hidrocarburos poliaromáticos · 10/04/2019 6 hidrocarburos poliaromáticos y sistema reproductor...

10/04/2019

1

Hidrocarburos poliaromáticos

Dra. Alicia G. Faletti

Profesora Adj. de Toxicología

Investigadora Ppal. del CONICET

CEFYBO-CONICET-Facultad de Medicina

Universidad de Buenos Aires

CEFYBO

CONICET

PRIMER CICLO DE CONFERENCIAS DE LA PRIMERA CÁTEDRA DE

TOXICOLOGÍA

PAHs no halogenados

Fenantreno

Antraceno

Naftaleno

Hidrocarburos poliaromáticos (PAHs)

PAHs no halogenados

PAHs halogenados

Dibenzo-p-dioxinas policlorados (dioxinas)

Bifenilos policlorados (PCBs)

Dibenzofuranos policlorados (PCDFs)

Bifenilos polibromados (PBBs)

Difeniléteres policlorados (PCDEs)

Difeniléteres polibromados (PBDEs)

PAHs halogenados

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2

PAHs no halogenadosBenzo[a]pireno(BaP)

9,10-Dimetilbenzoantraceno(DMBA)

H3C

H3C

3-Metilcolantreno(3MC)

H3C

Contaminantes ambientalesFuentes

PAHs no halogenados

Combustión incompleta de

Madera

Carbón

Motor de vehículos

Pirólisis de aminoácidos, lípidos o carbohidratos

Tabaco

Incienso

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PAHs

Mecanismo de acciónUnión del ligando

Ligando

Hsp90

Protein

quinasas

Fosforilación

proteica

Proliferación y

diferenciación

celular

Biotransformación

of xenobióticosAhRArnt

AhRmRNA

AhRArnt

GCGTGA

XRE

Ca2+

AhRHsp90

Hsp90XAP2

p23

XAP2

Traslocación

al núcleo

Heterodimerización

Unión al ADN

Fosforilación

Hsp90

Arnt

AhR = receptor de hidrocarburos aromáticos

XRE = elemento de respuesta al xenobiótico

Arnt = traslocador nuclear del receptor de hidrocarburos aromáticos

AhRR

AhRR

IARC: carcinógeno (promotor de tumores en distintos tejidos)

Disruptor endócrino

Toxicidad hepática

Alteraciones metabólicas: porfiria, diabetes, estrés oxidativo

Inducción enzimática (CYPs, GST)

Toxicidad reproductiva y del desarrollo

Alteraciones en el tracto gastrointestinal

Neurotoxicidad en niños

Inmunotoxicidad (infecciones, atrofia del timo, linfocitos T alterados

Toxicidad cutánea Cloracné

EfectosPAHs

(Agencia Internacional para la Investigación del Cáncer)

Hipertrofia

Hiperplasia

Fibrosis

Inflamación

Acumulación de lípidos

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Respuestas adaptativas (biotransformación de xenobióticos)

Respuestas tóxicas

Organogénesis

Funciones hormonales

Rol del AhR

Genes blanco de acción de los AhR

Enzimas de biotransformación (Cyp1A1, Cyp1A2, Cyp1B1)

Enzimas de conjugación (UDP-G-transferasa, GST-S-transferasa)

Genes reguladoras del ciclo celular (p27, jun-B)

Genes reguladoras de la apoptosis (bax, bcl-2)

PAHs

Flavonoides

O

O

OFlavona

Compuestos

fenólicos

(5000)

Alimentos no energéticos

Naturales o sintéticos

Antioxidantes

Neutralizan radicales libres

Quelan Fe, Cu, Zn

O

O

OH

Flavonol

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Efecto carcinógeno

AhR

Arnt

XRE

AhR Arnt

TCDD

BaP

Señalización

extracelularProliferación

celular

Apoptosis

Ciclo celular

CYP1A1

CYP1A2

CYP1B1

Promotor a través de AhR

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Hidrocarburos poliaromáticos

y

Sistema reproductor masculino

Humo del cigarrillo

Fumadores

Volumen semen

Recuento espermático

Motilidad espermática

Viabilidad de las células germinales

Defectos estructurales células germinales

Tasa de fertilidad

Tasa de implantación

Niveles de ROS

Niveles de GSH, actividad de SOD

Aductos ADN en espermatozoides

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Benzo[a]pireno (BaP)

Xu y col. Plos One 2014

Benzo[a]pirenoBaP-7,8-diol-9,10-epoxido

OH

OH

OH

HN

N N

N

HN

O

ADN

O

HO

OH

CYP1A1

ADN

Aductos en

espermatozoides

0 50 200300 0 50 200300 0 50 200300 0 50 2003000

5

10

15

20

Es

pe

rma

toc

ito

Es

pe

rmá

tid

es

Es

pe

rma

tozo

ide

s

He

pa

toc

ito

s

[BaP] (mg/kg)

Fre

cu

en

cia

de

mu

tac

ion

es

7 días

25 días

60 días

Exposición aguda

Ctrl NF (80 mg/kg) 3MC 3MC + NF

3-Metilcolantreno

(3MC)

Control 0.1 10

15

3040

45

50

55

3MC (mg/kg)

**

***Pubertad p<0.001

p<0.01

Día

s

Control 0.1 10

5

10

15

3MC (mg/kg)

**

p<0.01

Recuento

Espermático

**

Célu

las (

x 1

07)/

ml

Control 0.1 10

20

40

60

80

100

3MC (mg/kg)

Motilidad

**

***

p<0.01p<0.001

Po

rce

nta

je

Control 0.1 10

20

40

60

80

100

Viabilidad

3MC (mg/kg)

*

***

p<0.05p<0.001

Esp

erm

ato

zo

ides

via

ble

s (

%)

Exposición repetitiva

Control

BaP (50 mg/kg)

Cabeza

anormal

Cola

enrollada

Jeng et al. Enrivor Toxicol 2013 Faletti et al. No publicado aún

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Anticuerpo

anti-BPDE

Benzo[a]pireno (BaP)

0,5 – 50 mg/kg/semana por 5 semanas

Exposición repetitiva

Revel et al. Reprod Toxicol 2001

Ctrl 0.5 1 3 5 10 30 500

30

60

90

120

[BaP] (mg/kg)

Es

pe

rma

tozo

ide

s x

10

6/m

l

Ctrl 0.5 1 3 5 10 30 500

5

10

15

20

25

30

35

[BaP] (mg/kg)

Cé

lua

s (

%)

P<0,0001 (correlación negativa)

Apoptóticas

Necróticas

Control BaP Bap+Res0

20

40

60

80

100

Po

rce

nta

je

BaPControl

BaP+Resver

0

1

2

3

BaP = 5 mg/kg

Resveratrol = 50 mg/kg

7,12-Dimetilbenz[a]antraceno

(DMBA)

in vivo: 20 mg/kg por 2 días

Raj et al. Mutat Res 1984

Espermatozoides

anormales

Control DMBA0

50

100

150

***

Nú

me

ro /

50

0 c

élu

las

Espermatozoides

con cabeza anormal

Control DMBA0

20

40

60

80

100

120

140***

Nú

me

ro /

50

0 c

élu

las

Síntesis de ADN

0 1 2 3 4 5 60

20

40

60

80

100

Control

BaP

DMBA

PAH (µM)

Célu

las

ge

rmin

ale

s (

%)

Espermatogénesis

Estadío V Estadío VIII0

1000

2000

3000

4000

5000

Control DMBA BaP

*** ***

***

**

33%

72%

21%

85%

Pro

lifera

ció

n c

elu

lar

In vitro

Georgellis et al. Mutat Res 1990

10/04/2019

9

Estadío II-III

Espermatogonias Espermatocitos Espermátides0

1

2

3

4

5

6

**

**

**

***

****

Cé

lula

s g

erm

ina

les

/

cé

lula

s d

e S

ert

oli

Estado VII

Espermatogonias Espermatocitos Espermátides0

1

2

3

4

5

6

7

** **

** *

Cé

lula

s g

erm

ina

les

/

cé

lula

s d

e S

ert

oli

Escape de motores diésel

Watanabe y Oonuki Environ Health Perspect 1999

Exposición diaria

Nacimiento 3 meses

6 h / día, 5 días/semana

FSH

LH

[E2]

[T]

Exposición crónica

Control E filtrado E total0

5

10

15

20

25

30

35

**

*

Es

pe

rma

tozo

ide

s x

10

6/

tes

tíc

ulo

Control E filtradoE total

Humo del cigarrillo

(10 mg/kg/day)

Total ProgresivaRápida Lenta Estática0123

20

30

40

50

60

70

* **

**

*

Mo

tili

da

d (

%)

Reacción acrosomal

Control CSC0

20

40

60

**

Po

rce

nta

je

Capacitación

-80

-60

-40

-20

0No capacitados Capacitados

*

Tasa de fertilización

Control CSC0

20

40

60

80

**

Po

rce

nta

je

Exposición diaria (40 días)

Esakky et al. Reprod Toxicol 2016 Control CSC

(CSC)

10/04/2019

10

Control CSC0

20

40

60

80

100

**

% T

úb

ulo

s(c

élu

las T

un

el

po

sit

ivo

)

Control CSC0

10

20

30

40

50

60

70

**

% T

úb

ulo

s(c

élu

las A

nexin

a p

osit

ivo

)

Esakky et al. Reprod Toxicol 2016

Humo del cigarrillo

(10 mg/kg/day)

Exposición diaria (40 días)(CSC)

Esakky et al. Reprod Toxicol. 2012

Presencia de Vacuolas

Pérdida células germinales

Células apoptóticas o

necróticas

Espermatozoides anormales

Espermatozoides no

liberados

Espermatozoides dañados

Humo del cigarrillo

2 mg/kg/día por 7 días

H&E Tunel

DM

SO

CS

CC

SC

(CSC)

10/04/2019

11

Esakky et al. Reprod Toxicol. 2012

Células

apoptóticas

Anti-BPDE FusiónTunel

Células con

aductos en el ADN

Control

Humo del cigarrillo

2 mg/kg/día por 7 días

Presencia del BaP

(CSC)

En resumen

Modelo animales

Células germinales anormales

Espermatogénesis

Apoptosis de células germinales

Frecuencia de mutaciones

Induce necrosis

Induce desbalance hormonal

Atrasa la pubertad

Proliferación celular

Motilidad espermática

Fertilidad

PAHs

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12

PAHs y

Sistema reproductor femenino

Humo del cigarrillo

Fumadores

Menopausia temprana

Pérdida de folículos inmaduros

Desarrollo folicular anormal

Inhibición de la maduración del oocito

Formación de ROS

Tasa de fertilización

Tasa de implantación

Tasa de embarazo en FIV

Contenido de GSH

Peroxidación lipídica

Alteraciones en el balance redox

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13

Oocito diploide

46 cromosomas en metafase II

Oocitos diploides

NF FP FM FI0

5

10

15

20

25

P = 0.0006

Po

rce

nta

jeTasa de fertilización

NF FP FM FI0

50

100

x2 = 9.32, P = 0.025Z = 2.635, P = 0.008

Po

rce

nta

je

Retraso en la maduración de

oocitos

Fallas probables en la meiosis

Zenzes et al. Hum Reprod 1995

Humo del cigarrillo

Humo del cigarrillo

Zenzes et al. 1998, 2000, 2004

No fumadora Fumadora Fumadora

pasiva

Aductos ADN en células

de granulosa

Altera el huso acromático

Altera la meiosis

Forma aductos ADN en oocitos

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Activiadad enzimática

de AHH ovárica

Control BaP 3MC DMBA0

5

10

15

20 ****

**

Ac

tiv

ida

d d

e A

HH

Oocitos/ovario

Control BaP 3MC DMBA0

1000

2000

3000

4000

5000

****** **

*

No d

e o

ocito

s

PAHs no halogenadosBenzo[a]pireno (BaP)

3-Metilcolantreno (3MC)

H3C

9,10-Dimetilbenzoantraceno

(DMBA)

Destrucción de los folículos

primordiales

Dosis aguda

(80 mg/kg)

DMBA 3MC BaP

Cepa D2

Cepa B6

Mattison et al. Toxicol Appl Pharmacol, 1980

H3C

H3C

0.001

0.01

0.1

1

10

100

1000

6.8

69

0.0030.0012

0.18

0.001

0.01

0.1

1

10

100

1000

0.045

0.009

0.45

6.8

69

0.001

0.01

0.1

1

10

100

1000

0.045

Ratón Rata

Primordiales

Primarios

Secundarios

DMBA

3MC

BaP

VCD

VCH

0.001

0.01

0.1

1

10

100

1000

0.45

8.6

0.001

0.01

0.1

1

10

100

1000

3.6 8.6

0.001

0.01

0.1

1

10

100

1000

3.6

0.004

0.45

Borman et al. Toxicol App Pharmacol, 2000

Menor dosis del tóxico que produce la pérdida del 50% de los folículos ováricos

ÍNDICE DE OVOTOXICIDAD PAHs

Dosis diarias

(15 días)

0.02 mg/kg

0.0075 mg/kg

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15

Α-Naftoflavona

(αNF)

7,8-Benzoflavona

O

O

Fo Fi PA FA0

10

20

30

***

***

**

Tipo de folículos

No d

e f

olícu

los/1

0 m

m2

Cuerpos luteos

Ctrl 0.1 1 10 800

3

6

9

12

15 *****

*

NF (mg/kg)

No d

e C

L/m

m2

Tasa ovulatoria

Ctrl 0.1 1 10 800

20

40

60

80

NF (mg/kg)

*

*** ***

**N

o d

e o

ocit

os/r

ata

Control

NF (80 mg/kg)

Estimula el desarrollo folicular

Estimula la tasa ovulatoria

Aumento de la reserva folicular????

Exposición diaria

(prepúber)

Barreiro et al, Toxicol Appl Pharmacol, 252: 11, 2011

Folículos primordiales Fo

Folículos primarios (Fi)

Folículos preantrales (PA)

3-Metilcolantreno

(3MC)

Rhon-Calderón et al, Toxicology, 353-354, 58, 2016

Exposición

diaria

(prepúber)

Folículos Primarios

Ctrl <0.1 0.1 1.00

100

200

300

400

500

3MC (mg/kg)

***** ***

*** P<0.01P<0.001P<0.001

No o

f fo

lícu

los/o

vari

o

Folículos Primordiales

Ctrl <0.1 0.1 1.00

2000

4000

6000

3MC (mg/kg)

*

******

**

***

P<0.01P<0.001

P<0.001

No o

f fo

lícu

los/o

vari

o

CtrolNF (80 mg/kg)

3MC

3MC+NF

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16

3-Metilcolantreno

(3MC)

Exposición diaria

(prepúber)


Folículos Antrales

Ctrl <0.1 0.1 1.00

10

20

30

3MC (mg/kg)

******

*

***P<0.001

P<0.001P<0.05

No o

f fo

lícu

los/o

vari

o


3-Metilcolantreno

(3MC)


Exposición diaria

(prepúber)

3MC 1 mg/kg

Ctrl

3MC+NF


Tasa ovulatoria

Ctrl <0.1 0.1 1.00

3

6

9

12

15

18

3MC (mg/kg)

*** ***

P<0.001P<0.05

No d

e o

ocit

os/r

ata

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Folículos antrales apoptóticosC

on

tro

l3M

C

(1 m

g/k

g)

3M

C +

N

F

CtrolNF (80 mg/kg)

3MC

3MC+NF

Exposición diaria

(prepúber)

Ctrl <0.1 0.1 1.00

2

4

6

8

3MC (mg/kg)

*

*** ***

P<0.001 P<0.001

P<0.05

No o

f F

olícu

os/c

am

po

Rhon Calderón et al. Enviado a Arch Toxicol 2019

Matikainen et al, Endocrinology, 143: 615, 2002

Efecto de DMBA sobre células germinales de ovario fetal

DMBA DMBA + ANF

células

germinales

apoptóticas

proteína Bax

células

germinales

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

Bax +/+ Bax -/-

Primordiales Pa Pre A

DMBA (1 mg/kg)

**

Tpo 0 C C+N V 0.01 0.1 10

50

100

150

200

250

DMBA (µM)

DMBA (0.1)+ ANF

******

***

p<0.01

nº

oo

cit

os

fe

tale

s

PAHs

Efecto in vitro

Efecto in vivo

N

Fo

lícu

los

no

atré

sic

os

/

ov

ario

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Integridad del oocito

Espacio perivitelino

Zona pelúcida

Exposición diaria

(prepúber)



Tamaño del oocito

Ctrl <0.1 0.1 1.00

5

10

15

20

3MC (mg/kg)

******

p<0.001p<0.001

Áre

a (

m2)

Zona pelúcida

Ctrl <0.1 0.1 1.00.0

0.5

1.0

1.5

2.0

3MC (mg/kg)

***** ***

p<0.001p<0.001p<0.01

An

ch

o (

m)

Espacio perivitelino

Ctrl <0.1 0.1 1.00.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3MC (mg/kg)

****** ***

p<0.001p<0.001p<0.01

An

ch

o (

m)


FusiónHoechst

33342

Ioduro de

propidio

Co

ntr

ol

3M

C 1

mg

/kg

Viabilidad

Ctrl <0.1 0.1 1.00

30

60

90

3MC (mg/kg)

***** ***

p<0.01p<0.001

p<0.001

Ocito

s v

iab

les (

%)

CtrolNF (80 mg/kg)

3MC

3MC+NF

Exposición diaria

(prepúber)

3-Metilcolantreno

(3MC)Viabilidad del oocito


10/04/2019

19

3-Metilcolantreno

(3MC)Segregación meiótica

Co

ntr

ol

3M

C

(1 m

g/k

g)

3M

C +

N

F

-Tubulina Hoechst 3342 Fusión

CtrolNF (80 mg/kg)

3MC

3MC+NF

Exposición diaria

(prepúber)

Ctrl <0.1 0.1 1.00

3060

80

90

100

* *** ***

p<0.001p<0.01

3MC (mg/kg)

Oo

cti

os

c/s

eg

reg

ac

ión

no

rma

l (%

)


Ctrl <0.1 0.1 1.00

5

10

15

20

25

3MC (mg/kg)

**

***

p<0.001

***

p<0.001

p<0.05

**

AD

N e

n la c

ola

(%

)

Daño al ADN

Oocito

Ctrl

3MC

(1 mg/kg)

3MC

+ αNFCtrl NF (80 mg/kg) 3MC 3MC + NF

Rhon-Calderón et al. Toxicology 2016

3-Metilcolantreno

10/04/2019

20

3MC

Interacción oocito

espermatozoideCiclo celular

Activación de los

folículos primordiales

Cdk2

Akt1

Dnajb6

Vía

Notch Dll1

Hes1

Jag1

Notch2

Desarrollo

Folicular

Igf2

Icam

Adamts1

Interacción

celular

Cyp1a1

Cyp1b1

Cd9

Expresión génica

Progresión

tumoralMetabolismo

de xenobióticos

Sp1Bax

Caspasa-9

Apoptosis

Rhon-Calderón et al. Arch Toxicol 2018

Modificación postraduccional

3MC

Ciclo celular

Activación de los


Cdk2

Dnajb6Vía

Notch

Jag1

Notch2

Desarrollo

Folicular

Igf2

Adamts1

Cyp1a1

Apoptosis

Metabolismo

de xenobióticos

H3K4Me3

Bax

Caspasa-9


10/04/2019

21

3MC

Ciclo celular

Activación de los


Cdk2

Akt1

Dnajb6

Vía

Notch

Jag1

Notch2

Desarrollo

Folicular

Igf2

Icam

Adamts1

Interacción

celular

Cyp1a1

Modificación postraduccional

Progresión

tumoral

Sp1

Caspasa-9

Apoptosis

Metabolismo

de xenobióticos

H3K9Ac


3-Metilcolantreno

Toxicidad sistémica

Rhon-Calderón et al. Toxicology 2016

Exposición diaria

(prepúber)

Ctrl <0.1 0.1 1.00

5

10

15

20

25

3MC (mg/kg)

***

***

p<0.001

p<0.001

Médula ósea

MN

/1000 r

eticu

locito

s

Ctrl <0.1 0.1 1.00

3

6

9

12

3MC (mg/kg)

***

p<0.001

***

p<0.001Médula ósea

AD

N e

n la c

ola

(%

)

CtrolNF (80 mg/kg)

3MC

3MC+NF

10/04/2019

22

3-Metilcolantreno

Exposición diaria

(prepúber)

Aberraciones cromosómicas

Cariotipo

control

Cariotipo

3MC

(1 mg/kg)CtrolNF (80 mg/kg)

3MC

3MC+NF

Ctrl <0.1 0.1 1.00

30

70

80

90

100

3MC (mg/kg)

***

p<0.001

***

p<0.001

Meta

fases n

orm

ale

s (

%)

Toxicidad sistémica


Fragmentos

Ctrl <0.1 0.1 1.00

2

4

6

8

3MC (mg/kg)

***

p<0.001 ***

p<0.001

Fra

gm

en

tos d

e

cro

mo

so

mas (

%)

Dicéntricos

Ctrl <0.1 0.1 1.00

2

4

6

8

10

12

3MC (mg/kg)

***

p<0.001

***

p<0.001

Cro

mo

so

mas

dic

én

tric

os (

%)



3-Metilcolantreno

(3MC)


10/04/2019

23

Conclusiones3-Metilcolantreno(3MC)

H3C

Exposiciones

repetitivas

Diarias

(0,1-1,0 mg/kg)

3 vs/semana

(0,1 mg/kg)

Altera la expresión de genes involucrados en la función ovárica

Causa efecto sistémico No causa efecto sistémico

αNF previene el daño sistémico y gonadal

causado por 3MC

Destruye los folículos inmaduros y altera el desarrollo folicular

Afecta la integridad de los oocitos

En resumen

Modelo animales

Células germinales anormales

Destrucción folículos primordiales

Daño ADN en oocitos

Desarrollo folicular

Ovulación

Frecuencia de aductos de ADN


Induce apoptosis

Induce desbalance hormonal

Altera regulación genética y epigenética

Atrasa la pubertad

Fertilidad

PAHs

10/04/2019

24

Conclusiones

Bajas dosis de exposición

repetitiva a PAHs causan

toxicidad gonadal sin

generar toxicidad sistémica

Facultad de Medicina

Universidad de Buenos Aires, Argentina

Dr. Eric A. Rhon Calderón

Lic. Rocío A. Galarza

M. Analía E. Cortez

Lic. María A. Meneghini

M.V. Marcela Marquez

Financiamiento:

PIP 112-201101-00799 (CONICET)

PICT 2015-0588 (FONCYT)

UBACYT 20020130100156BA (Universidad de Buenos Aires)

NIH 5R01HD084542-02 (National Institute of Health)

Muchas

gracias National Primate Research Center,

OHSU, Beaverton, Oregon, USA

Dr. Alejandro Lomniczi

Dr. Carlos A. Toro

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