica. Set 1 è opzionale e consigliato in cui si desidera unacoperturacompletadelgeneDQB1compresiesone1eIntron1.Nota: Le Master Mix preparate in questa fase includono tutti i reagenti necessari perl'amplificazioneaeccezionedellamisceladiTaqPolimerasiperLong-RangePCR.

ElencoreagentiComponente Conservazione ProvenienzaPrimerMixHLA-A -20°C OmixonPrimerMixHLA-B -20°C OmixonPrimerMixHLA-C -20°C OmixonPrimerMixHLA-DRB1 -20°C OmixonPrimerMixHLA-DQB1(Set1)(Opzionale) -20°C OmixonPrimerMixHLA-DQB1(Set2)(Richiesto) -20°C OmixonPrimerMixHLA-DRB1 -20°C OmixonPrimerMixHLA-DQA1 -20°C OmixonDQBEnhancer1 -20°C OmixonDQBEnhancer2 -20°C OmixonTamponeLongRangePCR(10×) -20°C QiagendNTP(10mMciascuno) -20°C QiagenH2Operusoinbiologiamolecolare -20°C Qiagen

Protocollo

1.1. - Prelevare tutte lemiscelediprimer, iDQBEnhancer1e2, i dNTPe il tamponeperLong-RangePCR(10×)da-20°Celasciarescongelareatemperaturaambiente.


1.2. –CombinareidueEnhancerDQB:aggiungere132μLdiEnhancerDQB2nellaprovettacontenente Enhancer DQB 1. Rietichettare la provetta Enhancer DQB 1 con EnhancerDQBCombinato.

1.3. - Preparare unaMaster Mix per ciascuna Primer Mix secondo le tabelle riportate di

seguito:MasterMix:HLA-A,B,C,DRB1,DPB1eDQA1Reagente Volume/campione/locus Volume/96campioni/locusPrimerMix 2μL 204μLTamponeLongRangePCR(10×) 2,5μL 255μLdNTPMix(10mMciascuno) 1,25μL 127,5μLH2Operusoinbiologiamolecolare

13,85μL 1412,7μL

Volumetotale 19,6μL 1999,2μL

MasterMix:HLA-DQB1Set1(Opzionale)eDQB1Set2(Necessario)Reagente Volume/campione/locus Volume/96campioni/locusPrimerMix 2μL 204μLTamponeLongRangePCR(10×) 2,5μL 255μLdNTPMix(10mMciascuno) 1,25μL 127,5μLEnhancerDQBCombinato 5,6μL 571,2μLH2Operusoinbiologiamolecolare 7,85μL 800,7μLVolumetotale 19,2μL 1958,4μL

1.4. –VortexareciascunaMasterMixespinnareper1secondo.Mettere leMasterMixsughiaccio.

1.5. -DiluiretuttiigDNAfinoaunaconcentrazionetra20-30ng/μL(ilvolumeminimoè45

μL).

Nota: Holotype HLA include reagenti sufficienti per 96 reazioni più un volumeaddizionalepercompensareperditedipipettamentoeamplificazionifallite.


Fase2–AmplificazioneHLAClasseIeIIDurata:~8oree10minutiLoscopodellaFase2èamplificareilociHLA.LeamplificazionidiHLAClasseIeClasseIIsonostateottimizzateutilizzandoduesetdistintidicondizioniPCR.UnavoltacompletatelereazionidiPCR,l'amplificazionevieneverificatamedianteelettroforesisugeldiagarosio.

ElencoreagentiComponente Conservazione ProvenienzaMasterMixHLA-A -20°C Fase1MasterMixHLA-B -20°C Fase1MasterMixHLA-C -20°C Fase1MasterMixHLA-DRB1 -20°C Fase1MasterMixHLA-DQB1(Set1) -20°C Fase1MasterMixHLA-DQB1(Set2) -20°C Fase1MasterMixHLA-DPB1 -20°C Fase1MasterMixHLA-DQA1 -20°C Fase1MixEnzimiTaqPolimerasi -20°C QiagengDNA 4°C UtilizzatoreH2Operbiologiamolecolare 20°C Utilizzatore

Protocollo2.1–Prelevarel'enzimaTaqPolimerasida-20°C,spinnarloeaggiungerloaciascunaMasterMixsecondoletabelleriportatesotto,miscelandoaccuratamentepipettandosuegiù:

MasterMixpiùTaqPolimerasi:HLA-A,B,C,DRB1,DPB1eDQA1

Reagente Volume/campione/locus Volume/24campioni/locusMasterMixdaFase1 19,6μL 1999,2μLEnzimaTaqPolimerasi 0,4μL 40,8μLTotale 20μL 2040μL

Master Mix più Taq Polimerasi: HLA-DQB1 Set 1 (Opzionale) e HLA-DQB1 Set 2(Necessario)Reagente Volume/campione/locus Volume/24campioni/locusMasterMixdaFase1 19,2μL 1958,4μLEnzimaTaqPolimerasi 0,8μL 81,6μLTotale 20μL 2040μL


2.2-VortexareperbrevetempoespinnaretutteleMasterMixconleTaqPolimerasi.Pipettare20μLdiciascunaMasterMixconleTaqPolimerasinellesingoleposizionidellepiastrePCRa96pozzetti.

Nota: Le amplificazioni di Classe I e Classe II sono state ottimizzate utilizzando dueprogrammidiPCRdifferenti,quindileMasterMixdiClasseIeClasseIInondovrannoesserepostenellastessapiastra.

2.3–Aggiungere5μLdiciascungDNAdiluitonelpozzettoappropriatodellepiastrepreparatenella faseprecedente.Miscelaremediantepipettamento.Sigillareconunapellicola termicaeispezionarevisivamenteciascunpozzetto.SpinnaretuttelePiastreperamplificazione.

2.4 - Posizionare le PiastreperAmplificazionenel termociclatoreedavviare i programmiperamplificazionediClasseIeClasseIIcomeindicatonelletabelleriportatesotto:

AmplificazioneClasseI(HLA-A,BeC)Numerodicicli Temperatura Tempo

1 95°C 3minuti 95°C 15secondi

35 65°C 30secondi 68°C 5minuti1 68°C 10minuti1 4°C ∞

AmplificazioneClasseII(HLA-DRB1,DQB1set1,DQB1set2,DPB1eDQA1)Numerodicicli Temperatura Tempo

1 95°C 3minuti 93°C 15secondi

35 60°C 30secondi 68°C 9minuti1 68°C 10minuti1 4°C ∞

2.5-Verificareilbuonesitodell'amplificazionefacendocorrere2μLdiciascunampliconeinungeldiagarosiostandardal2%a250Vper30minuti.


DimensioniPrevisteAmpliconi

LocusHLA Dimensioneprevistaampliconi(kb)HLA-A,BeC ~3kbHLA-DRB1 ~4,3kb

HLA-DQB1(Serie1) ~4,7kbHLA-DQB1(Serie2) ~5,8kb

HLA-DPB1 ~4,5kbHLA-DQA1 ~4,5kb

E’ possibile interrompere la metodica in modo sicuro in questa fase. Gli ampliconipossonoessereconservatia4°Covernightoa-20°Cperpiùtempo.


Fase3–QuantificazioneAmpliconieNormalizzazione(utilizzandounFluorimetroperpiastre)Durata:~1oraSi raccomanda di eseguire la Quantificazione Ampliconi e Normalizzazione per garantire unaquantità di materiale di partenza adeguato nelle fase di preparazione della libreria. Laconcentrazione degli ampliconi vienemisurata utilizzando il Sistema QuantiFluor dsDNA checontieneuncolorante fluorescente ingradodi legarsi alDNAeduno standarddiDNAper laquantificazioneprecisaditutte lequantitàdiDNAadoppiofilamento(dsDNA). Inalternativa,poteteutilizzareuno strumentoper qPCRanziché il fluorimetroper piastre. Per Istruzioni sucome effettuare la Quantificazione di Ampliconi utilizzando uno strumento per qPCRconsultarel'Appendice3.

ElencoreagentiComponente Conservazione ProvenienzaPiastra(e)AmplificazioneClasseI 4°C Fase2Piastra(e)AmplificazioneClasseII 4°C Fase2StandardLambdaDNA(100ng/μL) 4°C PromegaColoranteQuantiFluordsDNA(200×) 4°C PromegaTamponeTE20×(pH7.5) 4°C PromegaH2Operbiologiamolecolare 20°C-25°C UtilizzatoreExoSAP-iT -20°C Affymetrix

Protocollo3.1. –PreparareglistandarddiDNAmediantediluizioneserialedellostandardLambdaDNA

(100ng/μL)fornitonelkitQuantiFluorsecondolatabelladidiluizioneriportatasotto:

Etichettasullaprovetta

DNAdipartenza

Vol.diDNA(μL)

Vol.diTE1x(μL)

Conc.finale(ng/μL)

Standard1 LambdaDNA 7,5μL 492,5μL 1.5ng/μLStandard2 Standard1 250μL 250μL 0.75ng/μLStandard3 Standard2 250μL 250μL 0.38ng/μLStandard4 Standard3 250μL 250μL 0.19ng/μLStandard5 Standard4 250μL 250μL 0.09ng/μLStandard6 Standard5 250μL 250μL 0.05ng/μLBianco Bianco 0μL 250μL 0ng/μL3.2. -PreparareunaPiastradiDiluizioneAmpliconiperciascunlocus:aggiungerealiquotedi

498μLditamponeTE1×aciascunpozzettodellapiastraa96pozzettideepwellequindi2


μLdell'ampliconecorrispondentedallePiastreAmpliconi.Mescolarebenepipettandovarievolte.Sigillarelepiastreevortexarleaccuratamente.Effettuareunospinincentrifuga.

3.3. - Preparare una soluzione di lavoro di QuantiFluor Dye 1× utilizzando la formulaseguente: 0.5 μL di QuantiFluor Dye (200X) + 99.5 μL di tampone TE 1×. Prepararesufficiente QuantiFluor Dye 1× affinché ciascun campione (di tutti quelli nelle PiastreAmpliconi)estandard(intotale14)ricevaun'aliquotaparia100μL.

3.4. - Preparare una Piastra per Quantificazione Standard e Piastre per QuantificazioneAmpliconi.Aggiungerealiquotedi100μLdisoluzionedilavorodiQuantiFluorDye1×nellevarie posizioni delle piastre ottiche a 96 appena preparate utilizzando il formato dellaPiastraQuantificazione Standard e delle PiastreQuantificazioneAmpliconi (vedere figuresupplementari).

3.5. -Utilizzando gli standardpreparati sopra, aggiungere100μLdi ciascuno standard, in

duplicato,apozzettiindividualinellaPiastraQuantificazioneStandard(totale14pozzetti).Miscelaremediantepipettamento.

3.6. - Aggiungere 100 μL di ampliconi diluiti dai pozzetti corrispondenti nelle Piastre

DiluizioneAmpliconiallevarieposizioninellePiastreQuantificazioneAmpliconi.Miscelaremediantepipettamento.

3.7. – Effettuare la lettura della Piastra Quantificazione Standard e delle Piastre

QuantificazioneAmpliconisulfluorimetro.3.8. -CalcolarelaconcentrazionediDNAnellePiastreQuantificazioneAmpliconiutilizzando

i valori di RFU letti. Fare riferimento alla Tabella Diluizione nel workbook fornito perassistenzaneicalcoli.

3.9. -DiluireilDNAnellePiastreAmpliconiconH2Operusoinbiologiamolecolareinmodo

chelaconcentrazionefinalediDNAsiaapprossimativamenteparia67ng/μL.• SelaconcentrazionediDNAè150ng/μLomaggiore:aggiungere25μLdiH2O• SelaconcentrazionediDNAè100-150ng/μL:aggiungere10μLdiH2O• LaconcentrazionediDNAèminoredi100ng/μL:nonaggiungereH2O.

3.10 - Per ciascun campione, combinate 15 μL di DQB1 (Set 1) e DQB1 (Set 2) in un nuovopozzetto(sesonostatiusatientrambiisetDQB1).

Nota: I DQB1 Set 1 e Set 2 amplificano entrambi gli esoni 2, 3 e 4. Se una dellereazioniconDQB1fallisceoèsignificativamentepiùdeboledell'altra reazione,nondovràesserecombinataconunareazioneavvenuta.Ciòserveperevitareladiluizionediunabuonaamplificazione.


3.11-Combinaretuttiilociperciascuncampioneinun'unicaPiastraAmpliconi.Combinare5μLda ciascun locus di un campione in una nuova piastra PCR a 96 pozzetti. Ciascun campionedovràoccupareunsingolopozzetto, conunvolumedi35μL.Quandovieneaggiunto il locusfinaledaciascuncampione,miscelareaccuratamentemediantepipettamento.

3.12–Aggiungere4μLdiExoSAP-iTinciascunampliconecombinato.Sciacquarebeneipuntalipipettandosuegiù.Sigillarelapiastraconunapellicolatermicaespinnare.3.13-PosizionarelePiastreAmpliconiinuntermociclatoreedeseguireilseguenteprogramma:

PurificazionePCRExoSAP-IT

Numerodicicli Temperatura Tempo1 37°C 45minuti1 80°C 15minuti1 4°C ∞

E’ possibile interrompere la metodica in modo sicuro in questa fase. Gli ampliconipossonoessereconservatia4°Covernightoa-20°Cperpiùtempo.


Fase4–PreparazioneLibreriaDurata:~3oree15minutiDurante questa fase, gli ampliconi combinati vengono preparati per il sequenziamento sulMiSeq Illumina.Gli ampliconi vengono frammentati per via enzimatica, le estremità vengonoriparateeadenilate,egliadattatoriconindicivengonoligatialleestremità.Successivamente,lelibrerie vengono combinate e sottoposte ad un'unica fase di purificazione e concentrazioneutilizzandobiglieAMPureXP.

Nota: Omixon raccomanda volumi maggiori di quelli necessari per 96 campioni inquantomolti degli enzimi e tamponi sono viscosi e si rischia un eccessiva perdita dimaterialenelcorsodeipipettamenti.

ElencoreagentiComponente Conservazione ProvenienzaPiastraAmpliconi 4°C Fase3PiastraAdattatori -20°C OmixonEnz.Framment.(A) -20°C OmixonTamponeFramment.(B) -20°C OmixonEnz.Riparaz.Estrem.(C) -20°C OmixonTamp.Riparaz.Estr.(D) -20°C OmixonEnz.Ligazione(E) -20°C OmixonTamp.Ligazione(F) -20°C OmixonBiglieAMPureXP 4°C Beckman/CoulterEtanoloall'80%(fresco) 20°C-25°C UtilizzatoreH2Operbiologiamolecolare 20°C-25°C Utilizzatore

Protocollo4.1-Accendereiltermociclatore.Verificarecheilcoperchioriscaldatosistiariscaldando.

Nota: Accertarsi di vortexare accuratamente l'Enzima di Frammentazione (A) primadell'uso.

4.2-PreparareMasterMixperFrammentazionesecondolatabellasotto:


MasterMixFrammentazione

Reagente Volumeperlibreria(μL)

Volumiraccomandatiper24librerie(μL)

Codif.colore

Enz.Framment.(A) 2μL 220,8μL GialloTamponeFramment.(B) 2μL 220,8μL RossoVolumetotale 4μL 441,6μL

4.3 - Preparare una Piastra Reagenti: porre una nuova piastra PCR a 96 pozzetti su un rackrefrigeranteperPCReaggiungere la stessaquantitàdelleMasterMixperFrammentazioneaciascunpozzettodiunacolonnasingola.

Nota:Lareazionedi frammentazioneèstatastudiatapergarantireDNAdi lunghezzaideale per il sequenziamento sulMiSeq Illumina. È importantemantenere i reagentifreddi fino a che la reazione viene avviata nel termociclatore per prevenire unaframmentazione eccessiva. Si raccomanda l’uso di pipettemulticanale per ridurre alminimoleprobabilitàchesiverifichiunaframmentazioneeccessiva.

4.4 - Centrifugare la Piastra Ampliconi per 10 secondi, e porla su ghiaccio o su un bloccorefrigerato.4.5-PreparareunaPiastradiReazione:porreunapiastraPCRa96pozzettinuovasuunbloccorefrigerato.4.6-Aggiungere4μLdiMasterMixperFrammentazionedallaPiastraReagentiaipozzettidellaPiastradiReazionecorrispondentiai campioninellaPiastraAmpliconi.Si raccomanda l'usodiunapipettamulticanale.4.7 -Trasferire16μLdiciascunampliconedallaPiastraAmpliconialpozzettocorrispondentesullaPiastradiReazioneutilizzandounapipettamulticanale.Miscelaremediantepipettamento.4.8-CoprirelaPiastradiReazioneconunapellicolatermicaecentrifugareper10secondi.4.9-IncubarelaPiastradiReazioneinuntermociclatoreconilseguenteprogramma:

ProgrammaFrammentazione

Numerodicicli Temperatura Tempo1 37°C 10minuti1 70°C 15minuti1 4°C ∞


E’possibileinterromperelametodicainmodosicuroinquestafase.Lelibreriepossonoessereconservatea4°Covernightoa-20°Cperpiùtempo.

4.10-PrepararelaMasterMixRiparazioneEstremitàsecondolatabellariportatasotto:

MasterMixRiparazioneEstremità

Reagente Volumeperlibreria(μL)

Volumiraccomandatiper24librerie(μL)

Codif.colore

H2O per biologiamolecolare

1,25μL 139,2μL

Enz.Riparaz.Estrem.(C) 1,25μL 139,2μL VerdeTamp.Riparaz.Estr.(D) 2,5μL 278,4μL ArancioVolumetotale 5μL 556,8μL 4.11 -AggiungerealiquoteugualidiMasterMixRiparazioneEstremità inunacolonnasingolainutilizzatadellaPiastraReagenti.4.12-CentrifugarelaPiastradiReazione(contenenteiCampioniframmentati)per10secondi.Aggiungere5μLdiMasterMixRiparazioneEstremitàdallaPiastraReagentiinciascunpozzettodellaPiastradiReazione.Si raccomanda l'usodiunapipettamulticanale.Miscelaremediantepipettamento.4.13-CoprirelaPiastradiReazioneconunapellicolatermicaecentrifugareper10secondi.4.14-IncubarelaPiastradiReazioneinuntermociclatoreconilseguenteprogramma:

ProgrammaRiparazioneEstremitàNumerodicicli Temperatura Tempo

1 20°C 30minuti1 65°C 30minuti1 4°C ∞


4.15 - Prelevare la Piastra Adattatori con indici da -20°C e far scongelare a temperaturaambientesubitodopol'avviodelProgrammaRiparazioneEstremitàneltermociclatore.QuandolaPiastraAdattatorièatemperaturaambiente,centrifugarlaper3minutia3.000giri/minuto.


4.16-StaccareconcautelalapellicolasigillantedallaPiastraAdattatori.Dopoaverrimossolapellicolasigillante,nonagitarelaPiastraAdattatoriperevitarecontaminazioniincrociate.4.17 – Trasferire l'intero volume di ciascun pozzetto dalla Piastra di Reazione (25 μL) nelpozzettocorrispondentenellaPiastraAdattatori.

Nota:SeNONsiprevedediutilizzarel'interaPiastraAdattatori,èpossibileutilizzaresoltanto il numero necessario di adattatori. Tagliare la pellicola sigillante dellapiastratraipozzettidautilizzareeipozzettidaconservare.Staccareconcautelalapellicola sigillante dalla Piastra Adattatori, lasciando la pellicola in posizione suipozzettidaconservare.a. Trasferire 25 μL da ciascun campione sottoposto a riparazione delle estremità

della Piastra di Reazione a un pozzetto nella Piastra Adattatori, miscelandoaccuratamenteconunapipetta.

b. Trasferire la totalità di ciascun campione dalla Piastra Adattatori nel pozzettooriginaledellaPiastradiReazione.

c. SigillarenuovamentelaPiastraAdattatorieriportarlaa-20°C.Pereseguirelefasiresidue descritte nel manuale, utilizzare la Piastra di Reazione al posto dellaPiastraAdattatori.

4.18 - Preparare la Master Mix Ligazione. Preparare Master Mix Ligazione sufficiente perciascuncampione.

MasterMixLigazione

Reagente Volume(μL) Volumiraccomandatiper24librerie(μL)

Codif.colore

Enz.Ligazione(E) 2,5μL 252,5μL BluTamp.Ligazione(F) 30μL 3030μL NeroVolumetotale 32,5 3282,5μL

4.19 - Pipettare la Master Mix Ligazione in 3 colonne inutilizzate della Piastra Reagenti. Siraccomandal'usodiunapipettamulticanale.4.20-Aggiungere32.5μLdiMasterMixLigazioneinciascunpozzettodellaPiastradiReazione.Siraccomandal'usodiunapipettamulticanale.Miscelaremediantepipettamento.4.21-CoprirelaPiastradiReazioneconunapellicolatermicaecentrifugareper10secondi.4.22-IncubarelaPiastradiReazioneneltermociclatoreconilseguenteprogramma:


ProgrammaLigazioneNumerodicicli Temperatura Tempo

1 25°C 10minuti1 65°C 20minuti1 4°C ∞


4.23-AttenderechelebiglieAMPureXPraggiunganolatemperaturaambiente.Accertarsicheesse siano omogenee (assenza di grumi o agglomerati). Preparare 5 mL freschi di etanoloall'80%(4mLdiEtOH+1mLH2O).4.24-CrearelaLibreria(finale)combinandoun'aliquotadaciascunampliconecombinato,cioèunalibreriacampione-specifica,inunaprovettasingolapermicrocentrifugalow-bindda2.0mL.

a. Per 16opiù campioni - Calcolare la quantità di ciascuna libreria campionedacombinare insieme in una Libreria singola di volume totale pari a 900 μL.Dividere i 900 μL per il numero di librerie campione. Questo è il volumedell'aliquota da prelevare da ciascuna libreria campione e da pipettare nellaLibreria(finale).

b. Permenodi16campioni–Trasferire60μLdiciascunalibreriacampioneinunaLibreria(finale).

4.25-Aggiungere900μLdibiglieAMPureXPnellaprovettaLibreria(finale).Miscelareafondovortexandoespinnaremoltovelocemente.Nonfarseparare lebiglie. Incubare laLibreriaper10minutiatemperaturaambiente.

Nota:SenelPoolFinalevisonomenodi900μLdilibreria,aggiungereunaquantitàequivalentedibiglieAMPureXP.IlrapportotraPoolFinaleebiglieAMPureXPdovràessereparia1:1.

4.26-InserirelaprovettaLibreriasuunsupportomagneticoeincubareper10minuti.4.27 – Lasciando bloccata la provetta sul supporto magnetico, rimuovere con cautela edeliminareilsurnatante,facendoattenzioneanontoccarelebiglie.4.28–Lasciandobloccatalaprovettasulsupportomagnetico,aggiungere~1.5–2mLfreschidietanoloall'80%allaprovettaLibreria. Ilvolumedietanoloaggiuntodovràesseresufficienteacoprirelebiglie.


Nota:Aggiungerel'etanolofacendolocaderesullatodellaprovettaoppostoaquellodovesisonodepositatelebiglie.

4.29-IncubarelaprovettaLibreriaatemperaturaambienteper30secondi;quindirimuovereconcautelaedeliminareilsurnatante.4.30-Ripeterelefasi4.28e4.29.4.31-SpinnareperpochissimotempolaprovettaLibreriaerimetterlasulsupportomagneticoconilcoperchioaperto.Eliminarel'etanoloresiduoconunapipetta.Nontoccarelebiglie.

Nota:Accertarsicheilpelletdibiglienoncontengaetanoloresiduo.Atalescopo,puòessered’aiutoruotarelaprovettasuunsupportomagneticopereliminarel'etanolosenzadisturbareilpelletdibiglie.

4.32-Farasciugareall'arialebiglieper5-8minutisulsupportomagnetico,finoacheilpelletdibiglieèasciutto.4.33-RimuoverelaprovettaLibreriadalsupportomagneticoedeluirecon31μLdiacquaperuso in biologia molecolare. Non toccare le biglie con il puntale della pipetta, altrimenti virimangonoattaccate.4.34 - Vortexare la Libreria per risospendere completamente le biglie. Se sulle pareti lateralirimangono delle goccioline, centrifugare per qualche secondo. Accertarsi che le biglierimanganoinsospensione.4.35-IncubarelaLibreriaatemperaturaambienteper2minuti.4.36–InserirelaprovettaLibreriasulsupportomagneticoper2minuti.4.37-Raccogliere laLibreria:mantenendolaprovettaLibreriaFinalenelsupportomagnetico,trasferire31μLdelsurnatanteinunanuovamicroprovettalow-bindda1.5ml.

E’ possibile interrompere lametodica inmodo sicuro in questa fase. Le libreriepossonoessereconservatea-20°Cperperiodiditempoprolungati.


Fase5–SelezioneDimensionaleLibreriaDurata:~1oraLa Fase 5 procede alla selezione dimensionale della Libreria finale proveniente dalla Fase 4utilizzandoilsistemaPippinPrep.IlPippinPreppuòselezionareautomaticamenteunagammadidimensionidiframmentidiDNAedeluirliinunacameradiraccolta.Nota:alpostodelPippinPrep è possibile utilizzare il Blue Pippin. Consultare l'Appendice 1 per le Istruzioni d'uso delPippinPrep.

ElencoreagentiComponente Conservazione ProvenienzaCassettageld’agarosioall'1.5%,senzacolorante

20°C-25°C SageScience

Miscelasoluz.caricam./marker(K)Pippin 4°C SageScienceLibreriacombinata 4°C Fase4

Nota:IlMarkerKvausatoconilPippinPrep.IlBluePippinusailmarcatoreR2.

Protocollo5.1-PortarelasoluzionedicaricamentoconMarkerKatemperaturaambiente.5.2-Combinare31μLdelPoolcon10μLdisoluzionedicaricamentoconMarkerK.5.3-Vortexareespinnare.5.4 - Impostare il sistemaPippinPrepper raccogliere frammentidiDNAtra650e1.300bps.Caricareilcampioneda40μLnellaportacampioneeavviarelacorsa.Laduratadellacorsaèdi45-50minuti.5.5 - Raccogliere l'intero contenuto (circa 40 μL) dalla porta di eluizione del Pippin Prep etrasferirlo inunanuovamicroprovetta low-bindda1.5ml.Questaè la libreriaconframmentiselezionati.

E’ possibile interrompere la metodica in modo sicuro in questa fase. Le libreriepossonoessereconservatea-20°Cperperiodiditempoprolungati.


Fase6–QuantificazioneLibreriaDurata:~1oraÈnecessarioquantificarelaLibreriasottopostaaselezionedimensionalepergarantirerisultatiottimali con il sequenziatoreMiSeq Illumina. La concentrazione della Libreria coi frammentiselezionati,puòessereaccuratamentemisuratamedianteqPCR.

ElencoreagentiComponente Conservazione ProvenienzaPrimerPremixIllumina10× -20°C KAPABiosystemsMasterMixKAPASYBRFASTqPCR2× -20°C KAPABiosystemsStd1(20.00pM) -20°C KAPABiosystemsStd2(2.00pM) -20°C KAPABiosystemsStd3(0.20pM) -20°C KAPABiosystemsStd4(0.02pM) -20°C KAPABiosystemsStandardDNAIllumina -20°C KAPABiosystemsH2Operbiologiamolecolare UtilizzatoreTamponeTE1×(pH8.0) UtilizzatoreLibreriaconframmentiselezionati 4°C Fase5

Protocollo6.1-Preparare laPrimerMixqPCRutilizzando ilPrimerPremix Illumina10×e laMasterMixKAPASYBRFASTqPCR2×:

Nota: I reagenti del kit KAPA SYBR FAST qPCR (MasterMix qPCR, Primer Premix esoluzioniROX)vengonocombinatiquandosiutilizzailkitper laprimavolta.Questasoluzionecombinataè stabileperalmeno30 cicli di congelamento/scongelamento.ConsultareladocumentazioneKAPAperdeterminareseèraccomandatalaROXperlostrumentoqPCRindotazione.

PrimerMixqPCR

Reagente Volume(mL)PrimerPremixIllumina10× 1mLMasterMixKAPASYBRFASTqPCR2× 5mLVolumetotale 6mL6.2–PrepararelaMasterMixqPCR.


MasterMixqPCR

Reagente Volume(μL)PrimerMixqPCR 228μLH2Operbiologiamolecolare 76μLVolumetotale 304μL6.3-PreparareunadiluizioneserialedellaLibreriaconframmentiselezionati.

a. Preparare una diluizione 1:1000 aggiungendo 1 μL di Libreria con frammentiselezionatia999μLditamponeTE1×(pH8.0),sciacquandoaccuratamenteilpuntaledellapipetta.Vortexareespinnare.

b. Preparareunadiluizione1:2000aggiungendo100μLdelladiluizione1:1000a100μLditampone1×TE(pH8.0).Vortexareespinnare.

6.4-PreparareunaPiastraperQuantificazioneqPCRutilizzandounanuovapiastracompatibileconilsistemaqPCRindotazione.

6.5-Pipettare16μLdiMasterMixqPCRintriplicatoperglistandard1-4,ladiluizione1:1000e

ladiluizione1:2000(vederefiguresupplementari).6.6 - Aggiungere aliquote di 4 μL di standard 1-4, diluizione 1:1000 e diluizione 1:2000 ai

pozzetticorrispondenti.6.7-SigillarelaPiastraQuantificazioneqPCRecentrifugarlaper10secondi.

Nota: Evitare di formare bolle nei pozzetti della piastra Quantificazione qPCR. Senecessario,centrifugarepereliminarelebolle.

6.8 -DeterminarelaconcentrazionediDNAdellaLibreriaconframmentiselezionatiutilizzando

lamacchinaperqPCRindotazione.6.9 - Utilizzando i risultati ottenuti dalla qPCR, diluire 10 μL della Libreria con frammenti

selezionati finoaunaconcentrazionedi2nMconH2Osterile inunanuovamicroprovettalow-bindda1.5-mL.ConservarelarestanteLibreriaconframmentiselezionatia-20°C.

E’ possibile interrompere la metodica in modo sicuro in questa fase. Le libreriepossono essere conservate a -20°C per periodi di tempo prolungati. In caso diconservazione per periodi prolungati, si raccomanda altamente di effettuare unariquantificazionedellalibreriaprimadicaricarlasuMiSeq.


Fase7–SequenziamentosuMiSeqIlluminaDurata:~40oree45minutiIlMiSeq Illuminaèuno strumentoperNGSautomatizzato ingradodi sequenziare la Libreriacon frammenti selezionati preparata nelle fasi precedenti. Al termine della corsa disequenziamentovieneeffettuatoautomaticamenteildemultiplexingdeicampioniindicizzati.

Suggerimento – Permonitorare la reazione di sequenziamento potete aggiungerePhiX all'1% come controllo addizionale. Consultare la documentazione Illumina sulcontrolloPhiXperulterioriinformazioni.

ElencoreagentiComponente Conservazione ProvenienzaCartucciaReagenti -20°C IlluminaHT1 -20°C IlluminaPR2 4°C IlluminaFlowCellMiSeq 4°C IlluminaLibreriaa2nM 4°C Fase6NaOH1No2N 20°C-25°C UtilizzatoreH2Operbiologiamolecolare 20°C-25°C Utilizzatore

CapacitàdeiKitReagentiMiSeqKitReagentiMiSeqIllumina

TempoOre

X2-96/7campioni

Std500Cycle(MS-102-2003) ~39 96

Std300Cycle(MS-102-2002) ~24 80

Micro500Cycle(MS-103-1002) ~19 28

Nano500Cycle(MS-103-1003) ~28 12

Nano300Cycle(MS-103-1001) ~17 6

Protocollo7.1-PreparareilMiSeqsecondoiprotocollistandardIllumina.7.2-PreparareunaLibreriaDenaturata1nM:Combinare10μLfreschidiNaOH0.2Ne10μLdellaLibreriaconframmentiselezionatidiluitaa2nMinunanuovamicroprovettalow-bindda


1.5 mL. Vortexare e spinnare. Incubare questa Libreria Denaturata 1 nM a temperaturaambienteper5minuti.7.3-PreparareunaLibreriaDenaturata20pM:Aggiungere980μLdiHT1refrigeratoai20μLdellaLibreriaDenaturata1nM.Vortexareespinnare.7.4-PreparareunaLibreriaDenaturata9pM:Aggiungere550μLdiHT1refrigeratoe450μLdellaLibreriaDenaturata20pMaunamicroprovettalow-bindda1.5mL.Vortexareespinnare.7.5 – Trasferire 600 μL della Libreria Denaturata 9 pM nella posizione di caricamento dellacartucciareagentiMiSeq.

Suggerimento – Si consiglia di utilizzare il workbook fornito per creare il FoglioCampionirichiestoperilMiseq.


Fase8–AnalisiDatidiSequenziamentoHLAIlMiSeqIlluminaprocessalaLibreria9pMegeneradatidisequenziamentonellaformadifilefastq.ConsultareilManualeHLATwinqualeausilioperl'installazionecorrettadiHLATwineperinformazionisull'interpretazionedell'analisidigenotipizzazionedeidatidisequenziamento.Peraiuto nella configurazione del Protocollo Automatizzato e domande circa l'installazione ol'analisideidati,[email protected].

ProtocolloAutomatizzato

InstallazioneITeConfigurazione1. InstallareHLATwinServersulserver.2. InstallareHLATwinClient suunPC client – al server si possono collegarepiù clientHLA

Twin.3. Contattare il Supporto Omixon ([email protected]) per istruzioni circa l'installazione

delprotocolloautomatizzato.

ProtocolloperAnalisi1. LanciareHLATwinClientedeffettuareillogin.2. I dati sono stati già elaborati o sono in fase di elaborazione. Riesaminare i risultati

utilizzandoilsistemaasemaforoinHLATwin.3. Esportareirisultatidigenotipizzazionee/olesequenzeconsenso,comerichiesto.

ProtocolloServerManuale

InstallazioneITeConfigurazione1. InstallareHLATwinServersulserver.2. InstallareHLATwinClientsuunPCclient.

ProtocolloperAnalisi1. LanciareHLATwinClienteeffettuareillogin.2. SelezionareidatiMiSeqinformatofastqofastq.gzeavviarel’interpretazionedeidaticon

HolotypeHLA.3. Al terminedella tipizzazioneHolotypeHLA, riesaminare i risultati utilizzando il sistemaa

semaforoinHLATwin.4. Esportareirisultatidigenotipizzazionee/olesequenzeconsenso,comerichiesto.

ProtocolloDesktopManuale

InstallazioneITeConfigurazione1. InstallareDesktopHLATwin.


ProtocolloperAnalisi1. LanciareHLATwineeffettuareillogin.2. SelezionareidatiMiSeqinformatofastqofastq.gzeavviarel’interpretazionedeidaticon

HolotypeHLA.3. Al terminedella tipizzazioneHolotypeHLA, riesaminare i risultati utilizzando il sistemaa

semaforoinHLATwin.4. Esportareirisultatidigenotipizzazionee/olesequenzeconsenso,comerichiesto.


FigureSupplementari

Esempio di schema per Piastra Ampliconi, Piastra Amplificazione,Piastra Diluizione, Piastra Quantificazione Ampliconi (per un locusindividuale)ePiastraReazione


EsempiodiPiastraQuantificazioneStandard

EsempiodiPiastraqPCR


Appendice1:PippinPrep

ProgrammazionePippinPrep1. CliccaresullaBarraProtocolEditorecliccaresulpulsante“New”.

2. Cliccaresull'iconacartellaafiancodelcampoCassetteeselezionare“1.5%DFMarkerK”perilPippinPrepo“1.5%DFMarkerR2”perilBluePippin.

3. Nellalaneprevistaperlacorsa:

a. Evidenziareilcampo"Range".b. In“RefLane”impostareilnumerodilaneincuisiprocederàallaseparazione.c. Impostareilcampo“Start*”a650.d. Impostareilcampo“End*”a1300.

4. NelcampoReferenceLane,selezionarelalaneincuisiprocederàallaseparazione.

5. Cliccaresulpulsante”SaveAs”eassegnareunnomealprogramma.

EsecuzionediunacorsasuPippinPrep1. AccendereilPippinPrepconilpulsantepostosulretrodeldispositivo.2. ControllarevisivamenteilPippinPrep.Accertarsichei5LEDsianoaccesiechel'interno

deldispositivosiapulitoeasciutto.3. Cliccare sul logo Sage Science in basso a destra su schermo, inserire una password

(“pips”didefault).4. CliccaresullabarraFactorySetupverificandocheBase-to-Thresholdsiaparia0.02.5. InserireildispositivodicalibrazionenelPippinPrep,accertandosichelastrisciascurasia

rivoltaversoilbassoecopraiLED.6. NellabarraMain,cliccaresulpulsante“Calibration”.7. NellafinestraCalibrazione,verificarecheilcampo“TargetIpHmA”siaimpostatoa0.80

(0.60perBluePippin),quindipremereilpulsante“Calibrate”.8. AndareallaBarraProtocols.Cliccaresulpulsante“Load”eselezionareilprogrammaper

HolotypeHLAelalanespecificachesiintendeutilizzare.Accertarsiche:a. Lalanecorrettasiaaccesa.b. L'indicatorediselezioneBroadspectrumsiaacceso.c. Lalanediriferimentosialastessasullaqualesiintendeeseguireilprogramma.

9. AndareallaBarraMain.Accertarsiche:a. Ilprogrammacheavetecaricatoèquelloselezionato.b. La lanedi riferimentoappropriata sia selezionatae sia anche la stessa in cui il

campionesaràcorso.10. Ispezionarelacassetta.Primadirimuoverelapellicolasigillantedaipozzetti,osservare

pervederesedietrolaportadieluizionesonopresentidellebolle.Sevisonodellebolle,picchiettaredelicatamenteeruotarelacassettatralemaniperfarlefuoriuscire.

11. Inserirelacassetta,conlapellicolaancoraacoprireipozzetti,nelPippinPrep.


12. Staccareconcuralapellicola,accertandosidirimuoverelapellicoladallatopulitodellacassetta(lane5)aquelloeventualmentegiàusato(lane1).Perevitarecontaminazioni,fareattenzioneanonspargeredelliquidonelrimuoverelapellicola.

13. Rimuoverel'interovolumeditamponedallaportadieluizionedellalanechesiintendeutilizzareeaggiungere40μLditamponeperelettroforesifresconellastessaporta.

14. Coprireconunastrisciasottiledipellicolaleportedieluizione.15. Sequalcheserbatoioèpienopermenodi3/4delvolumevarabboccatocontampone

per elettroforesi. Non riempire eccessivamente i pozzetti. Il livello del tampone deveraggiungereappenalaplastica,perimpedirefuoriuscitequandosichiuderàilcoperchiodelPippinPrep.Aggiungeretamponepartendodaipozzettipulitifinoaquelliusati(dalane5alane1).

16. Accertarsi che ciascuno dei pozzetti di caricamento (di agarosio) siano riempiti contamponeperelettroforesi.Illivellodeltamponedovràessere‘appena’sopral'agarosio,edapparirecompletamentepiatto.

17. Chiudere lentamente il Pippin Prep, accertarsi che il tampone non tocchi il coperchioquandosichiudeildispositivo.

18. Eseguireiltestdicontinuità.Quandoisensorisiseccanoleggermente,ècomunecheiltestdicontinuitàpossafallireunavolta.Sefallisce,eseguireiltestancoraunavolta.Unavolta completato il test di continuità, aprire lentamente il Pippin. Accertarsi che ilcoperchiodelPippinPrepnonabbiatrascinatofluidoattraversolacassetta.

19. VortexarebrevementelasoluzionedicaricamentoconMarkerKespinnarla.Aggiungere10μLdisoluzionedicaricamentoconMarkerKa~30μLdilibreria.

20. Vortexarelalibreriabrevementeespinnarla.21. Rimuovere40μLditamponedalpozzettoconilcampionechesiintendeutilizzare.22. Aggiungere~40μLdilibreriaconMarkerKalpozzettoconilcampionedautilizzare.23. Contrassegnarelalanechesistautilizzandoconleinizialideltecnicoeladata.24. ChiudereilPippinPrepecliccaresulpulsante“Start”.Accertarsichelalaneappropriata

siastataattivata.Ilcampionedevecorrerepercirca45minuti.25. Alterminedelprogramma,aprireconcautelailPippinPrep.Controllareseilcoperchio

trascinadelliquidolungolacassetta.26. Toglierelapellicolasulleportedieluizione,facendoattenzioneanontoccareilliquido.27. Trasferiretuttoilvolumedallaportaeluizioneinunanuovaprovettalow-bindda1.5ml.28. Coprire i pozzetti aperti conduepezzidipellicola sigillante. Lasciareuna linguetta sul

latopulito.Questofaciliteràlarimozionedellapellicoladallatopulitodautilizzare.29. Inserirelacassettasigillatanelsuoblisteremetterladaparte.30. PrenderelacassettadilavaggioeriempirlaconacquaMilliQ.Chiuderedelicatamenteil

coperchiodelPippinPrep,controllaresedelliquidoèstatotrascinatolungolacassettadilavaggio.

32. LasciareilPippinPrepchiusoperqualchesecondo.33. Aprire il Pippin Prep, controllare se del liquido è stato trascinato lungo la cassetta di

lavaggio.34. Rimuoverelacassettadilavaggio,svuotarlaelasciarlaasciugare.35. AsciugareilPippinPrepechiuderlodelicatamente.36. Selezionareilpulsante“ShutDown”nelmenuPippinPrep.


Appendice2:SampleSheet[Header],,,,,,,IEMFileVersion,4,,,,,,InvestigatorName,RHP,,,,,,ExperimentName,030315S_RHP,,,,,,Date,3/3/15,,,,,,Workflow,GenerateFASTQ,,,,,,Application,FASTQOnly,,,,,,Assay,CHOPPCRFree,,,,,,Description,030315L_RHP,,,,,,Chemistry,Default,,,,,,,,,,,,,[Reads],,,,,,,251,,,,,,,251,,,,,,,,,,,,,,[Settings],,,,,,,Adapter,AGATCGGAAGAGCACACGTC,,,,,,AdapterRead2,AGATCGGAAGAGCGTCGTGT,,,,,,,,,,,,,[Data],,,,,,,Sample_ID,Sample_Name,Sample_Plate,Sample_Well,I7_Index_ID,index,Sample_Project,Description001__030315S_RHP_1,001__030315S_RHP_1,030315P_RHP,A1,1,TAAGTGATC,030315S_RHP,002__030315S_RHP_2,002__030315S_RHP_2,030315P_RHP,B1,2,GTGGTATTC,030315S_RHP,003__030315S_RHP_3,003__030315S_RHP_3,030315P_RHP,C1,3,ATAAGTACT,030315S_RHP,004__030315S_RHP_4,004__030315S_RHP_4,030315P_RHP,D1,4,TAGGATTCA,030315S_RHP,005__030315S_RHP_5,005__030315S_RHP_5,030315P_RHP,E1,5,AAGTGCATA,030315S_RHP,006__030315S_RHP_6,006__030315S_RHP_6,030315P_RHP,F1,6,TACACACAA,030315S_RHP,007__030315S_RHP_7,007__030315S_RHP_7,030315P_RHP,G1,7,TCTCCGAGC,030315S_RHP,008__030315S_RHP_8,008__030315S_RHP_8,030315P_RHP,H1,8,AGTAACCGC,030315S_RHP,009__030315S_RHP_9,009__030315S_RHP_9,030315P_RHP,A2,9,AGGCAAGTT,030315S_RHP,010__030315S_RHP_10,010__030315S_RHP_10,030315P_RHP,B2,10,CCGTACTAT,030315S_RHP,011__030315S_RHP_11,011__030315S_RHP_11,030315P_RHP,C2,11,GCCAGGTGC,030315S_RHP,012__030315S_RHP_12,012__030315S_RHP_12,030315P_RHP,D2,12,CAACATCAC,030315S_RHP,013__030315S_RHP_13,013__030315S_RHP_13,030315P_RHP,E2,13,GTCAGCACC,030315S_RHP,014__030315S_RHP_14,014__030315S_RHP_14,030315P_RHP,F2,14,CTTGGCTGT,030315S_RHP,015__030315S_RHP_15,015__030315S_RHP_15,030315P_RHP,G2,15,GTAGTACTA,030315S_RHP,016__030315S_RHP_16,016__030315S_RHP_16,030315P_RHP,H2,16,GCAAGTCAA,030315S_RHP,017__030315S_RHP_17,017__030315S_RHP_17,030315P_RHP,A3,17,ATTACTACC,030315S_RHP,018__030315S_RHP_18,018__030315S_RHP_18,030315P_RHP,B3,18,CGCTCTAAT,030315S_RHP,019__030315S_RHP_19,019__030315S_RHP_19,030315P_RHP,C3,19,ACTTCGGTC,030315S_RHP,020__030315S_RHP_20,020__030315S_RHP_20,030315P_RHP,D3,20,TGGTACGAC,030315S_RHP,021__030315S_RHP_21,021__030315S_RHP_21,030315P_RHP,E3,21,TGCATAATG,030315S_RHP,022__030315S_RHP_22,022__030315S_RHP_22,030315P_RHP,F3,22,CTGGTTGGC,030315S_RHP,023__030315S_RHP_23,023__030315S_RHP_23,030315P_RHP,G3,23,CTCTTATTC,030315S_RHP,024__030315S_RHP_24,024__030315S_RHP_24,030315P_RHP,H3,24,AGGACTCTC,030315S_RHP,


025__030315S_RHP_25,025__030315S_RHP_25,030315P_RHP,A4,25,GCATTCCAA,030315S_RHP,026__030315S_RHP_26,026__030315S_RHP_26,030315P_RHP,B4,26,TCAAGGTCA,030315S_RHP,027__030315S_RHP_27,027__030315S_RHP_27,030315P_RHP,C4,27,CACTCCGTT,030315S_RHP,028__030315S_RHP_28,028__030315S_RHP_28,030315P_RHP,D4,28,CAGCCAGTT,030315S_RHP,029__030315S_RHP_29,029__030315S_RHP_29,030315P_RHP,E4,29,AGCAGCACA,030315S_RHP,030__030315S_RHP_30,030__030315S_RHP_30,030315P_RHP,F4,30,TTCCGTAAG,030315S_RHP,031__030315S_RHP_31,031__030315S_RHP_31,030315P_RHP,G4,31,TCCTGTGGA,030315S_RHP,032__030315S_RHP_32,032__030315S_RHP_32,030315P_RHP,H4,32,GTGATAGCC,030315S_RHP,033__030315S_RHP_33,033__030315S_RHP_33,030315P_RHP,A5,33,TAGCTCTGA,030315S_RHP,034__030315S_RHP_34,034__030315S_RHP_34,030315P_RHP,B5,34,GCGAGTTGA,030315S_RHP,035__030315S_RHP_35,035__030315S_RHP_35,030315P_RHP,C5,35,TAGGTAATG,030315S_RHP,036__030315S_RHP_36,036__030315S_RHP_36,030315P_RHP,D5,36,GTAACTATA,030315S_RHP,037__030315S_RHP_37,037__030315S_RHP_37,030315P_RHP,E5,37,CTCCAGCCG,030315S_RHP,038__030315S_RHP_38,038__030315S_RHP_38,030315P_RHP,F5,38,AATATACCG,030315S_RHP,039__030315S_RHP_39,039__030315S_RHP_39,030315P_RHP,G5,39,GCGAGACGT,030315S_RHP,040__030315S_RHP_40,040__030315S_RHP_40,030315P_RHP,H5,40,CCACCGGAT,030315S_RHP,041__030315S_RHP_41,041__030315S_RHP_41,030315P_RHP,A6,41,CGACGAGGT,030315S_RHP,042__030315S_RHP_42,042__030315S_RHP_42,030315P_RHP,B6,42,GCGCTGGCA,030315S_RHP,043__030315S_RHP_43,043__030315S_RHP_43,030315P_RHP,C6,43,GGCACTAGG,030315S_RHP,044__030315S_RHP_44,044__030315S_RHP_44,030315P_RHP,D6,44,CTGGAATCG,030315S_RHP,045__030315S_RHP_45,045__030315S_RHP_45,030315P_RHP,E6,45,CTTGTTATC,030315S_RHP,046__030315S_RHP_46,046__030315S_RHP_46,030315P_RHP,F6,46,AACCACTTA,030315S_RHP,047__030315S_RHP_47,047__030315S_RHP_47,030315P_RHP,G6,47,GGCGCTTCT,030315S_RHP,048__030315S_RHP_48,048__030315S_RHP_48,030315P_RHP,H6,48,CCGAGGCTT,030315S_RHP,049__030315S_RHP_49,049__030315S_RHP_49,030315P_RHP,A7,49,TCGATCGTT,030315S_RHP,050__030315S_RHP_50,050__030315S_RHP_50,030315P_RHP,B7,50,TTGGCTACG,030315S_RHP,051__030315S_RHP_51,051__030315S_RHP_51,030315P_RHP,C7,51,TATTGCGTC,030315S_RHP,052__030315S_RHP_52,052__030315S_RHP_52,030315P_RHP,D7,52,GATTCTAGG,030315S_RHP,053__030315S_RHP_53,053__030315S_RHP_53,030315P_RHP,E7,53,TCCAACACT,030315S_RHP,054__030315S_RHP_54,054__030315S_RHP_54,030315P_RHP,F7,54,TACCGAGGT,030315S_RHP,055__030315S_RHP_55,055__030315S_RHP_55,030315P_RHP,G7,55,TTGTACCGA,030315S_RHP,056__030315S_RHP_56,056__030315S_RHP_56,030315P_RHP,H7,56,TAGTGGAGG,030315S_RHP,057__030315S_RHP_57,057__030315S_RHP_57,030315P_RHP,A8,57,GACCTGTTA,030315S_RHP,058__030315S_RHP_58,058__030315S_RHP_58,030315P_RHP,B8,58,TTCTTCCTA,030315S_RHP,059__030315S_RHP_59,059__030315S_RHP_59,030315P_RHP,C8,59,ATTCCGGTT,030315S_RHP,060__030315S_RHP_60,060__030315S_RHP_60,030315P_RHP,D8,60,GTTAGGCTC,030315S_RHP,061__030315S_RHP_61,061__030315S_RHP_61,030315P_RHP,E8,61,AGTCTGACT,030315S_RHP,062__030315S_RHP_62,062__030315S_RHP_62,030315P_RHP,F8,62,ATACATAAC,030315S_RHP,063__030315S_RHP_63,063__030315S_RHP_63,030315P_RHP,G8,63,CGTTACGGC,030315S_RHP,064__030315S_RHP_64,064__030315S_RHP_64,030315P_RHP,H8,64,CCGCACTGG,030315S_RHP,065__030315S_RHP_65,065__030315S_RHP_65,030315P_RHP,A9,65,CACGTAGGC,030315S_RHP,066__030315S_RHP_66,066__030315S_RHP_66,030315P_RHP,B9,66,TAGAGCCAC,030315S_RHP,067__030315S_RHP_67,067__030315S_RHP_67,030315P_RHP,C9,67,TTGTCCAAT,030315S_RHP,068__030315S_RHP_68,068__030315S_RHP_68,030315P_RHP,D9,68,CCTGGTTCA,030315S_RHP,069__030315S_RHP_69,069__030315S_RHP_69,030315P_RHP,E9,69,ATCAATATG,030315S_RHP,070__030315S_RHP_70,070__030315S_RHP_70,030315P_RHP,F9,70,TGGTAACCG,030315S_RHP,071__030315S_RHP_71,071__030315S_RHP_71,030315P_RHP,G9,71,TTCTTGACG,030315S_RHP,072__030315S_RHP_72,072__030315S_RHP_72,030315P_RHP,H9,72,GTTCGTATC,030315S_RHP,


073__030315S_RHP_73,073__030315S_RHP_73,030315P_RHP,A10,73,ATCCTAGGA,030315S_RHP,074__030315S_RHP_74,074__030315S_RHP_74,030315P_RHP,B10,74,GCATTATAT,030315S_RHP,075__030315S_RHP_75,075__030315S_RHP_75,030315P_RHP,C10,75,TGACGTCTA,030315S_RHP,076__030315S_RHP_76,076__030315S_RHP_76,030315P_RHP,D10,76,TCAGATCCA,030315S_RHP,077__030315S_RHP_77,077__030315S_RHP_77,030315P_RHP,E10,77,CTCTGTGGT,030315S_RHP,078__030315S_RHP_78,078__030315S_RHP_78,030315P_RHP,F10,78,AGCGAGCGC,030315S_RHP,079__030315S_RHP_79,079__030315S_RHP_79,030315P_RHP,G10,79,ACTCCTACG,030315S_RHP,080__030315S_RHP_80,080__030315S_RHP_80,030315P_RHP,H10,80,CGTAACATC,030315S_RHP,081__030315S_RHP_81,081__030315S_RHP_81,030315P_RHP,A11,81,CCGGTGTAT,030315S_RHP,082__030315S_RHP_82,082__030315S_RHP_82,030315P_RHP,B11,82,CGGATCCTG,030315S_RHP,083__030315S_RHP_83,083__030315S_RHP_83,030315P_RHP,C11,83,AGGCGCTAC,030315S_RHP,084__030315S_RHP_84,084__030315S_RHP_84,030315P_RHP,D11,84,ATTCTGCTA,030315S_RHP,085__030315S_RHP_85,085__030315S_RHP_85,030315P_RHP,E11,85,ACTTGTAGG,030315S_RHP,086__030315S_RHP_86,086__030315S_RHP_86,030315P_RHP,F11,86,GCCTGTTGT,030315S_RHP,087__030315S_RHP_87,087__030315S_RHP_87,030315P_RHP,G11,87,ACACGACCA,030315S_RHP,088__030315S_RHP_88,088__030315S_RHP_88,030315P_RHP,H11,88,CAGCTCGGT,030315S_RHP,089__030315S_RHP_89,089__030315S_RHP_89,030315P_RHP,A12,89,ATCAACCTA,030315S_RHP,090__030315S_RHP_90,090__030315S_RHP_90,030315P_RHP,B12,90,GCGGAAGCG,030315S_RHP,091__030315S_RHP_91,091__030315S_RHP_91,030315P_RHP,C12,91,CCTGTTAGG,030315S_RHP,092__030315S_RHP_92,092__030315S_RHP_92,030315P_RHP,D12,92,ATCTGAGCC,030315S_RHP,093__030315S_RHP_93,093__030315S_RHP_93,030315P_RHP,E12,93,ACCTCCTCA,030315S_RHP,094__030315S_RHP_94,094__030315S_RHP_94,030315P_RHP,F12,94,CGCGAAGAG,030315S_RHP,095__030315S_RHP_95,095__030315S_RHP_95,030315P_RHP,G12,95,GTTCTCCTG,030315S_RHP,096__030315S_RHP_96,096__030315S_RHP_96,030315P_RHP,H12,96,GAATGACCA,030315S_RHP,


Appendice3:QuantificazioneAmpliconiutilizzandounostrumentoperqPCR

ElencoreagentiComponente Conservazione ProvenienzaTamponeTE20×(pH7.5) 4°C PromegaStandardDNALambda(100ng/μL) 4°C PromegaColorantedsDNAQuantiFluor200× 4°C PromegaH2Osterile 20°C-25°C UtilizzatorePiastra(e)AmplificazioneClasseI 4°C Fase2Piastra(e)AmplificazioneClasseII 4°C Fase2

Protocollo1. Creareunadiluizioneserialeutilizzandomicroprovetteda1.5mLelostandarddiDNA

QuantiFluorLambda(100ng/μL).Consultarelatabelladidiluizioneriportatasotto:Etichettasullaprovetta

DNAdiinput Vol.diDNA(μL)

Vol.diTE1x(μL)

Conc.finale(ng/μL)

Standard1 LambdaDNA 7,5μL 492,5μL 1.5ng/μLStandard2 Standard1 250μL 250μL 0.75ng/μLStandard3 Standard2 250μL 250μL 0.38ng/μLStandard4 Standard3 250μL 250μL 0.19ng/μLStandard5 Standard4 250μL 250μL 0.09ng/μLStandard6 Standard5 250μL 250μL 0.05ng/μLStandard7,bianco

Bianco 0μL 250μL 0ng/μL

2. PrepararePiastrediDiluizioneAmpliconi conpiastrea96deepwell (capacitàdi1mL

per pozzetto). Aggiungere aliquote di 498 μL di tampone TE 1× ai pozzetticorrispondentialnumerodiposizionioccupatedellePiastreAmpliconi.Aggiungere2μLdi DNA amplicone dalle Piastre Ampliconi ai corrispondenti pozzetti sulle Piastre diDiluizione Ampliconi, sciacquando accuratamente il puntale della pipetta. Sigillare lapiastraeVortexare.Centrifugarelapiastraper10secondi.

3. -PreparareunasoluzionedilavoroQuantiFluorDye1×utilizzandolaformulaseguente:0.5 μL diQuantiFluorDye (200X) + 99.5 μL di tampone TE 1×. Preparare soluzione dilavoro QuantiFluor Dye 1× sufficiente affinché ciascun campione (di tutti quelli nellePiastreAmpliconi)estandard(6standarde1biancoinduplicato)ricevaun'aliquotaparia50μL.


4. Inunapiastraa96pozzettinuovacompatibileconlamacchinaperqPCRindotazione,aggiungerealiquotedi50μLdisoluzionedilavoroQuantiFluorDye1xaipozzettichesiintendeutilizzare.

5. Utilizzando gli standard preparati sopra, aggiungere 50 μL di ciascuno standard, induplicato, a pozzetti individuali della Piastra Quantificazione a 96 pozzetti (totale 14pozzetti).Miscelaremediantepipettamento.

6. Quindi, aggiungere 50 μL di ampliconi diluiti dai pozzetti corrispondenti nelle PiastreDiluizione Ampliconi alle varie posizioni nelle Piastre Quantificazione a 96 pozzetti.Miscelaremediantepipettamento.

7. Inserire ciascuna Piastra Quantificazione nella macchina per qPCR una alla volta edeseguireilseguenteprogramma:Numerodicicli Temperatura Tempo

1 25°C 10secondi 25°C 15secondi2 25°C 30secondi(acquisizionedati)

8. CalcolarelaconcentrazionediDNAnellePiastraQuantificazioneAmpliconiutilizzandoidatiRFUgrezzigeneratidallostrumentoperqPCR.

9. - Diluire DNA nelle Piastre Ampliconi con H2O sterile in modo che la concentrazionefinalediDNAsiaapprossimativamenteparia67ng/μL.

• SelaconcentrazionediDNAè150ng/μLomaggiore:aggiungere25μLdiH2O

• SelaconcentrazionediDNAè100-150ng/μL:aggiungere10μLdiH2O

• SelaconcentrazionediDNAèminoredi100ng/μL:aggiungere0μLdiH2O.

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