hla 高分辨分型技术及应用
DESCRIPTION
HLA 高分辨分型技术及应用. 刘 湘. 博奥生物有限公司 HLA 服务部主任 生物芯片北京国家工程研究中心. 二零一三年八月二十七日. 公司 +国家工程研究中心模式. 2000 年 9 月 30 日在国家发改委、科技部、卫生部、教育部和北京市政府的大力支持下以清华大学和医科院等单位为依托发起成立了 : 博奥生物暨生物芯片北京国家工程研究中心。. 博奥 HLA 基因分型芯片系统. 每个点阵 2500 份样品. 2006 年,博奥 HLA 基因 分型芯片 系统开始承担中华骨髓库分型任务。. 3. 博奥 HLA 高分辨分型系统. - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
1
HLA 高分辨分型技术及应用
博奥生物有限公司 HLA 服务部主任生物芯片北京国家工程研究中心
刘 湘
二零一三年八月二十七日
公司+国家工程研究中心模式
2000 年 9 月 30 日在国家发改委、科技部、卫生部、教育部和北京市政府的大力支持下以清华大学和医科院等单位为依托发起成立了 : 博奥生物暨生物芯片北京国家工程研究中心。
3
每个点阵 2500 份样品
博奥 HLA 基因分型芯片系统
2006 年,博奥 HLA 基因分型芯片系统开始承担中华骨髓库分型任务。
4
博奥 HLA 高分辨分型系统
2009 年,博奥 HLA 高分辨分型系统开始承担中华骨髓库高分入库任务。
5
• SSO ( sequence specific oligonucleotide ):针对HLA 基因多个多态性位点设计出一整套等位基因组特异性探针。
• SSP ( sequence specific primer ):针对 HLA 基因多个多态性位点设计出一整套等位基因组特异性引物,扩增HLA 基因特异片段。
• SBT ( Sequencing Based Typing ): PCR 扩增所要分析的 HLA 基因片段,然后对 HLA 基因片段进行测序,对测序结果进行分析,可以直接得到高分基因型。
HLA 高分辨分型技术分类
6
HLA 基因高度复杂性• HLA 基因是人类基因中最复杂的基因复合体。高度的多态 性、高 GC 含量、高度的同源性。
Gene A B C DRB1 DQB1 总计Alleles 2,244 2,934 1,788 1,317 323 8,606
Gene A B C DRB1 DQB1 总计Heterozygous Ambiguities 16,093 28,592 12,224 21,675 285 78,869
• HLA 基因间高度的同源性和多态性导致测序分型时产 生大量的模棱两可基因组合。
http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla
7
难点 1 :等位基因有效扩增CGATAT
ACGTGACGGTTCTTTGCTATACG
TGCCAAGDNA 聚合酶
GACCACTGAGACCACGTA
DNA 聚合酶
DNA 聚合酶
等位基因1 扩增失败
等位基因 2
等位基因 1扩增效率低
等位基因 2
• 选择等位基因保守序列区域以及 HLA 基因位点间同源性低的区域设计引物。• 引物设计上考虑 HLA 基因特异扩增同时,保证等位基因扩增的均一性。• 采用多种 PCR 扩增策略,有效扩增 HLA 基因。
8
等位基因有效扩增策略
9
HLA 基因等位基因扩增
10
难点 2 :模棱两可等位基因组合区分样品 1B*15:01:01 B*46:12B*15:07:01 B*46:01:01
样品 2A*03:01:01 A*33:03:01A*03:103 A*33:18A*03:133 A*33:28
样品 3A*02:06:01 A*11:01:01A*02:06:09 A*11:01:34A*02:79:01 A*11:73A*02:142 A*11:24:02A*02:331 A*11:06
样品 1B*15:07:01 B*46:01:01
样品 2A*03:01:01 A*33:03:01
样品 3A*02:06:01 A*11:01:01
模棱两可等位基因组合 确定的等位基因组合
等位基因 1
等位基因 2
CAAA CC
T GTT GG
11
模棱两可等位基因组合CT
TT C
C
A GAA GG
等位基因 1
等位基因 2
NN(A/T)NN--------------NN(C/G)NN = NN(A/T)NN--------------NN(C/G)NN
NNTNN----------------NNGNN
NNANN----------------NNCNN
NNANN----------------NNGNN
NNTNN----------------NNCNN
分离等位基因(单倍型)
12
基于 SSP 和 SSO 原理解决方案
AGC CT TC AG
TA
G
G CC
T GGGG CC T
AAGCC DNA 聚合酶 AG
CT
AGC CT TC AGTA
G
--------G GGT GGGG CC
A
TGAAGAGC CC TC AGGT GGGG CCTGAAG
特异性引物
特异性探针
3'5' 5'
等位基因 1
HLA 基因扩增子
基于二代测序解决方案
油相 水相
焦磷酸测序 半导体测序
等位基因 2
等位基因 1
等位基因 2
CAAA CC
T GTT GG
14
读长与模棱两可问题解决关系CT
TT C
C
A GAA GG
等位基因 1
等位基因 2
270bp
适合 HLA 分型的二代测序平台454 : 400~800bp Ion Torrent : 400bpMiSeq : 2X250~300bp PacBio : ~5Kb
15
博奥 HLA 分型
16
博奥 HLA 分型的特点
技术特点 质量特点
17
技术特点• 高精度:解决等位基因杂合歧义、外显子多态性位点导致的模棱两可 ( Ambiguous Allele Combinations) 的问题。• 高准确性:采用多种策略有效避免 HLA 多态性影响,以及独特的 GSSP 引物设计、 GSSP 分型软件,保证 HLA 高分辨分型的准确性。• 高通量:博奥 HLA 高分分型可达 96,000 份样品 / 年。
操作系统 Mac OS Windows Linux
18
HLA GSSP 分型软件
跨操作系统虚拟机 Java
测序峰图识别模块 序列比对模块 引物筛选模块 分型模块
图形用户界面
高通量、高准确性、高精度
19
HLA GSSP 分型软件
20
HLA GSSP 分型软件
二代测序 -HLA 高分辨分型
测序数据分析
目标基因富集 文库制备 “ 油包水” PCR
22
HLA 基因位点平均 reads 数
8 通道 PTP 板每个通道的 HLA 基因位点平均reads 数
reads 数:测序读取序列数量
23
等位基因之间的 reads 数比例 HLA-A All reads
Allele1/Allele1+Allele2
HLA-CAll Allele1/
Allele1+Allele2reads
sample01 A*020101 ,A*110101 951 54.05% C*010201,
C*070201 849 45.35%
sample02 A*240201 ,A*240201 1058 100.00% C*050101,
C*070201 844 48.93%
sample03 A*0202,A*3601 1300 54.31% C*040101,
C*0718 1083 43.49%
sample04 A*2301,A*320101 813 51.17% C*040101,
C*0804 731 58.28%
sample05 A*010101,A*0207 1022 44.62% C*060201,
C*080101 1125 53.73%
sample06 A*110101,A*240201 707 43.42% C*030401,
C*070101 1183 50.38%
sample07 A*010101,A*020301 1414 40.45% C*030401,
C*060201 1252 45.45%
sample08 A*3402,A*7401 1276 52.51% C*040101,
C*070101 1116 45.61%
sample09 A*300201,A*3601 1220 53.52% C*040101,
C*070101 1199 46.71%
项目 时间 质控样品数 准确率
中华骨髓库历年质控
2006-2012 年 连续 7 年 4523 99.99%
美国 UCLA 能力验证活动
2005-2012 年参加 18次 108 100%
“HLA 分型质量控制标本鉴定”室间质控
2006-2010 年参加 9次 74 100%
连续 7 年的 2% 骨髓库分型样品抽检准确率达 99.99% 。18 次美国 UCLA DNA Exchange 实验室 HLA 分型能力验证活动,正确率均达到 100% 。连续 9 次参加卫生部临检中心的“ HLA 分型质量控制”室间质控,正确率均达到 100% 。
质量特点
质控报告
样品准备与运输•根据《生物样品质控及运输要求》用于指导样品的前期准备及运输条件;《样品检测需求单》用于您提出对样品或检测的要求
样品储存和管理•样品管理库能够有效记录样品位置,建立样品名片;超大的存储空间,规范的存储设施保证了样品的安全、有效
实验操作严格遵照 SOP--双人复核
•60 个 SOP 文件涵盖样品质检、测序实验、数据分析、仪器操作、环境控制等全部过程;关键步骤采取双人复核的方式,确保无误
QC层层把关•样品 QC 、原材料 QC 、检测结果 QC 、内部抽检等多重质控,检测报告严格的审核、批准过程确保数据质量
结果报告发送•数据经过专业的软件分析;结果报告经过层层复核、确认,可保证数据的不可修改、完整及保密要求
样品 QC
引物 QC
正常批次样品 抽检样品AX8214
C*03:03 C*07:02 TRUE AX8214-
RC*03:03 C*07:02
AX8363
C*01:02 C*03:02 TRUE AX8363-
RC*01:02 C*03:02
内部抽检
质量控制流程
培训及考核、SOP文件、过程质控、实验监督、内部抽检
基因扩增 插入质控品,并设空白对照,样品双人核对并拍照存档
进一步实验结果确定
结果确定
质谱、 CE检测,引物验证实验
引物合成结果不确定
测序反应 测序产物纯化
测序 数据收集,软件分型
样品接收、整理
电泳检测
27
质量控制流程
2727
质谱、 CE 检测,引物验证实验
引物合成
DNA 提取 、 分装
扩 增 产 物纯化
电泳检测
比较质控品结果
比较质控品结果
结果报告
双人复核
仪器校准
分区管理
28
博奥 HLA 实验室获得实验室认可
29
126688
93735低分辨分型高分辨分型
HLA 分型总样品数超过 22万份
从 2006 年至今,博奥 HLA 分型实验室已完成中华骨髓库超过 22万份样品的 HLA 分型检测。
HLA 分型总样品数
30
HLA新基因型
博奥已发现 35 个 HLA新基因型,并得到 WHO命名委员会( WHO Nomenclature Committee )的命名。
肿瘤个体化医疗( EGFR 、 KRAS 等) 遗传病致病基因检测
31
一代测序平台应用
二代测序平台应用 致病微生物基因组测序 遗传病致病基因检测 肿瘤个体化医疗
一代、二代测序平台应用
32
谢谢!博奥生物有限公司(生物芯片北京国家工程研究中心)北京市昌平区生命科学院路 18 号邮编: 102206电话 : 86-10-8071 5888 / 8072 6868传真 : 86-10-8072 6898