h.j. vollenweider, th. koller, j. parello and j.m. sogo- superstructure of linear duplex dna

8/3/2019 H.J. Vollenweider, TH. Koller, J. Parello and J.M. Sogo- Superstructure of linear duplex DNA

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P r o c . N a t i . A c a d . S c i . USAV o l . 7 3 , N o . 1 1 , p p . 4 1 2 5 - 4 1 2 9 , N o v e m b e r 1 9 7 6C e l l B i o l o g y

S u p e r s t r u c t u r e o f l i n e a r d u p l e x DNA( e l e c t r o n m i c r o s c o p y / a n a l y t i c a l u l t r a c e n t r i f u g a t i o n / c i r c u l a r D N A / b e n z y l d i m e t h y l a l k y l a m m o n i u m c h l o r i d e - s p r e a d i n g m e t h o d /e t h i d i u m b r o m i d e )

H . J . V O L L E N W E I D E R * , T H . K O L L E R * , J . P A R E L L O t , AND J . M . S O G O t* I n s t i t u t f u r Z e l l b i o l o g i e , E i d g e n 6 s s i s c h e T e c h n i s c h e H o c h s c h u l e , Z u r i c h , S w i t z e r l a n d ; t E q u i p e d e r e c h e r c h e 1 4 0 , C . N . R . S . , U n i v e r s i t 6 d u L a n g u e d o c ,M o n t p e l l i e r , F r a n c e ; a n d t I n s t i t u t o d e B i o l o g i a C e l u l a r , C . S . I . C . , M a d r i d , S p a i nC o m m u n i c a t e d b y A . F r e y - W y s s l i n g , S e p t e m b e r 7 , 1 9 7 6ABSTRACT T h e s u p e r s t r u c t u r e o f a c o v a l e n t l y c l o s e d c i r -c u l a r DNA ( o f b a c t e r i o p h a g e PM 2 ) w a s c o m p a r e d b y e l e c t r o nm i c r o s c o p y w i t h t h a t o f a l i n e a r d u p l e x DNA ( o f b a c t e r i o p h a g eT 7 ) w h e n i o n i c s t r e n g t h a n d b e n z y l d i m e t h y l a l k y l a m m o n i u mc h l o r i d e c o n c e n t r a t i o n w e r e v a r i e d . I n p a r a l l e l s t u d i e s t h es e d i m e n t a t i o n b e h a v i o r o f t h e s e DNAs w a s s t u d i e d b y a n a l y t -i c a l u l t r a c e n t r i f u g a t i o n , b u t f o r t e c h n i c a l r e a s o n s t h e s e h a d t ob e w i t h o u t b e n z y l d i m e t h y l a l k y l a m m o n i u m c h l o r i d e . B y c o m -b i n i n g t h e i n f o r m a t i o n f r o m t h e t w o m e t h o d s o n e h a s t o c o n -c l u d e t h a t w i t h i n c r e a s i n g i o n i c s t r e n g t h t h e l i n e a r d u p l e x T 7DNA s p o n t a n e o u s l y f o r m s a s t r u c t u r e s i m i l a r t o t h a t o f t h e s u -p e r h e l i c a l s t r u c t u r e o f c l o s e d c i r c u l a r PM 2 D N A . T h e s u p e r -

s t r u c t u r e i s d e s t r o y e d u n d e r p r e m e l t i n g c o n d i t i o n s a n d i n t h ep r e s e n c e o f a n e x c e s s o f e t h i d i u m b r o m i d e .T h e d e t e r m i n a t i o n o f t h e s t r u c t u r e o f D N A i n s o l u t i o n h a s b e e nt h e s u b j e c t o f numerous s t u d i e s . From s e d i m e n t a t i o n a n a l y s e si t i s k n o w n t h a t t h e s t r u c t u r e o f l i n e a r d u p l e x D N A i s d e p e n d e n ton i o n i c s t r e n g t h ( 1 - 4 ) . C o v a l e n t l y c l o s e d c i r c u l a r d u p l e x DNAw i t h d i f f e r e n t d e g r e e s o f s u p e r c o i l i n g s h o w s a very c o m p l e xs e d i m e n t a t i o n b e h a v i o r w h e n t h e c o u n t e r i o n a n d i o n i c s t r e n g t hare v a r i e d ( 5 - 8 ) . M o l e c u l a r d i m e n s i o n s h a v e a l s o b e e n g a u g e db y v i s c o s i m e t r y ( 4 , 9 ) a n d l i g h t s c a t t e r i n g ( 1 0 , 1 1 ) . Y e t t h e r e i ss t i l l c o n s i d e r a b l e d i s a g r e e m e n t i n t h e l i t e r a t u r e w h e n i t comest o d e t e r m i n i n g j u s t h o w e x t e n d e d a l i n e a r d u p l e x DNA m o l e -c u l e i s i n s o l u t i o n a n d t o w h a t e x t e n t t h e i o n i c s t r e n g t h i n f l u -ences t h e c o i l d i m e n s i o n s . I n o r d e r t o l e a r n more a b o u t t h es t r u c t u r e o f l i n e a r d u p l e x DNA m o l e c u l e s i n s o l u t i o n , wec o m p a r e d , b y e l e c t r o n m i c r o s c o p y a n d a n a l y t i c a l u l t r a c e n -t r i f u g a t i o n , t h e l i n e a r D N A o f b a c t e r i o p h a g e T 7 ( 1 2 ) w i t h DNAo f b a c t e r i o p h a g e PM 2 , w h i c h i s t h e most t i g h t l y s u p e r c o i l e dDN A k n o w n ( 1 3 ) .

MATERIALS AND METHODSM a t e r i a l s . B e n z y l d i m e t h y l a l k y l a m m o n i u m c h l o r i d e ( B A C )was a g i f t f r o m B a y e r , L e v e r k u s e n , G e r m a n y , a n d was u s e df r o m a s t o c k s o l u t i o n ( 1 4 ) i n f o r m a m i d e . E t h i d i u m b r o m i d e( E t d B r ) was o b t a i n e d f r o m S i g m a ( S t . L o u i s , M o . ) . A l l o t h e rc h e m i c a l s were p u r c h a s e d f r o m M e r c k , D a r m s t a d t , G e r m a n y .P h e n o l - e x t r a c t e d D NA f r o m p u r i f i e d E s c h e r i c h i a c o l i b a c -t e r i o p h a g e T 7 was a g i f t f r o m D r . R . P o r t m a n n . DNA f r o mb a c t e r i o p h a g e PM 2 ( c o n t a i n i n g over 90% f o r m I , c o v a l e n t l yc l o s e d c i r c u l a r DNA) was g i v e n t o us b y D r . W. A r b e r . H e a v ym e t a l i o n s were r e m o v e d b y t h e a d d i t i o n o f ED T A t o t h e d i -a l y s i s b u f f e r . DN A was d i s s o l v e d i n a b u f f e r c o n t a i n i n g 3 0 mMt r i e t h a n o l a m i n e - a c e t a t e a t pH 7 . 9 a n d s o d i u m a c e t a t e a t con-c e n t r a t i o n s b e t w e e n O - 3 M a n d 2 M .

A b b r e v i a t i o n s : s u p e r s t r u c t u r e , s t r u c t u r e f o r m e d b y f o l d i n g o f a d u p l e xDNA m o l e c u l e ; B A C , b e n z y l d i m e t h y l a l k y l a m m o n i u m c h l o r i d e ( n -a l k y l m i x t u r e : C 1 2 H 2 5 6 0% a n d C G 4 H N 4 0 % ) ; E t d B r , e t h i d i u m b r o -m i d e ; f o r m I PM 2 DNA, t h e c o v a l e n t l y c l o s e d c i r c u l a r f o r m o f DNAo f b a c t e r i o p h a g e PM 2 ; f o r m II PM 2 DNA, c i r c u l a r f o r m w i t h one ormore s i n g l e - s t r a n d c h a i n s c i s s i o n s .

4 1 2 5

E l e c t r o n M i c r o s c o p y . DNA ( 0 . 2 A s g / m l ) w a s a d s o r b e d t oc a r b o n - c o a t e d g r i d s b y t h e B A C - d r o p l e t m e t h o d ( 1 4 ) . T h e B ACc o n c e n t r a t i o n w a s v a r i e d i n d i f f e r e n t e x p e r i m e n t s . I n c o n t r o le x p e r i m e n t s t h e d r o p l e t m e t h o d w i t h 1 2 5 , g g / m l o f E t d B r ( 1 5 )was u s e d . A f t e r a d s o r p t i o n o f t h e DNA s t r a n d s , t h e s p e c i m e n sw e r e f l o a t e d o n r e d i s t i l l e d w a t e r f o r 1 0 m i n , d e h y d r a t e d i n 9 0 %e t h a n o l , a n d d r i e d o n f i l t e r p a p e r . T h e g r i d s w e r e r o t a r ys h a d o w e d a t a n a n g l e o f 7 0 w i t h 1 1 0 0 Hz c a r b o n p l a t i n u m f r o ma n e l e c t r o n g u n ( 1 6 ) .I n o r d e r t o e l i m i n a t e t h e p o s s i b i l i t y t h a t t h e DNA s t r u c t u r eo b s e r v e d i n t h e e l e c t r o n m i c r o s c o p e m i g h t b e d u e t o t h e e t h a n o lt r e a t m e n t o f t h e g r i d s ( s e e r e f . 1 7 ) , we m a d e s e v e r a l e x p e r i -m e n t s w i t h a n d w i t h o u t e t h a n o l d e h y d r a t i o n i n p a r a l l e l . S i n c en o d i f f e r e n c e w a s f o u n d , we r e t a i n e d t h e e t h a n o l s t e p , s i n c e i tg i v e s a s m o o t h e r b a c k g r o u n d a n d t h u s a b e t t e r c o n t r a s t f o r t h eDNA m o l e c u l e s .A n a l y t i c a l U l t r a c e n t r i f u g a t i o n . A n MS E u l t r a c e n t r i f u g e( 1 9 6 8 m o d e l ) w a s u s e d w i t h a f o u r c e l l r o t o r , u l t r a v i o l e t a b -s o r p t i o n o p t i c s , a n d a s c a n n i n g d e v i c e f o r d i r e c t r e c o r d i n g o fa b s o r b a n c e . B o u n d a r y s e d i m e n t a t i o n v e l o c i t y e x p e r i m e n t s w e r ep e r f o r m e d a t 3 5 , 0 0 0 r p m , 2 0 0 C , a n d DNA c o n c e n t r a t i o n s o fa b o u t 0 . 5 A o / m l , b y a m e t h o d s i m i l a r t o t h a t d e s c r i b e d i n r e f .1 8 . S e d i m e n t a t i o n c o e f f i c i e n t s s 2 0 w e r e m e a s u r e d b y s t a n d a r dp r o c e d u r e s a n d w e r e c o r r e c t e d f o r v i s c o s i t y e f f e c t s . F o r m I I PM2 DNA ( c i r c u l a r , w i t h o n e o r m o r e s i n g l e - s t r a n d c h a i n s c i s s i o n s )

n e v e r e x c e e d e d 4 0 % o f t h e t o t a l .RESULTSI n o r d e r t o i n v e s t i g a t e t h e i n f l u e n c e o f B AC o n t h e a p p e a r a n c eo f t h e DNA m o l e c u l e s i n t h e e l e c t r o n m i c r o s c o p e , we v a r i e dt h e B A C c o n c e n t r a t i o n b e t w e e n 1 X 1 0 - 5 a n d 5 X 1 0 - 2 %( w t / v o l ) . B e l o w 2 X 1 0 - 4 % B A C , t h e n u m b e r o f DNA m o l e -c u l e s b o u n d t o t h e s u p p o r t f i l m d e c r e a s e d u n t i l a t 1 X 1 0 - 5 %n o m o r e m o l e c u l e s w e r e a d s o r b e d . T h i s w a s t r u e i n d e p e n d e n to f t h e i o n i c s t r e n g t h t e s t e d . B e t w e e n 2 X 1 0 - 4 a n d 1 X 1 0 - 2 %B A C t h e a m o u n t o f a d s o r b e d DNA r e m a i n e d r o u g h l y c o n s t a n t ,g i v i n g r e p r o d u c i b l e b i n d i n g o f m o l e c u l e s t o t h e s u p p o r t f i l m .H i g h B AC c o n c e n t r a t i o n s w e r e c h a r a c t e r i z e d b y t h e p r e s e n c eo f h i g h l y c o m p a c t e d f o r m s ( F i g . 1 A a n d B ) , w h e r e a s a t l o wB A C c o n c e n t r a t i o n s r e l a x e d o r f o l d e d f o r m s f o r b o t h T 7 a n dPM 2 DNA w e r e f o u n d . Q u a l i t a t i v e l y , T 7 a n d PM 2 DNA b e -h a v e d s i m i l a r l y . T h e r e s u l t s a r e s u m m a r i z e d i n T a b l e 1 . A l lf u r t h e r e x p e r i m e n t s w e r e p e r f o r m e d a t 2 X 1 0 - 4 % B A C .F i g . 1C-H s h o w s r e p r e s e n t a t i v e f o r m s o f T 7 a n d f o r m I PM2 DNA a t 1 0 mM, 1 0 0 mM, a n d 1 M s o d i u m a c e t a t e c o n c e n -t r a t i o n s . B e l o w 1 0 0 mM s o d i u m a c e t a t e t h e s t r a n d s o f b o t hDNAs w e r e r e l a x e d a n d u n f o l d e d . A t 1 mM s a l t c o n c e n t r a t i o nt h e k n o w n s u p e r h e l i c a l s t r u c t u r e o f PM 2 DNA c o u l d n o t b eo b s e r v e d , a n d a t 1 0 mM i t o n l y a p p e a r e d a s a s l i g h t s u p e r t w i s t( T a b l e 1 ; F i g . i D ) . B e t w e e n 0 . 1 a n d 1 M b o t h DNAs p r o g r e s -s i v e l y a d o p t e d m o r e f o l d e d f o r m s . T h e T 7 DNA a s s u m e d a f o r mw i t h f r e q u e n t h a i r p i n f o l d s a n d t h i c k f i l a m e n t s , w h e r e a s t h e


2/5

4126 Cell Biology: Vollenweider et

B

D

F

Jt

FIG. 1. T7 DNA: left column (A , C , E, and G) . PM2 DNA: right column (B , D, F , and H). Magnification X22,500. All experiments wereperformed at aDNAconcentration of 0.2 j ~ g / m l in 30mMriethanolamine-acetate at pH 7.9 using the droplet technique of Vollenweider etal . (14). (A and B) Solvent containing 0.01Modium acetate and 5 X10-3% BAG. (C and D) Solvent containing 0.01Modium acetate and 2X1 0 -4 % BAC. (E and F) Solvent containing 0.1Modiumacetate and 2 X1 0 -4 % BAG. (G and H) Solvent containing 1Modium acetateand2 X1 0- 4 % BAG.Thesameresultwasobtained when 3.5% formaldehydewasadded.

typical thin filaments ofDNAprogressively disappeared ( F i g . conditions, which should lead to local melted regions ( 5 , 6 )LE and G) . The forms ofPMDNAarecompatible withasu- undetectable by conventional electron microscopy. The samplespercoiled DNA F i g . iF and H) . wereheated to 60 0C ( T 7 ) or75 'C (PM 2) for 15 min in 1MWecompared the forms of both DNAsunder premelting sodium acetate and 3.5% formaldehyde, 30mMriethanol-

A

C

E

G/-

.I I ' \ ,I.

I.

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 7 3 ( 1 9 7 6 )


3/5

C e l l B i o l o g y : V o l l e n w e i d e r e t a l .

~ ~ ~ An i....;A-- x i - - ) - - ; ; ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ z .

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 7 3 ( 1 9 7 6 ) 4 1 2 7

B . S #

D e e ~

F I G . 2 . T 7 DNA: l e f t c o l u m n ( A a n d C ) . PM 2 DNA: r i g h t c o l u m n ( B a n d D ) . M a g n i f i c a t i o n X 2 5 , 0 0 0 . T h e s a m e DNA a d s o r p t i o n t e c h n i q u ea s d e s c r i b e d i n t h e l e g e n d o f F i g . 1 w a s u s e d . S a m p l e s w e r e t r e a t e d i n t h e f o l l o w i n g w a y b e f o r e s p r e a d i n g : ( A a n d B ) T 7 DNA was h e a t e d t o 6 0 C a n d PM 2 DNA t o 7 5 C i n 1 M s o d i u m a c e t a t e , 3 . 5 % f o r m a l d e h y d e , a n d 3 0 mM t r i e t h a n o l a m i n e - a c e t a t e , pH 7 . 9 , f o r 1 5 m i n . A f t e r c o o l i n g ,B A C w a s a d d e d t o a c o n c e n t r a t i o n o f 2 X 1 0 - 4 % . ( C a n d D ) S a m e c o n d i t i o n s a s i n F i g . 1 G a n d H , e x c e p t t h a t B A C w a s r e p l a c e d b y 1 2 5 , u g / m lo f E t d B r . N o t e r e l a x e d f o r m I I PM 2 DNA m o l e c u l e o n t h e l e f t o f m i c r o g r a p h D .a m i n e - a c e t a t e a t pH 7 . 9 . A f t e r c o o l i n g i n i c e , t h e DNA w a sp r e p a r e d f o r e l e c t r o n m i c r o s c o p y w i t h 2 X 1 o - 4 % B A C ( F i g .2 A a n d B ) . U n l i k e t h e r e s u l t s s h o w n i n F i g . I G a n d H , w h i c hw e r e a l s o o b t a i n e d i n t h e p r e s e n c e o f f o r m a l d e h y d e b u t w i t h o u th e a t t r e a t m e n t , b o t h DNAs w e r e r e l a x e d ( P M 2 DNA: a b o u t3 A i m , T 7 D N A : a b o u t 1 2 , u m c o n t o u r l e n g t h ) . T h e s a m e w a s t r u ew h e n E t d B r a t a c o n c e n t r a t i o n o f 1 2 5 , u g / m l w a s u s e d ( 1 5 ) i n -s t e a d o f B A C , i m p l y i n g t h a t a p a r t i a l d e n a t u r a t i o n m u s t h a v et a k e n p l a c e . T h e s a m e e x p e r i m e n t w a s r e p e a t e d b u t w i t h o u tf o r m a l d e h y d e . A f t e r c o o l i n g , t h e DNA w a s a d s o r b e d a g a i n i nt h e p r e s e n c e o f e x c e s s E t d B r i n s t e a d o f B A C ( 1 5 ) . T h e f o r m IPM 2 DNA a p p e a r e d h i g h l y f o l d e d ( F i g . 2 D ) , p r o v i n g t h e a b -s e n c e o f n i c k i n g d u r i n g t h e h e a t t r e a t m e n t . T h e T 7 a n d f o r mI I PM 2 DNA s t r a n d s , h o w e v e r , r e m a i n e d f u l l y r e l a x e d a n de x t e n d e d ( F i g . 2 C a n d F i g . 2 D , s t r a n d a t l e f t ) .

T a b l e 1 . A p p e a r a n c e o f T 7 and PM2 DNA by e l e c t r o nm i c r o s c o p y i n t h e p r e s e n c e o f B A C *Sodium a c e t a t e c o n c e n t r a t i o n

B A C c o n -c e n t r a t i o n 1 0 0 500( % , w t / v o l ) 1 mM 1 0 mM mM mM 1 M1 x 1 0 - 2 c c c c f / c5 x 1 0 - 3 c c s f r / c f1 X 1 0 - 3 c r r S f f2 X 1 0 - 4 r P M 2 : s f f f fT 7 r

* c = c o m p a c t e d ( e . g . , F i g . 1 A a n d B ) ; r = r e l a x e d ( e . g . , F i g . 1 C ) ;s f = s l i g h t l y f o l d e d ( e . g . , F i g . 1 D ) ; f = f o l d e d ( e . g . , F i g . 1 G a n dH ) .

F i g . 3 s h o w s t h e s e d i m e n t a t i o n b e h a v i o r o f T 7 DNA com-p a r e d w i t h t h a t o f f o r m I a n d f o r m I I o f PM 2 DNA a s a f u n c -t i o n o f s o d i u m a c e t a t e c o n c e n t r a t i o n . T h e e x p e r i m e n t s c o u l dn o t b e d o n e i n t h e presence o f B A C b e c a u s e o f o v e r l a p p i n ga b s o r b a n c e a t 2 6 0 nm. P a r t i c u l a r l y i n t e r e s t i n g i s t h e f a c t t h a tb o t h T 7 a n d f o r m I PM 2 DNA s h o w t r a n s i t i o n s i n t h e same s a l tc o n c e n t r a t i o n range, near 0 . 1 M , a l t h o u g h t h e t r a n s i t i o n s go i no p p o s i t e d i r e c t i o n s . T h e s e d i m e n t a t i o n c o e f f i c i e n t o f T 7 DN Ai n c r e a s e s b y a b o u t a f a c t o r o f 2 , i n a g r e e m e n t , a l t h o u g h n o ts t r i c t l y c o m p a r a b l e , w i t h p u b l i s h e d d a t a ( 1 , 4 ) . T h e s e d i m e n -t a t i o n c o e f f i c i e n t o f f o r m I PM 2 DNA d e c r e a s e s a b o u t 1 5 %S2 0

30 -

2 0 -

0 0 . 0 0 1 0 . 0 1 0 . 1

T 7PM 2 / 1PM 2 / l 1

1 . 0 M NaOAcF I G . 3 . S e d i m e n t a t i o n c o e f f i c i e n t S 2 0 ( c o r r e c t e d f o r v i s c o s i t y )a s a f u n c t i o n o f t h e m o l a r c o n c e n t r a t i o n o f s o d i u m a c e t a t e ( N a O A c ) .( - ) f o r m I PM 2 DNA; ( 0 ) f o r m I I PM 2 DNA; ( A ) T 7 DNA. Thev a l u e 0 o n t h e a b s c i s s a c o r r e s p o n d s t o 3 0 mM t r i e t h a n o l a m i n e - a c e -t a t e , pH 7 . 9 .


4/5

4 1 2 8 C e l l B i o l o g y : V o l l e n w e i d e r e t a l .t o w a r d s t h a t o f f o r m I I PM 2 , w h i c h r e m a i n s n e a r l y c o n s t a n t .F o r m I a n d f o r m I I b e h a v e a s d i s t i n c t s p e c i e s , e v e n a t h i g h s a l tc o n c e n t r a t i o n s ( u p t o 2 M ) . T h i s b e h a v i o r i s v e r y s i m i l a r t o t h a to b s e r v e d w i t h PM 2 DNA i n t h e p r e s e n c e o f s o d i u m p e r c h l o r a t e( 5 ) . A t l o w s a l t c o n c e n t r a t i o n s T 7 DNA h a s l o w e r s 2 0 v a l u e s t h a nf o r m I I PM 2 DNA, w h e r e a s a t h i g h s a l t c o n c e n t r a t i o n s t h ec o r r e s p o n d i n g S 2 0 v a l u e s a r e h i g h e r t h a n t h o s e o f f o r m I PM2 D N A .

DISCUSSIONI t i s h i g h l y u n l i k e l y t h a t t h e p r o g r e s s i v e f o l d i n g o f T 7 DNA a ti n c r e a s i n g s a l t c o n c e n t r a t i o n i s a n a r t i f a c t o f s p e c i m e n p r e p a -r a t i o n . T h e s u p e r s t r u c t u r e w a s o b s e r v e d i n t h e p r e s e n c e o ff o r m a l d e h y d e , b u t d i s a p p e a r e d w h e n t h e s a m p l e s w e r e h e a t e dt o 6 0 ' C a n d 7 5 " C , r e s p e c t i v e l y . I t i s u n l i k e l y t h a t t h e f o l d i n go f T 7 DNA o c c u r s b y a c h a n g e i n t h e a d s o r p t i o n c h a r a c t e r i s t i c ss i n c e t h e n u m b e r o f a d s o r b e d DNA m o l e c u l e s w a s i n d e p e n d e n to f s a l t a n d B A C c o n c e n t r a t i o n ( w i t h i n t h e r a n g e s g i v e n i n T a b l e1 ) . F o r m I PM 2 DNA i s c h a r a c t e r i z e d b y a s u p e r h e l i c a ls t r u c t u r e i n s o l u t i o n ( 1 3 ) ; t h e r e f o r e , t h e o b v i o u s p a r a l l e l i n t h eb e h a v i o r o f b o t h t y p e s o f DNA i n t h e e l e c t r o n m i c r o s c o p e e x -p e r i m e n t s ( T a b l e 1 , F i g . 1 ) i s a n i n d i c a t i o n t h a t t h e f o l d i n g o ft h e T 7 DNA i s a l s o a r e a l p h e n o m e n o n . F u r t h e r m o r e , i n s i m i l a re x p e r i m e n t s i n w h i c h BAC w a s r e p l a c e d b y 1 , 1 2 - d i a m i n o -d o d e c a n e o r m a l o u e t i n e , a g o o d c o r r e l a t i o n b e t w e e n a n a l y t i c a lu l t r a c e n t r i f u g a t i o n a n d e l e c t r o n m i c r o s c o p y p e r f o r m ed u n d e rs t r i c t l y c o m p a r a b l e c o n d i t i o n s c o u l d b e e s t a b l i s h e d . T h i s i m p l i e st h a t u n d e r c o n t r o l l e d p r e p a r a t i o n c o n d i t i o n s ( 1 9 ) e l e c t r o nm i c r o s c o p y may r e v e a l f o r m s c o r r e s p o n d i n g t o t h o s e p r e s e n ti n s o l u t i o n ( P a r e l l o , E t i e n n e , R a y n a u d , a n d K o l l e r , i n p r e p a -r a t i o n ) . I t h a s r e c e n t l y b e e n r e p o r t e d t h a t s u p e r t w i s t i n g i n ac i r c u l a r DNA m o l e c u l e m u s t b e a p r o p e r t y o f t h e DNA m o l e -c u l e a n d n o t d e p e n d e n t o n c i r c u l a r i z a t i o n ( 2 0 ) .I t i s k n o w n f r o m a n a l y t i c a l u l t r a c e n t r i f u g a t i o n a n d v i s c o s i -m e t r y t h a t a l i p h a t i c d i a m i n e s w i t h 1 2 o r m o r e c a r b o n a t o m si n t h e a l i p h a t i c p a r t o f t h e m o l e c u l e ( 1 8 ) a n d s t e r o i d d i a m i n e s( 2 1 , 2 2 ) i n d u c e a n u n c o i l i n g o f c l o s e d c i r c u l a r D N A . F r o m t h ed a t a p r e s e n t e d ( T a b l e 1 ) i t a p p e a r s t h a t B A C , w h i c h i s a m o -n o c a t i o n i c a m p h i p h i l i c m o l e c u l e , h a s a s i m i l a r e f f e c t . T h ec o n d i t i o n s i n w h i c h t h i s r e l a x a t i o n o f f o r m I PM 2 DNA w a sm o s t p r on o u n c e d w e r e s h i f t e d t o w a r d s h i g h e r BAC c o n c e n -t r a t i o n s a s t h e s o d i u m a c e t a t e c o n c e n t r a t i o n w a s r a i s e d ( T a b l e1 ) . A b o v e 1 0 mM s o d i u m a c e t a t e a BAC c o n c e n t r a t i o n o f 2 Xl o - 4 % w a s t o o l o w t o u n f o l d f o r m I PM 2 DNA c o m p l e t e l y .B e c a u s e o f t h e r e l a x i n g e f f e c t o f B A C , w e b e l i e v e t h a t t h es t r a n d s v i s u a l i z e d i n o u r e l e c t r o n m i c r o g r a p h s o f F i g . 1 E - H a r es t i l l l e s s f o l d e d t h a n t h e y a r e i n s o l u t i o n i n t h e a b s e n c e o f B A G .I n t h e B A C - s a l t s y s t e m T 7 DNA b e h a v e d l i k e f o r m I PM 2 DNA( F i g . 1 G - H ) . T h i s i m p l i e s t h a t s i m i l a r m e c h a n i s m s a c t o n b o t ht y p e s o f DNA a n d t h a t T 7 DNA m i g h t a l s o h a v e a s u p e r s t r u c -t u r e i n s o l u t i o n . T h e f a c t t h a t a t r a n s i t i o n c a n b e d e t e c t e d b ya n a l y t i c a l u l t r a c e n t r i f u g a t i o n f o r b o t h T 7 DNA a n d f o r m I PM2 DNA i n t h e s a m e s a l t c o n c e n t r a t i o n r a n g e a t a b o u t 1 0 0 mM,s u g g e s t s t h a t t h e o b s e r v e d i o n i c s t r e n g t h d e p e n d e n c e i n v o l v e sa common m e c h a n i s m a c t i n g o n t h e l i n e a r a s w e l l a s o n t h ec i r c u l a r DNA m o l e c u l e . H o w e v e r , t h e t r a n s i t i o n d o e s n o t t a k ep l a c e i n t h e s a m e d i r e c t i o n f o r b o t h t h e m o l e c u l e s ( F i g . 3 ) . T h er e a s o n f o r t h i s i s n o t u n d e r s t o o d , b u t i t may b e e x p l a i n e d b yt h e i r d i f f e r e n t t o p o l o g i e s . T h e t r a n s i t i o n i s n o t v i s i b l e f o r t h en i c k e d c i r c u l a r PM 2 DNA s i n c e i t s s e d i m e n t a t i o n b e h a v i o rd e p e n d s v e r y l i t t l e u p o n i n c r e a s i n g s o d i u m a c e t a t e c o n c e n -t r a t i o n ( F i g . 3 ) .S u p e r h e l i c a l s t r u c t u r e s o f c o v a l e n t l y c l o s e d c i r c u l a r m o l e c u l e sa r e d e s t r o y e d b y m i l d d e n a t u r a t i o n ( 5 , 6 ) . O u r e x p e r i m e n t su n d e r p r e m e l t i n g c o n d i t i o n s u s i n g f o r m a l d e h y d e ( 2 4 ) s h o w t h a t

t h e f o l d i n g o f b o t h DNAs o b s e r v e d a t h i g h s o d i u m a c e t a t ec o n c e n t r a t i o n s a n d 2 X 1 0 - 4 % B AC d i s a p p e a r s . B o t h t y p e s o fDNA a p p e a r a s u n f o l d e d s t r a n d s ( F i g . 2 A a n d B ) , w h i c h a g a i ns u g g e s t s t h a t a n a t i v e l i n e a r DNA m o l e c u l e p o s s e s s e s a s u p e r -s t r u c t u r e v e r y s i m i l a r t o t h a t o f a c o v a l e n t l y c l o s e d c i r c u l a rDNA m o l e c u l e .I n t e r c a l a t i n g d r u g s l i k e E t d B r a n d t h o s e o f t h e a c r i d i n e g r o u pu n w i n d DNA d u p l e x e s ( 2 5 , 2 6 ) . I n t h e c a s e o f c o v a l e n t l y c l o s e dc i r c u l a r DNA, a n e x c e s s o f i n t e r c a l a t i n g d r u g l e a d s t o s u p e r -t w i s t i n g i n t h e r e v e r s e s e n s e ( 2 7 ) . O u r f i n d i n g s a r e i n a g r e e m e n tw i t h t h i s s u p e r h e l i c a l s t r u c t u r e ( F i g . 2 D ) . T h e r e s u l t s o f o u re x p e r i m e n t s w i t h e x c e s s o f E t d B r s h o w t h a t f o r T 7 ( F i g . 2 C ) a n df o r m I I PM 2 DNA ( F i g . 2 D , n i c k e d s t r a n d t o t h e l e f t ) , o n c e t h er e l a x e d f o r m h a s b e e n r e a c h e d , n o f u r t h e r r e c o i l i n g t a k e s p l a c e ,p r o b a b l y b e c a u s e t h e e n d s o f t h e s t r a n d s a r e n o t f i x e d . T h i sf i n d i n g i s i n a g r e e m e n t w i t h t h e r e s u l t s o f o t h e r a u t h o r s ( 2 6 , 2 8 ) ,w h o s h o w e d t h a t i n t e r c a l a t i n g d r u g s r e d u c e t h e s e d i m e n t a t i o nc o e f f i c i e n t a n d m a r k e d l y e n h a n c e v i s c o s i t y o f l i n e a r DNA.A t h i g h BAC c o n c e n t r a t i o n w e o b s e r v e d c o m p a c t DNAm o l e c u l e s ( F i g . 1 A a n d B ) . T h i s f o r m d o e s n o t a p p e a r t o b e t h es a m e a s t h e f o l d i n g i n d u c e d b y s o d i u m a c e t a t e . I t o c c u r r e d a l s ou n d e r p r e m e l t i n g c o n d i t i o n s . We b e l i e v e t h a t t h e c o m p a c t f o r mo c c u r s a s t h e r e s u l t o f B AC m i c e l l e f o r m a t i o n ( 1 4 ) .F o r t e c h n i c a l r e a s o n s t h e s e d i m e n t a t i o n a n a l y s i s c o u l d n o tb e p e r f o r m e d i n t h e p r e s e n c e o f B AC a n d i s t h e r e f o r e n o ts t r i c t l y c o m p a r a b l e t o t h e e l e c t r o n m i c r o s c o p e o b s e r v a t i o n s .N e v e r t h e l e s s , b o t h m e t h o d s a r e c o m p l e m e n t a r y . T h e p r o -g r e s s i v e f o l d i n g s e e n f o r T 7 DNA a s t h e s a l t c o n c e n t r a t i o n i si n c r e a s e d t o 1 M i s i n a g r e e m e n t w i t h t h e s 2 o v a l u e s , w h i c h a l s op r o g r e s s i v e l y i n c r e a s e u p t o 1 M . T h e c r o s s i n g o f t h e c u r v e s f o rT 7 a n d f or m I I PM 2 DNA i s o f i n t e r e s t . W e a s s u m e t h a t a t l o wi o n i c s t r e n g t h T 7 DNA s e d i m e n t s m o r e s l o w l y t h a n f o r m I I PM2 DNA s i n c e i t i s a l o n g e r a n d a l i n e a r m o l e c u l e . H o w e v e r ,w h e n t h e s t r a n d s a r e f o l d e d a t h i g h s a l t c o n c e n t r a t i o n s ( a r o u n d1 M ) , t h e s e d i m e n t a t i o n v e l o c i t y o f t h e s e m o l e c u l e s i s i n f l u e n c e dm o r e b y t h e m o l e c u l a r w e i g h t t h a n t h e f o r m [ m o l e c u l a r w e i g h to f 2 5 . 3 X 1 0 6 f o r T 7 DNA ( 1 2 ) a n d 6 X 1 0 6 ( 2 3 ) f o r PM 2 D N A ] .T h e s e d i m e n t a t i o n d a t a f o r f o r m I PM 2 D N A , h o w e v e r , d o n o ta g r e e w i t h t h e e l e c t r o n m i c r o g r a p h s o b t a i n e d a t 2 X 1 0 - 4 %B A C ( F i g . I D , F , a n d H ; T a b l e 1 ) . A t v e r y l o w s a l t c o n c e n t r a -t i o n s t h e c l o s e d c i r c u l a r m o l e c u l e s a r e r e l a x e d , a n d o n l y a t 1 0 0mM s a l t a n d a b o v e a r e t h e y t w i s t e d . T h i s d i s a g r e e m e n t m a yb e e x p l a i n e d b y t h e a c t i o n o f BAC u n w i n d i n g t h e s u p e r h e l i xi n l o w s a l t c o n c e n t r a t i o n ( T a b l e 1 ) .O u r c o m b i n e d d a t a f r o m e l e c t r o n m i c r o s c o p y a n d u l t r a -c e n t r i f u g a t i o n s u g g e s t t h a t a b o v e 1 0 0 mM s o d i u m a c e t a t e al i n e a r DNA m o l e c u l e p o s s e s s e s a s t r u c t u r e s i m i l a r t o t h a t o f ac o v a l e n t l y c l o s e d c i r c u l a r DNA m o l e c u l e . I t i s l i k e l y t h a t a t v e r yl o w s a l t c o n c e n t r a t i o n s T 7 DNA l o s e s i t s s u p e r s t r u c t u r e a s ar e s u l t o f e l e c t r o s t a t i c r e p u l s i o n ( 1 , 4 ) , w h e r e a s f o r f o r m I PM2 D N A , b e c a u s e t h e e n d s a r e f i x e d , e l e c t r o s t a t i c r e p u l s i o n w i l ln o t g i v e r i s e t o a r e l a x e d s t r u c t u r e ( 7 ) . T h u s , DN A m o l e c u l e sh a v e t h e a b i l i t y t o a s s u m e a h i g h e r o r d e r o f s t r u c t u r a l o r g a n i -z a t i o n a t i o n i c c o n c e n t r a t i o n s s i m i l a r t o t h o s e m e a s u r e d i n t h ec e l l n u c l e u s ( 2 9 ) . T h i s m a y h a v e i m p l i c a t i o n s f o r u n d e r s t a n d i n go f t h e p a c k i n g o f DNA w i t h i n c h r o m o s o m e s o f h i g h e r o r g a n -i s m s , v i r u s e s , a n d b a c t e r i o p h a g e s , a s w e l l a s f o r r e c o g n i t i o n i nt h e b i n d i n g o f p r o t e i n s t o n u c l e i c a c i d m o l e c u l e s . O u r r e s u l t si m p l y t h a t s o m e o f t h e f o r m s c o m m o n l y c o n s i d e r e d a ss p r e a d i n g a r t i f a c t s m a y b e p r e s e n t i n s o l u t i o n a n d h a v e b i o -l o g i c a l s i g n i f i c a n c e .

W e t h a n k M r s . H . M a y e r - R o s a a n d D r . G . E t i e n n e f o r e x c e l l e n tt e c h n i c a l a s s i s t a n c e a n d D r s . K e n D o w n i n g , B a r b a r a D o d , C h a r l e sW e i s s m a n n , a n d J a c k D u n i t z f o r c r i t i c a l l y r e a d i n g t h e m a n u s c r i p t . T h i s

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 7 3 ( 1 9 7 6 )


5/5

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 7 3 ( 1 9 7 6 ) 4 1 2 9w o r k was s u p p o r t e d b y S c h w e i z e r i s c h e r N a t i o n a l f o n d s z ur F 6 r d e r u n gd e r w i s s e n s c h a f t l i c h e n F o r s c h u n g , G r a n t no. 3 . 1 5 9 0 . 7 3 .

1 . R i n e h a r t , F . P . & H e a r s t , J . E . ( 1 9 7 2 ) A r c h . B i o c h e m . B i o p h y s .1 5 2 , 7 1 2 - 7 2 2 .2 . R i n e h a r t , F . P . & H e a r s t , J . E . ( 1 9 7 2 ) A r c h . B i o c h e m . B i o p h y s .1 5 2 , 7 2 3 - 7 3 2 .3 . T r i e b e l , H . & R e i n e r t , K . E . ( 1 9 7 1 ) B i o p o l y m e r s 1 0 , 8 2 7 - 8 3 7 .4 . R o s e n b e r g , A . H . & S t u d i e r , F . W. ( 1 9 6 9 ) B i o p o l y m e r s 7 ,7 6 5 - 7 7 4 .5 . B a u e r , W. ( 1 9 7 2 ) J . M o l . B i o l . 6 7 , 1 8 3 - 1 9 8 .

6 . B a u e r , W. ( 1 9 7 2 ) B i o c h e m i s t r y 1 1 , 2 9 1 5 - 2 9 2 0 .7 . U p h o l t , W. B . , G r a y , H . B . , J r . & V i n o g r a d , J . ( 1 9 7 1 ) J . M o l . B i o l .6 2 , 2 1 - 3 8 .8 . W a n g , J . C . ( 1 9 6 9 ) J . M o l . B i o l . 4 3 , 2 5 - 3 9 .9 . R o s s , P . & S c r u g g s , R . ( 1 9 6 8 ) B i o p o l y m e r s 6 , 1 0 0 5 - 1 0 1 8 .1 0 . C a m p b e l l , A . M . ( 1 9 7 6 ) B i o c h e m . J . 1 5 5 , 1 0 1 - 1 0 5 .1 1 . S c h u r z , J . & G r u b e r , E . ( 1 9 6 9 ) M a k r o m o l . C h e m . 1 2 8 , 1 0 2 -1 2 2 .1 2 . F r e i f e l d e r , D . ( 1 9 7 0 ) J . M o l . B i o l . 5 4 , 5 6 7 - 5 7 7 .1 3 . R e v e t , B . M . J . , S c h m i r , M . & V i n o g r a d , J . ( 1 9 7 1 ) N a t u r e NewB i o l . 2 2 9 , 1 0 - 1 3 .1 4 . V o l l e n w e i d e r , H . J . , S o g o , J . M . & K o l l e r , T h . ( 1 9 7 5 ) P r oc . N a ti .A c a d . S c i . U S A 7 2 , 8 3 - 8 7 .

1 5 . K o l l e r , T h . , S o g o , J . M . & B u j a r d , H . ( 1 9 7 4 ) B i o p o l y m e r s 1 3 ,9 9 5 - 1 0 0 9 .1 6 . M o o r , H . ( 1 9 7 0 ) P r o c e e d i n g s o f t h e I n t e r n a t i o n a l C o n f e r e n c eo n E l e c t r o n M i c r o s c o p y , 7 t h G r e n o b l e , F r a n c e ( S o c i R t 6 F r a n g a i s ed e M i c r o s c o p i e E l e c t r o n i q u e , P a r i s ) , V o l . 1 , p . 4 1 3 .1 7 . L a n g , D . ( 1 9 7 3 ) J . M o l . B i o l . 7 8 , 2 4 7 - 2 5 4 .1 8 . G o u r e v i t c h , M . , P u i g d o m e n e c h , P . , C a v e , A . , E t i e n n e , G . , M e r y ,J . & P a r e l l o , J . ( 1 9 7 4 ) B l o c h i m i e 5 6 , 9 6 7 - 9 8 5 .1 9 . S o g o , J . M . , P o r t m a n n , R . , K a u f m a n n , P . & K o l l e r , T h . ( 1 9 7 5 ) J .M i c r o s c . ( P a r i s ) 1 0 4 , 1 8 7 - 1 9 8 .2 0 . G r i f f i t h , J . D . ( 1 9 7 6 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 7 3 , 5 6 3 - 5 6 7 .2 1 . W a r i n g , M . J . & C h i s h o l m , J . W. ( 1 9 7 2 ) B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a2 6 2 , 1 8 - 2 3 .2 2 . W a r i n g , M . J . ( 1 9 7 0 ) J . M o l . B i o l . 5 4 , 2 4 7 - 2 7 9 .2 3 . E s p e j o , R . T . , C a n e l o , E . S . & S i n s h e i m e r , R . L . ( 1 9 6 9 ) P r o c . N a t lA c a d . S c i . USA 6 3 , 1 1 6 4 - 1 1 6 8 .2 4 . C r a w f o r d , L . V . & B l a c k , P . H . ( 1 9 6 4 ) V i r o l o g y 2 4 , 3 8 8 - 3 9 2 .2 5 . F u l l e r , W. & W a r i n g , M . J . ( 1 9 6 4 ) B e r . B u n s e n g e s . P h y s . C h e m .6 8 , 8 0 5 - 8 0 8 .2 6 . L e r m a n , L . S . ( 1 9 6 1 ) J . M o l . B i o l . 3 , 1 8 - 3 0 .2 7 . B a u e r , W. & V i n o g r a d , J . ( 1 9 6 8 ) J . M o l . B i o l . 3 3 , 1 4 1 - 1 7 1 .2 8 . W a r i n g , M . J . ( 1 9 6 4 ) B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 8 7 , 3 5 8 - 3 6 1 .2 9 . C e n t u r y , T . J . , F e n i c h e l , L . R . & H o r o w i t z , S . B . ( 1 9 7 0 ) J . C e l l S c i .7 , 5 - 1 3 .

C e l l B i o l o g y : V o l l e n w e i d e r e t a l .

h.j. vollenweider, th. koller, j. parello and j.m. sogo- superstructure of linear duplex dna

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