guia p. microbiologia medica
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ASOCIACIN
UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA
GUIA DE PRCTICA DE
MICROBIOLOGIA MDICA
CUARTO CICLO
SEMESTRE ACADMICO 2013-II
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RECOMENDACIONES GENERALES PARA EL USO DEL LABORATORIO DURANTE EL CURSO DE
MICROBIOLOGA MDICA
1. El estudiante deber asistir a las clases prcticas llevando consigo la Gua de Prcticas, mandil, plumn indeleble para escribir sobre vidrio y lpices de colores.
2. No se podr ingresar sin mandil a la sala de prcticas, para evitar contaminaciones 3. Durante las prcticas no se debe comer, beber ni fumar, para evitar o prevenir posibles
contaminaciones.
4. Sobre la mesa de trabajo slo debern colocar su gua de prctica y su libreta de apuntes. 5. Eliminar el material de desecho, como papeles, trozos de algodn, etc. al tacho de basura 6. Las coloraciones deben efectuarse en el lavadero de cada mesa de prctica para evitar que se
tian la mesa de trabajo, ropa o manos.
7. Colocar las lminas preparadas sobre hojas de papel blanco. 8. Dejar los cultivos ya usados, en la canastilla de tubos. Tener cuidado que permanezcan
debidamente cerrados y en posicin vertical para evitar que se derramen.
9. Las lminas coloreadas a desecharse debern ser colocadas en frascos de boca ancha con desinfectante.
10. Todos los cultivos que se preparen debern incubarse, teniendo en cuenta las siguientes anotaciones:
Nombre o iniciales de los estudiantes
Nombre del germen, nmero de mesa, turno y fecha de la siembra
Las placas debern ser invertidas, a menos que el profesor de instrucciones contrarias
Los tubos debern estar bien tapados y colocados en gradillas
Los alumnos se responsabilizan de colocar estos cultivos en estufa a 37C
11. Al finalizar el trabajo:
Limpiar con algodn los objetivos del microscopio
Tener cuidado de dejar el objetivo de menor aumento frente al condensador y que no queden lminas sobre la platina
Limpiar la mesa de trabajo
Comprobar que la llave de gas este cerrada
Lavarse prolijamente las manos con jabn carblico.
12. El Protocolo de cada prctica ser controlado por el profesor al final de la prctica.
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PRACTICA N 1
MICROSCOPIA: ESTUDIO Y MANEJO DEL MICROSCOPIO
I. OBJETIVO
1. Conocer e identificar correctamente las partes pticas y mecnicas del microscopio compuesto. 2. Familiarizar al alumno con el uso correcto, cuidado y conservacin del microscopio.
II. MATERIALES
Microscopios
Lminas portaobjetos
Laminillas cubreobjetos
Lminas coloreadas
Suero fisiolgico
Pipeta Pasteur
Plumn indeleble
Papel lente
Tela de felpa(25 cms)
Fibra de pelo y lana
III. PARTES DEL MICROSCOPIO
Reconocer cada una de las siguientes partes del microscopio:
PARTE MECANICA
Tubo portalentes y cremallera
Tornillos macro y micromtrico
Revolver
Platina
Condensador
Brazo y Pie
Charnela
PARTE OPTICA
Ocular
Objetivos
Espejo
Lentes de condensador
Diafragma
IV. SISTEMAS QUE COMPRENDE EL MICROSCOPIO
1. Sistema de soporte: comprende el brazo, el pie, el tubo ocular, el revolver y la platina. 2. Sistema de Iluminacin: comprende el foco, condensador y diafragma. 3. Sistema de Ajuste: comprende el macromtrico, micromtrico y cremallera 4. Sistema de Aumento: comprende el ocular generalmente de 10 x , 15 x, y los objetivos de 4x, 10, 20x, 40,
y 100x.
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PRACTICA N 1 - A
METODOS DE COLORACIONES: COLORACIONES SIMPLES., DIFERENCIALES Y ESPECIALES.
INTRODUCCION
La mayor parte de los colorantes usados en Microbiologa son de tres tipos:
A) Aquellos en los cuales el ion portador del color (cromfero) es el anin llamados colorantes cidos Ej. Eosinato de sodio Eosina.
B) Aquellos cuyo cromforo es el catin llamados colorantes bsicos Ej. Cloruro azul de metileno. C) Los colorantes neutros, compuestos por bsicos y cidos Ej. Hematoxilina (bsico) Eosina (cido). Para los trabajos bacteriolgicos generales se usan colorantes bsicos como el azul de metileno, cristal de violeta,
fucsina bsica, safranina, todos ellos pertenecen al grupo de los colorantes derivados de la anilina.
Las coloraciones pueden ser segn el nmero de colorantes que utilizan:
A) Simples: cuando se utiliza un solo colorante como el Azul de metileno, Tinta China, Azul de metileno B) Diferenciales: cuando utilizan ms de un colorante como la coloracin de Gram, y Ziehl - Neelsen. C) Especiales: cuando se usan colorantes que permiten reconocer ciertas estructuras celulares como la coloracin de
Leishman, Vago, etc.
A. COLORACIONES SIMPLES
Son aquellas coloraciones que utilizan un solo colorante para visualizar la morfologa de los microorganismos.
MATERIAL
Muestra con mezcla bacteriana
Lminas portaobjetos
Laminillas cubreobjeto
Asa bacteriolgica de Kolle en aro
Colorante Azul de metileno
Colorante Tinta China
Colorante Azul de lactofenol
Mechero de Bunsen
Varillas para coloracin
Aceite de cedro
Xylol
Papel lente
Microscopio de luz con objetivo de inmersin
COLORACIN AZUL DE METILENO:
1. Preparar un frotis con la mezcla bacteriana y fijar al calor 2. Cubrir el frotis con una gota del colorante y dejar actuar por 3 5 minutos 3. Lavar con agua y dejar secar 4. Observar al microscopio con objetivo de inmersin y aceite de cedro.
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RESULTADO: Los microorganismos se observan de color azul intenso
COLORACIN DE TINTA CHINA O NEGATIVA:
1. Colocar una gota de tinta china sobre la lamina portaobjetos 2. Agregar una gota de la mezcla bacteriana 3. Cubrir la preparacin con una laminilla cubreobjeto 4. Observar con lente de menor y mayor aumento.
RESULTADO: Los microorganismos sin teir resaltan sobre un fondo oscuro
COLORACIN AZUL DE LACTOFENOL:
1 Colocar una gota del colorante sobre la lmina portaobjetos 2 Colocar una muestra de un cultivo de hongo sobre el colorante 3 Cubrir con una laminilla cubreobjeto 4 Observar con lente de menor y mayor aumento
RESULTADO: Los microorganismos se observaran en un fondo azul celeste
PROTOCOLO
CLASE DE
COLORACION SIMPLE
MORFOLOGIA DEL
MICROORGANISMO
ESQUEMA DE LA
OBSERVACION
AZUL DE METILENO
TINTA CHINA
AZUL DE LACTOFENOL
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CUESTIONARIO
1. Que tipo de colorantes son el azul de metileno, tinta china y el azul de lactofenol, cido, bsico, neutro? 2. Cules son los componentes del azul de metileno 3. Qu estructura de la bacteria se colorea con el azul de metileno?
B. COLORACIONES DIFERENCIALES
Son aquellas coloraciones que utilizan ms de un colorante y, generalmente el segundo colorante es llamado colorante
de contraste. Entre los mas usados tenemos la coloracin de Gram y la de Ziehl Neelsen o tambin llamado cido-
alcohol resistente
COLORACION DE GRAM
Es una coloracin diferencial que permite diferenciar a las bacterias en Gram positivas y Gram negativas, segn la
estructura y composicin de la pared celular. En las Gram negativas, el peptidoglucano tiene una sola capa y las cadenas
no estn entrelazadas; en las Gram positivas la mayora presenta muchas capas de cadenas mucopptidas .
Existen varias modificaciones del Gram, una de ellas es la de Kopeloff
MATERIAL
Muestra con mezcla de bacterias Solucin fisiolgica al 0.85% Lminas portaobjetos Asa bacteriolgica de Kolle en aro Set de colorante de Gram, modificado por Kopeloff:
Violeta de Cristal violeta (colorante primario)
Bicarbonato de sodio
Lugol (mordiente)
Alcohol- acetona (decolorante)
Fucsina bsica (colorante de contraste) Mechero de Bunsen Varillas para coloracin Microscopio de luz con objetivo de inmersin Aceite de cedro Xylol Papel lente
PROCEDIMIENTO
1. Dividir la lmina en 3 partes: 1/3 para rotular el N de muestra y 2/3 para la preparacin del frotis. 2. Con el asa bacteriolgica previamente esterilizada, tomar la muestra y realizar un frotis en el centro de la lmina
portaobjeto, extendindola en espiral del centro a la periferia, para obtener una preparacin en capa fina.
3. Fijar la muestra, mediante el secado completo del frotis a temperatura ambiente, o con la ayuda de la llama dbil del mechero de Bunsen.
4. Colocar la lmina portaobjetos con la preparacin sobre la varilla de coloracin. 5. Cubrir el frotis con el colorante Violeta de Genciana, agregar 1- 2 gotas de la solucin de bicarbonato de sodio,
dejar actuar por 2 minutos.
6. Lavar con agua corriente (evitar la cada del chorro de agua directamente sobre el frotis) 7. Cubrir con Lugol durante 1- 2 minutos. 8. Lavar con agua.
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9. Decolorar el frotis con la solucin de alcohol- acetona (inclinar la lmina y decolorar hasta que no arrastre colorante) mximo por 10 segundos.
10. Lavar con agua. 11. Cubrir con el colorante de contraste fucsina bsica durante 30 segundos. 12. Lavar con agua. 13. Secar a temperatura ambiente o con ayuda de la llama dbil del mechero de Bunsen 14. Observar al microscopio con el objetivo de inmersin.
RESULTADO
Las bacterias Gram positivas se colorean de violeta y las bacterias Gram negativas de color rosado.
PROTOCOLO
CATEGORIA
BACTERIANA
MORFOLOGIA
BACTERIANA
ESQUEMA DE
LO OBSERVADO
GRAM POSITIVAS
GRAM NEGATIVAS
CUESTIONARIO
1. A que se debe que las bacterias Gram negativas no retengan el complejo cristal violeta- yodo? 2. A que se debe que los colorantes bsicos tian el ncleo de las clulas? 3. Con que clase de colorante teira el protoplasma de la clula?
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PRACTICA N 2
COLORACION DIFERENCIAL DE ZIEHL-NEELSEN
INTRODUCCION
Coloracin diferencial que permite la tincin de microorganismos que poseen elevado contenido de lpidos, como el
gnero Mycobacterium (bacilo tuberculoso), llamados tambin cido-alcohol-resistente. Al teirse los microorganismos
con el colorante primario (fucsina bsica fenicada) que es soluble en sustancias lipodes y aplicando el calor, el colorante
es forzado a penetrar en la clula y en esta forma resistir a la decoloracin.
MATERIAL
Lminas con frotices de bacilo tuberculoso Set de coloracin Ziehl-Neelsen:
Fucsina fenicada al 5% (colorante primario)
Alcohol cido (alcohol etlico con 3% de HCl)
Azul de metileno (colorante de contraste) Mechero de alcohol
PROCEDIMIENTO
1. Cubrir con fucsina fenicada el frotis realizado en la lmina y calentar la preparacin con el mechero de alcohol hasta apreciar el desprendimiento de vapores, repetir este procedimiento por tres veces , evitando que hierva el colorante.
2. Lavar con agua corriente. 3. Decolorar con alcohol cido hasta que se aprecie una coloracin rosada. 4. Lavar con agua corriente 5. Cubrir con colorante de contraste: Azul de metileno por un minuto. 6. Lavar con agua corriente 7. Secar y observar con lente de inmersin.
RESULTADO
Las bacterias cido alcohol resistentes se tien de color rojo y las no cido alcohol resistentes se tien de color azul.
PROTOCOLO
LAMINA
MORFOLOGA
ESQUEMA
COLORACION DE
ZIEHL- NEELSEN
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CUESTIONARIO
1. Para que clase de microorganismos es recomendable le coloracin cido alcohol resistente. 2. Cual es la funcin de la Fucsina bsica fenicada 3. A que se denomina colorante primario y colorante de contraste
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PRACTICA N 3
COLORACION ESPECIAL: COLORACION DE LEISHMAN Y VAGO
INTRODUCCION
Son coloraciones especiales que permiten colorear algunas bacterias que no tienen afinidad con los colorantes de anilina
como: las espiroquetas. As como tambin la coloracin de microorganismos presentes en la sangre.
COLORACION DE LEISHMAN
Es una coloracin especial policromtica utilizada para demostrar la presencia y morfologa de microorganismos en
sangre y tejidos como: Bartonella, Hongos, Rickettsias.
MATERIALES
Frotis de sangre con Bartonella Solucin de colorante Leishman Agua destilada tamponada Microscopio con lentes de 100X Aceite de inmersin
PROCEDIMIENTO
1. Cubrir el frotis con el colorante y dejar actuar por 5 minutos. 2. Agregar agua destilada tamponada mezclando bien y esperar 15 minutos 3. Lavar con agua de cao y dejar secar 4. Observar con objetivo de inmersin 5. Anotar los resultados en el protocolo.
COLORACIN DE VAGO
Es utilizado para la coloracin de grmenes fuso-espirilares y espiroquetas, que no se colorean por el mtodo de Gram,
ni por el Ziehl-Neelsen y que se colorean muy dbilmente con el Leishman.
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MATERIALES
Lmina portaobjetos Palito mondadientes Solucin fisiolgica al 0.85% Set de coloracin de Vago:
Mercuro cromo al 2%
Violeta de genciana
Asa de siembra en aro Microscopio con lentes de 100X Aceite de inmersin
PROCEDIMIENTO
1. En una lamina colocar una gota de suero fisiolgico al o.85% 2. Con el palito mondadientes obtener una muestra de sarro dentario y realizar un frotis en capa fina extendiendo en
sentido espiral de adentro hacia fuera.
3. Fijar el frotis al calor suave 4. Cubrir con Mercuro cromo durante 3 minutos 5. Lavar con agua corriente 6. Cubrir el frotis con Violeta de genciana por 3 minutos 7. Lavar con agua corriente 8. Secar y observar al microscopio con objetivo de inmersin.
RESULTADOS
Coloracin Leishman: Los microorganismos se tien de color rosado oscuro
Coloracin de Vago: Observar Treponema phagadeni, espiroqueta que se encuentra formando parte de la flora normal
de la boca, en forma de espiral y de color violeta- rosado.
PROTOCOLO
LAMINA
MORFOLOGIA
ESQUEMA
COLORACION
LEISHMAN
COLORACION VAGO
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CUESTIONARIO
1. Para que clase de microorganismos es recomendable le coloracin cido alcohol resistente 2. Cual es la funcin de la Fucsina bsica fenicada 3. A que tipo de colorante pertenece el colorante Leishman 4. A que grupo bacteriano se les denomina grmenes fuso-espirilares
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PRACTICA N4
MEDIOS DE CULTIVO SIMPLES, DIFERENCIALES Y ENRIQUECIDOS
INTRODUCCION Para el aislamiento de bacterias de un material patolgico, es necesario su cultivo en medios especiales con una
determinada concentracin de iones de hidrgeno, sales, compuestos nitrogenados, hidratos de carbono, humedad y
temperatura. Segn su utilizacin pueden ser: simples, enriquecidos y diferenciales.
MATERIALES
Probetas de 100 ml. Balones de 250 ml. Tiras de Papel indicador de pH Frasco con solucin NaOH (N/10) Frasco con solucin HCl (N/10) Pinzas rectas Bagetas de vidrio
Goteros de vidrio Trpodes con malla de Asbesto Tubos de 16x150 mm Tubos de 13x100 mm Placas Petri Frascos estriles Agua destilada Tubo con sangre citratada
Caldo nutritivo Agar simple
Extracto de carne 0.3 g Extracto de carne 0.3 g Peptona 1.0 g Peptona 1.0 g Dextrosa 0.5 g Dextrosa 0.5 g Cloruro de sodio 0.5 g Cloruro de sodio 0.5 g Agua destilada 100 ml Agua destilada 100 ml pH 7.0 - 7.4 Agar 1.5 g
pH 7.0 - 7.4
Caldo peptonado Peptona 2.0 g Cloruro de sodio 1.0 g
5.0 gr. de Agar Mac Conkey deshidratado. 6.0 gr. de Agar SS deshidratado. 6.5 gr. de Agar TSI. 2.2 gr. de Agar Citrato de Simmons 2.1 gr. de Agar Urea. 1.7 gr. de Caldo MR VP 3.3 gr. de Agar Lisina Hierro.
PREPARACION
I. MEDIOS DE CULTIVO SIMPLES
1. Para el Caldo nutritivo; primero disolver los ingredientes en los 100 ml de agua destilada y someter al calor hasta su completa dilucin. Luego tomar el pH con el papel indicador. Si el medio es cido agregar gota a gota la solucin
de NaOH; si el medio es alcalino agregar gota a gota solucin de HCl hasta lograr el pH indicado. Envasar y
dejar en refrigeracin hasta su utilizacin.
2. Para el Agar simple; disolver primero el Agar en los 100 ml de agua destilada tibia, luego agregar los dems ingredientes. Controlar el pH con ayuda de las soluciones de NaOH HCl. Luego envasar y esterilizar a 121C por
utilizacin.
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II. MEDIOS ENRIQUECIDOS
1. Para el Agar Sangre; primero preparar Agar simple y esterilizar en autoclave, luego dejar enfriar hasta una
obtener un buen homogenizado y distribuir en Placas Petri estriles; dejar luego solidificar y realizar el control de
esterilidad. Mantenerlo en refrigeracin hasta su utilizacin. El color normal del medio debe ser rojo cereza.
2. Para el Agar chocolate torne color chocolate, luego repartir en placas Petri estriles y realizar control de esterilidad y dejarlo despus en
refrigeracin.
3. Para el Agar Mac Conkey; disolver el medio en los 100 ml de Agua destilada, calentar hasta su completa disolucin. Autocl
4. Para el Agar SS; disolver el medio deshidratado en 100 ml. de Agua destilada, someter al calor hasta su completa disolucin . Repartir luego en placas estriles. No necesita autoclavar.
III. MEDIOS DIFERENCIALES
1. Para el Agar TSI (Hierro tres azcares);disolver el medio en 100 ml de Agua destilada, hervir hasta su completa
autoclavar colocar los tubos en plano inclinado. El medio al final tendr un color rojo naranja.
2. Para el Agar Citrato Simmons, seguir los pasos para el Agar TSI, el medio tendr un color verde.
3. Para el Agar Urea; disolver el medio en agua destilada, hervir hasta su completa disolucin y autoclavar. Despus adicionar 5 ml de Solucin de Urea al 40% esterilizada por filtracin; mezclar homogneamente y repartir en tubos
de 13x100mm en plano inclinado. El medio tendr un color amarillo.
4. Para el Caldo Peptonado; disolver los medios en agua destilada tibia, repartir en tubos de 13x100mm y autoclavar
5. Agar Lisina Hierro; disolver el medio en agua destilada por calor hasta su completa disolucin y repartir en tubos no inclinado.
PROTOCOLO
Realizar un cuadro indicando:
A. Los medios de cultivo preparados en cada mesa.
B. El color que presentan cada medio de cultivo preparado.
C. Materiales que usaron para la preparacin.
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PRACTICA N 4- A
SIEMBRA BACTERIANA. MEDIOS DE AISLAMIENTO.
INTRODUCCION
Cuando las bacterias se siembran en un medio de cultivo y en condiciones adecuadas, ocurre un incremento marcado del
nmero de clulas. Algunas especies alcanzan una poblacin mxima a las 24 horas y otras necesitan un perodo ms
prolongado para alcanzar su mximo desarrollo.
Los microorganismos que desarrollan en medios de cultivo en el laboratorio, se denominan cultivos y el resultado de la
multiplicacin bacteriana colonia, as como el procedimiento por el cual se pone en contacto un microorganismo con un
medio de cultivo, se llama siembra. Existen varias tcnicas de siembra, siendo las ms usadas : La siembra por
estra, por dispersin-agotamiento, por inoculacin y por puntura.
Las principales caractersticas morfolgicas que presentan las colonias son:
FORMA : Circular, elptica, puntiforme y filamentosa.
ELEVACIN : Plana, convexa, acuminada, umbilicada.
BORDE : Entera, ondulada, dentada y filamentoso.
SUPERFICIE : Lisa, rugosa, granulada.
TAMAO : Dimetro en milmetros.
CONSISTENCIA: Cremosa, membranosa y mucosa.
CROMOGENESIS: Pigmentacin verde, amarilla, roja, etc.
MATERIALES
Tubos con suero fisiolgico estril Tubos de 16x150 con Caldo nutritivo Tubos de 16x150 con Agar nutritivo Placas con Agar nutritivo Placas con Agar Mac Conkey Tubos de 16x150 con medio hipertnico de Chapman Placas con Agar hipertnico de Chapman Tubos con Agar Sabouraud Torundas estriles Asas de siembra en aro y punta
PROCEDIMIENTO
A) TIPOS DE SIEMBRA
Siembra por estra: Diseminar en forma de zigzag, una pequea cantidad de muestra bacteriana sobre la superficie del
medio de cultivo slido con la ayuda de un Asa de siembra en aro.
Siembra por dispersin-agotamiento: Sembrar la muestra bacteriana en zigzag, hasta la mitad de la superficie del
medio de cultivo
que se agote toda la muestra del Asa de siembra en aro.
Siembra por puntura: Sembrar la muestra bacteriana en un tubo con Agar semi-slido, con ayuda del Asa de siembra
en punta, introducindola en forma vertical hasta la mitad de Agar.
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Siembra por inoculacin: Con ayuda de un Asa en aro, tomar una muestra bacteriana e introducirlo hasta el fondo del
tubo con medio lquido, procurando no tocar las paredes del tubo.
B) LECTURA :
Con la ayuda del profesor:
1. El alumno proceder a hacer el estudio de lo que ha desarrollado en los medios de cultivos sembrados. 2. Realizar un protocolo con los resultados obtenidos.
PROTOCOLO
METODOS DE SIEMBRA
DESCRIPCION DE LA SIEMBRA
MEDIO DE CULTIVO
USADO
ESTRIA
DISPERSION AGOTAMIENTO
PUNTURA
INOCULACIN
CARACTERISTICA DE LA
COLONIA
OBSERVACION DE COLONIAS
MEDIO DE CULTIVO
USADO
FORMA
ELEVACIN
BORDES
SUPERFICIE
TAMAO
CONSISTENCIA
CROMOGENESIS
RESULTADO DE LAS SIEMBRAS REALIZADAS:
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PRACTICA N 5
METABOLISMO BACTERIANO
INTRODUCCION
La identificacin bacteriana inicial puede realizarse mediante la determinacin de las caractersticas de las colonias y
morfologa con tincin de Gram u otras coloraciones. Sin embargo, la caracterizacin final de un aislamiento bacteriano
desconocido, para identificarlo a nivel de gnero y especie se lleva a cabo estudiando ciertos sistemas enzimticos que
son nicos para cada especie y sirvan como marcadores de identificacin.
En el laboratorio, estos sistemas enzimticos se detectan inoculando una pequea porcin de la colonia bacteriana aislada
en una serie de medios de cultivo que contienen substratos especficos e indicadores qumicos que permiten detectar
cambios del pH o la presencia de subproductos especficos.
I. ACCION SOBRE LOS CARBOHIDRATOS
Por definicin, la fermentacin es un proceso metablico de oxido- reduccin que ocurre en un medio ambiente
anaerobio, y en lugar de oxgeno, un substrato orgnico sirve como el aceptor final de hidrgeno (electrones). Este
trmino de fermentacin se refiere a la utilizacin de hidratos de carbono como la glucosa los cuales les servirn como
fuente de energa y carbono.
Las bacterias se diferencian por los hidratos de carbono que utilizan, los tipos y cantidades de cidos mixtos producidos,
dando como resultado la acidificacin del medio, el cual es visible por el cambio de color en el medio de cultivo de
fermentacin (pH- indicador); la presencia de gas (CO2 e H+) se manifiesta por la presencia de burbujas o rotura del
medio slido.
A) REACCIONES DE OXIDACIN- FERMENTACIN DE AZUCARES:
EN MEDIO TSI (Triple Sugar Iron)
EL medio TSI fue diseado para la diferenciacin de Bacilos Gram negativos, basndose en la capacidad potencial de
estas bacterias para fermentar carbohidratos y producir sulfuro de hidrgeno (H2S).
El medio contiene tres azcares: glucosa, lactosa y sacarosa en proporciones de 1:10:10 respectivamente. Para detectar
los productos cidos generados se emplea un indicador de pH que es el rojo de fenol cuyo rango de viraje est entre pH
8.4 (rojo) y pH 6.8 (amarillo).
Los patrones de comportamiento de los bacilos Gram negativos ante los carbohidratos presentes en este medio pueden
ser fundamentalmente tres:
1. Fermentacin de glucosa nicamente. 2. Fermentacin de glucosa + lactosa, glucosa + sacarosa o glucosa + ambos carbohidratos. 3. No fermentacin de carbohidratos.
Como producto de la fermentacin de los diferentes carbohidratos se puede formar gas, que se detecta como pequeas
burbujas o grietas en el medio o por desplazamiento del mismo hacia arriba del tubo.
El medio tiene incorporado tiosulfato de sodio como fuente de azufre para generar H2S, y sales de hierro que al
reaccionar con el gas forman un precipitado negro insoluble de sulfuro ferroso (FeS).
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MATERIAL
Tubo con medio TSI en plano inclinado. Cepas control: E. coli, S. aureus, Ps. aeruginosa
PROCEDIMIENTO
1. Con el asa de siembra inocule una porcin pequea de la colonia en el centro del tubo y estre la superficie del pico de flauta.
2. Rotular e incubar a 37C por 18- 24 horas.
INTERPRETACION
Es indispensable que la lectura se haga en el tiempo de incubacin indicada.
1. Producto de H2S: ennegrecimiento en el fondo del tubo. 2. Fermentacin de la glucosa nicamente: (rojo/amarillo), esto se debe a que la glucosa (que se encuentra en baja
concentracin con respecto a los otros azcares), ha sido utilizada y la cantidad de cido producido no es suficiente
para neutralizar los productos alcalinos generados por la utilizacin de la peptona; adems los cidos pueden ser
utilizados.
Estos procesos, que son oxidativos, ocurren en la superficie del medio, mientras que en el fondo, por no estar en
contacto con el oxgeno, slo hay fermentacin y el medio permanece cido.
3. Fermentacin doble o triple de carbohidratos:(Amarillo/amarillo).La fermentacin de la glucosa y alguno (o ambos) de los otros dos azcares produce gran cantidad de cidos, por lo que el tubo permanece amarillo.
4. No fermentacin de carbohidratos:(rojo/anaranjado). Se presenta nicamente utilizacin oxidativa de peptonas, por lo que slo la superficie del tubo se alcaliniza.
5. Produccin de gas: Formacin de burbujas (CO2 e H+), grietas o desplazamiento del medio.
B) PRODUCCION DE ACIDOS Y ACETIL- METIL- CARBINOL (Acetoina)
1. PRUEBA DEL ROJO DE METILO ( RM )
La prueba de Rojo de metilo es una prueba cuantitativa que proporciona una caracterstica valiosa para identificar
especies bacterianas que producen cidos fuertes (lctico, actico, frmico) a partir de glucosa.
Estas bacterias que primariamente siguen la va de fermentacin de cidos mixtos frecuentemente producen
suficiente cido despus de una incubacin prolongada, como para mantener un pH por debajo de 4.4 (el punto
cido lmite del indicador rojo de metilo), superando el sistema amortiguador del pH del medio.
2. PRUEBA DE VOGES PROSKAUER ( VP )
El cido pirvico, un compuesto fundamental formado en la degradacin fermentativa de la glucosa, es
metabolizado por algunos microorgansmos produciendo el acetil- metil- carbinol(Acetoina)un subproducto
neutro de la va 2,3- butilenglicol.
La prueba se basa en la conversin del acetil- metil- carbinol en diacetil a travs de la accin del KOH y Oxgeno
atmosfrico. El diacetilo es convertido en un complejo rojo bajo la accin cataltica del Alfa naftol y Creatinina.
MATERIALES
Cepa bacteriana MR positivo y negativo Cepa bacteriana VP positivo y negativo Reactivo Rojo de metilo Reactivo de Voges- Proskauer(Alfa naftol al 5% y KOH al 40%) Cepas bacterianas E. coli y Klebsiella
PROCEDIMIENTO
1. Por la tcnica de inoculacin, sembrar independientemente la cepa control MR positivo y negativo, en el medio MR- VP. Rotular los tubos e incubar durante 48- 72 horas a 37C.
2. Proceder del mismo modo con las cepas VP controles, incubar por 18- 24 horas.
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INTERPRETACION
1. Para la prueba Rojo de Metilo, aadir al cultivo unas gotas del reactivo del mismo nombre, cuyo rango de viraje est entre pH 4.4(rojo) y 6.0 (amarillo). La prueba positiva se manifiesta de color rojo estable y la
negativa de color amarillo- naranja.
2. Para la prueba de Voges- Proskauer, agregar al cultivo 0.6 ml(12 gotas) de Alfa naftol y 0.2 ml (4 gotas) de KOH. Agitar el tubo por 1 minuto y dejarlo en reposo durante 15 minutos. Es importante aadir los reactivos en
el orden especfico.
Una prueba positiva, color rojo localizado en la mitad superior o en todo el tubo es observada dentro de los
primeros 15 minutos. Si la lectura se realiza despus de una hora los cultivos pueden presentar un color cobrizo,
siendo esta una interpretacin falsa positiva.
En la prueba negativa no cambia el color inicial del medio de cultivo.
II. ACCION SOBRE LAS PROTEINAS
PRODUCCION DEL INDOL
Las bacterias que poseen la enzima triptofanasa son capaces de actuar sobre el aminocido triptofano,
produciendo indol, un benzil pirrol, cido pirvico y amoniaco(NH3). El indol puede detectarse en un medio
rico en triptofano, observando la aparicin de un color rojo(en forma de anillo o impregnado en la tira de
papel), luego de agregar una solucin que contiene p- dimetilaminobenzaldehido.
MATERIALES
Cepa indol positivo y negativo. Medio lquido peptonado y/o Medio SIM Reactivo de Kovac(alcohol amilico + HCL concentrado + p- dimetilamino benzaldehido). Cepas bacterianas E. coli, Salmonella.
PROCEDIMIENTO
La aparicin de un color rojo fucsia brillante en la interfase del reactivo y el caldo, pocos segundos despus de
haber agregado el reactivo es indicativo de la presencia de indol y constituye una prueba positiva. Las
bacterias que ha pesar de desarrollar en el medio, pero que no producen indol, al agregar el reactivo, este
aparecer sin cambio alguno, siendo esta una prueba negativa.
III. UTILIZACION DEL CITRATO COMO UNICA FUENTE DE CARBONO
Esta prueba se utiliza principalmente para identificar varias especies de la familia Enterobacteriaceae, las
cuales pueden obtener energa por va distinta de la fermentacin de los carbohidratos, utilizando el citrato de
sodio como nica fuente de carbono para su metabolismo y desarrollo, por lo tanto,cualquier medio que se
emplee para determinar esta caracterstica no debe contener protenas ni carbohidratos.
El citrato de sodio es una sal del cido ctrico, compuesto orgnico simple que constituye uno de los
metabolitos del ciclo de Krebs.
PRINCIPIO
La utilizacin del citrato por una bacteria se detecta por su crecimiento en un medio con citrato con formacin
de subproductos alcalinos. El medio (Citrato de Simmons)incluye citrato de sodio, un anin como nica
fuente de carbono y fosfato de amonio como nica fuente de nitrgeno.
Las bacterias que pueden utilizar citrato tambin pueden extraer nitrgeno de la sal de amonio, con produccin
de amonio(NH3), alcalinizando el medio por conversin del NH3 en hidrxido de amonio(NH4OH),
detectndolo con el indicador de pH incorporado el azul de bromotimol cuyo rango de viraje esta entre pH
6.9(verde) y pH 7.8(azul).
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MATERIALES
Cepa control citrato positivo y negativo. Medio de Citrato de Simmons en plano inclinado
PROCEDIMIENTO
1. Con el asa de siembra bien esterilizada, sembrar por la tcnivca de estra en cada tubo la cepa citarto positiva y negativa.
2. Rotular los tubos e incubar a 37C por 18- 24 horas.
INTERPRETACION
Prueba positiva:Color azul en 24 a 48 horas y crecimiento en la superficie
del medio inclinado.
Prueba negativa: No hay cambio de color ni crecimiento.
IV. HIDRLISIS DE LA UREA (PRUEBA DE LA UREASA)
Prueba importante para la identificacin de especies bacterianas que poseen la enzima ureasa que hidroliza la
urea, segn el siguiente esquema:
O
NH2- C- NH2 + 2HOH ------------------- CO2 + H2O + 2 NH (NH4)2 CO3 Ureasa
El amoniaco reacciona en la solucin para dar carbonato de amonio, producindose una alcalinizacin y un
aumento del pH del medio que lleva como indicador el rojo neutro.
MATERIALES
Cepa patrn ureasa positiva y negativa ( E. coli, Proteus ) Medio Agar urea segn Christensen
PROCEDIMIENTO
1. Por medio de la siembra por estra, sembrar la cepa positiva y negativa. No inocular en el fondo. 2. Incubar durante 18- 24 horas a 37C
INTERPRETACION
Prueba positiva: se observa de color rosado en la superficie o en todo el medio.
Prueba negativa: El medio permanece del color original
V. PRUEBA DE LA CATALASA
La catalasa es una enzima que poseen la mayora de las bacterias aerobias y facultativa anaerobias.
El perxido de hidrgeno (H2O2) es uno de los productos finales del metabolismo oxidativo de los
carbohidratos y s se acumula es letal para el microorganismo.
La catalasa convierte el perxido de hidrgeno en agua y oxgeno de acuerdo a la siguiente reaccin:
2 H2O2 --------> 2 H2O + O2
La prueba es de vital importancia en la diferenciacin de los estreptococos (catalasa negativa) de los
estafilococos (catalasa positiva).
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MATERIALES
Cepas Controles: S. aureus, Streptococcus Enterococcus Solucin de Perxido de hidrgeno (H2O2) al 3% Medio de cultivo: cualquier medio slido, no inhibitorio, y sin sangre ya que los eritrocitos poseen
actividad de catalasa, por lo que su presencia puede dar resultados falsos positivos.
PRUEBA EN LMINA
a) Con el asa bacteriolgica en punta o un aplicador estril, picar el centro de una colonia bien aislada y transferir l inoculo a un portaobjetos limpio.
b) Aadir 1 a 2 gotas de H2O2 al 3% c) Observar si se forman burbujas o no inmediatamente despus que se aade el reactivo. d) Descartar la lmina en un recipiente con desinfectante.
PRECAUCIONES
1. El orden de la prueba en lmina no debe invertirse cuando se use asa de platino, ya que puede resultar falso positivo. El alambre de nichrone no interfiere en el resultado de la prueba.
2. La prueba debe realizarse en cultivos de 18- 24 horas; cultivos ms viejos pueden perder su actividad de catalasa dando una reaccin falsa negativa.
3. El H2O2 es extremadamente acstico, por lo que se debe evitar que toque la piel, en caso que ocurra inundar el rea afectada con alcohol de 70% para neutralizar la accin. NO DEBE USARSE AGUA.
INTERPRETACION
Prueba cualitativa: La aparicin rpida y prolongada de burbujas, de gas o efervescencia son indicativas de
catalasa positiva. Algunas bacterias poseen enzimas diferentes a la catalasa que descomponen el H2O2, dando
pocas burbujas diminutas durante 20- 30, stas no son catalasa positivas.
VI. PRUEBA DE LA CITOCROMO OXIDASA
Los citocromos son hemoprotenas que contienen hierro y actan como el ltimo eslabn de la cadena
respiratoria aerobia, transfiriendo electrones (H) al oxgeno con formacin de agua. El sistema citocromo se
encuentra en los organismos aerobios o anaerobios facultativos, permitiendo identificar a organismos que
carecen de la enzima o son anaerobios estrictos.
En el laboratorio se hace reaccionar la bacteria con un sustrato oxidable como el dimetil o tetrametil- p-
fenilendiamina ( el cual se presenta en solucin, discos o tiras llamados comnmente oxidasa).
MATERIAL
Cepa control: sembrada en Agar nutritivo
Reactivo de oxidasa
PROCEDIMIENTO
1. Directo: Se aaden a las placas sobre la bacteria dos o tres gotas del reactivo. 2. Indirecto: Se toma con el asa un poco de la colonia bacteriana y se extiende sobre los discos o tiras de
papel que tienen ya el reactivo de oxidasa
INTERPRETACIN
Las colonias bacterianas con actividad Citocromo oxidasa desarrollan inmediatamente un intenso color azul
oscuro.
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VII. PRUEBA DE LA HEMOLISINA
Algunos microorganismos son capaces de producir una serie de enzimas y sustancias txicas que pueden ser
detectadas al sembrar el microorganismo en una placa de Agar sangre, produciendo la lisis de los eritrocitos,
segn el tipo de lisis que producen pueden clasificarse en tipo Alfa, Beta y Gamma.
MATERIALES
Cepa bacteriana
Placas con Agar sangre de carnero
PROCEDIMIENTO
1. Con el asa en aro sembrar la cepa bacteriana en la placa de Agar sangre 2. Incubar por 18 24 horas a 37 C
INTERPRETACIN
Hemlisis tipo Alfa: Es un tipo de hemlisis incompleta, hay un enverdecimiento del medio debido a la salida
de un derivado del tipo de la metahemoglobina, que es oxidado a compuestos del tipo de la biliverdina
Hemlisis tipo Beta: Hay una lisis completa del eritrocitos observndose una zona clara alrededor de la colonia
VIII. PROTOCOLO
PRUEBAS
BIOQUMICAS
MEDIO DE
CULTIVO
REACTIVO Y /O
INDICADOR
LECTURA
TSI
(Fermentacin- H2S)
VOGES- PROSKAUER
(VP)
ROJO DE METILO
(MR)
INDOL
CITRATO
CATALASA
UREASA
CITOCROMO OXIDASA
HEMOLISINA
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PRACTICA N 6
PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A LOS ANTIBIOTICOS (ANTIBIOGRAMA)
INTRODUCCION
Es una prueba de laboratorio clnico que se utiliza para medir la actividad antibacteriana de los antibiticos y
quimioterapeticos empleados en el tratamiento de las enfermedades infecciosas.
La medida de la actividad antibacteriana puede realizarse por los siguientes mtodos:
Mtodo de dilucin Mtodo de Difusin en Agar
OBJETIVOS
1. Realizar la tcnica de difusin en Agar simple para determinar la susceptibilidad a los antibiticos. 2. Interpretar los resultados del mtodo utilizado. 3. Precisar las indicaciones y limitaciones de la tcnica empleada.
DILUCION EN TUBO
Permite estimar cuantitativamente la susceptibilidad de un antibitico, midiendo la concentracin inhibitoria mnima
(CIM), es decir, la concentracin ms baja que inhibe el crecimiento in vitro bacteriano. Consiste en la preparacin de una serie de diluciones del antibitico estudiado en caldo o en medio agar al cual se
inocula luego una suspensin del germen. Luego de una incubacin por 24 horas, se puede observar la CIM como la
dilucin ms alta en la que no existe crecimiento macroscpico bacteriano. Esta tcnica es costosa por la cantidad de
material que se utiliza.
DIFUSION EN AGAR (Segn Kirby- Bauer y col.)
Es un mtodo simple de rutina en Microbiologa mdica, para seleccionar el antibitico o quimioterpico ms adecuado
en la terapia de las enfermedades infecciosas. Consiste en sembrar la muestra en estudio sobre toda la superficie de una
placa de Agar y colocar luego discos de papel filtro que contienen los antibiticos y que despus de una incubacin de 24
horas, se observan las zonas de inhibicin alrededor de cada disco de antibitico. La cantidad de antibitico presente en
el disco difiere para los distintos frmacos.
MATERIALES
Placas de Agar nutritivo Placas de Agar Mller Hilton o Tripticase soya Tubos con caldo nutritivo Tubos con Agar semi- slido Tubos con cultivo bacteriano Asas de siembra Torundas estriles Discos impregnados con diferentes antibiticos o quimioterpicos (sensi- disck). Pinzas Mecheros
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PROCEDIMIENTO
1. Sumergir la torunda en el caldo bacteriano, escurrir en las paredes del tubo y sembrar uniformemente sobre la superficie de la placa de Agar.
2. Dejar reposar por 5 minutos a temperatura ambiente.
3. Con la pinza en condiciones estriles, colocar los discos impregnados con los diferentes antimicrobianos sobre la superficie del Agar. La distancia entre los discos debe ser de 20mm.
4. Incubar a 37C durante 24 horas.
LECTURA
a) Medir en milmetros el dimetro de las zonas de inhibicin del desarrollo bacteriano alrededor de los discos, incluyendo el dimetro del disco.
b) Comparar con la tabla el dimetro de las zonas de inhibicin obtenidas y determinar si el microorganismo es Resistente ( R) , intermedio (I), o susceptible (S) a los diferentes antimicrobianos utilizados.
Un resultado intermedio (I) indica que el aislado es menos susceptible de lo normal, pero puede responder a dosis
altas del antibitico.
La cantidad de antibitico presente en el disco depende de la concentracin y de su capacidad de difusin en el agar.
c) Anotar e interpretar los resultados.
PROTOCOLO
Desarrollar y esquematizar un cuadro indicando los resultados que se han obtenido en la prctica desarrollada.
CUESTIONARIO
1. Cul es la importancia de su aplicacin. 2. En que casos usted indicara esta prueba 3. Que indica la Resistencia o Susceptibilidad de un microorganismo en esta prueba.
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PRACTICA N 7
REACCION ANTIGENO ANTICUERPO: AGLUTINACIN
La aglutinacin es un fenmeno inmunolgico producto de una reaccin antgeno-anticuerpo en el que uno de los
reactantes es de naturaleza particulada, de tamao grande. Estas partculas pueden ser bacterias, eritrocitos, partculas de
ltex, bentonita, etc., y se encuentran recubiertas en forma natural o artificial por antgenos o anticuerpos. Al ser
suspendidas en un medio salino y mezclarse con antisueros o antgenos especficos, formaran los respectivos complejos
Ag-Ac observables a simple vista o con lentes de poco aumento.
AGLUTINACION BACTERIANA
Existen muchos mtodos comnmente empleados para demostrar la aglutinacin bacteriana, uno de los ms simples es la
aglutinacin en lmina o prueba de Widal, que consiste en la mezcla del antgeno con el suero del paciente en una
lmina. Esta tcnica ofrece un mtodo de muestreo rpido para anlisis de rutina.
MATERIALES
Lmina para aglutinacin ( lminas excavadas) Antgeno bacteriano Suero de paciente Pipetas serolgicas de 0.2 ml Palitos mondadientes
PROCEDIMIENTO
1. Con la pipeta colocar una gota del suero problema, en cada uno de los pocitos de una lmina de vidrio excavada. 2. Agregar una gota de cada uno de los antgenos a cada gota de suero de un mismo paciente. 3. Mezclar uniformemente con ayuda de un mondadientes distinto para cada gota. 4. Hacer rotar suavemente la lmina por espacio de 2 a 3 minutos.
RESULTADO
La aglutinacin se observa por la aparicin de grumos de tamao variable que tienden a agruparse en la periferia de la
gota. Anotar los resultados en su protocolo.
PROTOCOLO
REACTIVOS
TUBOS
1 2
3 4 5
ANTISUERO
0.08
0.04
0.02
0.01
0.005
ANTIGENO
AGREGAR UNA GOTA A CADA TUBO
TITULO
1/20
1/40
1/80
1/160
1/320
RESULTADO:
Ttulo del suero: .
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PRACTICA N 7- A
FAGOCITOSIS
La lnea celular de defensa est ntimamente asociada con la lnea humoral. La fagocitosis o el englobamiento de
partculas extraas por ciertas clulas es un fenmeno no especfico, pero se incrementa cuando intervienen anticuerpos
especficos o complementos. Entre las clulas fagocticas se encuentran los polimorfonucleares y los macrfagos
(monocitos libres). A estas sustancias que demuestran habilidad para hacer a los antgenos ms susceptibles a la
fagocitosis se les llama OPSONINAS.
FAGOCITOSIS IN VITRO
Las pruebas OPSONOCITOFAGICAS son difciles de realizar, en comparacin con otras pruebas serolgicas, pero en
ciertos sistemas es la nica a ser utilizada. El antgeno y la sangre total (conteniendo los anticuerpos, complemento y
leucocitos) se incuban juntos y luego, muestras de estas mezclan se colorean.
El ndice fagoctico es el nmero promedio de partculas ingeridas por cada 100 Neutrfilos de la sangre.
MATERIAL
Cultivo en caldo de Staphylococcus y/o Klebsiella Tubos de 13x100 con 0.5 ml de EDTA sdica al 1% Una jeringa de 5 ml con aguja N 20 Pipetas Pasteur con perilla de jebe Lminas portaobjetos Colorante Wright Agua tamponada Bao Mara a 37C Centrfuga Gradilla Microscopio con objetivo de inmersin Aceite de cedro
PROCEDIMIENTO
1. Con la jeringa hipodrmica recolectar 5 ml de sangre venosa. 2. Colocar en cada tubo con EDTA, 5 ml de sangre y mezclar suavemente. 3. Agregar 0.5 ml de cultivo bacteriano a cada tubo respectivamente. 4. Llevar los tubos a Bao Mara por 30 minutos, mezclando suavemente cada 10 minutos. 5. Centrifugar a 3000 r.p.m. por 5 minutos, cada tubo. 6. Recolectar con una pipeta Pasteur los elementos formes de la capa de glbulos blancos de cada tubo. 7. Realizar los frotices y colorear con Wright:
Cubrir el frotis con colorante Wright por espacio de 3 minutos. Aadir agua tamponada y soplar suavemente realizando una buena mezcla. Despus de 15 minutos, lavar con agua de cao. Secar y observar con objetivo de inmersin.
RESULTADO
Se observar la presencia de grmenes intracelulares que han sido fagocitados.
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PRACTICA N 8
REACCION DE PRECIPITACION
INTRODUCCION
Es una reaccin antgeno- anticuerpo, en el que el antgeno es de naturaleza soluble. Cuando se mezcla un antgeno
soluble con su anticuerpo correspondiente se forma un precipitado en la zona de equivalencia y visibles por lo general
macroscpicamente. Las reacciones de precipitacin pueden realizarse en un gel como el Agar.
INMUNODIFUSION SIMPLE
Llamada tcnica de Mancini, se utiliza para determinar la concentracin de Inmunoglobulinas en el suero humano. En el
que, un anticuerpo conocido se incorpora a un medio de Agar noble y se deja gelificar; luego se realizan perforaciones en
el Agar donde se coloca el antgeno, procedindose luego a incubar, luego de lo cual, se realiza la lectura observndose
la formacin de un halo circular de precipitacin cuyo dimetro es proporcional a la concentracin antignica.
INMUNODIFUSION DOBLE
Llamada tambin mtodo de Ouchterloni, es til para comparar antgenos, detectar anticuerpos precipitantes, anticuerpos
antinucleares y antgenos en enfermedades. En esta prueba se emplea Agar semi-slido en portaobjetos, en el cual se
efectan perforaciones, los cuales se llenan con los elementos reaccionantes (antgeno- anticuerpo) y luego de 12 a 24
horas de incubacin a temperatura ambiente, observamos la aparicin de bandas de precipitacin.
INMUNOELECTROFORESIS
Es til para la separacin de las protenas en un campo elctrico, permitiendo medir e identificar componentes sricos:
IgA, IgM, IgG, IgD e IgE, cadenas livianas y componentes monoclonales.
Resulta de la combinacin de la electroforesis con la inmunodifusin. En una primera fase los antgenos son colocados
en las perforaciones realizadas en el Agar y separados de acuerdo a su movilidad en un campo elctrico, luego de una
corrida electrofortica, se coloca el antisuero en una especie de surco longitudinal que se abre en el Agar frente a las
protenas que han migrado. Luego de incubar, se forman bandas de precipitacin frente a las Inmunoglobulinas
reaccionantes.
MATERIALES
Suero positivo Antgeno Lminas de vidrio con Agar noble al 1% Placas Petri Pipetas capilares Lminas preparadas y coloreadas
PROCEDIMIENTO
1. Con una pipeta capilar, colocar el suero (contiene los anticuerpos) en el orificio central. 2. Depositar en los orificios perifricos los antgenos a estudiar. 3. Colocar las lminas en una cmara hmeda.
RESULTADO
Observar las bandas de precipitacin que se forman:
Identidad total : Las bandas de precipitacin se unen.
Identidad parcial : Se observa un espoln.
No identidad : Las bandas se cruzan.
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PRACTICA N 9
PRUEBAS INMUNOENZIMATICAS: ELISA
INTRODUCCION
En los ltimos aos se han desarrollado numerosos mtodos para la deteccin de antgenos virales como de anticuerpos
especficos (Ig. M, Ig. G o Ig. Totales).
Se trata de procedimientos de alta sensibilidad, mucho mayor que la prueba de Hemaglutinacin o la prueba de Fijacin
de Complemento y similar a la prueba de Radioinmunoensayo (RIA).
Esta prueba se usa para medir la cantidad de anticuerpo presente en una muestra determinada utilizando colorantes
fluorescentes o enzimas con sustratos cromognicos, las que producen una reaccin de color.
Estas pruebas se conocen como Anlisis de Inmunoabsorbencia Ligada a Enzimas (enzime- linked immunosorbent assay) ELISA.
La ventaja de ELISA con respecto a la prueba de Inmunofluorescencia consiste en que no es necesario un observador
experimentado y en que es posible procesar un gran nmero de muestras simultneamente en forma rpida y
automatizada.
PROCEDIMIENTO
Determinacin de Anticuerpo en fase slida
Sensibilizar una placa de poliestireno, tubo perla, esto consiste en absorber la superficie de la placa con el anticuerpo especfico antiviral o anticuerpo de captura.
Luego se aade la muestra clnica, si esta contiene antgeno viral se unir al anticuerpo de captura Esta unin se detectar mediante otro anticuerpo marcado con una enzima. Las enzimas ms usadas son la
peroxidasa, fosfatasa alcalina biotina- aviclina.
Luego, lavar cuidadosamente para eliminar el anticuerpo marcado no combinado con el antgeno. Aadir el sustrato de la enzima. Observar la presencia de color.
LECTURA
El desarrollo de color puede observarse visualmente o de preferencia con un colormetro o un espectrofotmetro. A mayor cantidad de antgeno presente en la muestra, ms intenso ser el color observado.
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PRUEBA DE ELISA
(ESQUEMA)
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REACCIN DE PRECIPITACIN
(ESQUEMA)
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PRACTICA N 10 - 11
SEMINARIO I: VACUNACIN Y SEROTERAPIA.
1. Objetivos de la vacunacin y Requisitos de una buena vacuna.
2. Tipos de vacunas y Consecuencias patolgicas de la vacunacin.
3. Practicas de vacunacin actual y Medidas de control
INMUNIDAD
4. Clulas del Sistema Inmune.
5. Respuesta inmunitaria en infecciones bacterianas y virales.
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PRACTICA N 12
PREPARACION DE ANTIGENOS BACTERIANOS
INTRODUCCION
Antgeno es toda sustancia que introducida parenteralmente en el hombre o en los animales, induce la formacin de
anticuerpos o la aparicin de fenmenos de hipersensibilidad. "In vitro" y en presencia de factores accesorios, pueden
reaccionar con el anticuerpo especfico, dando lugar a fenmenos perceptibles.
Los Antgenos ms comunes en Medicina son: las bacterias, virus, toxinas, esporas de hongos, hematies, suero, etc.
Se aplican en las inmunizaciones y consisten en inocular un antgeno en dosis adecuadas y generalmente progresivas con
las siguientes finalidades.
1. Inducir en el hombre o en los animales, la formacin de anticuerpos que los protejan contra determinados procesos infecciosos. Este mtodo conocido como vacunacin confiere inmunidad adquirida activa.
2. Obtener antisueros, o sea sueros que contengan anticuerpos, los cuales sern empleados en: a) Seroterapia, para el tratamiento de diferentes enfermedades, como la difteria, ttanos, etc., en las cuales se
administran anticuerpos pre- formados confiriendo al paciente una inmunidad adquirida pasiva.
B) La tipificacin de especies bacterianas, lo que ha dado lugar a verdaderos esquemas de clasificacin, como el
de Kauffmann-White para las Salmonellas, el de Ewing para las Shigellas y el de Kauffmann-Knipschildt-
Vahlne para Escherichia coli.
I. PREPARACION DE ANTIGENOS BACTERIANOS SOMATICOS Y FLAGELARES,A PARTIR DE
CULTIVOS EN MEDIO SOLIDO.
A. MATERIAL
Cultivo bacteriano en medio slido y en desarrollo confluente Cultivo bacteriano en medio lquido (caldo nutritivo) Pipetas graduadas estriles de 5 cc. Suero fisiolgico estril, repartido en frascos de 100 cc. Embudos y gasa, estriles para filtrar Acido fnico concentrado en tubos de 13x100 ml. Formol concentrado, en tubos de 13x100 ml. Pipetas de Pasteur, estriles Escala de MacFarland (tubo N 3) Pipetas graduadas de 1 ml. Tubos vacos estriles de 16x150 ml. Algodn y Alcohol yodado Agar nutritivo en placas y tubos
B. PROCEDIMIENTO
1. Con una pipeta graduada, agregar 2 cc. de suero fisiolgico estril a los cultivos bacterianos presentados en medio slido
2. Recoger por lavado todo el desarrollo bacteriano, tratando de no arrastrar agar 3. Filtrar a travs de gasa estril 4. Separar la suspensin en cantidades iguales en dos tubos de 13x100
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5. Para preparar el Antgeno somtico "O", medir la cantidad de suspensin bacteriana de uno de los tubos y agregar fenol en volumen necesario para alcanzar una concentracin de 0.5%.
Se puede as mismo inactivar las fracciones flagelares, sometiendo el antgeno a la ebullicin durante
dos horas, o tratndolo con alcohol absoluto.
6. Para preparar el Antgeno flagelar "H", inactivar las fracciones somticas en el otro tubo de suspensin bacteriana, agregando formol puro hasta alcanzar una concentracin del 0.5%
7. Ambas suspensiones para poder ser inoculadas, se llevaran a una densidad de 9x108 grmenes por cc. para lo cual se agregan con pipeta Pasteur a un tubo con 10 cc. de suero fisiolgico, gotas de cada uno de los
antgenos concentrados hasta alcanzar una turbidez similar al tubo N3 de la Escala de MacFarland.
Este es un Mtodo turbidimtrico de clculo bacteriano, que consiste en diluir el antgeno y apreciar la turbidez
obtenida comparndola con la de los tubos patrones de un nefelmetro o determinndola con exactitud mediante un
Espectrofotmetro.
El Nefelmetro ms conocido es el de MacFarland, que se obtiene de la siguiente manera:
Preparar una solucin de Cloruro de Bario al 1%
Otra de cido sulfrico al 1%.
Colocar una serie de 10 tubos vacos y estriles
Agregar las soluciones, de acuerdo al siguiente cuadro:
TUBO N
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Cl2Ba 1%
0.1 cc.
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
H2SO4 1%
9.9 cc.
9.8
9.7
9.6
9.5
9.4
9.3
9.2
9.1
9.0
Bacterias
por cc.
3.0 x
108
6.0 x
108
9.0 x
108
1.2 x
109
1.5 x 10
9
1.8 x 10
9
2.1 x 10
9
2.4 x
109
2.7 x 10
9
3.0 x 10
9
La unin de ambos reactivos qumicos forma un precipitado blanco de Sulfato de bario que al homogenizarse da una
turbidez que es ms intensa cuanto mayor es la cantidad de Cloruro de bario empleado. A cada tubo corresponde una
concentracin de grmenes determinada, de acuerdo a lo sealado en el cuadro.
C. CONTROL DE ESTERILIDAD
Sembrar cada uno de los antgenos preparados, en caldo nutritivo y/o agar sangre, con la finalidad de controlar su esterilidad
Realizar la observacin a las 18 24 horas, no debe haber crecimiento bacteriano.
Resultado: Realizar un protocolo del trabajo realizado en la prctica.
D. INOCULACION
1. Inocular en la vena marginal de la oreja del conejo dosis de 0.25 cc., 0.5cc., 0.75cc., 1.0cc., 1.5cc., 2.0cc., 2.5cc., hasta 3.0cc., del antgeno, con intervalo de 4 a 5 das.
2. Realizar la sangra despus de 4 das de la ltima inyeccin.
D. DESARROLLAR UN PROTOCOLO DE INOCULACIN (DEMOSTRACION)
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PRACTICA N 13
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE COCOS GRAM POSITIVOS:
GENERO STAPHYLOCOCCUS
INTRODUCCION
Los Estafilococos pertenecen a la Familia Micrococcaceae y son organsmos redondos u ovales, agrupados
generalmente en forma de racimos, inmviles, no esporulados, y Grampositivos en los cultivos jvenes. Son habitantes
naturales de la flora nasal, boca, piel e intestinos, pero como patgeno es causante de diversos procesos infecciosos que
van desde fornculos, abscesos, intoxicaciones alimentarias hasta septicemias mortales. De las tres especies conocidas
S. aureus, S. epidermidis y S. saprophyticus, slo dos tienen importancia mdica. Slo la especie patgena S. aureus
produce una enzima llamada coagulasa.
MATERIALES
Tubos con secrecin purulenta Placas Petri con Agar hipertnico de Chapman Placas Petri con Agar sangre Tubos con Caldo plasma Lminas portaobjetos Set de colorantes para Gram Asa de platino en aro
PROCEDIMIENTO:
1. Sembrar la muestra problema en las placas con Agar hipertnico de Chapman y Agar sangre, empleando el mtodo de dispersin-agotamiento
2. Realizar un frotis de la muestra y colorearla con Gram. 3. Observar placas sembradas con Staphylocococcus con 24-48 horas de incubacin a 37C, estudiando las
caractersticas de las colonias en medios de Agar sangre y Agar Hipertnico de Chapman (tamao, forma ,
pigmento, hemolisis, etc.)
4. De la placa con Agar sangre y Agar Hipertnico de Chapman, tomar una asada de una colonia de color amarillo e inocularlo el tubo con caldo plasma e incubar a 37C (Prueba de la coagulasa)
5. Realizar la prueba de la Catalasa.
RESULTADOS:
1. Caractersticas macroscpicas de la muestra: 2. Resultado de la coloracin realizada 3. Resultado de la reaccin de la Coagulasa, en caldo plasma observar que slo S. aureus coagula el plasma. 4. Resultado de la reaccin de Catalasa, agregando agua oxigenada y observando la aparicin de burbujas. 5. Resultado en Agar hipertnico de Chapman observar las colonias amarilla (manita positivas) de S. aureus y S.
epidermidis. 6. Observar la presencia de hemlisis en las placas con Agar sangre
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PROTOCOLO:
Realizar un protocolo de trabajo indicando: la especie bacteriana que se trabajo, tamao de la colonia, forma que
presenta, pigmento, hemlisis, y otras caractersticas que crea conveniente.
Complete el cuadro con lo realizado durante la practica.
CEPAS
BACTERIANAS
TRABAJADAS
MH
AS
COAGULASA
CATALASA
GRAM
Caracterstica
morfolgica
CUESTIONARIO:
1. Que factores condicionan la patogenicidad de Staphylococcus aureus. 2. Que caractersticas fisiolgicas identifican a Staphylococcus aureus. 3. Mencione de que cuadros infecciosos son causantes las especies de Staphylococcus. 4. Cul es la composicin del Medio hipertnico de Chapman
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PRACTICA N 14
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE COCOS GRAM POSITIVOS:
GENERO STREPTOCOCCUS
INTRODUCCION
El gnero Streptococcus comprende muchas especies agrupadas segn la clasificacin de Lancefield en los grupos A (S.
pyogenes); B (S. agalactiae); C (Ej. S. equi); D (Ej. Enterococos); G (S. canis); H (S. sanguis); K (S. salivarius) y
Streptococcus pneumoniae (no pertenece a ningn grupo). Con la coloracin de Gram se comportan como positivos
adoptando formas de cadenas. Algunos son patgenos para el hombre y los animales, otros forman parte de la flora
normal o transitoria del cuerpo humano y otros son saprofitos.
Los Streptococcus desarrollan en medios enriquecidos como el agar sangre, que permite diferenciar algunas especies en
base a la hemlisis producida. La hemolisis tipo es incompleta, los glbulos rojos que rodean a la colonia son
parcialmente daados pero no lisados como sucede en la hemolisis tipo . Existe un enverdecimiento del medio debido a la salida del eritrocito de un derivado del tipo de la metahemoglobina, que es oxidado a compuestos como la biliverdina.
El grupo de estreptococos alfa hemolticos se denominan S. viridans. La mayora de Streptococcus pueden desarrollar
en presencia o ausencia de oxgeno. Diversas pruebas bioqumicas permiten la diferenciacin de las especies de
Streptococcus.
MATERIAL
Cultivo de Streptococcus en medio de caldo BHI Placas con Agar sangre de carnero Torunda estril y bajalengua Tubos con Thioglicolato Tubos con caldo Inulina Discos de Bacitracina Discos de Optochin Solucin de Desoxicolato al 2% Tubo con ClNa al 6.5% Lminas portaobjetos Set de colorantes de Gram- Kopeloff Asas de Kolle, pinzas Microscopio, aceite de inmersin.
PROCEDIMIENTO
1. Observar el desarrollo de la cepa de Streptococcus en el medio de caldo BHI, observe si el crecimiento produce turbidez o sedimenta.
2. Tomar una muestra de la garganta con ayuda de la torunda estril, y sembrar en el Agar sangre por el mtodo de dispersin y agotamiento, rotular, incubar a 37C por 18- 24 horas. Con la misma torunda realizar un frotis en la
lmina portaobjetos y colorear por Gram.
3. Realizar la siembra de la cepa en la otra placa con Agar sangre por el mtodo de dispersin agotamiento, en el primer cuadrante colocar un disco de Bacitracina, en el segundo cuadrante el disco de Optochin, incubar a 37C por
18- 24 horas.
4. Sembrar la cepa en el medio de Thioglicolato. 5. Sembrar la cepa en el caldo de Inulina. 6. Sembrar la cepa en el tubo con ClNa al 6.5%
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LECTURA
1. Observar el desarrollo en el Agar sangre sembrada con muestra de la garganta, determinar que colonias son sospechosas de Streptococcus . Realizar el frotis de las colonias sospechosas y colorear por Gram.
2. Observar el tipo de hemlisis, la sensibilidad a la Bacitracina y Optochin en la otra placa de Agar sangre. En la misma placa agregar una gota del Desoxicolato de sodio al 2% sobre una o varias colonias aisladas e incubar a 35C
durante 30 minutos. De otra colonia aislada, realizar un frotis y colorear por Gram.
3. Observar el metabolismo a la Inulina. 4. Observar el desarrollo en el medio de Thioglicolato. 5. Observar el desarrollo en la solucin de ClNa al 6.5%
PROTOCOLO
Realizar un protocolo de trabajo de la prctica realizada
IDENTIFICACION PRESUNTIVA DE STREPTOCOCOS
ORGANISMO
SENSIBILIDAD
CAM
P
Hidrlisis
De
Metabo
Lismo
De
La
Inulina
Desarro
llo
NaCl
6.5%
Lisis por
Bilis
Baci
tra
cina
Opto
chin
Hipu
Rato
Escu
lina
Desoxi
colato
Sodio
- hemolticos GRUPO A
S. pyogenes
S
R
N
N
N
N
N
N
GRUPO B
S. agalactiae
R*
R
P
P
N
N
P*
N
GRUPO C, F, G
R
R
N
N
N
N
N
N
- hemolticos GRUPO Viridans
R*
R
N
N
N*
N
N
N
S. pneumoniae
R
S
N
N
N
P
N
P*
S= Sensible; R= Resistente; N= Negativo; P= Positivo; *= Reaccin variable
CUESTIONARIO
1. Que prueba de laboratorio realizara para diferenciar Str. Pneumoniae de los Streptococcus del grupo viridans 2. El Streptoccocus beta hemoltico es causante de que tipo de infecciones. 3. Cual es la importancia de la cpsula polisacrida que presenta el Pneumococo
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PRACTICA N 15
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE COCOS GRAM NEGATIVOS: GENERO NEISSERIA
INTRODUCCION
Las Neisserias son cocos Gram negativos, que se presentan caractersticamente en pares, con los lados adyacentes
aplanados, simulando granos de caf. Comprende varias especies, entre stas N. Gonorrhoeae, y N. Meningitidis, causan frecuentemente enfermedad significativa en el hombre. En muestras clnicas del tracto urogenital u otras, se tien
adicionalmente con el colorante azul de metileno, observndose las Neisseria intra y extracelularmente.
Estos microorganismos son exigentes y requieren medios enriquecidos como el Agar chocolate, que le proporciona una
rica fuente de hierro y el Agar Thayer Martin.
La mayora de las especies requieren para el crecimiento una humedad relativamente alta y una tensin de CO2 entre 5 a
10%. Desarrollan a temperaturas exactas entre 35 a 37C y un pH de 7.2 a 7.6.
Todas las especies producen catalasa y Citocromo- oxidasa, que permiten diferenciarlos de otros microorganismos
morfolgicamente similares.
La diferenciacin bioqumica se realiza por pruebas de utilizacin de hidratos de carbono: Glucosa, maltosa, sacarosa y
lactosa.
El diagnstico de gonorrea requiere una estrecha cooperacin entre el mdico y el laboratorio.
Se debe considerar los siguientes aspectos:
a) Recoleccin correcta de la muestra. b) Seleccin del recipiente apropiado para el transporte y rpido envo al laboratorio. c) Seleccin del medio de cultivo apropiado d) Aislamiento e identificacin de la bacteria en el laboratorio.
MATERIALES
Placa con Agar Thayer Martin sembrada con Neisseria Placa con Agar chocolate sembrada con Neisseria Muestra clnica de secrecin endocervical. Lmina control con frotis de Neisseria coloreada con Gram Reactivo de Citocromo- oxidasa Reactivo de catalasa Solucin fisiolgica al 0.85% Lminas portaobjetos Set de coloracin de Gram Colorante de Azul de metileno Microscopio Asas de siembra en aro y punta Solucin de alcohol yodado Algodn y Xilol.
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METODOLOGIA
1. Observar en el medio de Thayer Martin y Agar chocolate, las colonias pequeas, circulares de bordes continuos, blanco- grisaceos, convexas, brillantes o ligeramente opacas si corresponden a N. Gonorrhoeae y si es N.
Meningitidis colonias pequeas de borde entero, circulares, translcidas o ligeramente opacas.
2. Dejar caer una gota del reactivo de oxidasa sobre una colonia y observar entre los 2- 3 minutos el cambio de color del rosado al marrn o negro, que corresponde a una prueba de oxidasa positiva.
3. Realizar un frotis de la colonia oxidasa positiva y colorearla por el Gram. Comparar con la lmina control. 4. Realizar un frotis de la muestra clnica de secrecin endocervical y colorearla con el azul de metileno.
PROTOCOLO
MEDIO DE CULTIVO
MUESTRA
COLONIAS
TAMAO
GRAM
AZUL DE
METILENO
AGAR THAYER MARTIN
AGAR CHOCOLATE
SECRECION
ENDOCERVICAL
PRUEBAS BIOQUIMICAS
OXIDASA
CATALASA
Cuestionario:
1. Como diferenciara bioqumicamente Neisseria gonorrhoeae de N. meningitidis 2. Porque necesitan de un medio enriquecido como el Agar chocolate para su desarrollo 3. Que otras Neisserias conoce y cual es su habitat.
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PRACTICA N 16
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE BACILOS GRAM POSITIVOS:
GENERO BACILLUS
INTRODUCCION
El gnero Bacillus agrupa microorganismos aerobios Grampositivos, formadores de esporas y que pueden sobrevivir en
el ambiente por muchos aos. Algunas especies causan enfermedades en el hombre y los animales como el B. anthracis
causante de la enfermedad conocida como "carbunco", otros como el B. cereus, B. subtilis, B. megaterium y B.
mycoides son saprofitas y se encuentran en el suelo, agua y aire.
La especie patgena B. anthracis, causante del carbunco en los procesos patolgicos se presenta como un bacilo
rectilneo, Gram positivo, grueso, inmvil y capsulado. En los cultivos, las colonias son grandes, mates, rugosas con
bordes festoneados (aspecto de cabeza de medusa), se agrupan en largas cadenas, sin cpsula y conforme el cultivo
envejece forman esporas.
MATERIALES
Muestra bacteriana Placas Petri con Agar nutritivo Placas Petri con Agar sangre Tubos con Caldo nutritivo Tubos con Agar semi-slido Tubos con gelatina Lminas para frotices Set de coloracin de Gram Set de coloracin de Hiss para cpsula Set de coloracin de Wirtz Conklin para esporas Asa de Kolle
PROCEDIMIENTO
1. Sembrar la muestra en placas de Agar sangre, Agar nutritivo, caldo nutritivo y gelatina. 2. Preparar frotices para colorear con Gram, Hiss, y Wirtz Conklin.
COLORACION HISS (PARA CAPSULA)
1) Preparar un frotis 2) Cubrir con Fucsina bsica y calentar hasta el desprendimiento de
De vapores por 30 segundos
3) Lavar con solucin acuosa de Sulfato de cobre al 20%. 4) Lavar con agua corriente y secar 5) Observar al microscopio con lente de inmersin
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COLORACION DE WIRTZ CONKLIN ( PARA ESPORAS)
1) Preparar un frotis 2) Cubrir con verde de malaquita y calentar hasta el desprendimiento de
vapores por 5 minutos (adicionar colorante cada vez que falte)
3) Lavar con agua corriente 4) Colorear con safranina al 0.5% por 1 minuto 5) Lavar y secar 6) Observar al microscopio con lente de inmersin
LECTURA:
EN LOS CULTIVOS
En Agar sangre: Las colonias se observan blanco grisceo, no hemoflica en las especies patgenas y - hemolticas en
las especies saprofitas.
En Agar nutritivo: Se observan bacilos endoesporulados
En caldo nutritivo: Se observa un sedimento en el fondo del tubo.
En Agar semi-slido: Se observa un crecimiento en forma de pino invertido
En Gelatina: slo las especies saprofitas producen hidrlisis.
EN LAS LAMINAS COLOREADAS
Gram : Bacilos Grampositivos dispuestos en cadenas, las esporas generalmente se ubican en el centro de
bacilo.
Hiss : El cuerpo bacteriano se observa de color prpura y la cpsula de color claro o incolora.
Wirtz Conklin : El cuerpo bacteriano se observa de color rosado y la espora de color verde.
RESULTADOS
A) DE LOS MEDIOS DE CULTIVO:
GENERO BACILLUS
ESPECIE PATGENA
ESPECIE SAPROFITA
Caldo nutritivo
Agar nutritivo
Agar sangre
Agar semi-slido
Hemolisis
Hidrlisis de la gelatina
Prueba de la Catalasa
Fermentacin salicina
Movilidad
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PRACTICA N 16 - A
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE BACILOS GRAM POSITIVOS: GENERO LISTERIA
INTRODUCCION
El gnero Listeria comprende bacilos Grampositivos, microaerfilos, no esporulados, mviles y presentan flagelos
peritricos. Se presentan aislados o en grupos de dos en cadena o en forma de V de Y. Esta ampliamente distribuido en
la naturaleza, en los vegetales en descomposicin, en el suelo, en las heces de los portadores sanos animales y hombres.
La especie patgena es Listeria monocytogenes y la enfermedad que causa se le conoce como Listeriosis, la cual
compromete los ganglios linfticos, produce sntomas neurolgicos, encefalitis aguda y monocitosis en sangre.
El microorganismo se puede aislar de la sangre, lquido cefalorraqudeo y de las heces, desarrolla bien en medios de
cultivo comunes.
MATERIAL
Tubos con Caldo nutritivo Tubos con medios semislidos (Motilidad) Placas Petri con Agar sangre Placas Petri con Agar nutritivo Tubos de 13x100 con:
Agar urea de Christensen Citrato de Simmons Caldo rojo de fenol con glucosa Caldo rojo de fenol con sacarosa Caldo rojo de fenol con lactosa Caldo rojo de fenol con manita Caldo rojo de fenol con salicina Caldo esculina Caldo MR-VP
PROCEDIMIENTO
1. Hacer frotices a partir de una colonia en Agar y colorearla con Gram. 2. Preparar una lmina en fresco a partir de una suspencin bacteriana en caldo nutritivo, entre lmina y laminilla. 3. Sembrar la muestra en el medio semi-slido, placas de Agar sangre, Agar nutritivo, y en los diferentes medios
diferenciales
4. Dejar en incubacin por 24 a 48 horas a 37C.
LECTURA
FROTICES CON GRAM : Se observaran como bacilos Grampositivos. LAMINAS EN FRESCO : Se observar la movilidad peritrica, utilizando los objetivos de 40 aumentos. EN CALDO NUTRITIVO : Se observar una turbidez tenue y homognea. EN AGAR SANGRE : Se observar colonias pequeas con hemolisis tipo Beta. EN MEDIOS DIFERENCIALES : Observar
MOVILIDAD + GLUCOSA + MR +
HEMOLISINA + SACAROSA - VP +
CATALASA + LACTOSA -
OXIDASA - MANITA -
UREA - SALICINA +
CITRATO - ESCULINA +
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PRACTICA N 17 - 18
"ESTUDIO MICROBIOLOGICO DE LA FLORA NORMAL DE LA SECRECION BUCOFARINGEA
INTRODUCCION
La flora normal se adquiere con rapidez durante y poco despus del nacimiento, y cambia de forma continua a lo largo
de la vida. Los organsmos presentes en un determinado momento dependen de la edad, nutricin y medio ambiente del
individuo, por lo que es difcil determinar la flora normal de cada individuo ya que depende en gran parte de los factores
antes enunciados; ejemplo, los lactantes alimentados con leche materna tienen Estreptococos y Lactobacilos en su tracto
gastrointestinal, en los pacientes que estn recibiendo grandes dosis de antibiticos presentan un gran desarrollo de
levaduras.
La nariz y la boca pueden ser intensamente colonizados por bacterias como Estreptococos, Estafilococos, difteroides, y
cocos gramnegativos.
La superficie de los dientes y los surcos gingivales contienen un gran nmero de bacterias anaerobias.
La rinofaringe esta habitada generalmente por estreptococos no hemolticos y diplococos gramnegativos, en ella puede
poblarse un gran numero de especies patgenas como Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, S.
pyogenes, Klebsiella pneumoniae y Haemophilus influenzae.
MATERIALES
Caldo nutritivo en tubos (13 x 100)
Agar nutritivo en placas
Agar sangre en placas
Agar chocolate en placas
Medio hipertnico de Chapman en placas
Agar Mac Conkey en placas
Agar Sabouraud en tubos
Torundas estriles (2 x tubo)
Baja lengua
Asa de Kolle en aro
Laminas portaobjetos
Set de colorante Gram
Varillas para coloracin
PROCEDIMIENTO
A. PRIMER DIA
1. Con ayuda de torundas estriles y el baja lengua, tomar una muestra de la orofaringe. 2. Sembrar las muestras, en los diferentes medios de cultivo. 3. Incubar las placas y tubos sembrados por 24 a 48 horas a 37C
B. SEGUNDO DIA
LECTURA
Con la ayuda del Profesor, el alumno proceder a hacer el estudio de lo que ha desarrollado en los medios de cultivos.
IDENTIFICACION
Sembrar en los diferentes medios de cultivo para el estudio bioqumico correspondiente y pruebas de patogenicidad si se
requiere.
- Caldo plasma en tubo
- Disco de Bacitracina
- Disco de Optochin
- Reactivo de Citocromo- oxidasa
- Reactivo de catalasa
PROTOCOLO
El alumno realizar un cuadro estadstico con los resultados obtenidos.
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PRACTICA N 19 - 20
AISLAMIENTO E IDENTIFICACCION DE BACILOS ACIDO- ALCOHOL- RESISTENTES
GENERO MYCOBACTERIUM.
INTRODUCCION
Este gnero esta conformado por microorganismos que se caracterizan por tener morfologa bacilar, poseen un alto
contenido de lpidos complejos en su estructura qumica y se desarrollan lentamente en los medios de cultivo frente a los
cuales son exigentes con los componentes nutritivos.
Existen especies patgenas para el hombre y los animales, as como especies saprofitas en el aire, en el agua y en la
tierra.
Las especies patgenas para el ser humano son: Mycobacterium tuberculosis variedad Hominis, que puede infectar
cualquier lugar del organismo, siendo la localizacin pulmonar, renal y digestiva los mas frecuentes y el esputo es el
espcimen clnico ms comn para establecer el diagnstico especfico a travs de la baciloscopia.
Mycobacterium leprae produce la lepra enfermedad de Hansen; Mycobacterium bovis, Mycobacterium avium,
Mycobacterium kansasi y Mycobacterium simiae, con menor frecuencia, tambin, son patgenos.
MATERIALES
Un frasco de boca ancha con muestra de esputo positivo Lminas portaobjetos nuevas y desengrasadas Lminas con extensiones de M. Tuberculosis var. Hominis Lminas con extensin de otros tipos de Mycobacterias Set de colorante de Gram Set de colorante de Ziehl- Neelsen (col. A. A. R.) Cepas patrones sembradas en medio Lownstein jensen + verde de malaquita
PROCEDIMIENTO
1. Observar los caracteres macroscpicos del esputo: sangre, mucoide, mucopurulento. 2. Tomar una partcula mucopurulenta del esputo y hacer una extensin homognea sobre la lmina portaobjetos
nueva.
3. Fijar la preparacin. 4. Realizar una coloracin con Gram y otra con Ziehl- Neelsen
El mismo procedimiento se sigue con muestras de orina, heces, lquido cefalorraqudeo, lquido pleural, etc.
LECTURA
Observar como los grmenes visibles por el Gram, no aparecen en la coloracin de Ziehl- Neelsen porque no son cidos
alcoholes resistentes.
El bacilo de Koch y los otros Mycobacterium en cambio aparecen como elementos bacilares rojos en un fondo azul.
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EXAMEN MICROSCOPICO CUANTITATIVO
Enfocar con el objetivo de 100x la lmina referencial, cuantificar la cantidad de bacilos en toda la longitud de los 2/3 del
extendido que corresponde aproximadamente a 100 campos y anotar los resultados, segn el siguiente cuadro:
Negativo : No se observan bacilos en 100 campos.
Positivo (+) : Menor de 1 bacilo por campo, en 100 campos.
Positivo (++) : De 1 a 10 bacilos por campo, en 50 campos.
Positivo (+++) : Ms de 10 bacilos por campo, en 25 campos.
La lectura cuantitativa permite controlar la evolucin del paciente que esta en tratamiento y permite detectar aquellos que
sean resistentes al tratamiento.
TIPIFICACIN DE MICOBACTERIAS
Se investiga la velocidad de desarrollo y la produccin de pigmento, permitiendo clasificarlos en grupos.
I. Cepas que desarrollan en 8 ms das. Llamadas de desarrollo lento.
GRUPO I: Pigmentan por estmulo de la luz. Son fotocromgenas.
Ejemplo: M. kansasi , M. simiae
GRUPO II: Pigmentan sin necesidad de estmulo luminoso. Son escotocromgenas. Ejemplo: M. scrofulaceum
GRUPO III: No pigmentan espontneamente, ni por estmulo luminoso.
Son no cromgenas. Ejemplo: M. tuberculosis var. Humano
y M. tuberculosis var. Bovina
II. Cepas que desarrollan en 7 das o menos.
GRUPO IV: Pueden pigmentar o no pigmentar. Ejemplo: M. fortuita
PROTOCOLO DE TRABAJO:
Realizar esquemas de lo realizado y observado en la prctica correspondiente.
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PRACTICA N 21 - 22
SEMINARIO II: ANTIBITICOS Y QUIMIOTERPICOS
1. Clases de agentes antibacterianos 1.1: Inhibidores de la sntesis de la pared celular
1.2: Inhibidores de la sntesis de protenas
2. Clases de agentes antibacterianos y antituberculostticos 2.1: Inhibidores de la sntesis de cidos nucleicos
2.2: Inhibidores de la funcin de la membrana citoplasmtica
3. Resistencia a los agentes antibacterianos 1. : Gentica de la resistencia 2. : Mecanismos de resistencia
4. Clases de agentes antivirales 4.1: Gentica de la resistencia
4.2: Mecanismos de resistencia
5. Clases de agentes antimicticos 5.1: Gentica de la resistencia
5.2: Mecanismos de resistencia
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ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA MDICA
PRACTICA N 23
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE BACILOS GRAM NEGATIVOS: GENERO PSEUDOMONA
INTRODUCCION
La especie Pseudomona aeruginosa es un bacilo Gram negativo, casi todas son mviles con flagelos polares
monotricos y multitricos, no poseen cpsula, no forman esporas, no son exigentes para su desarrollo In Vitro.
Pseudomona aeruginosa es la especie ms frecuentemente asociada con enfermedad humana, principalmente
quemaduras severas, pero tambin se aslan de orina, sangre, lavados bronquiales, esputo y tracto genital femenino.
En pacientes comprometidos pueden causar infecciones con riesgo de vida fatales.
La deteccin del pigmento piocianina en el medio de cultivo es virtualmente diagnstica de P. aeruginosa, la
mayora de los aislamientos producen tambin el pigmento fluoresceina y desarrollan bien a 42C.
MATERIAL
Cepa de Pseudomona aeruginosa en caldo nutritivo. Caldo Tripticase en tubo de 16 x 150 Agar nutritivo en Placa Petri Agar Mac Conkey en tubo 16 x 150 Agar semi-slido en tubo de 13 x 100 Medio TSI Reactivo de Oxidasa Frasco con cloroformo Set de colorantes Gram Lminas portaobjetos
PROCEDIMIENTO
1. Hacer un frotis a partir de la cepa Pseudomona aeruginosa y colorear por el mtodo de Gram. 2. Sembrar la cepa de P. aeruginosa en los diferentes medios de cultivo, por las tcnicas conocidas. 3. Incubar a 37C por 24- 48 horas.
RESULTADOS
COLORACION DE GRAM : Bacilos pequeos, Gram negativos.
CALDO NUTRITIVO : Observar el crecimiento abundante en el medio, el pigmento de color verdoso
y un olor caracterstico.
AGAR MAC CONKEY : Observar colonias grises claro, no fermentadoras de lactosa.
MEDIO TSI : No hay cambios, ya que P. aeruginosa y otras especies de este gnero no
fermentan los carbohidratos [utilizan los carbohidratos slo por va oxidativa
en el medio de oxidacin- fermentacin (OF)].
AGAR NUTRITIVO : Describir la colonia, observar la difusin del pigmento en el agar, y realizar la
prueba de la oxidasa, que es positiva para P. aeruginosa.
CALDO TRIPTICASE : Agregar 1 ml de cloroformo p