hla b27 strip · aparición de precipitados en alguna de las soluciones (tampón de hibridación,...
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HLA B27 StripTest para la detección de alelos HLA B*27
Test for the detection of HLA B*27 alleles
Test per il rilevamento di alleli HLA B*27
OPERON, S.A. - Camino del Plano, 19 - E-50410 Cuarte de Huerva - (Zaragoza) – ESPAÑA
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HLA B*27 STRIPTest para la detección de alelos HLA B*27
FINALIDAD PREVISTAEl test HLA B*27 Strip es un test que permite la determinación de alelos HLA B*27. Este grupo de
alelos ha sido asociado a una serie de patologías, como la espondilitis anquilosante (88-95 % de lospacientes), la uveítis anterior aguda (50-60 % de los pacientes), la artritis reactiva (60-85 % de lospacientes) y la enfermedad intestinal inflamatoria (50-60 % de los pacientes).
Este test es solo una herramienta para ayudar a los profesionales en el diagnóstico de las patologíasindicadas. No debe utilizarse como única herramienta de diagnóstico.
FUNDAMENTOEl Sistema Principal de Histocompatibilidad es un conjunto de genes, en su mayoría altamente
polimórficos, cuyos productos se expresan en una gran variedad de células y que son responsables dela respuesta inmune "adaptativa". Estos genes están presentes en todos los vertebrados y en el hombrereciben el nombre de Sistema HLA (del inglés Human Leukocyte Antigen). Las proteínas que codificanestos genes se denominan "moléculas HLA" o "antígenos HLA".
Se ha demostrado la existencia de predisposición genética frente a varias patologías en losindividuos portadores del antígeno de histocompatibilidad HLA-B*27: espondilitis anquilosante (1, 2, 3,4), uveítis anterior aguda (1, 3, 4), artritis reactiva (1, 4) , enfermedad intestinal inflamatoria (4).
La espondilitis anquilosante (o espondiloartritis anquilosante, EA) es una enfermedad reumáticacrónica e incapacitante frecuente, sobre todo, en la raza blanca (0.5-1% de la población).Habitualmente aparece en varones entre los 20 y 30 años de edad.
La uveítis anterior aguda es el tipo de uveítis endógena más frecuente. La uveítis es la inflamacióndel tracto uveal, una capa vascular pigmentada situada entre la esclerótica y la retina. Los síntomasprincipales son fotofobia, dolor, eritema, disminución de la visión y lagrimeo.
La artritis reactiva es la inflamación de una o más articulaciones que aparece como reacción a unainfección y que por lo general causa inflamación del tracto urinario y genital, de las articulaciones y delos ojos.
La enfermedad inflamatoria intestinal se emplea para referirse a una serie de problemas que afectanpredominantemente al intestino y que se caracterizan porque producen una inflamación crónica, queno tiende a la curación. Agrupa varias enfermedades, pero sobre todo la enfermedad de Crohn y lacolitis ulcerosa.
El procedimento del kit HLA B27 Strip consta de tres pasos: a) Extracción de ADN, b) amplificaciónmediante PCR y c) hibridación/revelado.
a) Extracción de ADN (reactivos no incluidos en el kit).
b) Amplificación mediante PCR En esta etapa se realiza la amplificación simultánea de un fragmento de un gen control (HCP5) y del
exón 2 de los alelos HLA-B*27, entre otros.
c) Hibridación y reveladoEn esta etapa se produce la unión específica de los fragmentos de ADN amplificados durante la PCR
a una serie de sondas unidas covalentemente a una membrana de nylon.
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ES
Cada membrana incluye las siguientes sondas:• una sonda para los alelos HLA-B*27.• una sonda para el gen HCP5, empleado como control interno de la PCR,• una sonda control del revelado.
Estas membranas contienen, además, unas líneas negra y roja para el control de posición de la tiradurante la interpretación de los resultados.
La detección de los fragmentos hibridados a las diferentes sondas se realiza mediante el uso de unconjugado (estreptavidina-peroxidasa) que se une a una marca de biotina que se añade a losfragmentos de ADN amplificados durante la PCR. Tras la adición de un sustrato de la peroxidasa (TMB)se genera un precipitado de color azul allí donde se haya producido la hibridación.
Como resultado final del test se obtiene un patrón de bandas que se interpreta con la ayuda de unatira control.
MATERIALES INCLUIDOS EN EL KIT
HLA B27 STRIP Kit 16 tests Kit 48 tests
Membranas 16 tests 48 tests
Cubetas 8 canales 2 --
Reactivos de PCR Mezcla PCR 0,8 ml 1,2 ml x 2
Primers 0,11 ml 0,275 ml
Taq 0,030 ml 0,070 ml
Desnaturalizante 1 ml 1 ml
Tampón de hibridación 60 ml 125 ml
Tampón de lavado 1 100 ml 250 ml
Conjugado 60 ml 125 ml
Tampón de lavado 2 130 ml 350 ml
Substrato 30 ml 65 ml
Instrucciones de uso 1 1
Plantilla de interpretación 1 1
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Control de reveladoLínea control
Línea control
Control de amplificación
HLA B*27
STRIPS
PL
REAG PCR
REAG PCR MIX
REAG PRIMER
REAG TAQ
SOLN DN
BUF HYB
BUF WASH 1
CONJ HRP
SUBS TMB
BUF WASH 2
MATERIALES NO INCLUIDOS EN EL KIT Para el desarrollo del kit se requieren, además, los siguientes materiales:1. Microtubos para PCR.2. Micropipetas y puntas para micropipetas (estériles o irradiadas con UV e, idealmente, con filtro).3. Pinzas y lápiz (opcional).4. Cronómetro.5. Termómetro.
EQUIPOS NECESARIOS PARA EL DESARROLLO DEL KIT1. Termoagitador para placas
El kit ha sido validado con los termoagitadores: PST-60HL (Biosan S.L.), Profiblot T30 y T48(Tecan), Autoblot 3000H (medTEC), TENDIGO (Fujirebio), Dynablot Heat (Dynex).
2. TermocicladorSe han probado con éxito los siguientes termocicladores: MJ Mini Gradient Thermal Cycler(BioRad), Mastercycler Personal (Eppendorf), S1000 Thermal Cycler (BioRad), G -Storm GS1(Gene Technologies), GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems) y FlexCycler(Analytikjena).
3. Escáner BLOTrix S1 o BLOTrix R2 (BioSciTec, opcional).
PRECAUCIONES1. Utilizar todos los reactivos únicamente in vitro. 2. Seguir rigurosamente las instrucciones indicadas. La modificación de cualquiera de los pasos o
temperaturas puede afectar gravemente a los resultados del test.3. Es esencial que todos los materiales que se vayan a usar estén libres de DNAsas. Se recomienda
usar puntas de pipeta con filtro en la preparación de PCRs, para evitar problemas decontaminación por formación de aerosoles. Siga todas las precauciones normales para lapreparación de las amplificaciones. Utilice material autoclavado para el proceso dehibridación/revelado.
4. Almacenar los componentes del kit en las condiciones indicadas.5. No intercambiar los componentes de kits con distinto número de lote.6. No usar los componentes del kit después de las fechas de caducidad. 7. Las tiras reactivas son de un único uso.8. Las cubetas proporcionadas son de un único uso.9. Cada canal de la cubeta es para una única tira.10. En caso de rotura del envase, el producto puede ser utilizado si ninguno de los componentes ha
sido dañado.11. El producto usado debe desecharse conforme a la legislación vigente.12. Las muestras de pacientes deben considerarse siempre como potencialmente infecciosas.
Observe todas las normas medioambientales y de seguridad.13. Es aconsejable que la tira, una vez utilizada se manipule teniendo las mismas consideraciones
que con la muestra. Se recomienda gestionarla como material potencialmente peligroso.14. La solución de desnaturalización contiene < 2 % de NaOH y es irritante para ojos y piel (H314
y P280, P305, P351, P338, P310).15. No tirar la caja externa del kit hasta que se haya utilizado todo el contenido. La caja contiene
información esencial respecto al marcado CE del producto y lotificación
ALMACENAMIENTOAlmacenar todos los reactivos a 2-8 ºC. Debido al almacenamiento a 2-8 ºC puede observarse la
aparición de precipitados en alguna de las soluciones (tampón de hibridación, tampones de lavado 1 y2, conjugado). Estos precipitados se redisuelven al atemperar (conjugado) o calentar a 42 ºC (tampónde hibridación y tampones de lavado 1 y 2).
La fecha de caducidad de todos los reactivos está impresa en la etiqueta.
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MUESTRASEl material de partida para la realización del test es ADN de concentración conocida. Este ADN
puede extraerse de sangre (con EDTA o citrato), saliva o tejidos y debe de ser de calidad suficiente parapoder ser amplificado mediante PCR (R 260/280 >1,5).
Se han probado con el kit muestras de ADN extraídas con los siguientes procedimientos:a) Sangre periférica extraída por punción en vena; ADNs purificados por precipitación salina.b) Sangre extraída por punción digital; ADNs purificados con kit de extracción de ADN de Operon
(Refs 3.149.020.64.000 y 3.149.050.64.000).c) Muestras de saliva recogidas y extraídas con el kit "Saliva DNA collection, isolation and
purification kit" de Norgen Biotek.d) Muestras de ADN purificadas a partir de sangre periférica con el extractor automático Qiacube
de Qiagen y empleando el kit QIAamp DNA Blood MiniKit (Qiagen).e) Muestras de ADN purificadas a partir de sangre periférica con el extractor automático
AmpliPrep (Roche) y empleando el kit TNAI (Roche).
Almacenar las muestras de ADN a 2-8 ºC, si se van a analizar en un tiempo breve, o a -20 ºC paraalmacenamientos más prolongados.
PROCEDIMIENTO DE HLA B27 STRIP1.- Reacción en cadena de la polimerasa
Preparación de PCRsImportante: antes de abrir los viales con los reactivos de PCR centrifugarlos brevemente. De este modose asegurará de que todo el contenido de los mismos esté en el fondo del tubo.
• Preparar los tubos de PCR necesarios según el número de ADNs que se vayan a amplificar.• En cada tubo de PCR añadir: 39 µl de premezcla de PCR + 5 µl de primers + 1 µl de Taq + 5
µl de ADN (50 ng/µl). Mezclar bien. Si es posible, mantener los reactivos y las mezclas a 2-8 ºCdurante la preparación. Si se van a amplificar varios ADNs se recomienda preparar una mezcla común con todos losreactivos, de modo que finalmente se añadan 45 µl de mezcla + 5 µl de ADN (50 ng/µl). Porejemplo:
Nº de PCRs Premezcla de PCR Primers Taq
1 39 µl 5 µl 1 µl
3 136,5 µl 17,5 µl 3,5 µl
5 214,5 µl 27,5 µl 5,5 µl
8 351 µl 45 µl 9 µl
* Las mezclas con todos los reactivos para la PCR deben prepararse siempre enexceso, para contrarrestar las pérdidas de volumen que se producen durante elproceso de pipeteo.
Siguiendo las buenas prácticas de laboratorio, el usuario debería amplificar también un controlnegativo (agua o tampón TE, por ejemplo) y, si fuera necesario, un control positivo (no incluido en elkit).
AmplificaciónDebe tenerse en cuenta la importancia de conseguir una adecuada concentración de ADN para
obtener los resultados esperados.
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Introducir los tubos en el termociclador (si se requiere, añadir 1 gota de aceite Nujol sobre cadareacción de PCR) y amplificar el ADN con el siguiente programa:
96 ºC, 5 min35 ciclos de: 96 ºC, 30 seg
61 ºC, 30 seg 72 ºC, 30 seg
72 ºC, 5 min.4 ºC.
Comprobación de la PCRSi se desea, puede comprobar el resultado de la PCR en un gel de agarosa al 2,5 %. Para ello
aplique 5 µl de cada reacción de PCR en un pocillo del gel. Desarrolle la electroforesis a 100 Vdurante 80 min y observe al UV. Los tamaños de los distintos posibles productos de la amplificación seindican a continuación:
Control de amplificación: 149 pbHLA B*27: 190 pb
Una vez terminada la PCR continuar con el desarrollo de la tira. Si las muestras no se van a analizaren el momento, almacenarlas a 2-8 ºC durante no más de 24 h. Para almacenamientos másprolongados, congelar a -20 ºC.
→ Ver esquema de preparación de PCR en Anexo al documento
2.- Desarrollo de la tiraBajo petición, Operon facilitará al usuario el procedimiento de trabajo según el instrumento que se
vaya a utilizar para el desarrollo de las tiras (PST-60HL, Profiblot, Autoblot 3000H, TENDIGO oDynablot Heat). Alternativamente, puede consultarlo en la siguiente dirección web:
http://www.operon.es/es/products/protocols.
En el paso de desnaturalización, se dispensarán en la placa 12,5 µl de desnaturalizante + 12,5 µlde PCR.
El producto se ha probado utilizando diferentes plataformas de trabajo. A modo informativo seespecifican los nombres comerciales de las plataformas de trabajo utilizadas, lo que no implica un usoexclusivo y dependiente de dichas marcas comerciales, sino que se refieren de forma representativa almodo de trabajo utilizado. El producto funciona correctamente mientras se utilice una plataforma queasegure el programa de temperatura planteado para el producto.
→ Ver esquema básico del desarrollo de la tira en Anexo al documento
3.- Interpretación de la tiraLa interpretación de las tiras puede hacerse de manera visual, con ayuda de la plantilla incluida en
el kit (ver procedimientos de trabajo para cada instrumento) o de forma automática, mediante el uso delos escáneres BLOTrix R2 o BLOTrix S1 (BioSciTec).
Bajo petición, OPERON, S.A., S.A. facilitará al usuario las instrucciones para la interpretaciónautomática de las tiras mediante escáner (DO-09053002 “Instrucciones de uso BLOTrix R2_S1”).Alternativamente, puede consultarlo en la siguiente dirección web:
http://www.OPERON, S.A..es/es/products/protocols.Importante: la interpretación automática de los resultados requiere siempre de una verificación
visual de las tiras; bandas muy débiles podrían no ser detectadas por el instrumento.
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RESULTADOSLa tira puede mostrar los siguientes resultados:• Negativo para HLA-B*27: aparecerá la banda correspondiente al control de amplificación
(HCP5), junto con la banda de control de revelado.• Positivo para HLA-B*27: aparecerán las bandas correspondientes al control de amplificación
(HCP5) y a HLA-B*27, junto con la banda de control de revelado.• Inválido: se darán por inválidas todas aquellas determinaciones en las que no aparezca la
banda correspondiente al control de amplificación (indicativo de problemas durante laamplificación por PCR). Igualmente serán inválidas aquellas determinaciones en las que noaparezca ninguna banda, incluida la banda de control de revelado.
En la siguiente figura se muestran los posibles resultados que podrían detectarse con HLA B27 Strip:
CONTROL DE CALIDADLa línea control de revelado debe aparecer siempre por encima de la línea negra superior. Su
ausencia será indicativa de problemas en la fase de hibridación/revelado del producto.La tira correspondiente al control de amplificación negativo mostrará únicamente la línea de control
de revelado. En el caso de muestras de ADN, deberá aparecer en todas las tiras la banda asociada alcontrol interno de amplificación (HCP5). Su ausencia será indicativa de problemas en la fase deamplificación del ADN (ausencia de ADN, ADN en mal estado, problemas en la PCR).
PRESTACIONES / EVALUACIONES INTERNAS Y EXTERNASLa utilización de este test está limitada a profesionales cualificados y familiarizados con métodos de
Biología Molecular.Se ha evaluado el test con muestras de ADN de pacientes fenotipados o genotipados por otros
métodos así como con muestras de ADN del International Histocompatibility Working Group. Losresultados obtenidos fueron satisfactorios y se muestran a continuación:
• Evaluación de sensibilidad y especificidad con muestras del International HistocompatibilityWorking Group (IHWG).Se ha evaluado la sensibilidad/especificidad de HLA B27 Strip mediante el análisis de un totalde 58 muestras del IHWG con genotipo determinado mediante secuenciación o SSP. Se haobtenido una concordancia de sensibilidad y especificidad del 100 %.
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Control de reveladoLínea control
Línea control
Inválidos
Control de amplificación
HLA B*27
Negativo Positivo
• Evaluación de sensibilidad y especificidad con muestras tipificadas mediante citometría deflujoSe han evaluado un total de 99 muestras de sangre caracterizadas mediante citometría de flujoy con el test GenoQuick HLA-B*27 (muestras dudosas por citometría). Se ha obtenido unaconcordancia de sensibilidad y especificidad del 100 %.
• Evaluación de sensibilidad y especificidad con muestras tipificadas mediante citometría deflujo realizada en los laboratorios CatLab (Terrassa).Se han evaluado un total de 100 muestras de sangre caracterizadas mediante citometría deflujo y mediante PCR a tiempo real usando el kit Fluorotype HLAB27 de Hain Lifesciences(muestras dudosas por citometría). Se ha obtenido una concordancia de sensibilidad yespecificidad del 100 %.
POSIBLES PROBLEMAS1. No aparece ninguna banda en la tira, incluida la banda control.
• No se han equilibrado a temperatura ambiente el conjugado y/o revelador.• No se ha añadido el conjugado y/o revelador, o se han añadido en poca cantidad.
2. Sólo aparece la línea de la sonda control.• Fallo de amplificación de la PCR (comprobar en gel de agarosa).• No se ha añadido la PCR, o se ha añadido en menor cantidad, en el paso de hibridación.• Temperatura incorrecta del tampón de hibridación/lavado 1 (superior a la indicada).• Temperatura incorrecta del incubador (superior a la indicada).
3. Fuerte color de fondo en la tira tras el revelado.• Los pasos de lavado no se realizaron de manera adecuada (tiempo inadecuado, cantidad de
tampón menor, tampones fríos).
4. Tinción no homogénea de la tira.• Agitación inadecuada (revisar la programación del termoagitador para placas).• Las tiras no quedaron sumergidas por completo durante las incubaciones.
5. Resultados inesperados• Temperatura de incubación y/o de los tampones/reactivos inadecuadas.• Contaminación en las PCRs (comprobar con un control negativo).• Contaminación de canales adyacentes por paso de líquido de un canal a otro al añadir el
tampón de hibridación.
Se ha evaluado el funcionamiento del test modificando la temperatura del paso dehibridación/revelado entre 39 y 45 ºC. Se ha observado que el test funciona correctamente entre 39 y45 ºC. Aún así, la temperatura óptima de desarrollo del test es de 42 ºC y se recomienda mantener ycontrolar estrictamente esta temperatura de trabajo.
SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDADSe evaluó con varios lotes la cantidad mínima de ADN puro que puede genotiparse adecuadamente
con el kit HLA B27 Strip. Con los resultados obtenidos se concluyó que la mínima cantidad de ADN enla PCR con la que se pueden conseguir resultados perfectamente legibles es de 1 ng. Cantidadesinferiores dan lugar a bandas muy débiles, en algunos casos difíciles de visualizar.
Se ha calculado la sensibilidad y especificidad teórica del kit teniendo en cuenta todos los alelosHLA-B descritos por el International Histocompatibility Working Group (108 alelos B*27 y 2332 alelosno B*27. Agosto de 2012).
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Sensibilidad teórica (alelos HLA B*27 teóricamente detectados frente a alelos HLA B*27 totales):97,2 %.Especificidad teórica (alelos no HLA B*27 teóricamente detectados frente a alelos HLA B totales):99,7 %
Alelo Total Alelo Total Alelo Total
B07 195 B41 24 B54 27
B08 105 B42 17 B55 68
B13 70 B44 197 B56 40
B14 39 B45 14 B57 71
B15 296 B46 39 B58 46
B18 87 B47 10 B59 6
B27 108 B48 31 B67 4
B35 264 B49 22 B73 2
B37 41 B50 17 B78 9
B38 48 B51 125 B81 5
B39 91 B52 42 B82 3
B40 241 B53 35 B83 1
EFECTO HOOKSe ha evaluado el funcionamiento del kit HLA B27 Strip en presencia de cantidades crecientes de
ADN (hasta 1000 ng). No se ha observado efecto de inhibición de la PCR, ni reducción de laintensidad de las bandas obtenidas, ni aparición de problemas de reacción entrecruzada. No existe,por lo tanto, efecto Hook.
PRECISIÓN INTRAENSAYO Se ha estudiado la precisión intraensayo de HLA B27 Strip mediante el análisis de cinco réplicas de
16 muestras de ADN con tres lotes diferentes de producto. El análisis lo realizó una misma persona ylos resultados de las réplicas fueron idénticos en todos los casos, demostrando la alta precisiónintraensayo del producto.
PRECISIÓN INTERDÍASe analizaron 15 muestras de ADN, cada una de ellas por duplicado, con 1 lote de producto HLA
B57 Strip a lo largo de 5 días consecutivos. El análisis lo realizó una misma persona y los resultadosobtenidos para cada ADN fueron los mismos en todos los casos, demostrando la alta precisión interdíadel producto.
PRECISIÓN INTERLABORATORIOTres personas analizaron 15 muestras de ADN con un lote de HLA B27 Strip. El análisis se hizo el
mismo día y los resultados obtenidos fueron idénticos, demostrando la alta precisión interlaboratorio delproducto.
PRECISIÓN INTERLOTESe analizaron 16 muestras de ADN, por triplicado, con tres lotes de producto HLA B27 Strip. El
análisis lo realizó una misma persona y los resultados obtenidos con todos los lotes fueron idénticos,demostrando la alta precisión interlote del producto.
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HLA B*27 STRIPTest for the detection of HLA B*27 alleles
INTENDED USEThe HLA B*27 Strip test allows the determination of the HLA B*27 allele. This group of alleles has
been associated with a wide range of pathologies such as ankylosing spondylitis (88-95% of patients),acute anterior uveitis (50-60% of patients), reactive arthritis (60-85% of patients), and inflammatorybowel disease (50-60% of patients).
This test is only a tool to help the professionals in the diagnosis of the indicated pathologies. This kitcannot be the only diagnosis tool.
PRINCIPLEThe Major Histocompatibility System comprises a set of genes, most of them highly polymorphic,
whose products are expressed in a wide range of cells and are responsible for the ‘adaptive’ immuneresponse. These genes are present in all vertebrates and, in humans, they are known as the HLA(Human Leukocyte Antigen) system. The proteins encoded by these genes are called ‘HLA molecules’ or‘HLA antigens’.
The existence of a genetic predisposition to various diseases in individuals carrying the HLA-B*27histocompatibility antigen has been demonstrated: ankylosing spondylitis (1, 2, 3, 4), acute anterioruveitis (1, 3, 4), reactive arthritis (1, 4), inflammatory bowel disease (4).
Ankylosing spondylitis (or ankylosing spondylarthritis, AS) is a chronic, disabling rheumatic disease,more common especially in white people (0.5-1% of the population). It usually appears in malesbetween 20 and 30 years of age.
Acute anterior uveitis is the most common form of endogenous uveitis. Uveitis is an inflammation ofthe uveal tract, a pigmented vascular layer that lies between the sclera and the retina. The mainsymptoms are photophobia, pain, erythema, decreased vision and tearing.
Reactive arthritis is an inflammation of one or more joints that appears as a reaction to an infectionand which usually causes inflammation of the urinary and genital tract, the joints and eyes.
Inflammatory bowel disease refers to a group of disorders that predominantly affect the intestine andwhich are characterized by chronic inflammation, which tends not to subside. It brings together variousdiseases, but especially Crohn's disease and ulcerative colitis.The existence of a genetic predisposition tovarious diseases in individuals carrying the HLA-B*27 histocompatibility antigen has been demonstrated:ankylosing spondylitis, acute anterior uveitis, reactive arthritis, inflammatory bowel disease.
The HLA B27 Strip kit procedure has three steps: a) DNA extraction, b) PCR amplification and c)hybridization/development.
a) DNA extraction (Reagents not included in the kit).b) PCR amplificationSimultaneous amplification of a control gene fragment (HCP5) and of exon 2 of HLA-B*27 alleles
takes place in this step.c) Hybridization and developmentSpecific binding of PCR-amplified DNA fragments takes place during this step, using a series of
probes that are covalently bound to a nylon membrane.
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EN
Each membrane has the following probes:
• a probe for the different HLA B*27 alleles.• a probe for the HCP5 gene, used as an internal PCR control, • a development control probe.
In addition, these membranes comprise a black and a red line for monitoring the position on the stripduring the interpretation of results.
The detection of the fragments that hybridize to the different probes is carried out using a streptavidin-peroxidase conjugate that binds to a biotin marker added to the PCR-amplified DNA fragments.Following the addition of a peroxidase substrate (TMB), a blue precipitate appears in the locations werehybridization has taken place. The end result of the test is a pattern of bands that can be interpreted withthe help of a control strip.
KIT CONTENTSHLA B27 Strip 16 tests kit 48 tests kit
Membranes 16 tests 48 tests
8 channel tray 2 --
PCR Reagent PCR Mix 0.8 ml 1.2 ml x 2
Primers 0.11 ml 0.275 ml
Taq 0.030 ml 0.070 ml
Denaturing 1 ml 1 ml
Hybridization buffer 60 ml 125 ml
Wash 1 buffer 100 ml 250 ml
Conjugate 60 ml 125 ml
Wash buffer 2 130 ml 350 ml
Substrate 30 ml 65 ml
Instructions 1 1
Interpretation chart 1 1
11
Developing controlControl line
Control line
Amplification control
HLA B*27
STRIPS
PL
REAG PCR
REAG PCR MIX
REAG PRIMER
REAG TAQ
SOLN DN
BUF HYB
BUF WASH 1
CONJ HRP
BUF WASH 2
SUBS TMB
MATERIALS NOT INCLUDED IN THE KITThe following additional material is required when using the kit:1. Microtubes for PCR2. Micropipettes and micropipette tips (sterile or UV-irradiated and ideally with a filter)3. Tweezers and a pencil (optional)4. Chronometer5. Thermometer
REQUIRED EQUIPMENTS FOR KIT DEVELOPMENT1. Thermoshakers for plates
The kit has been validated with the following thermoshakers: PST-60HL (Biosan S.L.), ProfiblotT30 y T48 (Tecan), Autoblot 3000H (medTEC), TENDIGO (Fujirebio), Dynablot Heat (Dynex).
2. ThermocyclerThe following thermocyclers have been succesfully used with the kit: MJ Mini Gradient ThermalCycler (BioRad), Mastercycler Personal (Eppendorf), S1000 Thermal Cycler (BioRad), G -StormGS1 (Gene Technologies), GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems) and FlexCycler(Analytikjena).
3. BLOTrix S1 or BLOTrix R2 scanner (BioSciTec, optional).
PRECAUTIONS1. Only use the reagents in vitro.2. Strictly follow the instructions provided. Modifying any of the prescribed steps or temperatures
may severely affect the test results.3. All the materials and reagents used must be free of DNAses. The use of filtered pipette tips is
recommended for PCR preparation to prevent aerosol contamination. Ensure that all the usualprecautions are taken in the preparation of the amplifications. Use autoclaved material for thehybridization/development process.
4. Store the kit components as indicated in the instructions.5. Do not exchange components from kits with different lot numbers.6. Do not use kit components after the expiration dates.7. Strips are for single-use.8. Supplied trays are for single-use. 9. Each channel of the supplied trays is for just one strip. 10. If the package is broken, the product can still be used providing none of the components have
been damaged.11. The used product should be discarded in compliance with current legislation.12. Patient samples must always be treated as potentially infectious. Environmental and safety
standards must be adhered to.13. Once it is used, it is advisable to manipulate the strip taking into account the same
considerations as for the sample. The strips have to be manipulated with the proper precautionsand should be managed as biohazardous material.
14. The denaturation solution contains < 2% NaOH and is an irritant to both eyes and skin (H314and P280, P305, P351, P338, P310).
15. Do not discard the external box of the kit until its content has been totally used. The external boxcontains essential information regarding the EC marking and component lots.
STORAGEStore all reagents at 2-8 ºC. Precipitates may appear in some solutions (hybridization buffer, wash
buffers 1 and 2, conjugate) owing to storage at 2-8 ºC. The precipitates are dissolved again when theyare brought back to room temperature (conjugate) or heated to 42 ºC (hybridization buffer and washbuffers 1 and 2).
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The expiry date of all the reagents is printed on the label.
SAMPLESThe base material for carrying out the test is DNA of a known concentration. This DNA can be
extracted from blood (with EDTA or citrate), salive or tissue and should be of sufficient quality for PCRamplification (R 260/280 >1,5).
DNA samples, obtained by several DNA extraction methods, have been tested on HLA B27 Strip. Theextraction procedures were the following:
a) Peripheral blood obtained by venipuncture; purified DNAs by salting-out method.b) Blood collected by finger prick; purified DNAs using Operon DNA extraction kit (refs
3.149.020.64.000 and 3.149.050.64.000).c) Saliva samples collected and extracted using the Norgen Biotek "Saliva DNA collection, isolation
and purification kit".d) DNA samples purified from peripheral blood using the robotic workstation for automated
purification of DNA Qiacube and the kit QIAamp DNA Blood MiniKit (Qiagen).e) DNA samples purified from peripheral blood using the robotic workstation for automated
purification of DNA AmpliPrep (Roche) and the kit TNAI (Roche).
Store the DNA samples at 2-8 ºC if they are going to be used shortly after, or at -20 ºC for longerperiods of storage.
HLA B27 STRIP PROCEDURE1.- Polymerase chain reaction
PCR preparationImportant: before opening the vials with the PCR reagents centrifuge them briefly. This will ensure that allthe contents will be at the bottom of the tube.
• Prepare the required PCR tubes based on the number of DNAs to be amplified.• Add to each PCR tube: 39 µl of PCR premix + 5 µl of primers + 1 µl of Taq + 5 µl of DNA (50
ng/µl. Mix well. If possible, keep the reagents and the mixtures at 2-8 ºC during the preparation.If various DNA samples are to be amplified, preparing a common mixture with all the reagents isrecommended to finally add 45 µl of mixture + 5 µl of DNA (50 ng/µl). For example:
No. of PCRs PCR premix Primers Taq
1 39 µl 5 µl 1 µl
3 136.5 µl 17.5 µl 3.5 µl
5 214.5 µl 27.5 µl 5.5 µl
8 351 µl 45 µl 9 µl
*The mixtures containing all PCR reagents should always be prepared in excess tocompensate for the loss of volume that takes place during the pipetting process.
Due to requirements of "good laboratory practice", the user should also include a negative control(e.g. water or TE buffer) to exclude contamination and, if required, a positive control (not included inthe kit).
AmplificationRegard the importance of getting a suitable concentration of the DNA to get a proper result.
13
Place the tubes in the thermocycler (if necessary, add 1 drop of Nujol mineral oil over each PCRreaction) and amplify the DNA using the following programme:
96 ºC, 5 min35 cycles of: 96 ºC, 30 sec
61 ºC, 30 sec 72 ºC, 30 sec
72 ºC, 5 min4 ºC.
PCR verificationIf desired, the PCR result can be verified in a 2.5% agarose gel. To do this, apply 5 µl of each of the
PCR reactions in a gel well. Run the electrophoresis at 100 V for 80 minutes and examine under UVlight. The sizes of the various possible amplification products are as follows:
Control gene: 149 bp.HLA B*27: 190 bp.
Once the PCR is finished, continue with strip development. If the samples are not to be analysedimmediately, store them at 2-8 ºC for no longer than 24 hours. For longer periods of storage, freeze at-20 ºC.
→ See the PCR preparation diagram in the Annex of the document.
2.- Strip developmentOn request, Operon will provide the user with the working procedure for the specific instrument to
be used for processing the strips (PST-60HL, Profiblot, Autoblot 3000H, TENDIGO or Dynablot Heat).Alternatively, please refer to to the following web address:
http://www.operon.es/products/protocols.In the denaturing step, 12.5 µl of denaturation buffer + 12.5 µl of PCR will be dispensed in the
tray.The product has been tested using different work platforms. For your information, the commercial
names of the work platforms used are specified, which does not imply an exclusive use of suchtrademarks but the work protocol. The product works correctly as long as the platform used ensures thetemperature program raised for the product.
→ See the Strip developing diagram in the Annex of the document.
3.- Strip interpretationStrip interpretation can be done visually, using the evaluation chart included in the kit (see working
procedures for each instrument) or automatically, with BLOTrix R2 or BLOTrix S1scanners (BioSciTec). On request, OPERON, S.A. will provide the user with the instructions for the automatic strip
interpretation with the scanners (DO-09053002 “Instructions of use BLOTRix R2_S1”). Alternatively,please refer to to the following web address:
http://www.OPERON, S.A..es/es/products/protocols.Important: results of strips interpretation with the scanners must always be visually verified; very faint
bands could be not detected by the instruments.
RESULTSThe strip can display the following results:• Negative for HLA-B*27: appearance of the line corresponding to the amplification control
(HCP5) along with the developing control line.
14
• Positive for HLA-B*27: appearance of the lines corresponding to the amplification control(HCP5) and HLA-B*27, along with the developing control line.
• Invalid: all cases where the line corresponding to the amplification control does not appear(indicative of problems during PCR amplification) will be regarded as invalid. Similarly, the testwill be invalid in those cases where no line appears, including the developing control line.
The following figure shows the possible results that could be obtained with the HLA B27 Strip:
QUALITY CONTROLThe development control line should always appear above the upper black line. Its absence will be
indicative of issues encountered during the product hybridization/development stage.The strip corresponding to the amplification negative control will show only the developing control
band. Regarding to DNA samples, the band associated with the internal amplification control (HCP5)must appear in all samples. Its absence will be indicative of issues during the DNA amplification stage(absence of DNA, DNA in poor condition, PCR issues).
FEATURES / EXTERNAL AND INTERNAL EVALUATIONSThe use of this test is restricted to professional users that are familiar with the methods used in
Molecular Biology.The test has been evaluated with DNA samples obtained from patients phenotyped or genotyped by
other methods, in addition to DNA samples from the International Histocompatibility Working Group.The following satisfactory results were obtained:
• Evaluation of sensitivity and specificity with samples from the International HistocompatibilityWorking Group (IHWG).The sensitivity/specificity of the HLA B27 Strip was evaluated by analysing a total of 58 IHWGsamples, where the genotype was determined by sequencing or SSP. A concordance of sensitivityand specificity of 100% was obtained.
• Evaluation of sensitivity and specificity with samples typified by flow cytometry.The evaluation involved a total of 99 blood samples, characterized by flow cytometry and withthe GenoQuick HLA-B*27 test (inconclusive cytometry samples). A concordance of sensitivity andspecificity of 100% was obtained.
15
Developing controlControl line
Control line
Invalid
Amplification control
HLA B*27
Negative Positive
• Evaluation of sensitivity and specificity with samples typified by flow cytometry in CatLablaboratories (Terrassa).The external evaluation involved a total of 100 blood samples, characterized by flow cytometryand by Real Time PCR using the kit Fluorotype HLA B27 from Hain Lifesciences (inconclusivecytometry samples). A concordance of sensitivity and specificity of 100% was obtained.
POTENTIAL ISSUES1. No bands appear on the strip, including the control band.
• The conjugate and/or developer were not balanced at room temperature.• The conjugate and/or developer were not added, or were added in too small quantity.
2. Only the control band appears• PCR amplification has failed (check with an agarose gel).• The PCR was not added, or was added in too small quantity in the hybridization step.• Incorrect hybridization or wash 1 buffers temperature (higher than instructed).• Incorrect incubator temperature (higher than instructed).
3. The strip has a strong background colour following development• The washing steps were not performed effectively (wrong timing, buffer quantity too small, cold
buffers).
4. Non-homogenous strip staining• Inadequate shaking (please review the plate thermo-shaker programme).• The strips were not entirely submerged during the incubations.
5. Unexpected results• Inadequate incubation and/or buffer/reagent temperatures.• PCR contamination (verify using a negative control).• Contamination of adjacent channels owing to the transfer of liquid from one channel to another
when adding the hybridization buffer.
The test has been run and verified by altering the temperature of the hybridization/development stepsto a temperature between 39 and 45 ºC. It has been observed that the test performs correctly between39 and 45 °C. Even so, the optimal temperature for the performance of the test is 42 °C, and it isrecommended to maintain and strictly control this working temperature.
SENSITIVITY AND SPECIFICITYThe sensitivity of HLA B27 Strip was evaluated with several lots of product. The minimum DNA
quantity per PCR than can be right genotyped is 1 ng (bands with good intensity). Lower DNA quantitiescause weak bands, in some cases difficult to see.
The theoretical sensitivity and specificity of the kit was calculated taking into account all HLA-B allelesdescribed by the International Histocompatibility Working Group (108 B*27 alleles and 2332 non-B*27alleles. August 2012).
Theoretical sensitivity (HLA B*27 alleles theoretically detected versus total HLA B*27 alleles): 97.2 %Theoretical specificity (non HLA B*27 alleles theoretically detected versus total HLA B alleles: 99.7 %
Allele Total Allele Total Allele Total
B07 195 B41 24 B54 27
B08 105 B42 17 B55 68
B13 70 B44 197 B56 40
B14 39 B45 14 B57 71
16
Allele Total Allele Total Allele Total
B15 296 B46 39 B58 46
B18 87 B47 10 B59 6
B27 108 B48 31 B67 4
B35 264 B49 22 B73 2
B37 41 B50 17 B78 9
B38 48 B51 125 B81 5
B39 91 B52 42 B82 3
B40 241 B53 35 B83 1
HOOK EFFECTHLA B27 kit has been assessed in the presence of increased quantities of DNA (up to 1000 ng). No
PCR inhibiting effects or reductions in the intensity of the bands were observed and there were no issueswith cross-reaction. There is therefore no Hook effect.
INTRA-ASSAY PRECISIONThe intra-assay precision of HLA B27 kit was studied using five replicas of 16 DNA samples and three
different product lots. The analysis was performed by a single person and the results of the replicas wereidentical in all cases, demonstrating the product’s high intra-assay precision.
INTER-DAY PRECISION15 DNA samples were analysed in duplicate with 1 lot of HLA B27 Strip product over 5 consecutive
days. The analysis was performed by a single person and the results obtained for each DNA wereidentical in all cases, demonstrating the product’s high intra-day precision.
INTER-LABORATORY PRECISIONThree people analysed 15 DNA samples with one HLA B27 Strip lot. The analysis was carried out on
the same day and the results obtained were identical, demonstrating the product’s high intra-laboratoryprecision.
INTER-LOT PRECISION16 DNA samples were analysed in triplicate with three HLA B27 Strip product lots. The analysis was
carried out by the same person on the same day obtaining identical results with all three lots,demonstrating the product’s high inter-lot precision.
17
HLA B*27 STRIPTest per il rilevamento di alleli HLA B*27
USO PREVISTOIl test HLA B*27 è un test che permette la determinazione degli alleli HLA B*27. Questo gruppo di
alleli è stato associato a una serie di patologie, come la spondilite anchilosante (88-95% dei pazienti),l'uveite anteriore acuta (50-60% dei pazienti), l'artrite reattiva (60-85% dei pazienti) e la malattiainfiammatoria intestinale (50-60% dei pazienti).
Questo test deve essere utilizzato esclusivamente da persone qualificate nella diagnosi dellepatologie correlate. Il risultato di questo test dovrebbe essere confermato con altri metodi diagnostici.
FONDAMENTO
Il sistema principale di istocompatibilità è un insieme di geni, la maggior parte dei quali altamentepolimorfici, i cui prodotti sono espressi in una grande varietà di cellule e che sono responsabili dellarisposta immunitaria "adattativa". Tali geni sono presenti in tutti i vertebrati e nell'uomo prendono il nome di sistema HLA (dall'inglese Human Leukocyte Antigen). Le proteine codificate da questi genisono chiamate "molecole HLA" o "antigeni HLA".
È stata dimostrata l'esistenza di una predisposizione genetica a varie patologie nei soggetti portatoridell'antigene di istocompatibilità HLA-B*27: spondilite anchilosante (1, 2, 3, 4), uveite anteriore acuta(1, 3, 4), artrite reattiva (1, 4), malattia infiammatoria intestinale (4).
La spondilite anchilosante (o spondiloartrite anchilosante, SA) è una malattia reumatica cronica e invalidante, frequente soprattutto nella razza bianca (0,5-1% della popolazione). Solitamente simanifesta negli uomini tra i 20 e i 30 anni di età.
L'uveite anteriore acuta è il tipo di uveite endogena più frequente. L'uveite è l'infiammazione del trattouveale, una tonaca vascolare pigmentata situata tra la sclera e la retina. I sintomi principali sonofotofobia, dolore, eritema, diminuzione della vista e lacrimazione.
L'artrite reattiva è un'infiammazione di una o più articolazioni che si sviluppa come reazione a un'infezione e che generalmente provoca infiammazione delle vie urogenitali, delle articolazioni e degli occhi.
Il termine malattia infiammatoria intestinale viene utilizzato per indicare una serie di problemi cheinteressano prevalentemente l'intestino e che si caratterizzano per il fatto che provocanoun'infiammazione cronica, che non tende a guarire. A questo gruppo appartengono varie malattie, tra le quali le principali sono la malattia di Crohn e la colite ulcerosa.
La procedura del kit HLA B27 Strip prevede tre fasi: a) estrazione del DNA b) amplificazione tramitePCR e c) ibridazione/rivelazione.
a) Estrazione del DNA (reagenti non inclusi nel kit).
b) Amplificazione tramite PCR In questa fase viene realizzata l'amplificazione simultanea di un frammento di un gene di controllo
(HCo5) e dell'esone 2 degli alleli HLA-B*27, tra gli altri.
18
IT
c) Ibridazione e rivelazioneIn questa fase ha luogo il legame specifico tra i frammenti di DNA amplificati durante la PCR e una
serie di sonde legate covalentemente a una membrana di nylon.Su ogni membrana sono presenti le seguenti sonde:• una sonda per alleli HLA-B*27.• una sonda per il gene HCP5, utilizzato come controllo interno della PCR,• una sonda di controllo della rivelazione.
Queste membrane contengono, inoltre, una linea nera e una rossa per il controllo delposizionamento della striscia durante l’interpretazione dei risultati.
Il rilevamento dei frammenti ibridati con le diverse sonde si esegue utilizzando un coniugato(streptavidina-perossidasi) che si lega a una marcatura di biotina incorporata durante la PCR neiframmenti di DNA amplificato. Dopo l’aggiunta di un substrato della perossidasi (TMB), si genera unprecipitato di colore blu nei siti in cui è avvenuta l’ibridazione.
Come risultato finale del test si ottiene un pattern di bande da interpretare con l'ausilio della strisciadi controllo.
MATERIALI INCLUSI NEL KIT
HLA B27 STRIP Kit 16 tests Kit 48 tests
Membrane 16 tests 48 tests
Vaschetta 8 canali 2 --
Reagenti per PCR Mix di PCR 0,8 ml 1,2 ml x 2
Primer 0,11 ml 0,275 ml
Taq 0,030 ml 0,070 ml
Denaturante 1 ml 1 ml
Tampone di ibridazione 60 ml 125 ml
Tampone di lavaggio 1 100 ml 250 ml
Coniugato 60 ml 125 ml
Tampone di lavaggio 2 130 ml 350 ml
Substrato 30 ml 65 ml
Istruzioni d'uso 1 1
Schema per l'interpretazione 1 1
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Controllo di revelazioneLinea di controllo
Linea di controllo
Control de amplificación
HLA B*27
STRIPS
PL
REAG PCR
REAG PCR MIX
REAG PRIMER
REAG TAQ
SOLN DN
BUF HYB
BUF WASH 1
CONJ HRP
BUF WASH 2
SUBS TMB
MATERIALI NON INCLUSI NEL KITPer l'uso del kit sono necessari, inoltre, i seguenti materiali:1. Microprovette per PCR.2. Micropipette e punte per micropipette (sterili o irradiate con UV e, preferibilmente, con filtro).3. Pinzette e matita (opzionale).4. Cronometro.5. Termometro.
APPARECCHI NECESSARI PER LO SVILUPPO DEL KIT1. Termomixer per piastre
Il kit è stato validato con i termoagitatori: PST-60HL (Biosan S.L.), Profiblot T30 y T48 (Tecan),Autoblot 3000H (medTEC), TENDIGO (Fujirebio), Dynablot Heat (Dynex).
2. TermociclatoreSono stati testati con successo i termociclatori qui di seguito: MJ Mini Gradient Thermal Cycler(BioRad), Mastercycler Personal (Eppendorf), S1000 Thermal Cycler (BioRad), G -Storm GS1(Gene Technologies), GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems), FlexCycler(Analytikjena).
3. BLOTrix S1 or BLOTrix R2 scanner (BioSciTec, opzionale).
PRECAUZIONI1. Tutti i reagenti sono esclusivamente per uso in vitro.2. Seguire rigorosamente le istruzioni fornite. La modifica di qualsiasi punto della procedura o
temperatura può compromettere i risultati del test.3. È essenziale che tutti i materiali utilizzati siano liberi di DNAse. Si consiglia di utilizzare puntali di
pipette con filtro nella preparazione di PCR, per evitare problemi di contaminazione performazione di aerosol. Seguire tutte le normali precauzioni necessarie per l'amplificazione delDNA. Utilizzare materiali autoclavato per il processo di ibridazione / rilevazione.
4. Conservare i componenti del kit nelle condizioni indicate.5. Non scambiare componenti di kit con diverso numero di lotto.6. Non utilizzare i componenti del kit dopo la data di scadenza.7. Le strisce reattive sono monouso.8. La vaschetta in dotazione sono monouso.9. Ogni canale dei vassoi in dotazione è per una sola striscia.10. In caso di rottura della confezione, è possibile utilizzare il prodotto sempreché nessuno dei
componenti risulti danneggiato.11. Il prodotto usato deve essere smaltito in conformità con la legislazione vigente.12. I campioni dei pazienti devono sempre essere considerati come potenzialmente infettivi.
Osservare tutte le norme ambientali e di sicurezza.13. È opportuno che la striscia viene manipolato volta aver utilizzato le stesse considerazioni con il
campione. Si raccomanda di gestirlo come materiale potenzialmente pericolosa.14. La soluzione di denaturazione contiene < 2% di NaOH ed è irritante per gli occhi e per la pelle
(H314 e P280, P305, P351, P338, P310).15. Non gettare il box esterno del kit fino a quando il suo contenuto è stato completamente
utilizzato. Il box esterno contiene le informazioni essenziali per la marcatura CE e per le lotti dicomponenti.
CONSERVAZIONEConservare tutti i reagenti a 2-8 °C. A causa della conservazione a 2-8 °C, in alcune delle soluzioni
(tampone di ibridazione, tamponi di lavaggio 1 e 2, coniugati) potrebbero formarsi dei precipitati. Taliprecipitati si ridisciolgono durante il riscaldamento a temperatura ambiente (coniugato) o a 42 °C(tampone di ibridazione e tamponi di lavaggio 1 e 2).
La data di scadenza di tutti i reagenti è indicata sull'etichetta.
20
CAMPIONIIl materiale di partenza per l’esecuzione del test è DNA a concentrazione nota, che può essere
estratto da sangue (con EDTA o citrato), saliva o tessuti e deve essere di qualità sufficiente perl’amplificazione tramite PCR (R 260/280 >1,5).
Sono stati provati campioni di DNA estratti da sangue con le seguenti procedure:a) Sangue periferico ottenuto da prelievo venoso; estrazione del DNA mediante precipitazione
salina (salting-out).b) Kit di estrazione del DNA di OPERON S.A.: rif 3.149.020.64.000, Kit de estrazione di DNA.
(Rif. 3.149.020.64.000 y 3.149.050.64.000).c) Campione di saliva raccolti ed estratti con il kit "Saliva DNA collection, isolation and purification
kit" di Norgen Biotek.d) Campioni di DNA purificati da sangue periferico con l'estrattore automatico Qiacube di Qiagen
utilizzando il kit QIAamp DNA Blood MiniKit (Qiagen).e) Campioni di DNA purificati da sangue periferico con l'estrattore automatico AmpliPrep (Roche)
utilizzando il kit TNAI (Roche).
Se i campioni di DNA verranno analizzati in breve tempo, conservarli a 2-8°C; per unaconservazione prolungata mantenerli a -20 °C.
PROCEDURA DI HLA B27 STRIP1.- Reazione a catena della polimerasi
Preparazione delle PCRImportante: prima di aprire i flaconi con i reagenti PCR, centrifugare brevemente. Questo assicurerà chetutto il contenuto sarà al fondo del flacone.
• Preparare le provette per PCR necessarie in base al numero di campioni di DNA da amplificare.• Aggiungere in ciascuna provetta per PCR: 39 µl di premix di PCR + 5 µl di primer + 1 µl di Taq
+ 5 µl di ADN (50 ng/µl). Mescolare bene. Se possibile, mantenere i reagenti e le mix a 2-8 °Cdurante la preparazione.In caso di amplificazione di più campioni di DNA, si consiglia di preparare una mix comunecontenente tutti i reagenti, in modo da aggiungere poi 45 µl di mix + 5 µl di DNA (50 ng/µl).Ad esempio:
Nº di PCR Premix di PCR Primer Taq
1 39 µl 5 µl 1 µl
3 136,5 µl 17,5 µl 3,5 µl
5 214,5 µl 27,5 µl 5,5 µl
8 351 µl 45 µl 9 µl* Le mix contenenti tutti i reagenti per la PCR devono essere preparate sempre ineccesso, per compensare le perdite di volume che si verificano durante la pipettatura.
Secondo la buona pratica di laboratorio, l'utente deve inoltre amplificare un controllo negativo(acqua o tampone TE, per esempio) e, se necessario, un controllo positivo (non incluso nel kit).
AmplificazioneConsiderate l'importanza di ottenere una adeguata concentrazione del DNA per ottenere un risultato
corretto. Inserire le provette nel termociclatore (se necessario, aggiungere 1 goccia di olio Nujol su ogni
reazione di PCR) e amplificare il DNA con il seguente programma:
21
96 ºC, 5 min35 cicli di: 96 ºC, 30 seg
61 ºC, 30 seg 72 ºC, 30 seg
72 ºC, 5 min4 ºC
Verifica della PCRSe opportuno, è possibile verificare il risultato della PCR su gel di agarosio al 2,5 %. A tal fine,
applicare 5 µl di ciascuna reazione di PCR in un pozzetto del gel. Eseguire l'elettroforesi a 100 V per 80min e osservare agli UV. Di seguito sono indicate le dimensioni dei diversi possibili prodotti diamplificazione:
HCP5: 149 pbHLA B*27: 190 pb
Una volte terminata la PCR, continuare con lo sviluppo della striscia. Se i campioni non vengonoanalizzati immediatamente, conservarli a 2-8 °C per non più di 24 ore. In caso di conservazioneprolungata, congelarli a -20 °C.
→ Vedere le schema di preparazione della PCR nell'allegato
2.- Sviluppo della striscia Su richiesta, l'azienda fornirà all'utente la procedura di lavoro dependendo dello strumento che verràutilizzato per lo sviluppo delle strisce (PST-60HL, Profiblot, Autoblot 3000H, TENDIGO o DynablotHeat). In alternativa, è possibile consultare il seguente indirizzo web:
http://www.operon.es/products/protocols.Nel denaturazione fase, 12,5 µl di denaturazione buffer + 12,5 µl di PCR verrà erogata nel
vassoio.Il prodotto è stato testato con diverse piattaforme di lavoro. Per vostra informazione si
specificano i nomi commerciali delle piattaforme di lavoro utilizzate ma non implica l'uso esclusivo edipendente di tali marchi commerciale. Il prodotto funziona correttamente durante l'utilizzo di unapiattaforma che garantisce il programma di temperatura sollevata per il prodotto.
→ Vedere il sviluppo della striscia nell'allegato
3.- Interpretazione della strisciaInterpretazione della striscia puó essere fatta visivamente, usando il schema per l'interpretazione
incluso nel kit (vedere la procedure per ogni strumento) o automaticamente, utilizzando gli scannerBLOTrix R2 o BLOTrix S1 (BioSciTec).
Su richiesta, l'azienda fornirà all'utente le istruzioni per l'interpretazione automatica delle strisce conscanner (DO-09053002 “Instructions of use BLOTrix R2_S1”). In alternativa, è possibile consultare ilseguente indirizzo web:
http://www.OPERON, S.A..es/es/products/protocols.Importante: l'interpretazione automatica del risultato richiede sempre una verifica visiva delle strisce;
bande molto deboli non potrebbero essere rilevate dallo strumento.
RISULTATILa strip può mostrare i seguenti risultati:
• Negativo per HLA-B*27: comparirà la banda corrispondente al controllo dell'amplificazione(HCP5), insieme alla banda di controllo dello sviluppo.
22
• Positivo per HLA-B*27: compariranno le bande corrispondenti al controllo dell'amplificazione(HCP5) e a HLA-B*27, insieme alla banda di controllo dello sviluppo.
• Non valido: dovranno essere considerate non valide tutte le determinazioni nelle quali noncompaia la banda corrispondente al controllo dell'amplificazione (a indicare problemi durantel'amplificazione mediante PCR). Analogamente, non saranno valide le determinazioni nelle qualinon compaia alcuna banda, compresa la banda di controllo dello sviluppo.
La figura seguente mostra i possibili risultati che possono essere ottenuti con il kit HLA B27 Strip:
CONTROLLO DI QUALITÀLa linea di controllo della rivelazione deve comparire sempre al di sopra della linea nera superiore.
La sua eventuale assenza indicherà un problema nella fase di ibridazione/rivelazione del prodotto.La strisce corrispondente al controllo de amplificazione negativo mostrerá soltanto la banda di
controllo di rivelazione. La banda riferita al controllo interno di amplificazione (HCP5) deve esserepresente in tutti i campioni analizzati (HCP5). La sua eventuale assenza indicherà un problema nellafase di amplificazione del DNA (assenza di DNA, DNA in cattive condizioni, problemi nella PCR).
PRESTAZIONI / VALUTAZIONI INTERNE ED ESTERNEQuesto test deve essere utilizzato esclusivamente da professionisti qualificati e familiarizzati con i
metodi di biologia molecolare.Il test è stato valutato con campioni di DNA di pazienti sottoposti a fenotipizzazione e
genotipizzazione mediante altri metodi, nonché con campioni di DNA forniti dall'InternationalHistocompatibility Working Group. I risultati ottenuti sono stati soddisfacenti e sono mostrati di seguito:
• Valutazione della sensibilità e della specificità con campioni forniti dall'InternationalHistocompatibility Working Group (IHWG).La sensibilità/specificità del test HLA B27 Strip è stata valutata mediante l'analisi di un totale di 58 campioni forniti dall'IHWG con genotipo determinato tramite sequenziamento o SSP. È stata ottenuta una concordanza di sensibilità e specificità del 100%.
• Valutazione della sensibilità e della specificità con campioni tipizzati mediante citometria aflusso.È stato valutato un totale di 99 campioni di sangue caratterizzati mediante citometria a flusso econ il test GenoQuick HLA-B*27 (campioni dubbi dopo citometria). È stata ottenuta unaconcordanza di sensibilità e specificità del 100%.
23
Controllo di revelazioneLinea di controllo
Linea di controllo
Non valido
Controllo dell'amplificazione
HLA B*27
Negativo Positivo
• Valutazione della sensibilità e della specificità con campioni tipizzati mediante citometria aflusso eseguita nei laboratori CatLab (Terrassa).È stato valutato un totale di 100 campioni di sangue caratterizzati mediante citometria a flusso emediante PCR in tempo reale utilizzando il kit Fluorotype HLAB27 di Hain Lifesciences(campioni dubbi dopo citometria). È stata ottenuta una concordanza di sensibilità e specificitàdel 100%.
POSSIBILI PROBLEMI1. Sulla striscia non compare alcuna banda, nemmeno quella di controllo.
• Non si è atteso che il coniugato e/o il rivelatore raggiungessero la temperatura ambiente.• Il coniugato e/o il rivelatore non sono stati aggiunti o sono stati aggiunti in quantità insufficiente.
2. Compare solo la linea della sonda di controllo.• Errore di amplificazione nella PCR (eseguire un controllo su gel di agarosio).• Durante la fase di ibridazione il prodotto di PCR non è stato aggiunto o è stato aggiunto in
quantità insufficiente.• Temperatura non corretta del tampone di ibridazione/lavaggio 1 (superiore a quella indicata).• Temperatura non corretta dell’incubatore (superiore a quella indicata).
3. Forte colore di fondo sulla striscia dopo la fase di rivelazione.• La procedura di lavaggio non è stata eseguita correttamente (durata troppo breve, quantità di
tampone insufficiente, tamponi freddi).
4. Colorazione non omogenea della striscia.• Agitazione inadeguata (controllare la programmazione del termomixer per piastre).• Le strisce non sono rimaste completamente sommerse durante le incubazioni.
5. Risultati inattesi.• Temperatura di incubazione e/o dei tamponi/reagenti non corretta• Contaminazione nelle PCR (verificare con un controllo negativo).• Contaminazione di canali adiacenti dovuta al passaggio di liquido da un canale all'altro durante
l'aggiunta del tampone di ibridazione.
È stato valutato il funzionamento del test modificando la temperatura della fase diibridazione/rivelazione tra 39 e 45 °C. E’ stato osservato che il test fornisce prestazioni adeguate tra 39e 45°C. Tuttavia la temperatura ottimale è di 42°C; si raccomanda quindi di mantenere e controllareattentamente la temperatura di esercizio.
SENSIBILITÀ È stata valutata con vari lotti la quantità minima di DNA puro necessaria per eseguire una corretta
genotipizzazione con il kit HLA B27 Strip. I risultati ottenuti hanno mostrato che la quantità minima diDNA nella PCR con cui è possibile ottenere risultati perfettamente leggibili è di 1 ng. Con quantitàinferiori si ottengono bande molto deboli, che in alcuni casi sono difficili da visualizzare.
Sono state calcolate la sensibilità e la specificità teoriche del kit tenendo conto di tutti gli alleli HLA-B descritti dall'International Histocompatibility Working Group (108 alleli B*27 e 2332 alleli nonB*27. Agosto 2012).
Sensibilità teorica (alleli HLA B*27 teoricamente rilevati rispetto agli alleli HLA B*27 totali): 97,2 %.Specificità teorica (alleli non HLA B*27 teoricamente rilevati rispetto agli alleli HLA B totali): 99,7 %.
24
Alleli Total Alleli Total Alleli Total
B07 195 B41 24 B54 27
B08 105 B42 17 B55 68
B13 70 B44 197 B56 40
B14 39 B45 14 B57 71
B15 296 B46 39 B58 46
B18 87 B47 10 B59 6
B27 108 B48 31 B67 4
B35 264 B49 22 B73 2
B37 41 B50 17 B78 9
B38 48 B51 125 B81 5
B39 91 B52 42 B82 3
B40 241 B53 35 B83 1
EFFETTO HOOKIl funzionamento del kit HLA B27 Strip è stato comprovato in presenza di quantità crescenti di DNA
(fino a 1500 ng). Non sono stati osservati effetti di inibizione della PCR, né di riduzione dell’intensitàdelle bande ottenute, né comparsa di problemi di reazioni crociate. Non si verifica, pertanto, alcuneffetto Hook.
PRECISIONE INTRASAGGIO La precisione Intrasaggio è stata verificata analizzando 5 replicati di 16 DNA diversi con 3 lotti di
prodotto HLA B27 Strip. L’analisi è stata realizzata dalla stessa persona e sono stati ottenuti risultatiidentici per i replicati in tutti i casi, a dimostrazione dell’alta precisione intrasaggio di HLA B27 Strip.
PRECISIONE INTERGIORNALIERASono stati analizzati 15 campioni di DNA, ciascuno in duplicato, con 1 lotto di prodotto HLA B27
Strip in 5 giorni consecutivi. L’analisi è stata realizzata dalla stessa persona e i risultati ottenuti perciascun DNA sono stati uguali in tutti i casi, a dimostrazione dell’alta precisione intergiornaliera del kit
PRECISIONE INTERLABORATORIOTre persone hanno analizzato 15 campioni di DNA in duplicato con un lotto di HLA B27 Strip.
L’analisi è stata realizzata lo stesso giorno e i risultati ottenuti sono stati identici, a dimostrazionedell’alta precisione interlaboratorio di HLA B27 Strip.
PRECISIONE INTERLOTTOSono stati analizzati 16 campioni di DNA in triplicato con tre lotti di prodotto HLA B27 Strip. L’analisi
è stata realizzata dalla stessa persona nello stesso giorno e sono stati ottenuti risultati identici con tutti ilotti, a dimostrazione dell’alta precisione interlotto di HLA B27 Strip.
25
BIBLIOGRAFÍA / REFERENCES / BIBLIOGRAFIA1. Van der Berg R. "How should we diagnose spondyloarthritis according to the ASAS classification
criteria". Polskie Archiwum Medycyny Wewnethznej (2010). 120 (11): 452-457.2. Brown M.A. "HLA Class I associations of ankylosing spondylitis in the white population in the
United Kingdom". Annals of the rheumatic disease (1996). 55: 268-270.3. Monnet D. et al. "Ophthalmic findings and frequency of extraocular manifestations in patients
with HLA-B27 uveitis: a study of 175 cases. Opthalmology (2004). 111 (4): 802-809.4. Di Lorenzo A.L. "HLA B27 Syndromes". MedScape. emedicine.medscape.com/article/1201027-
overview.
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ANEXO / ANNEX / ALLEGATO
Esquema de preparación de PCR / PCR preparation diagram / Schema di preparazione della PCR
Desarrollo de la tira / Strip developing diagram / Sviluppo della striscia
Interpretación de resultados / Reading of results / Lettura dei risultati
+ 2 ml tampón hibridación/ hybridization buffer /
tampone di ibridazione (42 ºC)
30 min 10 min
+ 2 ml tampón lavado 1 / wash buffer 1/
tampone di lavaggio 1 (42 ºC)
30 min 5 min
+ 2 ml tampón lavado 2wash buffer 2 /
tampone di lavaggio 2(42 ºC)
+ 2 ml conjugado /conjugate / coniugato
(Tª amb/room Tª)
5-10 min
+1 ml substrato / substrate
(Tª amb/room Tª) +Agua / water / acqua
42 ºC450 rpm
42 ºC
42 ºC 42 ºC 42 ºC
450 rpm
450 rpm 450 rpm 450 rpm
x 2
x 3
+ X ul desnaturalizante/denaturing/denaturante
+ X ul PCR
10 min
42 ºC
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Fecha de caducidad / Expiration date / Data di scadenza
Número de lote / Lot number / Numero di lotto
Uso diagnóstico in vitro / For in vitro diagnostic use / Per uso diagnostico in vitro
Este producto cumple con las exigencias de la Directiva 98/79/EC sobre los productos
sanitarios para diagnóstico in vitro / This product fulfills the requirements of Directive
98/79/EC on in vitro diagnostic medical device / Questo prodotto soddisfa i requisiti
della Direttiva 98/79/CE relativa a dispositivi medico-diagnostici in vitro.Número de catálogo / Catalogue number / Numero di catalogo
Leer instrucciones de uso / Please read pack inserts / Leggere le istruzioni d’uso
Fabricado por / Manufactured by / Prodotto da
Contenido suficiente para <n> ensayos / Contents sufficient for <n> tests / Contenuto
sufficiente per <n> saggi
Conservar a / Store at / Conservare a
Precaución / Caution / Precauzione
Reactivo corrosivo / Corrosive reagent / Reagente corrosivo
DO-09051018 Rev.6– 25.10.2018
OPERON, S.A. - Camino del Plano, 19 - E-50410 Cuarte de Huerva - (Zaragoza) – SPAIN
+ 34 976 503597
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