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Graziele Fonseca de Sousa
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Gene ERBB25
Codifica o receptor tipo 2 do fator de
crescimento epidérmico
humano(HER2)
Cerca 20% -30% das mulheres com câncer de mama
apresentam amplificação de
ERBB2
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HER2 biomarcador para o câncer de mama
A tirosina quinase desempenha um papel fundamental na regulação dos processos como o crescimento celular, sobrevivência e diferenciação.
http://www.roche.pt/sites-tematicos/her2/index.cfm/her2_e_o_cancro/o-que-e-o-her2/
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TrastuzumabA Trastuzumab é potencialmente nocivo para os pacientes sem a produção de HER2, porque ele utiliza o mesmo receptor encontrado em tecido cardíaco não patológico, podendo causar cardiotoxicidade e em alguns casos, morte.
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Porque utilizar os ensaios de FISH e IHQ?
• São métodos comumente utilizados para a avaliação de superprodução da proteína ou amplificação do gene em relação as características morfológicas tumorais;
• Ao contrário das técnicas moleculares, não requer homogeneização do tumor;
No entanto os resultados de aproximadamente 20% dos testes de HER2 realizados no departamentos de patologia nos locais de tratamento primário mostraram-se incorretos quando as amostras eram reavaliadas em um alto volume no laboratório central.
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ObjetivosGerar a produção de materiais de
referência para estudar a utilização do IHQ e FISH para quantificação e caracterização das linhas celulares SKBR-3 e MCF-7 de carcinoma de mama HER2 em termos de produção e amplificação de ERBB2, respectivamente, e para examinar a adequação destas linhas celulares como controles para os teste de HER2.
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Materiais e Métodos Linhas celulares de carcinoma de mama SK-BR-3 e MCF-
7;
Anticorpo anti-HER2 IgY de frango;
Anticorpo monoclonal anti-HER2 IgG de camundongo;
Anticorpos secundários, anti-IgY biotinilada (Genway Biotech) e anticorpo anti-IgG biotinilada (Ventana);
Sonda de DNA para o gene ERBB2 foi a BAC;
Os anticorpos e a sonda foram detectados por microscopia de fluorescência com estreptavidina-Qdot 655 (Invitrogen) como o reagente de detecção final de afinidade.
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Imunohistoquímica ( IHQ)
O anticorpo conjugado a uma enzima, pode catalisar uma reação que produzirá
coloração.
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Hibridização Fluorescente In Situ (FISH)
http://www.biomedicinapadrao.com/2012/03/hibridizacao-fluorescente-in-situ-fish.html
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Resultados
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Para os experimentos FISH em células FFPE, foi utilizado o sonda da HER2 Ventana em vez do sonda BAC CTD-2019C10 usado para células cultivadas fixas e foi utilizado o corante orgânico fluoresceína isotiocianato como o rótulo em vez de Qdot 655.
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Discussão
Teste deHER2
Trastuzumab
Tratamento adequadoNegativo
Positivo
Seleção de pacientes para terapia:
Imprecisão observada na prática clínica e em ensaios clínicos:
• Falta de padrões de referência;
• Falta do uso de calibradores do ensaio.
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Acreditasse que os materiais de referência ideais para padrões e calibradores em testes de HER2 (bem como outros biomarcadores) possam ser as linhas celulares.
• As linhas de células podem ser cultivadas em vitro;
• Podem ser fixadas e processadas de maneira semelhantes aos das amostras histopatológicas;
• Obtenção de um duradouro banco de material de controle, fornecendo assim a reprodutibilidade e coerência entre os diferentes ensaios.
• A utilização de materiais com base em células de referência será útil para ambos os teste IHQ e FISH.
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Sistema de utilização de 2
linhas de células
SK-BR-3
MCF-7
Caracterização da produção da
proteína HER2 e a amplificação do
geneERBB2
contêm aproximadamente
10x mais cópias do gene ERBB2 e cerca
de 15x mais quantidade da proteína HER2
FISH E IHQ
Utilizado como controle devido ao pequeno número
de cópias de ErbB2 em nestas
células.
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Conclusões Demonstraram que SK-BR-3 e MCF-7
são candidatos adequados como materiais de referência para o teste HER2. Acoplado com as plataformas de ensaio associados, eles fornecem valiosos controles quantitativos para a medição de amplificação de HER2 no câncer de mama e de produção nas amostras, independentemente do anticorpo/ sonda ou detector usado.