Ultracentrifuge를 사용하여 여러 가지 DNA또는 RNA 분자들을 분리,

분석하는 실험은 gel electrophoresis와 함께 빈번히 수행되는 실험이다.

그러나 대부분 기존의 실험 순서대로 실험하고 그 결과를 얻어내고 있을

뿐, 그 원리 원칙에 대한 이해가 부족한 경우가 많다. Centrifueg,

s a m p l e의 양 , 시약의 종류 , 기구등 실험실 여건이 다를

때에는 각자 실험실 사정에 맞는 modify된 procedure를 작성해야

하는데 그러기 위해서는 여러 가지 type의 gradient에 대한 완벽한

이해가 있어야 한다.

본 장 에 서 는 g r a d i e n t c e n t r i f u g a t i o n 에 대 한

원리와 여섯 종류의 gradient에 대하여 그예를 들어 설명하고자 한다.

1. Types of Gradient

1) Velocity Type 2) Equilibrium Type

2. 여섯 종류의 Gradient

1) High Salt Neutral Sucrose Velocity Gradient 2) Low Salt Neutral Sucrose Velocity Gradient 3) Alkaline Sucrose Velocity Gradient 4) Neutral CsCl Equilibrium Density Gradient 5) Alkaline CsCl Equilibrium Density Gradient 6) Neutral CsCl-EtBr Equilibrium Density Gradient

sample의 침강속도 차이를 이용한다.

sample을 sucrose gradient의 상층에 조심스럽게 올려놓은 다음

centrifugation으로 원심력을 증가시켜주면 sucrose 용액보다

비중이 큰 sample은 침강하게 된다. Sample의 종류에 따라 그

침강 속도가 다르므로 일정시간 후 원하는 sample이 gradient의

중간쯤에 다다랐을 때 sample을 취한다.

*30% sucrose라 하더라도 그 비중은 1.13 정도밖에 되지 않으므로 비중이 1.25 정도인 단백질이나 1.7인 DNA helix는 침강하는데 문제가 없다.

s value

-침강 속도는 s 값으로 나타낸다. 이는 스웨덴의 Svedberg 가 ultracentrifuge

를 발명했고 이 실험을 제일 먼저 수행했으므로 s 값으로 표시하게 되었다.

-S 값이 클수록 침강속도가 빠른 것이다.

Nobel Prize for Chemistry(1926)

Thodor Svedbreg

Gradient 만들기

Gradient former는 여러 가지가 있지만 대체로 아래 그림과 같이 만든다.

Tube의 size와 volume에 관계 없이 한 개의 gradient를 30분이상 걸리도록

천천히 만들어야 양질의 gradient 가 형성된다. 보통 5~10% 에서 시작해서

20~30%로 끝나는 gradient를 사용한다.

Velocity type에 쓰이는 gradient에 주로 sucrose를 사용하는 이유

- sucrose는 이당류 중에서도

head-to-head 결합을

하고 있어서 다른 물질과

화학 반응을 하지 않는다.

- 수소결합이 가능한 OH group이 10개이상 있어서 상당히 viscous하여

diffusion되기 전에 우리가 필요한 모든 실험을 할 수 있다.

-단당류는 어느 정도 diffusion이 될 수 있을 뿐만

아니라 다른 sample과 반응할 경우도 있기 때문에

사용하기 어렵고, 더 큰 탄수화물은 대단히 viscous

하여 실험에 사용할 수 없다.

* Sucrose gradient는 상온에서 도 24 시간 이상, 냉장고에 두면 20일 이상 두었다가 쓸 수 도있다.

Equilibrium type 의 gradient는 sample을 buoyant density (ρ)에 따라 분리 해준다.

핵산을 sample로 할 때는 대부분 5.7 M CsCl 용액을 사용한다.

Sucrose를 사용할 때와는 달리 equilibrium type에서는 gradient를 centrifuge tube에

미리 만들어 놓지 않고 sample과 CsCl 용액을 잘 섞은 후 35,000~45,000 rpm 정도

의 높은 속도로 장시간 (30~50 시간) centrifugation 하여 gradient를 형성시킨다.

같은 길이의 double-stranded(ds) liner DNA ,

ds nicked DNA, ds circular supertwisted DNA, single-starnded(ss)

DNA를 sample로 하여 여섯 종류의 centrifugation gradient 실험을 수

행했을 때의 결과를 도시하고 그 내용을 설명한다.

Agarose gel electrophoresis에서는 반대로 ds liner DNA가 nicked DNA

보다 빠르게 이동하는 경우가 보통이다.

Sucrose gradient와 달리 agarose gel 에서는 DNA가 agarose 그물 사이

를 통과해야 한다.

Liner DNA 가 snaking 에 더 유리하기 때문에 network 을 먼저 빠져 나

간다. DNA가 network을 한 줄로 빠져나가는 것을 snaking 이라고 한다.

High Salt Neutral Sucrose Velocity Gradient

Low Salt Neutral Sucrose Velocity Gradient

High salt 조건에서는 intrastrand charge repulsion 을 최소화 할 수 있기

때문에 마찰을 줄일 수 있는 compact form을 이루게 된다.

따라서 ssDNA 가 dsDNA 보다 빠르게 침강한다.

Alkaline Sucroes Velocity Gradient

Alkaline CsCl Equilibrium Density Gradient

Neutral CsCl Equilibrium Density Gradient

Neutral CsCl-EtBr Equilibrium Density Gradient

EtBr과 함께 density gradient centrifugation

이 되면 non-supercoiled DNA와 supercoiled

DNA를 분리시킬 수 있다