Hagyomnyos mdon ellltott sajtokbl izollt tejsav-baktriumok szelekcijaing. BOTH Emese, dr. GYRGY va, dr. BRAHM Beta, ing. MIKLSSY Ildik, prof.dr.ing. LNYI Szabolcs

XVI. Nemzetkzi Vegyszkonferencia - 2010 Kolozsvr

Bevezet: ProbiotikumokProbiotikumok: el mikroorganizmusok, amelyek megfelel mennyisgben fogyasztva jtkony hatssal vannak a gazdaszervezet egszsgre.

Let your food be your medicine and your medicine be your food (Hippocrates)

Bevezet: Probiotikus tulajdonsgokSav- s epetoleranciaAdhzis kpessg Patogn baktriumok szaporodsnak gtlsa (savtermels, hidrogn-peroxid-termels, bakteriocin-termels, kompetitv inhibci)Immunogn jelleg

Anyag s mdszerTejsavbaktriumok izollsa

mintagyjts: sajtok, oltszelektv tptalaj (MRS-agar)tbbszri jraolts szntenyszetjellemzs: Gram-fests, telepmorfolgia, oxignigny, oxidz- s katalz prba, laktzbonts

Anyag s mdszerSav- s epetolerancia- vizsglat48 rs baktriumtenyszet MRS tplevesbengyomor- s vkonybl-nedv-szimull oldatok ksztse (pH=2, valamint pH=8, 0,5% epes)beolts, inkubls (90 perc, valamint 180 perc, 37oC)mintavtel kezdetben s az inkubls vgna kezdeti sejtszm s a kezels utni sejtszm arnynak meghatrozsa (48 ra, 37oC)

Anyag s mdszerTapadsvizsglat epitliumsejtek felletre in vitroepitliumsejtek tenysztse microplate lemezen (15 nap, 37oC, 5% CO2 )baktriumsejtek tenysztse MRS tplevesben (48 ra, 37oC)epitliumsejtek mossainkubls egytt (2 ra, 37oC)nem tapadt sejtek mossaGram-fests, mikroszkpi megfigyels

Anyag s mdszerPatogn baktriumok gtlsnak vizsglatapatogn baktriumok beoltsa (48 rs tenyszet): Salmonella enteritidis Staphylococcus aureus 5973Bacilus cereus 2Escherichia coli ATCC 13706 Listeria monocytogenes tejsavbaktriumok (10 napos tenyszet) fellszja a szilrd tptalajon kpzett lyukakbainkubls (72 ra), gtlsi znk megfigyelse

Eredmnyek Tejsavbaktriumok izollsaklnbz morfolgij telepek felszedse szilrd tptalaj felletrl39 tejsavbaktrium izoltum

EredmnyekSav- s epetolerancia- vizsglat

Chart1

10026.66

1004.67

10024.73

10012.87

10066.15

10050.56

1003.82

10010.29

10059.1

10013.33

10046.15

10014.67

10012.5

0 min

90 min

vizsglt trzsek

tllsi szzalk (%)

Savtolerancia-vizsglat

Sheet1

Torzs090

SGj103.310026.66

SRj102.2.11004.67

SRj104.210024.73

SGj102.1.110012.87

SGt102.2.210066.15

SRj102.2.2.10050.56

Szj104.41003.82

SGt102.110010.29

Szj102.110059.1

SRt104.210013.33

SGj102.1.210046.15

SGt101.3.210014.67

O2101.210012.5

Sheet1

0 min

90 min

vizsglt trzsek

tllsi szzalk (%)

Savtolerancia-vizsglat

Sheet2

0180

SGj103.31000

SRj102.2.11000

SRj104.210080

SGj102.1.11000

SGt102.2.21004

SRj102.2.2.1005

Szj104.41000

SGt102.11000

Szj102.11003

SRt104.21000

SGj102.1.21000

SGt101.3.21000

O2101.21000

Sheet2

00

00

00

00

00

00

00

00

00

00

00

00

00

0 min

180 min

Tested strains

Viability (%)

Viability of isolated bacterial strains incubated with artificial intestinal juice

Sheet3

EredmnyekSav- s epetolerancia- vizsglat

Chart2

1000

1000

10080

1000

1004

1005

1000

1000

1003

1000

1000

1000

1000

0 min

180 min

vizsglt trzsek

tllsi szzalk (%)

Epetolerancia-vizsglat

Sheet1

Torzs090

SGj103.310026.66

SRj102.2.11004.67

SRj104.210024.73

SGj102.1.110012.87

SGt102.2.210066.15

SRj102.2.2.10050.56

Szj104.41003.82

SGt102.110010.29

Szj102.110059.1

SRt104.210013.33

SGj102.1.210046.15

SGt101.3.210014.67

O2101.210012.5

Sheet1

0 min

90 min

vizsglt trzsek

tllsi szzalk (%)

Savtolerancia-vizsglat

Sheet2

0180

SGj103.31000

SRj102.2.11000

SRj104.210080

SGj102.1.11000

SGt102.2.21004

SRj102.2.2.1005

Szj104.41000

SGt102.11000

Szj102.11003

SRt104.21000

SGj102.1.21000

SGt101.3.21000

O2101.21000

Sheet2

0 min

180 min

vizsglt trzsek

tllsi szzalk (%)

Epetolerancia-vizsglat

Sheet3

EredmnyekTapadsvizsglat epitliumsejtek felletre in vitro

Epitliumsejtekre tapadt baktriumsejtek Gram fests utn.

EredmnyekPatogn baktriumok gtlsnak vizsglataSRj102.2.2, Szj102.1 s SGt102.2.2 trzsek gtl hatssal rendelkeznek a Salmonella enteritidis nvekedsre

Gtlsi znk alakulsa Salmonella enteritidis esetn. SRj104.2 izoltum fellszjaSRj102.2.2 izoltum fellszjaSzj102.1 izoltum fellszjaSGt102.2.2 izoltum fellszja

sszefoglalsikerlt 39 tejsavbaktrium izoltumot ltrehozni s jellemezni biokmiai s morfolgiai tulajdonsgok alapjnszelektltuk sav- s epetolerancijuk alapjntapadsvizsglatot vgeztnk epitliumsejtek felletrepatogn trzsekre kifejtett bakteriosztatikus hatsukat vizsgltuk az izoltumok kzl sikerlt probiotikus baktriumokat szelektlni

Ksznm megtisztel figyelmket!

napjainakban egyre n a funkcionlis lelmiszerek, ezen bell a probiotikus termkek irnti rdeklds. Az egyszsggyi vilgszervezet legjabb meghatrozsa szerint a probiotikumok olyan l mikroorganizmusok, amelyek megfelel mennyisgben fogyasztva jtkony hatssal vannak a gazdaszervezet egszsgre.A probiotikumok legnagyobb csoportjt a tejsavbaktriumok kpezik.

Ahhoz, hogy egy baktriumtrzset probiotikusnak nevezhessnk, amellett, hogy nem lehet patogn, a kvetkez felttleket kell teljestenie:Elssorban tl kell lnie a gyomor savas s a vkonybl epes tartalm kzegt, hogy el tudjon jutni a megfelel helyre aktv formban.A msodik legfontosabb tulajdonsg, hogy el tudjon szaporodni a vastagblben, az, hogy meg tudjon tapadni a blhmsejtek felletn, ne rljn ki a szervezetbl.Nagyon sok kutats irnyul a probiotikumok ltal termelt metabolitok tanulmnyozsra, amellyel megakadlyozzk a patogn baktriumok megtelepedst a blrendszerben. Klnbz mechanizmusok rvn, gtoljk a blpatogneket: - szerves savakat termelnek, ezltal cskkentik a pH-t, amely nem kedvez a Gram negatv baktriumok szaporodsnak.- hidrognperoxidot termelnek, amely kztudottan ers oxidlszer - bakteriocineket termelnek, amely a sejtmembrnt krostja- gtoljk a patogn baktriumok megtapadstHatssal vannak az immunrendszer sejtjeire, cskkentve egyes helyi gyulladsok kialakulst.

A kutatsom clja az volt, hogy sajtokbl izollt tejsavbaktriumokat szelektljak bizonyos probiotikus tulajdonsgok alapjn.Ehhez els lpsben tejsavbaktriumokat izolltam olyan sajtokbl, amelyek nem kereskedelmi starter kultrkkal voltak beoltva. Az izollshoz szelektv tptalajra volt szksgnk, amelyen csak a tejsavbaktriumok fejldnek ki. A szntenyszetek ltrehozsa utn morfolgia s biokmiai teszteknek vetettk al az izoltumokat. Csak a Gram pozitv s katalz negatv trzsket rdemes tovbbi ksrletekre felhasznlni.

Az els szelekcis kritrium az emsztrendszer egyes szakaszain val tljuts volt. Ezrt mestersges gyomornedv s vkonyblnedv oldatokat ksztettem. A gyomornedv oldat tulajdonkppen egy 2-es pH-j ssav oldat volt, mg a vkonyblnedv epeskat tartalmaz s a pH-ja a vkonybl els szakasznak pH-jhoz hasonlan 8-as.Ezekbe az oldatokba baktrium szuszpenzit tettnk s inkubltuk 9o ill. 18o percig. Az inkubls eltt s utn mintt vettnk s szmoltuk a telepkpz egysgek szmt minden esetben.

A kivlasztott izoltumokbl szrmaz baktriumok tapadsi kpessgt vizsgltuk blhmsejetekhez in vitro krlmnyek kztt. A tapadsvizsglat abbl ll, hogy a microplate-en megtapadt epitliumsejtekkel egytt inkubljuk a baktriumsejteket, majd lemossuk a nem tapadtakat, Gram szerint megfestjk, majd mikroszkpi megfigyelssel megllaptjuk egy adott epitliumsejthez tapadt baktriumsejtek szmt.t patogn baktriumtrzset vlasztottunk ki, hogy vizsgljuk a tejsavbaktriumok hatst ezek szaporodsra.A kvetkez diagramm a savtolerancia-teszt vgeredmnyeit mutatja sszestve, itt az els oszlop minden esetben a kezdeti sejtszm, mg a mellette lv a kezels utni vgs sejtszmot adja a kezdetihez viszonytva %ban kifejezve. A vizsglt trzsek kzl 26 esetben nincs tlls a 9o perces inkubls vgn. Ngy trzs esetn figyelhet meg magas savtolerancia, 11 trzset vlasztottunk ki a tovbbi ksrletekhez.A kvetkez diagramm az epes tolerancia-teszt vgeredmnyeit mutatja sszestve, itt az els oszlop minden esetben a kezdeti sejtszm, mg a mellette lv a kezels utni vgs sejtszmot adja a kezdetihez viszonytva %ban kifejezve. Csupn ngy izoltum esetn figyelhet meg tlls, ezt a ngyet vlasztottuk ki a tovbbi ksrletekhez.

A tapadsvizsglat eredmnye a baktrium- s epitliumsejtek egytt inkublsa utni Gram-fests utn volt leolvashat. A vizsglt trzsek tapadsi kpessge jnak bizonyult, sszehasonltva elz, elismert probiotikus trzsekkel vgzett tapadsi kpessg-vizsglat eredmnyvel. t patogn baktriumtrzset vlasztottunk ki, hogy vizsgljuk a tejsavbaktriumok hatst ezek szaporodsra. Ezek kzl a Salmonella enteritidis esetn volt megfigyelhet gtls. Az brn Salmonella enteritidissel beoltott tptalajban lyukak lthatak, ebbe pipettztuk a tejsavbaktriumok 1o napos tenyszeteinek fellszjt. A 2, 3,4 es helyen gtlsi zna alakult ki.