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GUILHERME OSCAR HINING
EXTRAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE AFLATOXINAS POR CROMATO GRAFIA EM
CAMADA DELGADA
CANOAS, 2011
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GUILHERME OSCAR HINING
EXTRAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE AFLATOXINAS POR CROMATO GRAFIA EM
CAMADA DELGADA
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao Curso de Química do Centro Universitário La Salle – Unilasalle como exigência parcial para obtenção do grau de Bacharel em Química.
Orientação: Profª. Drª. Marisa Tsao
CANOAS, 2011
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GUILHERME OSCAR HINING
EXTRAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE AFLATOXINAS POR
CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA
Aprovado pelo avaliador em 15 de dezembro de 2011.
AVALIADOR:
_____________________________
Profª. Drª. Marisa Tsao
Unilasalle
Trabalho de Conclusão aprovado como requisito parcial para a obtenção do grau de Bacharel em Química pelo Centro Universitário La Salle – Unilasalle
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RESUMO
As micotoxinas são metabólitos secundários altamente tóxicos produzidos por
algumas cepas de fungos. Dentre as toxinas mais perigosas, encontram-se as
aflatoxinas, que representam grande risco a saúde humana e animal sendo
potencialmente carcinogênicas.
A contaminação por aflatoxinas pode representar prejuízos econômicos e sérios
danos à saúde, sendo pertinente, medidas de controles sistemáticos desta toxina
por meio de monitoramento e a fiscalização dos alimentos.
A química analítica mostra-se aliada neste contexto. Através dos ensaios analíticos é
possível a extração da toxina dos alimentos e a sua posterior quantificação pela
técnica da cromatografia em camada delgada (CCD). Embora existam outras
técnicas para quantificação desta toxina, a CCD é uma técnica bastante usada,
principalmente, em países em desenvolvimento por não requisitar grandes aparatos
tecnológicos e apresentar resultados analíticos satisfatórios e que foi objeto deste
trabalho de conclusão de curso.
Foram analisadas 48 amostras, entre elas, amendoim e derivados de milho, que
pertencem ao grupo de alimentos de alta suscetibilidade de contaminação por
aflatoxinas. Os resultados das análises mostraram que as aflatoxinas continuam a
contaminar alimentos para consumo humano, inclusive, com níveis de contaminação
superior ao limite máximo permitido pela legislação do país.
Palavras-chave: Aflatoxinas. Ensaios analíticos. Cromatografia em camada delgada.
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ABSTRACT
Mycotoxins are highly toxic secondary metabolites produced by some strains of fungi.
Among the most dangerous toxins, are the aflatoxins, which represent a great risk to
human and animal health being potentially carcinogenic.
The aflatoxin contamination may represent economic losses and serious damage to
health, and relevant control measures of this toxin through systematic monitoring and
surveillance of food.
The analytical chemistry appears to be allied in this context. Through the analytical
tests it is possible to extract the toxin from food and their subsequent quantification
by the technique of thin layer chromatography (TLC). Although there are other
techniques for quantification of this toxin, the TLC is a technique widely used,
especially in developing countries for not ordering large technological devices and
present analytical results were satisfactory and that the subject of this course
conclusion.
We analyzed 48 samples, including, peanuts and corn derivatives, which belong to
the high susceptibility of food contamination by aflatoxins. The test results showed
that aflatoxins continue to contaminate food for human consumption, even with
contamination levels exceed the maximum allowed by law in the country.
Key-words: Aflatoxins. Analytical tests. Thin layer chromatography.
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Estrutura química das aflatoxinas ............................................................ 16
Figura 2 – Núcleo furano e cumarina ........................................................................ 17
Figura 3 – Biotransformação da aflatoxina B1. .......................................................... 29
Figura 4 – Aflatoxina B2 ............................................................................................. 30
Figura 5 – Carta controle ........................................................................................... 39
Figura 6 – Etapas da extração das aflatoxinas.......................................................... 44
Figura 7 – Delimitação da cromatofolha .................................................................... 47
Figura 8 – Placa de camada delgada com amostra de castanha-do-pará
sob luz UV (comprimento de onda de 366 nm) ......................................... 48
Figura 9 – Delimitação da placa de camada delgada bidimencional ......................... 50
Figura 10 – Distribuição das regiões de amostragem ............................................... 53
Figura 11 – Distribuição das amostras analizadas .................................................... 54
Figura 12 – Percentual de amostras contaminadas .................................................. 55
Figura 13 – Grupos de aflatoxinas identificados nas amostras contaminadas .......... 56
Figura 14 – Panorama geral do estudo realizado ...................................................... 57
Figura 15 – Relação entre origem das amostras e contaminação ............................ 58
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 – Alimentos e o risco de contaminação por tipo de micotoxina ................. 21
Quadro 2 – Absorbância das soluções ...................................................................... 37
Quadro 3 – Valores de absortividade molar (ε) das aflatoxinas em acetonitrila
em 350 nm ............................................................................................. 38
Quadro 4 – Limite máximo tolerado (LMT) das aflatoxinas em alguns alimentos ..... 40
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Principais fungos e suas toxinas. ............................................................ 19
Tabela 2 – Classificação dos alimentos conforme sua atividade de água ................ 24
Tabela 3 – Atividade de água para algumas espécies fúngicas ................................ 25
Tabela 4 – Limite mínimo da umidade relativa do ar ................................................. 25
Tabela 5 – Temperaturas para produção e crescimento das aflatoxinas .................. 26
Tabela 6 – Toxicidade de algumas aflatoxinas.......................................................... 31
Tabela 7 – Distribuição das amostras ....................................................................... 52
Tabela 8 – Amostras de outros estados .................................................................... 53
Tabela 9 – Tipos de amostras e sua contaminação .................................................. 54
Tabela 10 – Aflatoxinas quantificadas nas amostras contaminadas ........................ 55
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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
Afla. Aflatoxina
AFB1 ou B1 Aflatoxina B1
AFB2 ou B2 Aflatoxina B2
AFG1 ou G1 Aflatoxina G1
AFG2 ou G2 Aflatoxina G2
AM Amostra
ANVISA Agência Nacional Vigilância Sanitária
AOAC Association of Official Analytical Chemists
C Concentração (mol/L)
CCD (TLC) Cromatografia em camada delgada
DNA Ácido desoxirribonucléico
EP Ensaio de proficiência
FC Fator de correção
FEPPS Fundação Estadual de Produção e Pesquisa em Saúde
FR Formulário de registro
HPLC High performance liquid chromatography
HMF High moisture food
INMETRO Instituto Nacional de Metrologia
IPB Instituto de Pesquisas Biológicas
IMF Intermediate moisture food
LACEN Laboratório Central de Saúde Pública
LMF Low moisture food
LD Limite de detecção
LQ Limite de quantificação
LMT Limite máximo tolerado
MM Massa molecular
NBR Norma Brasileira de Regulamentação
P Padrão
PEMQSA Programa Estadual de Monitoramento e Qualidade Sanitária dos
Alimentos
RBC Rede Brasileira de Calibrações
RS Rio Grande do Sul
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RF Fator de retenção
RDC Resolução da Diretoria Colegiada
SVS Secretaria de Vigilância em saúde
TFA Ácido trifluoracético
UV Ultra violeta
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LISTA DE SÍMBOLOS
A Absorbância
aw atividade da água
ε Absortividade molar
Absortividade molar média
cm centímetro
λ comprimento de onda
ºC grau centígrado
kg quilograma
g grama
h hora
min minuto
µg micrograma
mL mililitro
µL microlitro
nm nanômetro
ppb partes por bilhão
T Temperatura
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SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 13
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .......................... ....................................................... 14
2.1 Contaminação por aflatoxinas .................. ....................................................... 14
2.1.1 Natureza química das aflatoxinas .................................................................... 15
2.2 Fungos ........................................ ....................................................................... 16
2.2.1 Ocorrência e condições de contaminação........................................................ 18
2.2.2 Medidas preventivas ........................................................................................ 21
2.3 Produção e condições para o crescimento de mico toxinas ......................... 21
2.3.1 Substrato .......................................................................................................... 22
2.3.2 Atividade de água (aw) ..................................................................................... 22
2.3.3 Temperatura ..................................................................................................... 24
2.4 Origem da contaminação de alimentos por micotox inas .............................. 25
2.4.1 Descontaminação e inativação de micotoxinas ................................................ 26
2.5 Biotransformação das aflatoxinas ................................................................... 27
2.6 Toxicidade .................................... ...................................................................... 29
2.7 Detecção das aflatoxinas ...................... ............................................................ 30
2.8 Controle de qualidade de ensaios analíticos ... ............................................... 31
2.8.2 Ensaio de proficiência ...................................................................................... 32
2.9 Padrões de aflatoxinas ........................ ............................................................. 33
2.9.1 Cuidados com padrões de aflatoxinas ............................................................. 34
2.9.2 Determinação da concentração das soluções de trabalho dos padrões .......... 35
2.10 Legislaçãosobre micotoxinas ........................................................................ 38
2.11 Fiscalização ..................................................................................................... 39
3 PARTE EXPERIMENTAL .............................. ........................................................ 40
3.1 Metodologia analítica ........................................................................................ 40
3.2 Materiais e equipamentos ...................... ........................................................... 40
3.3 Reagentes ..................................... ..................................................................... 41
3.4 Descrição do método ........................................................................................ 42
3.4.1 Amostrageme extração .................................................................................... 44
3.4.2 Purificação ........................................................................................................ 44
3.4.3 Partição líquido-líquido ..................................................................................... 44
3.4.4 Concentração e ressuspensão ......................................................................... 45
3.4.5 Determinação e quantificação das aflatoxinas ................................................. 45
12
3.4.6 Confirmação ..................................................................................................... 48
3.4.7 Cálculo ............................................................................................................. 49
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO .......................... ................................................... 51
5 CONCLUSÃO ....................................... ................................................................. 58
REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 59
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1 INTRODUÇÃO
As aflatoxinas são um grupo de furanocumarinas altamente tóxicas produzidas
por algumas cepas de fungos, principalmente, Aspergillus Flavus e Aspergillus
Parasiticus. Nos anos 80, a Vigilância Sanitária do Distrito Federal detectou a
presença de aflatoxinas em amendoins e derivados destinados ao consumo
humano. Desde então, a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), através
de programas como, Programa Estadual de Monitoramento e Qualidade Sanitária
dos Alimentos (PEMQSA), monitora e avalia a qualidade dos alimentos
comercializados no país no que tange à micotoxinas, especialmente, às aflatoxinas.
A principal proposta deste trabalho é apresentar os níveis de contaminação por
aflatoxinas em produtos de alta suscetibilidade, como amendoim ederivados e
também, derivados de milho, oferecidos ao consumo humano no estado do Rio
Grande do Sul. As amostras foram provenientes, na sua maioria, do PEMQSA e
analisadas entre os meses de agosto e novembro de 2011 no Laboratório de
Micotoxinas vinculado a Seção de Contaminantes pertencente ao Instituto de
Pesquisas Biológicas - Laboratório Central de Saúde Pública - IPB-LACEN/RS,
usando-se a técnica de extração publicada pela Association of Official Analytical
Chemists (AOAC) e Cromatografia em Camada Delgada (CCD) para quantificação
das amostras.
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2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Contaminação por aflatoxinas
Os primeiros relatos da presença de micotoxinas ocorreram na Europa e na
Ásia provocando epidemias em humanos e animais levando milhares a morte. Na
época, suspeitava-se que a origem destes surtos estavam relacionados à dieta
alimentar
As aflatoxinas foram descobertas em 1960, após mortandade de milhares de
perus jovens ocorrido na Inglaterra, os quais, teriam sido alimentados com ração à
base de amendoim contaminado proveniente do Brasil e da África. “As aves afetadas
morriam geralmente dentro de uma semana, sendo seus sintomas, a perda de
apetite, diminuição da mobilidade, fraqueza das asas, das pernas. A necropsia
sempre revelava lesões necróticas no fígado e congestionamento nos rins.”
(STEVENS et al., 1960 apud MOLIN; VALENTINI, 1999, p. 1).
Segundo a Food Ingredients Brasil (2009) e Jay (2005), a partir da ração que
causou a morte dos animais na época, foram isolados Aspergillus flavus e uma
toxina produzida por esse fungo, a qual foi designada aflatoxina (toxina do
Aspergillus flavus – A-Afla toxina).
Em 1963, pesquisadores separaram, por cromatografia em papel, as
aflatoxinas B e G, assim classificadas por apresentar fluorescência azul (B = blue)
everde (G = green) quando observadas sob luz ultravioleta (366 nm), devido ao anel
furocumarínico. Posteriormente, um grupo de pesquisadores da Inglaterra isolou por
diferenças de mobilidade em cromatografia de camada delgada quatro toxinas:
Aflatoxinas B1, B2, G1 e G2. A partir desta descoberta, as atenções e estudos sobre
micotoxinas vem sendo intensificadas.
Molin e Valentini (1999) relatam sobre a descoberta das fórmulas estruturais
das aflatoxinas B e G, elucidadas em 1963 por Asao et al. (1963) e por Van der
Merwe et al. (1963). A fórmula estrutural da aflatoxina B2 foi determinada
simultaneamente por Chang et al. (1963) nos EUA e por Van Dorp et al. (1963) na
Bélgica e, posteriormente, na Escócia, foi determinada a estrutura química da AFG1
por Cheung e Sim (1964).
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Na Figura 1 abaixo, é representado à estrutura química de cada uma das
quatro principais aflatoxinas: onde AFB1 representa a aflatoxina B1, AFB2 a
aflatoxina B2, AFG1 a aflatoxina G1 e AFG2 representa a aflatoxina G2.
Figura 1– Estrutura química das aflatoxinas
Fonte: Freire et al., 2007.
2.1.1 Natureza química das aflatoxinas
Conforme Araujo (2006) apud kwiatkowski e Alves (2007), as aflatoxinas
pertencem à classe de compostos químicos denominados furanocumarinas.
Possuem um núcleo cumarina associado ao furano e a lactona (Figura 2). As
aflatoxinas do grupo B possuem anel ciclopentona e o grupo G, lactonas
insaturadas, enquanto grupo M são derivados hidroxilados de B1 e B2. As
aflatoxinas são substâncias lipofílicas de baixa massa molecular, onde AFB1, AFB2,
AFG1, AFG2 tem massa molecular de 312, 314, 328, 330 g/mol, respectivamente.
As aflatoxinas são cumarinas altamente substituídas com mais de 18 toxinas
conhecidas. A aflatoxina B1 é produzida por todos os fungos produtores de
aflatoxinas e tem em AFM1 como produto hidroxilado da AFB1. A AFM1 é encontrada
no leite, urina e fezes de animais como um produto metabólico.
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Figura 2 – Núcleo furano e cumarina
Furano Lactona
(cumarina)
Fonte: Solomons; Fryhle, 2000.
Hoje, sabe-se que das micotoxinas, as aflatoxinas B1, B2, G1, G2 são as mais
importantes. Contaminam facilmente grãos e cereais e são altamente tóxicas e
facilmente entram na cadeia alimentar, seja humana ou animal. “A aflatoxina B1 é o
composto com maior atividade carcinogênica que se conhece, não sendo
desprezível sua atividade mutagênica.” (GOMPERTZ et al., 2002, p. 424).
2.2 Fungos
Os fungos formam filamentos denominados hifas, que em conjunto formam
micélios, os quais, são responsáveis pela fixação dos bolores no substrato e
posterior reprodução. O micélio, também dá aspecto característico às colônias que
forma: “Estas colônias podem ter um aspecto cotonoso, ser secas, úmidas,
compactas, aveludadas, gelatinosas, com variadas colorações.” (FRANCO e
LANDGRAF, 2003, p.3).
Conforme Antón e Lizaso (2001), os fungos que crescem nos alimentos são
conhecidos pelo homem desde a antiguidade. Ele os tem utilizado em seu próprio
beneficio, tanto para melhorar alimentos, como para fins terapêuticos (antibióticos).
“As principais espécies fúngicas produtoras de toxinas pertencem aos gêneros:
Alternaria, Aspergillus, Claviceps, Fusarium, Penicillium, Phitomyces, Myrothecium,
Stachybotrys e Phoma.” (GOMPERTZ et al., 2002, p. 423). Alguns destes gêneros
são toxigênicos, deterioradores de alimentos e produtores de micotoxinas.
Jay (2005) cita que micotoxinas são metabólitos secundários formados durante
a fase exponencial de crescimento dos fungos não tendo significância para o
crescimento ou metabolismo do organismo produtor. No entanto, quando
aminoácidos, acetatos, piruvatos e outros precursores primários são formados em
17
grandes quantidades, a síntese dessas substâncias em micotoxinas pode ser uma
maneira natural dos fungos reduzirem tais precursores. “Elas são substâncias
químicas [...] não são essenciais ao crescimento e ao desenvolvimento dos fungos, o
que significa dizer, que mesmo na ausência destas, há crescimento e
desenvolvimento fúngico.” (MOLIN; VALENTINI, 1999, p. 1).
Conforme Sabino et al. (2008), a produção de micotoxinas pelos fungos
também necessita que condições ambientais como, temperatura e umidade sejam
favoráveis, além disso, necessitam que características bioquímicas nos substratos
propiciem a sua produção e crescimento.
Freire et al. (2007) cita que as micotoxinas podem entrar na cadeia alimentar
humana e animal por meio de contaminação direta ou indireta. A contaminação
indireta de alimentos e rações ocorre pela contaminação prévia de fungo toxigênico,
bem como, a produção de micotoxinas, e mesmo que o fungo tenha sido eliminado
durante o processamento, essas toxinas ainda permanecerão no alimento. A
contaminação direta ocorre quando um fungo toxigênico coloniza alimentos com
posterior formação de micotoxinas e a ingestão.
“Entre as principais micotoxinas de interesse na área de alimentos citamos:
aflatoxinas, patulina, ocratoxina, zearalenona, tricotecenos, fumosinas.” (SABINO et
al., 2008, p. 761). A Tabela 1 apresenta as principais toxinas geradas por fungos,
seus substratos predominantes e os efeitos sobre a saúde humana e animal.
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Tabela 1 – Principais fungos e suas toxinas
Principais substratos
Principais fungos produtores
Principal toxina Efeitos
Amendoim, milho. Aspergillus flavus e
Aspergillus parasiticus
Aflatoxina B1 Hepatotóxica, nefrotóxica,
carcinogênica.
Trigo, aveia, cevada, milho e
arroz. Penicillium citrinum Citrinina Nefrotóxica para
suínos
Centeio e grãos em geral.
Claviceps purpúrea Ergotamina Gangrena de extremidades,
convulsões
Milho Fusarium
verticillioides Fumonisinas Câncer de esôfago
Cevada, café, vinho.
Aspergillus ochraceus e Aspergillus carbonarius
Ocratoxina Hepatotóxica, nefrotóxica,
carcinogênica.
Frutas e sucos de frutas
Penicillium expansum e Penicillium
griseofulvum
Patulina Toxicidade vagamente
estabelecida
Milho, cevada,
aveia, trigo, centeio.
Fusarium sp Myrothecium sp Stachybotrys sp Trichothecium sp
Tricotecenos: T2,
neosolaniol, fusanona x, nivalenol,
deoxivalenol.
Hemorragias, vômitos,
dermatites.
Cereais Fusarium
graminearum Zearalenona
Baixa toxicidade; síndrome de
masculinização e feminização em
suínos
Fonte: Food Ingredients Brasil, 2009.
2.2.1 Ocorrência e condições de contaminação
Para Kwiatkowski e Alves (2007) e Molin e Valentini (1999) a infecção fúngica
nas plantas, seu crescimento e a posterior produção de micotoxinas em alimentos
pode ocorrer sob várias condições e, de modo geral, podemos dividir os fungos
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produtores de micotoxinas em dois grupos principais: os fungos de campo ou pré-
colheita, que são aqueles em que a contaminação inicia-se no plantio e vai até
depois da safra, e fungos de armazenamento, que atacam após a colheita, durante a
silagem.
Conforme Molin e Valentini (1999), os fungos de campo são mais toxigênicos,
pois tem longo período para se desenvolver nas plantas, considerando-se ainda, que
elas ficam sujeitas as intempéries climáticas, como: geadas, granizo, chuva em
excesso ou falta, extremos de temperaturas; condições do solo e relevo, como: falta
de nutrientes, competição com plantas invasoras, ação de roedores e condições de
manejo como: plantio em época errada, atraso na colheita ou fora do tempo. Já os
fungos de armazenamento ou pós-colheita ocorrem, principalmente, devido ao
manejo inadequado durante e após a colheita, com armazenagem e silagens mal
conduzidas, como por exemplo, grãos armazenados com altos teores de umidade,
silos mal vedados, fermentação da silagem, ação de roedores e insetos.
Os fungos têm grande capacidade de adaptação e podem se desenvolver em
quase todas as plantas no campo, tipos de cereais, oleaginosas ou em ingredientes
de ração armazenada para consumo posterior. “Em quase todas as matérias-primas
destinadas a gêneros alimentícios, tais como: arroz, milho, feijão, trigo, cevada, soja,
castanha-do-pará, nozes, amendoim, café, sorgo, [...] já foram detectados um ou
mais tipos de micotoxinas.” (SABINO et al., 2008, p. 761.). No entanto, a presença
de fungos não significa contaminação por micotoxinas. Jay (2005) cita que o
crescimento de fungos produtores de toxinas, podem sob determinadas
circunstâncias, não produzir tais toxinas porque tais toxinas não são essenciais ao
crescimento do fungo.
Os alimentos que apresentam maior risco de contaminação por aflatoxinas são
respectivamente, amendoim e milho, conforme Quadro 1.
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Quadro 1 – Alimentos e o risco de contaminação por tipo de micotoxina
Alimento Fungo Micotoxina Risco de contaminação
Amendoim, amêndoas
Aspergillusflavus Aflatoxina alto
Milho
A. flavus Aflatoxina
Fusarium spp Tricotecenos alto
F. moniliforme Zearalenona
Sorgo
Fusarium spp Tricotecenos
Alternaria spp Alternariol, metil etil
alternariol Ac. Tenuazônico,
alto
A. flavus Aflatoxina
Penicillium spp Ocratoxina, Ac. Ciclopiazônico,
tremorgênio, citrinina
Trigo Alternaria spp Alternariol, metil etil
alternariol Ac. Tenuazônico,
moderado
Fusarium spp Tricotecenos
F. graminearum Deoxinivalenol
Cevada P. verrucosum Ocratoxina
Farinha Penicillium Várias
Cereais matinais à base de milho
Fusarium spp Aspergillus
flavus
Tricotecenos, Fumonisinas Aflatoxinas
Cereais matinais à base de trigo
Fusarium spp Tricotecenos Moderado
Queijo Penicillium Várias
Carnes process.salame
Penicillium Várias
Leite e queijo Resíduos Aflatoxina M
Ovos Resíduos Aflatoxinas, ocratoxinas,
tricotecenos
Maçã Penicillium Patulina
Fonte: Adaptado de Taniwaki et al., 2011.
21
A razão pela qual a ocorrência de aflatoxinas é alta em amendoim não foi
completamente estabelecida. Um dos motivos pode ser atribuído ao fato de que A.
Flavus e A. Parasiticus dominarem na micoflora em solos de plantio de amendoim.
(MACHINSKI JUNIOR, 2011).
2.2.2 Medidas preventivas
A prevenção ao crescimento fúngico e produção de micotoxinas é complexa e
pode envolver inúmeras condições. A redução da atividade de água, secagem
rápida e armazenagem com condições controladas de umidade e temperatura,
remoção de unidades danificadas e grãos contaminados, ajuda na prevenção ao
crescimento dos fungos. O uso de cultivares resistentes para amendoim e algumas
práticas, como calagem, secagem e escolha de tipos de solo que interferem na
biossíntese das aflatoxinas. Além disso, cuidar a época de colheita, evitando que o
alimento fique mais tempo exposto, aumenta a segurança do alimento e inibe o
desenvolvimento dos fungos micotoxigênicos. (VIEGAS et al., 2005, ROSSETO et
al., 2003 e FERNADEZ et al., 1997 apud KWIATKOWSKI; ALVES, 2007)
2.3 Produção e condições para o crescimento de mico toxinas
Kwiatkowski e Alves (2007) citam que micotoxinas são encontradas
mundialmente e que regiões que tenham temperatura e umidade alta são as
principais áreas de ocorrência. Neste contexto, o Brasil, devido às condições
climáticas favoráveis, dispõe de condições ideais para o desenvolvimento de fungos.
“O Brasil, devido à prevalência de clima tropical, apresenta condições ideais
para o desenvolvimento desses fungos.” (KWIATKOWSKI; ALVES, 2007, p. 46).
Amaral e Machinski Junior (2006), citam que as aflatoxinas são produzidas por
três espécies de Aspergillus: A. flavus, A. parasiticus e A. nomius. A. Flavus produz
apenas aflatoxinas do grupo B (aflatoxinas B1 e B2), enquanto A. Parasiticus e A.
Nomius produzem aflatoxinas dos grupos B e G (aflatoxinas B1, B2, G1 e G2).
Os fatores mais importantes para produção de micotoxinas são citados: “sendo
que a temperatura, a umidade e o tipo de substrato são os mais importantes.”
(MALLOZZI; CORRÊA, 1998 apud GONÇALEZ et al., 2001, p. 15).
22
2.3.1 Substrato
Alguns substratos são mais suscetíveis ao desenvolvimento de micotoxinas
que outros, principalmente devido ao seu teor de carboidratos. Franco e Landgraf
(2003), cita que além de carboidratos, também substratos ricos em proteínas e
gorduras favorecem a produção de aflatoxinas. “Sementes oleaginosas, como
amendoim e castanha do Brasil também são suscetíveis.” (TANIWAKI et al., 2011,
p.46).
2.3.2 Atividade de água (aw)
Percebe-se que da discussão anterior, a disponibilidade de água também é
fundamental para o crescimento de aflatoxinas. Em geral, a forma mais adequada de
quantificá-la é através de atividade de água (aw), que é a relação entre a pressão de
vapor de um determinado material (P) e a pressão de vapor da água pura (Po), nas
mesmas condições. Em termos práticos, a aw de um alimento reflete a quantidade de
água livre disponível, isto é, a água não comprometida com ligações químicas,
dissolução de solutos, metabolismos, entre outros. “A água existente nos alimentos
nem sempre se encontra disponível para o fungo porque alguns substratos estão
fortemente ligados à água, retendo-a, dificultando sua absorção.” (SCUSSEL, 1998;
MALLOZZI; CORREA, 1998 apud GONÇALEZ et al., 2001, p. 15) .
Nem toda a água do grão está igualmente disponível. Alguma água está fortemente adsorvida nos constituintes do grão através de pontes de hidrogênio de alta energia, inicialmente numa monocamada de moléculas e é referida como água ligada. Fora desta camada a água vai se tornando cada vez mais fracamente ligada quanto mais longe estiver dos constituintes do grão. Eventualmente as moléculas de água vão ficando livres de ligações químicas, mas são retidas em microporos, [...]. À medida que os poros enchem, a água que eles contêm torna-se cada vez mais prontamente disponível aos microrganismos até o grão se saturar e a água ficar completamente disponível. (MOLIN; VALENTINI, 1999, p.10).
Considerando-se a necessidade da disponibilidade de água livre para o
crescimento de microorganismos, sua ausência, torna-se fator limitante para o
crescimento e a velocidade de multiplicação desses seres, retardando a
contaminação e a deterioração dos alimentos.
23
Na Tabela 2, é apresentada a classificados os alimentos quanto aos limites de
atividade de água (aw) presente em sua composição:
Tabela 2– Classificação dos alimentos conforme sua atividade de água (aw)
Classificação do Alimento Atividade de água ( aw)
alta umidade ou High Moisture Food– HMF aw > 0,90
intermediária ou Intermediate Moisture Food – IMF aw entre 0,89 e 0,60
baixa umidade ou Low Moisture Food – LMF
aw < 0,60
Fonte:Landgraf e Franco, 2003.
Conforme Gonçalez et al. (2001) o Aspergillus flavus requer uma atividade de
água mínima entre 0,78 e 0,80 para o crescimento e 0,83 a 0,87 para produção de
toxina. Para Franco e Landgraf (2003) os alimentos com atividade de água entre
0,80 e 0,85, a deterioração ocorre dentro de uma a duas semanas, causada por uma
grande variedade de fungos. Com aw igual 0,75 a deterioração é retardada e a 0,70
ou inferior, pode não ocorrer. Citam ainda, o conceito “água de alarme” (alarm water)
como parâmetro para estimar a estabilidade de alimentos desidratados durante o
armazenamento. Está relacionado à quantidade de água que não deve ser excedida
e assim, evitar o crescimento de fungos.
Marthe Calanog (1976) apud Jay (2005), relata que em aw 0,94 a temperatura
ótima para produção de aflatoxina B1 é de 24º C.
A Tabela 3, mostra a atividade de água (aw) mínima e atividade de água (aw)
ótima para crescimento e produção de aflatoxinas.
24
Tabela 3 – Atividade de água (aw) para algumas espécies fúngicas
Espécie Fúngica aw mínima aw ótima Processo
A. flavus 0,80 0,98 Crescimento
A. flavus 0,82 0,95 - 0,99 Produção
A. parasiticus 0,80 - 0,83 0,99 Crescimento
A. parasiticus 0,86 - 0,87 0,95 Produção
Fonte: Adaptado de Pitt & Hocking, 2009, apud Taniwaki et al., 2011.
De acordo com Taniwaki et al. (2011, p. 46), “a maioria dos fungos requer
umidade relativa acima de 80% e um mínimo de aw para crescer.” Os limites
mínimos de umidade para crescimento de A. flavus e produção de aflatoxinas em
diferentes alimentos estão relacionados na Tabela 4.
Tabela 4 – Limite mínimo da umidade relativa do ar para crescimento de aflatoxinas
Umidade (%) Alimento
18 Trigo, milho e sorgo
16,5 Arroz não beneficiado
17,5 Arroz beneficiado
17 – 18 Soja
9 – 10 Amendoim
Fonte: Taniwaki et al., 2011.
2.3.3 Temperatura
A temperatura é outro fator importante para o crescimento dos fungos, a
produção de micotoxinas e conseqüentemente, a contaminação de alimentos por
estas toxinas. Sua variação influencia e caracteriza os mínimos e máximos de
crescimento fúngico, em conjunto com outros fatores, como substrato e aw. De uma
forma geral, a temperatura ótima para produção de toxinas encontra-se entre o
mínimo e o máximo da temperatura de crescimento.
25
Segundo a Food Ingredients Brasil (2009, p. 37), “A temperatura ótima para o
crescimento de micotoxinas esta determinado entre 24 °C e 28 °C”. Christensen
(1971) apud Jay (2005) relata que sob condições ideais de crescimento algumas
aflatoxinas podem ser detectadas em 24 horas ou dentro de 4 a 10 dias.
Tabela 5 – Temperaturas para produção e crescimento das aflatoxinas
Espécie Fúngica T. mínima (°C)
T. ótima (°C)
T. máxima (°C) Processo
A. flavus 10 - 12 33 43 - 48 crescimento
A. flavus 13 16 - 31 37 produção
A. parasiticus 12 32 42 crescimento
A. parasiticus 12 - 40 produção
Fonte: Adaptado de Pitt & Hocking, 2009 apud Taniwaki et al., 2011.
2.4 Origem da contaminação de alimentos por micotox inas
Para Sabino et al. (2008) cita que devido aos graves problemas que as
micotoxinas podem acarretar, muitos países tem estabelecido medidas para o seu
controle nos alimentos destinados ao consumo humano e também animal.
“Programas de monitoramento dos níveis de contaminação de alimentos por
micotoxinas são essenciais para estabelecer prioridades em ações de vigilância
sanitária.” (CALDAS et al., 2002, p. 320.).
Considerando que o Brasil é um grande produtor e exportador de grãos e
carne, problemas decorrentes da contaminação por micotoxinas resultariam, além
dos problemas de relacionados à saúde pública, em sérios prejuízos econômicos.
“Cada vez maior o número de países que importam e exportam, [...] leva a novos
desafios para a indústria alimentícia e para os órgãos reguladores responsáveis pelo
cumprimento das normas relativas à inocuidade dos alimentos comercializados e a
proteção dos consumidores.” (SABINO et al., 2008, p. 761.). Conforme Molin e
Valentini (1999), a contaminação de silagens, cereais e rações pode gerar danos à
saúde animal, como: diminuição da produtividade, problemas na reprodução,
26
retardado no ganho de peso para animais confinados, pré-disposição a doenças e a
morte dos animais.
Preocupados com a saúde pública, governantes mantêm políticas de
monitoramento destas toxinas, como por exemplo, o Programa Estadual de
Monitoramento e Qualidade Sanitária dos Alimentos (PEMQSA), que desde 2003,
através da parceria entre estado, municípios e a vigilância sanitária, disponibiliza
material humano e recursos financeiros para a obtenção de amostragens, a
realização das análises e laudos técnicos e, a manutenção contínua da fiscalização
de alimentos.
Neste contexto, o Laboratório Central de Saúde Pública – LACEN/RS,
instituição vinculada a Fundação Estadual de Produção e Pesquisa em Saúde –
FEPPS, através do seu Laboratório de Micotoxinas, realiza o monitoramento dos
níveis de aflatoxinas em alimentos consumidos no Rio Grande do Sul. Utilizando
metodologias analíticas adequadas, pesquisa e fiscaliza a presença, principalmente,
das aflatoxinas B1, B2, G1, G2 em alimentos, como: milho e derivados, amendoim e
derivados, trigo e derivados, arroz, castanhas e nozes comercializados no estado.
2.4.1 Descontaminação e inativação de micotoxinas
Não são conhecidos métodos de descontaminação aplicados a produtos
destinados à alimentação capazes de garantir 100 % da qualidade do alimento. Por
isso, a prevenção ainda é o melhor método para controlar micotoxinas em alimentos.
Conforme Sekiyama (2006), deve-se atentar que os testes que demonstraram ser
eficazes in vitro, não apresentaram, necessariamente, a mesma efetividade ao
serem realizados in vivo. Resultados, muitas vezes satisfatórios na eliminação das
contaminações causadas pelos fungos, porém, podem interferir na qualidade dos
alimentos e suas propriedades organolépticas. Perda de nutrientes,
descaracterização da aparência, odores e, em outros, a presença residual de
produtos químicos podem deixar o alimento impróprio para o consumo, tanto na
forma de ração animal quanto para alimentação humana.
Por exemplo, o calor usado no processamento dos alimentos não é eficiente
para neutralizar a ação das aflatoxinas. Franco e Landgraf (2003) citam que
amendoim contaminado quando torrado pode reduzir AFB1 em 70% e AFB2 em 45%.
Prado e Oliveira (1996), fizeram a torração do amendoim com forno de microondas e
27
observaram que em potência máxima de 0,8 kW, por 6 minutos foi capaz de destruir
de 41,52 a 69,56% do total de aflatoxinas presentes em uma amostra previamente
contaminada.
O emprego de calor e hidróxido de sódio mostrou-se eficiente na inativação das
aflatoxinas quando aplicado sobre grãos de milho armazenados. Segundo Camou-
Arriola e Prince (1989) apud Jay (2005), milho naturalmente contaminado com 1600
ppm de aflatoxina quando tratado com de NaOH a 3% e a 100 ºC por 4 minutos, e
posteriormente processado e frito resultou na destruição de 99% da aflatoxina.
Labuza (1983) apud Jay (2005) relatou que AFB1 e AFB2 foram reduzidas em
sementes milho pela ação do bissulfito de sódio, o qual, tem ação antimicrobiana
comparável à do ácido propiônico.
Franco e Landgraf (2003) consideram que a circulação de amônia sobre grãos
de milho durante o armazenamento pode inativar aflatoxinas, porém, altera a
coloração dos grãos.
Sekiyama et al. (2006) cita que o uso de adsorventes como carvão ativado,
colestiramina, aluminossilicato de cálcio e sódio hidratado, glucomanano, entre na
outros, podem ser eficientes quando administrados junto com ração animal, porém o
inconveniente desse método é o fato de ocorrer também, a adsorção de nutrientes
do alimento.
Segundo Molin e Valentini (1999), programas propondo melhoramento genético
iniciados ainda na década de 80, principalmente na cultura do milho, mostrou existir
suficiente variabilidade genética que permite a seleção de plantas tolerantes a
fungos. Desde então, várias linhagens de sementes modificadas geneticamente vêm
surgindo apresentando genótipos resistentes devido a diferenças nos perfis
protéicos.
Asis et al., (2005) apud Kwiatkowski e Alves (2007) relatou que pesquisadores
da Universidade Nacional de Córdoba na Argentina, constataram que podem ser
desenvolvidos genótipos de amendoim com moderada resistência a contaminação
por Aspergillus SP
2.5 Biotransformação das aflatoxinas
Após a ingestão, a aflatoxina B1 é biotransformada por enzimas, dando origem
a um produto reativo, o 8-9-epóxido, que pode se ligar tanto ao DNA quanto à
28
albumina sérica formando adutos de aflatoxina-N7-guanina e aflatoxina-N7-lisina,
respectivamente, sendo que as ligações covalentes dos adutos no DNA um passo
crítico na hepatocarcinogênese das aflatoxinas. (Kwiatkowski e Alves, 2007).
Na Figura 3 é apresentada à estrutura química da B1 e dos possíveis produtos
((a), (b), (c), (d), (e)) após biotransformação desta toxina, por meio de:
a) ataque redutivo ou hidratação da dupla ligação do éter vinílico;
b) abertura da estrutura bi-furanóide;
c) fissão hidrolítica da lactona cumarínica;
d) redução da ciclopentana;
e) hidroxilação.
Figura 3 – Biotransformação da aflatoxina B1
Fonte: Sabino, 1986.
A aflatoxina B1 pode formar um derivado, a toxina M1, substituindo o ligante
hidreto por um grupamento hidroxila.
A aflatoxina B2, também pode formar um derivado, neste caso, a toxina M2,
substituindo-se o ligante hidreto por um grupamento hidroxila, conforme representa a
figura 4:
29
Figura 4 – Aflatoxina B2
Fonte: Sabino, 1986.
2.6 Toxicidade
A toxicidade das micotoxinas esta relacionadacom os níveis da toxina ingerida.
Para Gompertz et al. (2002), os tipos básicos de toxicidade podem ser verificados:
aguda, crônica mutagênica e teratogênica. Efeitos agudos podem deteriorar as
funções hepáticas e renais, fatal em alguns casos. Já entre os efeitos crônicos esta
a indução ao câncer de fígado. Segundo Franco e Landgraf (2003), além da
atividade aguda em diversos animais, pequenas quantidades são suficientes para
causar danos hepáticos e hemorragias no trato gastrointestinal e na cavidade
peritoneal.
Freire et al. (2007, p.13), “As aflatoxinas têm propriedades oncogênicas e
imunosupressivas, induzindo infecções em pessoas contaminadas com essas
substâncias.” Cita que a toxina por possuir capacidade de se ligarem ao DNA das
células afetam a síntese protéica contribuindo para formação de aplasia tímica, que
é a ausência congênita do timo e das paratireóides o que causa queda na imunidade
celular conhecida como síndrome de Di George.
Machinski Junior (2011) relatou que as aflatoxinas são moléculas lipofílicas de
baixo peso molecular podendo ser facilmente absorvidas no intestino delgado,
principalmente na região do duodeno, seguindo posteriormente para o fígado por
meio de suplemento sangüíneo, onde são concentradas devido à alta
permeabilidade da membrana hepática a essa toxina e ao processo de
biotransformação das células hepáticas.
30
Tabela 6 – Toxicidade da algumas aflatoxinas
Aflatoxina LD 50 mg/kg peso vivo
M1 (alguns animais principalmente vacas) 0,320
B1 0,364
G1 0,784
M2 (em alguns animais, principalmente vacas) 1,228
M2 1,696
G2 3,450
Fonte: Adaptado de Antón;Lizaso, 2001.
Doll e Peto (1981) apud Caldas et al. (2002) estimou que 35% dos casos de
câncer humano estejam diretamente relacionados à dieta e à presença de
aflatoxinas em alimentos um fator importante para produção de câncer hepático.
Gompertz et al. (2002), relatou que à aflatoxina B1 é o composto com maior atividade
carcinogênica conhecida, não sendo desprezível sua atividade mutagênica.
Machinski Junior (2011) relata que a Organização Mundial da Saúde
recomenda um controle sistemático dos níveis de aflatoxinas na dieta de populações
de regiões tropicais e subtropicais por terem alta prevalência de aflatoxinas nos
alimentos e rações dessas regiões.
2.7 Detecção das aflatoxinas
Machinski Junior (2011) cita que os níveis de aflatoxina nos produtos
contaminados por micotoxinas só podem ser observados pelo emprego de
metodologia analítica adequada, pois, somente assim, a fiscalização, o controle da
qualidade, as pesquisas e estudos epidemiológicos, estudo da produção e do
metabolismo dos fungos toxigênicos, entre outros, são possíveis de serem
observados e servem para justificar a finalidade das análises.
É bastante difícil detectar a presença de aflatoxinas em grãos uma vez que a
contaminação é extremamente heterogênea. Conforme Sabino (2008), em um lote
de grãos, apenas 0,5% podem estar contaminados e alguns deles, contaminados
31
com altos teores de aflatoxinas. Neste contexto, o erro devido a amostragem pode
ser grande. Grãos de amendoim podem conter até 1000000 ng/g de aflatoxinas e
grãos de milho até 400000 ng/g. Estes extremos de concentração de aflatoxinas em
unidades individuais do produto explicam a grande variabilidade nos resultados de
um lote em particular e a extensão do erro na amostragem.
Gonçalez et al. (2001), também, Amaral e Machinski Junior (2006), citam vários
métodos que podem ser utilizados para detecção e/ou quantificação de micotoxinas.
Entre eles, estão os métodos cromatográficos: cromatografia líquida de alta
eficiência (CLAE), Cromatografia em Camada Delgada (CCD) e cromatografia
gasosa (CG), além dos Métodos de Imunoensaios de Injeção sequencial (SIIA),
imunoenzimático (ELISA) ou com uso de Biossensores de Imunoafinidade.
Dentre os métodos adotados, o de cromatografia em camada delgada ainda é
muito empregada na análise e quantificação de aflatoxinas, por ser uma técnica de
referência para a maioria dos laboratórios brasileiros, não necessitar de
equipamentos onerosos e ser confiável. (AMARAL; MACHINSKI JUNIOR, 2006).
2.8 Controle de qualidade de ensaios analíticos
O controle e a manutenção da qualidade nos ensaios analíticos merecem
cuidados especiais, principalmente, por interferir na confiabilidade analítica com que
este laboratório trabalha. Ações práticas sugerem algumas medidas, dentre elas, a
calibração do equipamento e da vidraria e a participação do laboratório em ensaios
de proficiência. (ALBANO; RAYA-RODRIGUEZ, 2009).
2.8.1 Calibrações de vidrarias e equipamentos
A calibração das vidrarias e de equipamentos eletrônicos utilizados nos
métodos analíticos são componentes fundamentais na qualidade final dos resultados
expressos por eles. Esses instrumentos sofrem desgastes ao longo do tempo
aumentando o risco de variação dos resultados podendo comprometer a qualidade
das mesmas. As calibrações se fazem necessárias periodicamente a fim de que
estes equipamentos sejam revalidados e possam operar dentro da confiabilidade
analítica.
32
A calibração pode ser interna e externa. Calibrações internas são
procedimentos que fazem parte dos controles internos do laboratório e são
registrados em Formulário de Registro (FR) específicos. As calibrações externas são
realizadas por empresas especialmente contratadas para este fim. Para laboratórios
acreditados é necessário que a empresa contratada tenha credenciamento por
órgão certificado, por exemplo, a Rede Brasileira de Metrologia (RBC).
2.8.2 Ensaio de proficiência
Uma das formas de avaliar a qualidade dos ensaios analíticos realizados pelo
laboratório é através da participação nos ensaios de proficiência (ALBANO; RAYA-
RODRIGUES, 2009). Nestes, um laboratório provedor envia amostras previamente
contaminadas e quantificadas aos participantes do programa e estes realizam as
análises determinando e quantificando os níveis de toxinas encontrados de acordo
com a metodologia adotada em cada laboratório, que tem por objetivo obter
resultados satisfatórios em relação ao valor alvo estipulado e dentro do intervalo de
confiança estabelecido pelo laboratório provedor da comparação.
As metodologias empregadas para avaliação dos resultados dos ensaios de
proficiência são, normalmente, o Gráfico de Youden ou Z-score. Segundo Albano e
Raya-Rodriguez (2009), a metodologia de Youden parte da análise de duas
soluções de igual natureza e concentrações próximas, obtendo-se pares de
resultados (x,y) que são então trabalhados estatisticamente e representados por um
gráfico com a identificação do laboratório participante. A avaliação leva em conta a
posição de cada par de resultados em relação ao ponto de intersecção da média de
X e da média de Y e em qual quadrante se posiciona. Duas linhas médias dividem o
gráfico em quatro quadrantes e em situação ideal ocorre distribuição igualitária em
todos eles. Os pontos situados no 1º e no 3º quadrante representam tendência de
resultados baixos ou altos para ambas as soluções, caracterizando erros
sistemáticos. Pontos no 2º e 4º quadrante indicam a ocorrência de erros aleatórios,
refletindo disparidade no desempenho do laboratório.
Na metodologia Z-score, os resultados das amostras X e Y são analisados
separadamente e calcula-se o Z-score pela Equação 1:
Z= (a – b) / s (1)
33
Onde:
a = valor obtido no ensaio do laboratório
b = estimativa do valor real
s = desvio padrão
O desempenho de cada laboratório participante do programa é avaliado a partir
da estimativa do valor real através de consenso e da análise estatística dos
resultados enviados por todos os participantes.
A análise do Z-score segue a seguinte relação:
• Satisfatório: quando IzI ≤ 2
• Questionável: quando 2 <IzI< 3
• Insatisfatório: quando IzI ≥ 3
2.9 Padrões de aflatoxinas
As soluções dos padrões de aflatoxinas, utilizados tanto nos programas de
ensaios de proficiência quanto na validação de sua metodologia, normalmente, têm
sua apresentação na forma concentrada, necessitando que sejam diluídos para
atender a faixa de trabalho. É importante observar que estes padrões, sempre que
possível, não sejam adquiridos na forma de cristais, pois, oferece maior risco a
saúde durante seu manejo por se dispersarem facilmente na área do laboratório.
A concentração das soluções de trabalho dos padrões de aflatoxina é
primordial para a correta quantificação. A necessidade de obtenção de valores
inequívocos para as soluções de trabalho dos padrões começa pela adoção de
medidas seguras, desde sua aquisição através de fornecedores credenciados,
cuidados na conservação e durante a sua manipulação. O uso de vidrarias e
equipamentos calibrados, o uso de solventes de boa qualidade nas diluições e
adequado manejo técnico, também são importantes neste processo, onde as
soluções de trabalho servem de referência e delas dependem todas as
quantificações de amostras, como por exemplo, na técnica de cromatografia em
camada delgada.
34
2.9.1 Cuidados com padrões de aflatoxinas
Os cuidados com padrões iniciam-se pela identificação e escolha do bom
fornecedor, idôneo e que possa atender aos requisitos da qualidade, preço e prazo
de entrega. Ao chegarem ao laboratório, devem ter suas condições de integridade
analisadas, como: embalagem, rótulo, aparência da solução, e as informações
contidas no certificado de análise conferidas, para somente então, proceder à
entrada do material registrando-o em livro de registro próprio.
O certificado de análise, trás informações importantes, dentre elas, a
concentração, a pureza, validade e orientações de manejo, contribuindo para
qualidade e rastreabilidade do produto.
A conservação dos padrões no laboratório deve ser feita estocando-os em
freezer com temperaturas iguais ou inferiores a -20 °C, acondicionados após
fracionamento e diluição, em frasco âmbar, vedado e ao abrigo da luz, para evitar
sua degradação. O freezer deve ser exclusivo não sendo estocados outros materiais
além de padrões primários e soluções de trabalho dos padrões. O acesso deve ser
restrito e controlado, por exemplo, através de fechadura codificada. O controle da
temperatura do freezer deve ser feito diariamente, sendo registrado em Formulário
de Registro (FR) específico, observando-se faixa de tolerância, cabendo ação
corretiva ao sinal de problemas que possam por em risco a conservação dos
padrões.
A manipulação dos padrões e das soluções de trabalho requerem cuidados,
não só na sua preservação, mas também, no manejo feito pelo laboratorista, visto
serem substâncias potencialmente cancerígenas. Devem ser retirados do freezer
uma hora antes de seu uso e mantidos na capela de exaustão em temperatura
ambiente. É imprescindível o uso de luvas e máscara contra vapores tóxicos
durante sua manipulação.
Após o uso, a descontaminação dos equipamentos e da vidraria é feita com
solução de hipoclorito de sódio, a lavagem e, por fim, passagem de acetona P.A.
nas mesmas. Antes de iniciar a descontaminação os frascos contendo padrões de
aflatoxinas devem ser devolvidos ao freezer para evitar que estes sofram inativação
dos componentes.
35
2.9.2 Determinação da concentração das soluções de trabalho dos padrões
A concentração das soluções de trabalho do padrão de aflatoxinas pode ser
feita por medição em triplicata, com uso do espectrofotômetro. Neste equipamento,
faz-se incidir um feixe luminoso de comprimento de onda selecionado através de
uma solução do branco (cubeta 1) e outro feixe sobre a solução do padrão em
aferição (cubeta 2). A partir da diferença entre a leitura da absorbância do branco e
da solução do padrão é feito o cálculo para determinar a concentração da solução
de trabalho deste padrão, aplicando-se a lei de Lambert-Beer, conforme Equação 2:
A = ε.b.c (2)
Inicialmente, o equipamento passa por uma rápida calibração, da qual, é obtido
o fator de correção (FC) do equipamento. O FC representa o desvio do
equipamento, é obtido através de medições seriadas de uma solução de dicromato
de potássio de diferentes concentrações em um determinado comprimento de onda.
O branco é feito com solução de ácido sulfúrico (H2SO4) 0,009 mol/L, com o qual, o
equipamento é zerado. As soluções de dicromato de potássio são preparadas em
três concentrações diferentes. As soluções A, B e C, são diluídas com ácido sulfúrico
até possuem, respectivamente, 0,265 mol/L, 0,133 mol/L e 0,066 mol/L.
A leitura em triplicata das absorbâncias para as soluções A, B e C, e o posterior
cálculo da média das absorbâncias foi aplicado na Equação 3 abaixo, da qual,
obteve-se a absortividade molar nas três concentrações.
ε = [A x 1000] / C (3)
Onde:
ε é absortividade molar;
A é absorbância;
C é concentração da solução em mol/L.
36
Quadro 2 – Absorbância das soluções
Solução Concentração de K2Cr2O7 (mol/L)
Absorbância (média) esperada
A 0,265 0,84
B 0,133 0,41 – 0,42
C 0,066 0,21 Fonte: Procedimento Operacional Padronizado, IPB-LACEN/RS, 2009.
Com os valores da absortividade εA (absortividade da solução A), εB
(absortividade da solução B) e εC (absortividade da solução C) foi calculado a
absortividade molar média, através da Equação4, ilustrada abaixo:
= [εA + εB + εC] / 3 (4)
O fator de correção do espectrofotômetro (FC) foi calculado aplicando-se a
Equação 5 abaixo:
FC = 3160 / (5)
O valor de FC esperado na calibração do espectrofotômetro deve estar dentro
da faixa situada entre 0,95 e 1,05 para ser considerado calibrado. Nos casos em que
FC se encontrar fora da faixa o procedimento deve ser repetido e, caso persistirem
os erros, o equipamento deve ser caracterizado como descalibrado e não apto para
determinação da concentração das soluções de trabalho dos padrões.
Após calculado valor do FC do espectrofotômetro e estando o mesmo dentro
da faixa válida, pode-se então iniciar a quantificação das soluções de trabalho. No
Laboratório de Micotoxinas do IPB-LACEN/RS, adotou-se concentrações situadas:
0,8 a 1,0 µg/mL para AFB1, AFG1 e 0,2 a 0,5 µg/mL para AFB2 e AFG2.
Para obtenção das faixas acima descritas, o padrão puro pode ser diluído em
acetonitrila HPLC até atender a faixa estipulada. A confirmação da concentração é
feita através da leitura em triplicata de cada um dos padrões de aflatoxina no
espectrofotômetro com aplicação da Equação 5 abaixo:
[C] µg/mL = A x FC x MM x 1000 / ε (5)
37
Onde:
[C] = Concentração em µg/mL;
A = Absorbância;
FC = Fator de correção do espectrofotômetro;
MM = Massa molecular da micotoxina;
ε = Absortividade molar da micotoxina.
Quadro 3 – Valores de absortividade molar (ε) das flatoxinas em
acetonitrila em 350 nm
Micotoxinas Absortividade molar
(cm -1.mol -1.L)
Massa molecular
(g/mol)
Aflatoxina B1 20721 312
Aflatoxina B2 22456 314
Aflatoxina G1 17640 328
Aflatoxina G2 17640 330
Fonte: Adaptado do Procedimento Operacional Padronizado, IPB-LACEN/RS, 2010.
O controle e a verificação da concentração das soluções de trabalho pode ser
feito mediante medição trimestral das concentrações através do espectrofotômetro,
como descrito acima. Os dados são transcritos para um formulário de registro e
geram uma Carta Controle.
A carta controle serve para acompanhar o desempenho das soluções de
trabalho dos padrões ao longo do tempo. Um dos principais parâmetros observados
no processo é a absortividade molar (ε). A análise crítica da carta controle, objetiva
principalmente, identificar queda na qualidade dos padrões devido a manipulação
constante, degradação ao longo do tempo, contaminação, inativação, entre outros
processos que prejudiquem a qualidade das soluções de referência.
A Figura 5, mostra o gráfico gerado por uma carta controle:
38
Figura 5 – Carta Controle
Carta de Controle
16000
16500
17000
17500
18000
18500
19000
19500
20000
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27
Dias
ε
Fonte: do Procedimento Operacional Padronizado, IPB-LACEN/RS, 2010.
2.10 Legislaçãosobre micotoxinas
No Brasil, a Resolução da Diretoria Colegiada, RDC n. 7, de 18 de Fevereiro de
2011, dispõe sobre os Limites Máximos Tolerados (LMT) para micotoxinas em
alimentos, que são apresentados no Quadro 4:
39
Quadro 4 – Limite máximo tolerado (LMT) das aflatoxinas para alguns alimentos
Fonte: Adaptado da Resolução de Diretoria Colegiada, 2011.
2.11 Fiscalização
Os principais órgãos fiscalizadores de micotoxinas no Brasil referenciam o
Ministério da Agricultura através da Secretaria de Defesa Agropecuária, o Ministério
da Saúde pela Divisão de Alimentos, DETEN/SVS, e a Agência Nacional de
Vigilância Sanitária (ANVISA).
Micotoxina Alimento Limite Máximo Tolerado (µg/Kg)
Aflatoxina
B1 - B2 - G1 - G2
- Alimentos À base de cereais para
alimentação infantil (lactentes,
crianças na primeira infância) 1,0
- Cereais e produtos de cereais,
inclui cevada malteada.
- Feijão
- Produtos de cacau e chocolate
5,0
Aflatoxina
B1 - B2 - G1 - G2
- Castanhas, inclui nozes, pistachios,
avelã e amêndoas;
- Frutas desidratadas e secas;
- Castanha-do-Brasil sem casca para
consumo direto;
- Amêndoas de cacau;
10,0
- Castanha-do-Brasil sem casca para processamento posterior; 15,0
Aflatoxina
B1 - B2 - G1 - G2
- Castanha-do-Brasil com casca para
consumo direto;
- Especiarias: pimenta, canela, noz-moscada, gengibre, outros - Amendoim com casca, sem casca,
cru, torrado, em pasta ou manteiga;
- Milho, milho em grãos (partido,
inteiro, amassado, moído), farinhas
ou sêmolas de milho.
20,0
40
3 PARTE EXPERIMENTAL
Muitas pesquisas foram realizadas após a descoberta, na década de 60, e
ainda são realizadas, seja para identificar os níveis de contaminação ou desenvolver
métodos de análise mais precisos, rápidos e viáveis em termos de custos e menor
impacto ambiental.
3.1 Metodologia analítica
Este Trabalho de Conclusão de Curso foi desenvolvido no Laboratório de
Micotoxinas que adotou o método de extração e quantificação das aflatoxinas
seguindo a Official Methods of Analysis (2005), 18 th Ed. AOAC – Association of
Official Analytical Chemists, Chapter 49, Method 970.44, 975.35, 968.22, por se
tratar de uma metodologia analítica oficial, de fácil execução, não envolvendo
grandes equipamentos, oferecendo resultados analíticos confiáveis.
3.2 Materiais e equipamentos
• Espectrofotômetro UV/VIS Jasco-7800;
• Cubetas de quartzo (percurso óptico de 1cm);
• Gabinete de visualização ou Cromatovisor Camag;
• Capela de exaustão química Quimis;
• Balança semi-analítica Ohaus-Scout;
• Liquidificador industrial Turbo A;
• Ultra-som Unique-1600;
• Estufa Biopar S22;
• Refrigerador Prosdócimo;
• Freezer Consul;
• Cilindro de gás nitrogênio White Martins, pureza 99,5%;
• Banho Maria Biopar, (50 °C);
• Béquer de 50, 100, 250 e 600 mL;
• Balão volumétrico de 1000 mL;
• Proveta volumétrica de 50, 250 e 500 mL;
• Bastão de vidro;
41
• Funil de vidro;
• Papel filtro Whatman, nº 4;
• Funil de separação de 500 mL;
• Microseringa de 10 µL;
• Micropipetador de 200 e 500 µL;
• Cuba cromatográfica com tampa (1000 mL);
• Pipeta volumétrica de 5 e 10 mL;
• Pipeta graduada de 0,2 mL;
• Espátula de metal;
• Cromatofolha 20x20 cm com sílica gel 60G sem indicador fluorescente;
• Tubos de ensaio;
• Suporte para tubo de ensaio;
• Frasco de vidro para amostra.
3.3 Reagentes
• Metanol p.a., marca Vetec;
• Clorofórmio grau HPLC, marca Vetec;
• Celite 545 p.a., marca Merck;
• Cloreto de potássio p.a., marca Vetec;
• Sulfato de cobre anidro p.a., marca Vetec;
• Sulfato de Amônio p.a. marca Dinâmica;
• Éter Etílico p.a., marca Dinâmica;
• Solução aquosa de H2SO4;
• Ácido Trifloroacético p.a. (TFA), marca Vetec;
• Tolueno p.a., marca nuclear;
• Acetonitrila p.a., marca J. T. Backer;
• Ácido Acético Glacial p.a., marca Vetec;
• Hipoclorito de Sódio 5% p.a., marca Vetec;
• Acetona p.a., marca Vetec;
• Hexano p.a., marca J. T. Backer.
42
3.4 Descrição do método
As aflatoxinas foram extraídas das amostras com solução de metanol/cloreto
de potássio a 4%, passando posteriormente por uma etapa de limpeza com uso de
agentes clarificantes como, solução de sulfato de cobre a 10%, para matrizes de
amendoim e derivados, nozes ou, solução de sulfato de amônio a 30%, para
matrizes como cereais e grãos.
A extração de gordura para amostras de amendoim e derivados foi feito com
hexano em funil de separação. A separação das aflatoxinas em solução é feita com
clorofórmio por partição líquido-líquido da qual uma alíquota é secada com gás
Nitrogênio (N2) e ressuspensa com mistura de tolueno:acetonitrila (98:2mL) com
posterior aplicação na cromatofolha. A quantificação das aflatoxinas foi realizada
com auxílio de luz ultravioleta em 366 nm, através da observação da intensidade das
manchas da amostra comparando-as com as do padrão.
O fluxograma a seguir, representado na figura 6, mostra as etapas do processo
de extração das aflatoxinas até a etapa de Cromatografia em Camada Delgada
(CCD).
43
Figura 6–Etapas da extração das aflatoxinas
Fonte: Autoria própria, 2011.
+ 270 mL Metanol + 30 mL KCl 4% liquidificador por 5 min filtrar
+ 150 mL CuSO4 ou (NH4)2SO4
+ 50 cm3celite agitar e filtrar
+ 150 mL H2O + 10 mL clorofórmio
agitação por 3 min + 10 mL clorofórmio
Concentra até secura
Ressuspende em tolueno:Acetonitrila
50 g da amostra
150 mL Filtrado
150 mL Filtrado
Funil de separação
10 mL fase orgânica (Recolhe extrato l)
Funil de Separação
10 mL fase orgânica (+ extrato ll)
Recolhe
CCD
44
3.4.1 Amostrageme extração
A amostragem é iniciada através da trituração de aproximadamente 2 kg de
amostras de amendoim, milho, castanha-do-pará ou arroz, em liquidificador de aço
inox. Homogeneizou-se o produto obtido e procedeu-se o quarteamento. Após,
pesou-se 50g da amostra para um béquer de 250 mL e realizou-se a extração.
Nesta etapa, o objetivo foi separar o analito de interesse da matriz. Para
favorecer o contato entre o substrato sólido e o solvente, triturou-se em liquidificador
industrial a amostra preparada no procedimento anterior com 270 mL de metanol e
30 mL de solução aquosa de Cloreto de potássio a 4 %. Agitou-se por cinco minutos
em velocidade baixa e após, filtrou-se à amostra em papel filtro Whatman® número
quatro através de funil simples recolhendo-se os primeiros 150 mL em uma proveta
graduada.
3.4.2 Purificação
Essa etapa foi realizada devido a freqüente presença de contaminantes, por
exemplo, glicose e corantes, na amostra. Para tanto, procedeu-se da seguinte forma:
transferiu-se o filtrado para um béquer de 600 mL, adicionou-se 150 mL de agente
clarificante, neste caso, uma solução aquosa de sulfato de cobre (CuSO4 10%) para
amostras de amendoim e derivados, castanhas e 50 cm³ de celite 545. Para
amostras de milho e arroz, adicionou-se 150 mL de sulfato de amônio ((NH4)2SO4 a
30%).
Homogeneizou-se a mistura com bastão de vidro e fez-se a filtração em papel filtro
Whatman® Nº 4, através de funil simples e recolhendo-se, novamente, os primeiros
150 mL em proveta.
3.4.3 Partição líquido-líquido
Transferiu-se o filtrado para um funil de separação de 1000 mL. Para amostras
gordurosas, como amendoim e derivados, adicionou-se 40 mL de hexano para
extração da gordura, a qual, pode interferir na visualização dos pontos na etapa de
quantificação. Agitou-se manualmente por 3 minutos e após a separação das fases,
desprezou-se a fase orgânica retornando a amostra para o funil de separação.
45
Adicionou-se 150 mL de água ultra pura e 10 mL de clorofórmio grau HPLC.
Agitou-se durante cinco minutos, cuidando para a amostra não emulsionar. Os gases
desprendidos devido à agitação do funil foram liberados várias vezes durante o
procedimento. Após a agitação, deixou-se em repouso por 10 minutos para a
separação das fases. Foi retirada a fração inferior da solução do funil (fase
orgânica). Esta foi então armazenada em um béquer de 50 mL, identificado como
Extrato I.
Adicionou-se uma segunda alíquota de 10 mL de clorofórmio e procedeu-se uma
segunda extração, como descrito acima, recolhendo a fração e juntando-a com a
primeira (Extrato II).
3.4.4 Concentração e ressuspensão
Retirou-se uma alíquota de 10 mL do Extrato II com auxílio de uma pipeta
volumétrica, transferindo para um tubo de ensaio graduado de 15 mL. Concentrou-
se a amostra em banho maria na temperatura de 50 °C até secura sob corrente de
gás nitrogênio.
Redissolveu-se o extrato com 200 µL de solução de tolueno:acetonitrila
(98:2mL) para amostras de amendoim e derivados e arroz. Para os cereais e
derivados a redissolução é feita com 500 µL da solução tolueno:acetonitrila
(98:2mL). Agita-se por aproximadamente 1 minutos, para garantir a completa
solubilização do extrato.
3.4.5 Determinação e quantificação das aflatoxinas
A determinação e quantificação das aflatoxinas por cromatografia em camada
Delgada foi feito através da comparação visual da amostra ressuspensa com os
padrões, ambos aplicados na mesma cromatofolha de sílica gel 60G sem indicador
de fluorescência. Inicialmente, ativou-se a cromatofolha com aquecimento em estufa
a 110 ºC por 30 min. Delimitou-se a migração das frentes pelos solventes na
cromatofolha.
As delimitações da cromatofolha foram feitas a lápis, onde AM é o ponto de
aplicação da amostra e P, ponto para aplicação do padrão, como mostra a Figura 7:
46
Figura 7 – Delimitações da cromatofolha
Fonte: Instrução de Trabalho, IPB-LACEN/RS, 2009.
Os padrões foram retirados do freezer e deixados à temperatura ambiente em
capela de exaustão por 1h e, quando ambientados foram aplicados na cromatofolha,
conforme delimitações mostradas acima.
Aplicou-se 5 µL dos padrões B1, B2, G1 e G2 com o auxílio de microseringa na
cromatofolha. Em seguida, na mesma cromatofolha, aplicou-se 5 µL de cada uma
das amostras extraídas. Esta placa serviu como primeira verificação da
contaminação por aflatoxinas.
Na cuba cromatográfica foi feita a eluição das amostras e dos padrões. Foi
utilizado como solvente de eluição (corridas) uma mistura de clorofórmio p.a, éter-
etílico p.a, e ácido acético glacial p.a (85mL:15mL:5mL), preparados diretamente na
cuba. Papel filtro foi colocado para forrar o interior da cuba. O papel filtro fica
embebido na solução e tem a função de melhorar a saturação do ambiente interno.
A cuba deve permanecer em repouso nestas condições, por cerca de uma hora,
antes de se colocar a cromatofolha e dar início à eluição.
Após a aplicação dos volumes descritos a cima na cromatofolha, foi colocada
na cuba em posição vertical onde, a parte inferior fica em contato com a solução
eluente. A corrida cromatográfica dura em torno de 30 a 40 minutos, conforme
demarcação na parte superior da placa e supervisão do analista. Após, a
cromatofolha é retirada da cuba e colocada em capela de exaustão para evaporação
dos solventes, por cerca de 10 minutos.
47
A placa foi então avaliada sob luz ultravioleta no comprimento de onda de 366
nm, em gabinete de visualização.
Para amostras contaminadas com aflatoxinas foi realizada a quantificação. Por
isso, foi necessário preparar uma nova placa com mais pontos de padrão e da
amostra, neste caso, preparou-se uma nova cromatofolha de sílica gel e os volumes
injetados foram: 2 µL, 5 µL, 7 µL, 10 µL, da amostra contaminada e 1 µL, 2 µL, 5 µL,
7 µL, apenas dos padrões a serem usados na quantificação.
Através da Figura 8, observa-se que a fluorescência azul representa a
aflatoxina B1 e B2, e a fluorescência verde, as aflatoxinas G1 e G2, do padrão na
placa de camada delgada submetida a luz ultra-violeta.
Figura 8 – Placa de camada delgada com amostra de castanha-do-pará sob luz UV
(comprimento de onda de 366 nm)
Fonte: Autoria própria, 2011.
Na placa da Figura 8, foi aplicado uma amostra de castanha-do-pará na parte
central da cromatofolha. Os dois pontos luminosos à esquerda são respectivamente
os padrões de aflatoxina B1 e B2 e tem coloração azul. À direita, temos os pontos
G1 e G2 do padrão de aflatoxina, de coloração verde. Observou-se, nesta análise, à
ausência de contaminação por aflatoxinas na amostra.
B1 B2 A G1 G2
48
3.4.6 Confirmação
A confirmação da presença de aflatoxinas na amostra foi feita pulverizando-se
a primeira cromatofolha com solução aquosa de ácido sulfúrico (1:3). Deixou-se
secar a temperatura ambiente e visualizou-se em comprimento de onda de 366 nm.
A troca da fluorescência dos pontos aplicados na cromatofolha para amarelo indicam
contaminação por aflatoxinas. Amostras que não apresentarem mudança para a cor
amarela, confirmam ausência de aflatoxina.
Para amostras contaminadas com aflatoxina B1 e G1, faz-se a confirmação
pela reação com ácido trifluoracético (TFA). Dividiu-se a cromatofolha em dois lados
verticalmente e em cada lado cromatografou-se dois pontos de 3 µL da amostra e 2
pontos de 3 µL do padrão com microseringa. Em um dos lados sobrepôs-se 1 µL de
TFA em um dos pontos dos padrões e em um dos pontos das amostras.
Desenvolveu-se a eluição no sistema: clorofórmio + éter + ácido acético glacial
(85mL:15mL:5mL,). A placa foi examinada em luz ultravioleta com comprimento de
onda em 366 nm. A confirmação se dá quando à aflatoxina com TFA aparece em RF
menor que o quantificado (RF 0,15 – 0,50 cm).
Outra forma de confirmação pode ser feita pela cromatografia bidimensional.
Este recurso pode ser usado quando estiverem presentes no extrato, substâncias
interferentes que proporcionem dúvidas na quantificação das aflatoxinas.
A Figura 9 mostra as delimitações de uma cromatofolha bidimensional. I e II
representam os solventes de eluição e A, B, C, D e E os pontos aplicados na
cromatofolha de amostra e padrão, respectivamente.
49
Figura 9 – Delimitações da placa de camada delgada bidimencional
Fonte: Instrução de Trabalho, IPB-LACEN/RS, 2009
Delimitou-se a migração das frentes dos solventes na placa cromotográfica
através de dois sulcos paralelos a lados contíguos, sendo as distâncias entre os
sulcos e seus respectivos lados iguais a 5 cm e 6 cm. Aplicou-se volumes de 3 µL
para padrões e amostras. Os solventes de eluição usados são: Solução I:
Clorofórmio PA. e Acetona PA. ; Solução II : Tolueno PA.: Acetato de Etila PA.: Ácido
Fórmico PA.
A quantificação foi feita comparando-se a intensidade de fluorescência das
manchas de menor intensidade das aflatoxinas das amostras com a intensidade das
manchas dos padrões. Como é conhecido o valor do volume do padrão injetado e a
concentração do padrão pode-se então calcular a concentração da aflatoxina
presente na amostra conforme descrito a seguir.
3.4.7 Cálculo
O cálculo para determinação da concentração de cada composto na amostra
analisada (C) é comparado por visualização com RF de cada padrão de aflatoxina,
expresso em µg/kg (ppb), calculado através da Equação 6:
WZ
VYSppbC
.
..)( = (6)
Onde:
.... E
.... D
.... C II→→→→
. A
I↑↑↑↑
.
50
S = volume em µL de padrão de fluorescência igual à da amostra;
Y = concentração do padrão de micotoxina em µg/mL usada na
cromatofolha
Z = volume em µL da mancha do extrato da amostra na qual a intensidade
de fluorescência foi igual a do padrão;
W = massa em gramas da amostra contida no extrato final;
V = volume final do extrato em µL, levando em conta diluições eventuais.
51
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Foram analisadas 48 amostras no período de agosto a novembro de 2011. A
maior parte das amostras foram provenientes do Programa Estadual de
Monitoramento e Qualidade Sanitária dos Alimentos (PEMQSA), coletadas em
diversos pontos no estado do Rio Grande do Sul, conforme cronograma da vigilância
sanitária. Contudo, uma amostra analisada foi proveniente de outra região do Brasil.
Outras 12 amostras, foram adquiridas no comércio da região metropolitana de Porto
Alegre. A distribuição dos pontos de coleta e a procedência ou beneficiamento das
amostras foi feita de acordo com as regiões geográficas, sendo que a maior parte
das amostras é oriunda do Rio Grande do Sul, conforme mostra o Tabela7.
Tabela 7 – Distribuição das amostras
Regiões Pontos de Coleta da Amostra
Pontos de Beneficiamento
Região Noroeste do RS 04 06
Região Nordeste do RS 05 12
Região Centro-Leste RS 04 05
Região Metropolitana de Porto Alegre 34 16
Região Centro-Oeste do RS - 01
Outro estado 01 06
Não Informado - 02
TOTAL 48 48
Fonte: autoria própria, 2011.
As amostras provenientes ou beneficiadas em outro estado estão distribuídas
conforme mostra a Tabela 8:
52
Tabela 8 – Amostras de outros estados
Estado Ponto de Coleta da Amostra
Ponto de Beneficiamento
Santa Catarina 01 01
Paraná - 01
São Paulo - 04
Fonte: Autoria própria, 2011.
A melhor representação para a distribuição geográfica dos pontos em que as
amostras foram coletadas e os pontos onde as amostras foram
beneficiadas/produzidas, incluindo-se aí todas as regiões, esta demonstrado na
figura 10:
Figura 10 – Distribuição das regiões de amostragem
Fonte: Autoria própria, 2011.
Percebe-se que a maioria das amostras coletadas, assim como, analisadas de
acordo com a região de beneficiamento/produção do alimento, foi proveniente da
região metropolitana e capital do Rio Grande do Sul, seguido da região nordeste,
também do RS.
53
A distribuição das amostras quanto ao tipo de alimentos analisados estão
representados conforme mostra a Tabela 9:
Tabela 9 – Tipos de amostras e sua contaminação
Alimento Amostrado
Quantidade de Amostras
Amostras Contaminadas
% de Amostras Contaminadas
Amendoim 11 02 18,18
Derivados de Amendoim 19 02 10,53
Farinha de Milho 14 - 0,0
Arroz Descascado 02 - 0,0
Castanha-do-Pará 02 - 0,0
TOTAL 48 04 8,33
Fonte: Autoria própria, 2011.
A Figura 11, representa melhor a distribuição dos alimentos analisados:
Figura 11 – Distribuição das amostras analisadas
Fonte: Autoria própria, 2011.
Observa-se que a maioria das amostras analisadas foram de derivados de
amendoim, seguido de farinha de milho. Verifica-se também, que as amostras de
arroz e castanha-do-pará são pouco representativas quanto à contaminação destes
produtos por aflatoxinas por constituírem pequeno número de amostragem.
54
A figura seguinte, representa o percentual total de contaminação das amostras.
Figura 12 – Percentual de amostras contaminadas
Fonte: Autoria própria, 2011.
Percebe-se que 8,33% das amostras estavam contaminadas, Este valor é
considerável quando se trata de alimentos destinados ao consumo humano e os
risco decorrentes destas toxinas para saúde humana.
Na Tabela 10, é apresentado o valor de aflatoxinas totais quantificadas nas
amostras contaminadas.
Tabela 10 – Aflatoxinas quantificadas na amostras contaminadas
Amostra Contaminada
Aflatoxina B1
(µg/Kg)
Aflatoxina B2
(µg/Kg)
Aflatoxina G1
(µg/Kg)
Aflatoxina G2
(µg/Kg)
Aflatoxina Total
(µg/Kg)
Amendoim 79,40 22,86 - - 102,26
Amendoim 52,93 16,01 - - 68,94
Derivado amendoim
5,35 - - - 5,35
Derivado amendoim
Traços - - - traços
Fonte: Autoria própria, 2011.
Das aflatoxinas encontradas nos ensaios, os grupos presentes nos alimentos
contaminados foram AFB1 e AFB2, não sendo encontradas, AFG1 nem AFG2 em
nenhuma das amostras analisadas.
55
A figura a seguir, representa a distribuição dos grupos de aflatoxinas
encontradas nos alimentos contaminados.
Figura 13 – Grupos de aflatoxinas identificadas nas amostras contaminadas
Fonte: Autoria própria, 2011.
Verificou-se que das quatro amostras contaminadas, em todas, constatou-se
contaminação por AFB1, seguido da AFB2, em duas amostras.
A Figura 14, mostra um panorama geral do estudo realizado sobre os níveis de
contaminação por aflatoxinas nas amostras analisadas e os resultados obtidos.
56
Figura 14 – Panorama geral do estudo realizado
Fonte: Autoria própria, 2011.
Em duas amostras de amendoim os valores de aflatoxinas quantificadas na
amostragem, mostraram-se acima do valor permitido pela legislação. Em outras
duas amostras, dentro do Limite Máximo Tolerado (LMT) de aflatoxinas para
alimentos derivados de amendoim.
Uma amostra de derivados de amendoim apresentou traços de aflatoxina
AFB1, porém com valores abaixo do limite de quantificação adotado pelo laboratório
(para AFB1 o LQ = 1,2 µg/kg), não sendo possível sua quantificação devido à
limitação na sensibilidade do método.
Outro dado importante sobre a contaminação das amostras analisadas, diz
respeito a origem das amostras. A Figura 15, mostra a relação entre a origem das
amostras e sua contaminação.
57
Figura 15 – Relação entre origem das amostras e contaminação
Fonte: Autoria própria, 2011.
Observa-se que amostras beneficiadas no Rio Grande do Sul apresentaram
apenas uma contaminação. No entanto, amostras oriundas de outros estados,
apesar de um universo pequeno de amostras, apresentou por sua vez,
contaminação por aflatoxinas em metade das amostras analisadas.
Em duas amostras de amendoim in natura adquiridas não foi relatado sua
origem. As duas amostras não apresentaram contaminação.
A partir dos resultados apresentados, verificou-se que para efeitos de
monitoramento, a identificação da procedência das amostras pode ajudar a delimitar
possíveis focos de contaminação, e com isso estabelecer políticas para prevenção
de doenças em decorrência da ingestão destes alimentos, além de auxiliar a
vigilância sanitária quanto às ações de controle e fiscalização.
58
5 CONCLUSÃO
O monitoramento das condições sanitárias dos alimentos consumidos pelos
gaúchos, no que tange às aflatoxinas, merece atenção especial e, a justificativa para
manutenção de programas públicos como o Programa Estadual de Monitoramento e
Qualidade Sanitária dos Alimentos (PEMQSA), dentre outros, está no fato de não
estarmos livres da contaminação por aflatoxinas nos alimentos.
A fiscalização por órgãos controladores do estado deve ser permanente
quando se trata de alimentos, principalmente, pelo fato das aflatoxinas terem sua
produção e disseminação sensivelmente afetados por fatores climáticos e pelas
circunstancias de manejo e beneficiamento dos alimentos. Neste sentido, alimentos,
dentre eles: milho e derivados, amendoim e derivados, muito suscetíveis a
contaminação por aflatoxinas, necessitam que seus processos envolvendo
fabricação e inclusive, comercialização, permaneçam, ainda, sob severas
regulamentações, oferecendo assim, melhores garantias de qualidade aos alimentos
colocados ao consumo humano.
Embora a amostragem realizada tenha sido feita sob um pequeno período do
ano, de agosto a novembro de 2011, e não abranger todas as regiões do estado e,
ser apenas representativa para amendoim e derivados e farinha de milho, constatou-
se que apenas uma amostra oriunda do RS apresentou contaminação por
aflatoxinas. No entanto, amostras beneficiadas e provenientes de outros estados,
mas, disponíveis no comércio do RS, apresentaram maior freqüência de
contaminação, sendo que em uma das amostras foi verificado uma contaminação
cinco vezes superior ao permitido pela legislação vigente, a RDCn. 7, de 18 de
Fevereiro de 2011.
A técnica por cromatografia em camada delgada utilizada para quantificação
das aflatoxinas neste Trabalho de Conclusão de Curso, mostrou-se eficiente, mas,
apresentou seu limitante na quantificação de amostras quando contaminações é a
níveis de traços. Neste sentido, a adoção de técnicas com maior sensibilidade se faz
necessária. A cromatografia líquida apresenta-se como alternativa por sua alta
sensibilidade propiciando que baixas concentrações de contaminação possam ser
quantificadas.
59
REFERÊNCIAS
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