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Methyl Primer Express® ソフトウェアバージョン 1.0

Getting Started Guide

1

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3

Getting Started Guide

Methyl Primer Express® ソフトウェア

はじめに

gDNA シーケンスの解析

プライマーの設計

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For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.

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JP75203/2007

目　次

Methyl Primer Express® ソフトウェア v1.0 Getting Started Guide i

まえがき iiiこのガイドの使い方 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . iii

詳細情報の入手方法 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . iv

サポート情報 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . iv

安全に関する情報 v安全に関する表記法 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . vi

第 1章はじめに 1Methyl Primer Express® ソフトウェアについて . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2

DNA メチル化について . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2

ワークフローについて . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

ユーザーのシーケンスファイルを用いた応用 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

第 2章 gDNA シーケンスの解析 5ワークフローの概要 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

章の構成 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

Methyl Primer Express® ソフトウェアの起動 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

サンプルデータを用いたワークフロー . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

シーケンスのインポート . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

シーケンスに遺伝子情報を付加 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

CpG アイランドの検索 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

CpG レポートの確認 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

ターゲットシーケンスの選択 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

DNA シーケンスレポートの確認 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

プライマーの設計 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

シーケンスに遺伝子情報を付加するその他の方法 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

シーケンスに名前を付ける . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

シーケンスに転写開始点情報を付加する . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

シーケンスに翻訳開始コドンの情報を付加する . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

ii Methyl Primer Express® ソフトウェア v1.0 Getting Started Guide

第 3章プライマーの設計 19プライマーの設計 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

章の構成 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

プライマーペアの選択に関するガイドライン . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

サンプルデータを用いたワークフロー（続き） . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

プライマーの種類の選択 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

BSP 用プライマーの設計 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

プライマーペアの選択 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

BSP プライマーレポートの作成 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24

プライマーの設計に関する留意事項 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

バイサルファイトシーケンシング（BSP）に関する留意事項 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

メチル化特異的 PCR（MSP）に関する留意事項 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

Methyl Primer Express® ソフトウェア v1.0 Getting Started Guide iii

まえがき

このガイドの使い方

このマニュアルの目的

『Methyl Primer Express® ソフトウェア v1.0 Getting Started Guide』では、Methyl Primer Express ソフトウェアを使用して CpGアイランドを検索し、メチル化実験用プライマーの設計手順を説明します。

準備このマニュアルを読み進める前に以下の準備をお願いします。

• Methyl Primer Express® ソフトウェア v1.0 をコンピュータにインストールしてください

• Microsoft® Windows XP または Windows 2000 オペレーティングシステムの基本的操作の説明は簡略化しております

• GenBank などの遺伝子シーケンスデータベースを利用したことがあることが望ましいです

表記法このマニュアルでは、次の表記法を使用しています。

• 太字は、ユーザの行う操作を示します。たとえば、次のとおりです。残りの各フィールドについて、0 を入力し、[Enter] キーを押します。

• ゴシック体は、初めての記述または重要な語を示し、強調しています。たとえば、次のとおりです。

解析の前に、必ず新しいマトリックスを調製してください。• 右三角記号（）は、ドロップダウンメニューまたはショートカットメニューで連続して選択するコマンドの区切りを示します。たとえば、次のとおりです。

「File」「Open」「Spot Set」を選択します。

サンプル列を右クリックし、「View Filter」「View All Runs」を選択します。

ユーザへの注意事項 Applied Biosystems のユーザマニュアルには、2 種類の注意事項が記載されています。各注意事項は、次のような特定のレベルの注意と対応が必要なことを示しています。

注：製品を使用する上で役に立ちますが、必須ではない情報を記述しています。

重要！装置の適切な操作、ケミストリキットの正しい使用法、化学物質の安全な使用法に関する必要な情報を記述しています。

まえがき詳細情報の入手方法

iv Methyl Primer Express® ソフトウェア v1.0 Getting Started Guide

詳細情報の入手方法

関連資料このソフトウェアには、次の関連資料があります。

『Methyl Primer Express® ソフトウェア v1.0 クイックリファレンスカード』（JP751） - Methyl Primer Express® ソフトウェアを使用した一般的なワークフローの段階的な実行手順が簡潔に記載されています。

注：ソフトウェアのインストール CD に収録されているユーザマニュアルを開くには、Adobe® Acrobat® Reader® ソフトウェアを使用します。このソフトウェアは、 www.adobe.com/jp から入手できます。

注：詳細については、ivページの「サポート情報」を参照してください。

連絡先 Applied Biosystems では、弊社のユーザマニュアルをより使いやすいものにするため、お客様からのご意見、ご要望をお待ちしております。次の電子メールアドレス宛にお送りください。

[email protected]

重要！前述の電子メールアドレスでは、マニュアルに関するご意見、ご要望のみを受け付けています。マニュアルのご注文、PDF ファイルのダウンロード、またはテクニカルサポートをご希望の場合は、http://www.appliedbiosystems.co.jp にアクセスし、「Support」のリンクをクリックしてください（次の「サポート情報」を参照してください）。

サポート情報最新サービスおよびサポート情報を入手するには、http://www.appliedbiosystems.co.jp にアクセスし、「Support」のリンクをクリックしてください。

「Support」ページでは、次のことが可能です。

• よくある質問（FAQ）を検索する

• Applied Biosystems ユーザマニュアル、MSDS、およびその他の関連資料をダウンロードする

• カスタマートレーニングに関する情報を入手する

• ソフトウェアアップデートパッチ等をダウンロードする

http://www.adobe.com/jp

mailto:[email protected]

http://www.appliedbiosystems.com

http://www.appliedbiosystems.co.jp

Methyl Primer Express® ソフトウェア v1.0 Getting Started Guide v

安全に関する情報

この節では、次の項目について説明します。

■ 安全に関する表記法. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . vi

安全に関する情報安全に関する表記法

vi Methyl Primer Express® ソフトウェア v1.0 Getting Started Guide

安全に関する表記法

注意を促す語句 Applied Biosystems ユーザマニュアルでは、関連する危険に対して注意が必要な箇所に、4種類の注意を促す語句を表示しています。それぞれの語句 - 重要、注意、警告、危険 - は、警告の程度を表します。

注意を促す語句の定義

重要！装置の適切な操作、ケミストリキットの正しい使用、化学物質の安全な使用に必要な情報を示します。

回避しないと、軽傷または中程度の障害を招くことがある潜在的に危険な状況を示します。危険な行為に対して警告するときにも使用されます。

回避しないと、死亡または重傷を招く可能性がある潜在的に危険な状況を示します。

回避しないと、死亡または重傷を招く切迫した危険な状況を示します。この語句が使用されるのは、極度に危険な状況に限られます。

例

注意を促す語句の使用例を次に示します。

重要！サンプル名、ランフォルダ名、パス名に使用できる文字数は、合計で 250 文字未満です。

筋骨格系および反復動作による障害の危険　これらの危険は、反復動作、不自然な姿勢、激しい労作、不健康な位置での静止状態、接触圧力などの職場環境要素を含みますが、これらに限定されない潜在的な危険要素によっても引き起こされるものです。

補助人員なしに、コンピュータやモニタの移動や持上げ作業を行わないでください。コンピュータやモニタの重量によっては、移動や持上げに 2 名またはそれ以上の人員を要します。

第 1章

第 1 章

はじめに

第 2 章


第 3 章


Methyl Primer Express® ソフトウェア v1.0 Getting Started Guide 1

メモ

1

はじめに

この章では、次の項目について説明します。

■ Methyl Primer Express® ソフトウェアについて. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2

■ DNA メチル化について. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2

■ ワークフローについて . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .3

■ ユーザーのシーケンスファイルを用いた応用 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .3

第 1章　はじめにMethyl Primer Express® ソフトウェアについて

2 Methyl Primer Express® ソフトウェア v1.0 Getting Started Guide

メモ

Methyl Primer Express® ソフトウェアについてMethyl Primer Express® ソフトウェアでは、メチル化マッピング技術として一般に使用されている 2 種類のプライマー（バイサルファイトシーケンシング（BSP）用およびメチル化特異的 PCR（MSP）用）を設計することができます。このソフトウェアでは、DNA シーケンス内で CpG アイランドが検索でき、CpG を含むシーケンスに対してバイサルファイト処理後の結果がシミュレーションされます。また、その結果に対して MSP または BSP 解析用の推奨プライマーペアの候補が示されます。どちらのプライマー設計プログラムにおいても、多様な実験条件に対応させることができます。

Methyl Primer Express® では、MSP または BSP 解析用のプライマーをデザインをするための基本手順の多くを自動化できます。目的とする DNA シーケンスをソフトウェアにインポートすると、条件に一致する CpG アイランドがすべて検索され、ターゲットシーケンスに基づいてプライマー設計が実施されます。シーケンス内で見つかったすべての CpG アイランドや、ターゲットシーケンスに基づいてリストアップされたすべてのプライマーペアは、レポートとして確認できます。

DNA メチル化についてエピジェネティクスは、DNA シーケンスの変化を伴わずに後代に受け継がれる後天的な遺伝子発現パターンの違いを扱う研究分野で、DNA メチル化は、最も顕著なエピジェネティック修飾です。

DNA メチル化は、DNA が複製後にうける化学修飾の 1 つで、グアニンに隣接しているシトシン（CpG 部位）が、メチル化酵素によるメチル化の基質となります。DNA 複製時に、メチルトランスフェラーゼによってメチル化状態が維持される様に働きます。複製後、DNA 内のすべての CG 塩基対がメチル化されるわけではないため、メチルトランスフェラーゼは、ヘミメチル化状態を認識し、新たに合成された各 DNA の相補鎖が適切にメチル化されるように作用します。

メチル化には 2 つの機能があり、次のように作用します。

a. 外来の DNA を破壊するよう設計されたエンドヌクレアーゼからの保護

b. 遺伝子発現制御 - 発現のオン /オフを制御

ヒトゲノムにおいて CpG ジヌクレオチドに富んだ領域は、 CpG アイランドと呼ばれます。既知のヒトゲノムプロモータの半分以上は、このような非メチル化 CpG ジヌクレオチドの領域を有します。CpG 部位の過剰メチル化は、老化などの複雑な生物学的プロセスを担う遺伝子の発現を、結果的に抑制させる可能性があります。通常、CpG 部位以外のグローバルな低メチル化には遺伝子のプロモータ領域の過剰メチル化が伴い、これが様々な癌の発生において重大な役割を果たすことも、最近報告されました。

第 1章　はじめにワークフローについて


メモ

1

プロモータの CpG アイランドがメチル化されると、関連遺伝子が不活化し、この不活化が体細胞分裂によって遺伝することから、プロモータの CpG アイランドに大きな関心が寄せられています。CpG アイランドのメチル化は、遺伝するエピジェネティックな現象で、遺伝子発現の変化が細胞分裂によって遺伝し、関連 DNA シーケンスの変化は伴わないと考えられています。プロモータ領域の CpG アイランドのメチル化状態と対象遺伝子の発現量の間に相互関係が存在するかどうかを判断するための研究が、現在盛んに行われています。

メチル化パターン研究手法としてよく知られたものの 1 つに、gDNA のバイサルファイト処理によるメチル化シトシンと非メチル化シトシンの識別が挙げられます。バイサルファイト処理を行うと、非メチル化シトシンはウラシル（U）に変換されます。その結果、DNA シーケンスが変化し、非メチル化シトシンはチミン（T）として読み取られ、メチル化シトシンはそのままシトシンとして表示されます。

ワークフローについてこのマニュアルでは、遺伝子シーケンスの例として GenBank データベースの BRCA1 遺伝子シーケンス（ファイル番号 AC#: U37574）を使用してタスクを実行します。

ユーザーのシーケンスファイルを用いた応用このマニュアルを参照することで、遺伝子の例（BRCA1）に関連するプライマーを設計できるほか、任意の gDNA シーケンスに対してもここで示すワークフローが応用できます。

第 1章　はじめにユーザーのシーケンスファイルを用いた応用


メモ

第 2章

第 2 章


第 3 章


第 1 章

はじめに


メモ

2



■ ワークフローの概要. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .6

■ Methyl Primer Express® ソフトウェアの起動 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .7

■ サンプルデータを用いたワークフロー . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .7

■ シーケンスに遺伝子情報を付加するその他の方法 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .15

第 2章　gDNA シーケンスの解析ワークフローの概要


メモ

ワークフローの概要

章の構成この章では、次の操作方法について説明します。

• gDNA シーケンスのインポート

• シーケンスに遺伝子情報を付加

• CpG アイランドの検索

• 目的の CpG アイランドの選択

• ターゲットシーケンスの選択

次の図に、Methyl Primer Express® ソフトウェアを使用して、インポートしたシーケンスから CpG アイランドを検索し、最終的に PCR プライマーを設計するためのワークフローを示します。

第 2章　gDNA シーケンスの解析Methyl Primer Express® ソフトウェアの起動


メモ

2

Methyl Primer Express® ソフトウェアの起動Methyl Primer Express® ソフトウェア v1.0 を起動するには、デスクトップ上のをクリックします。

サンプルデータを用いたワークフローこのマニュアルでは、例としてヒト DNA シーケンス（BRCA1 遺伝子）を使用し、Methyl Primer Express ソフトウェアの使用方法を説明します。

シーケンスのインポート

Methyl Primer Express ソフトウェアにシーケンスを読み込ませるには

1. 予め GenBank データベースで BRCA1 遺伝子（AC#: U37574）のシーケンスをダウンロードし、テキストファイルとして保存します。

「File」「Import Sequence」を選択し、ダウンロードしたファイルを読み込みます。

または、

2. GenBank データベースを開き、BRCA1 遺伝子（AC#: U37574）を検索し、そのシーケンスをコピーします。

コピーしたシーケンスを「Insert Nucleotide Sequence」ボックスにペーストします。

重要！インポートしたシーケンスに N コールが 1 つでも含まれていると、エラーメッセージが表示され、次の手順に進めなくなります。変換が必要な N 塩基が gDNA シーケンスに含まれる可能性を最小限に抑えるために、最新の GenBank シーケンスを入手してください。

注：シーケンスの例では、N 塩基はあらかじめ変換されています。AC#: U37574 のシーケンスを用いる場合、各 N塩基は暫定的に以下のように変換してください。

• 8, 21, 108, 236, 254, 336 塩基目の Nは Cに変換します。

• 965, 3620 塩基目の Nは Aに変換します。

• 2027 塩基目の Nは削除してください。



メモ

シーケンスに遺伝子情報を付加

インポートしたシーケンスに、次のようないくつかの遺伝子情報を付加することができます。

• ユーザ指定のシーケンス名（15ページ）

• 遺伝子シーケンスの転写開始点（8ページ、15ページ）

• 遺伝子シーケンスの翻訳開始コドン（16ページ）

このワークフローでは、シーケンスに転写開始点の情報のみを付加します。

転写開始点は、インポートしたゲノムシーケンスの GenBank ファイルで mRNA の行を参照することにより特定できます。

転写開始点の注釈を付加するには

1. BRCA1 遺伝子の GenBank ファイル（AC#: U37574）の「Features」セクションで、mRNA 開始シーケンス番号を見つけます。

2. インポートしたゲノムシーケンスの任意の場所をポインタでクリックし、画面右下の「Base Position」フィールドでシーケンス番号の位置を確認します。

3.「Base Position」に表示される番号が GenBank ファイルの mRNA 開始番号（例では1581）に一致するまで、シーケンスをスクロールしながらポインタを移動します。



メモ

2

4. 開始点の塩基と、開始点から 12 個以上後ろにある塩基までを選択します。

5.「Sequence Features」「Set Transcription Bases」を選択します。転写開始点の塩基がハイライトされ、青の下線が付けられます。スクロールして、遺伝子情報を付加した塩基を確認します。

注：シーケンスに転写開始点の情報を付加するほか、オプションで 16ページの手順に従って翻訳開始コドンの情報を付加することもできます。

インポートしたシーケンスに遺伝子情報を付加後、ソフトウェアで CpG アイランドを検索できます。



メモ

CpG アイランドの検索

インポートしたシーケンスに遺伝子情報を付加すれば、より効果的なプライマー設計を行うことができます。

1.「Design Primers」「Find CpG Islands」を選択します。

「CpG Islands」ダイアログボックスに、現在設定されている CpG アイランドの検出条件を再検討するかどうかを尋ねるメッセージが表示されます。



メモ

2

2. 次のいずれかを選択します。

• 「No」 - CpG アイランドの検索にデフォルト設定が使用され、ステータスウィンドウに進行状況が表示されます。

• 「Yes」 - 表示される「Customize Settings」ダイアログボックスで、Methyl Primer Express Software によって設定されたパラメータ値を調整し、「OK」をクリックします。Frommer アルゴリズムによって CpG アイランドが予測されます。

重要！デフォルト設定はソフトウェアの実行に適したパラメータ値に設定されていますが、実験目的に応じて設定を修正することができます。

注：ソフトウェアをいったん終了して再度起動すると、デフォルトの設定に戻ります。

3. 検索が終了したら、次に説明する手順で CpG レポートを確認します。



メモ

CpG レポートの確認

CpG レポートには、CpG 部位がピンクの垂直バーで横軸上に示されます。また、転写開始点は青のバーで、翻訳開始コドンは赤のバーで示されます（このマニュアルでは、転写開始点のみ設定しました。翻訳開始コドンの設定手順については 16ページを参照して下さい）。CpGアイランドはピンクの実線で横軸の下に表示されます。

レポートをスクロールして、検索結果を確認して下さい。



メモ

2

ターゲットシーケンスの選択

シーケンス内で見つかった CpG アイランドの確認後、プライマー設計のターゲットシーケンスとして使用するシーケンス領域を選択します。

1. CpG レポートで、画面右下の「Select an island」ドロップダウンリストから目的のアイランドを選択し、「Next」をクリックします。

2. そのまま転写開始点前後のハイライト表示された領域を使用するか、または、選択したCpG アイランド内でプライマー設計領域を適宜選び直し、「Next」をクリックします。

注：転写開始塩基情報を付加した場合、転写開始点前後の 500 個の塩基がターゲットシーケンスとして自動的に選択されます。転写塩基情報を付加しなかった場合、選択した CpG アイランドが自動的にターゲットシーケンスとして設定されます。シーケンスの選択を変更するには、別のターゲットシーケンスを選択し、「Next」をクリックします。



メモ

DNA シーケンスレポートの確認

DNA シーケンスレポートで、推奨されるターゲットシーケンスを確認します。

DNA シーケンスレポートには、gDNA シーケンス、推奨ターゲットシーケンス、選択したターゲットシーケンス、メチル化ターゲットシーケンス、および非メチル化ターゲットシーケンスが表示されます。

プライマーの設計第3章「プライマーの設計」の手順に従って MSP 用または BSP 用のプライマーを設計します。



メモ

2

シーケンスに遺伝子情報を付加するその他の方法この節で説明する方法は、このマニュアルのワークフローでは使用されていませんが、実際のシーケンスでは、用途に応じてご活用ください。

シーケンスに名前を付ける

インポートした gDNA シーケンスに名前を付けるには

1.「Sequence Features」「Enter Sequence Name」を選択します。

2. シーケンスの名前を入力し、「OK」をクリックします。

シーケンスに転写開始点情報を付加する

シーケンスに転写開始点情報を付加する場合、8ページで説明した方法のほかに、次の方法を使用することもできます。

1.「Edit」「Find」を選択します。

2. 検索シーケンスを固有なものにするために、開始コドンと、10 個以上の塩基配列をペースト（または入力）します。

3.「Find」をクリックして検索を開始します。

遺伝子シーケンス内で転写開始文字列が検索され、ハイライトされます。

4.「Find」ダイアログボックスを閉じます。



メモ

5.「Sequence Features」「Set Transcription Bases」を選択し、シーケンスに転写開始点情報を付加します。

転写開始点がハイライトされ、青の下線が付けられます。

シーケンスに翻訳開始コドンの情報を付加する

シーケンスに翻訳開始コドンの情報を付加する方法は 2 通りあります。

方法 1

1. ダウンロードした GenBank ファイル（7ページ参照）から CDS 行を参照します。

2. インポートしたシーケンスの任意の場所をポインタでクリックし、そのシーケンス位置を画面右下の「Base Position」に表示します。



メモ

2

3. このフィールドに表示される位置が GenBank リファレンスファイルの CDS 番号（2877）に一致するまで、シーケンス内でポインタを移動します。

4. 一致した塩基位置と、その後ろの 2 個の塩基（ATG）を選択します。

5.「Sequence Features」「Set Translation Start Codon」を選択します。翻訳開始コドンが赤でハイライトされます。ウィンドウをスクロールしてコドンを確認します。



メモ

方法 2

1.「Find」ダイアログボックスで、「Edit」「Find」を選択します。

2. サンプルの CDS 領域の先頭から数個の塩基をペースト（または入力）します。

3.「Find」をクリックして検索を開始します。

翻訳開始コドンがハイライトされます。

4.「Find」ダイアログボックスを閉じます。

5. ハイライトされた塩基文字列の先頭位置をポインタでクリックし、最初の 3 個のヌクレオチド（ATG）のみを選択します。

6.「Sequence Features」「Set Translation Start Codon」を選択します。コドンが赤でハイライトされます。

第 3章

第 3 章


第 2 章


第 1 章

はじめに


メモ

3



■ プライマーの設計 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .20

■ サンプルデータを用いたワークフロー（続き）. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .21

■ プライマーの設計に関する留意事項 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .26

第 3章　プライマーの設計プライマーの設計


メモ


章の構成この章では、次の操作方法について説明します。

• BSP（または MSP）用プライマーの設計

• BSP（または MSP）用プライマーレポートの作成

シーケンス内の 2 本の DNA 鎖はバイサルファイト処理後に相補性が失われるため、PCR 増幅には DNA 鎖特異的プライマーが必要です。メチル化の研究には、どちらの DNA 鎖を選択しても構いません。一方のストランドで適切なプライマーが得られない場合は、もう一方のストランドで適したプライマーを設計できます。

すべての非メチル化 C が T（U）に変換されるため、バイサルファイト処理後の gDNA は、考えられる 4 種類の塩基のうち、ほとんどが（場合によっては完全に）3 種類の塩基のみで構成される、歪んだ塩基組成を持ちます。バイサルファイト変換後の DNA 鎖は T、G、A に富み、PCR によって作成される相補鎖は A、C、T に富むことになります。

バイサルファイト変換後の gDNA を増幅するために設計されたプライマーでは、二次アンプリコンにつながる複数のアニーリング部位が生じることがしばしばあり、また、性質上プライマーダイマーが形成されやすくなることもあります。

プライマーペアの選択に関するガイドライン

一般的に PCR プライマーを設計する上では、ダイマーを形成せず特異性の高いアンプリコンを増幅できるプライマーの設計が重要になります。

プライマーペアを選択する際は、次のことに注意してください。

• 複数の CpG アイランドが見つかった場合、予測された CpG アイランドのいずれかが増幅のターゲット領域になります。

• CpG アイランドが最小アンプリコンサイズより小さい場合、アイランド全体にまたがるプライマーペアが必要です。

• CpG アイランドが最大アンプリコンサイズより大きい場合、アイランドの範囲内のプライマーペアが必要です。

• CpG アイランドが最小アンプリコンサイズと最大アンプリコンサイズの間にある場合、少なくともアイランドの 3 分の 2 をカバーするプライマーペアが必要です。

Methyl Primer Express ソフトウェアでは、これらのガイドラインが考慮され、自動的にプライマー設計に適用されます。



メモ

3

サンプルデータを用いたワークフロー（続き）

プライマーの種類の選択

14ページで説明した DNA シーケンスレポートの確認後、MSP 用または BSP 用のどちらのプライマーを設計するかを選択できます。このマニュアルのワークフローでは、BSP 用のプライマーを設計します。

「DNA Sequence View」ウィンドウのドロップダウンリストから MSP または BSP を選択します。

BSP 用プライマーの設計

BSP 用プライマーを設計するには

1.「DNA Sequence View」ウィンドウ下部のドロップダウンリストから「Design BSP Primers」を選択し、「Next」をクリックします。

BSP 用プライマーの設計条件を再検討するかどうかを尋ねるダイアログボックスが表示されます。

2. 次のいずれかを選択します。

• 「No」 - デフォルト設定によっていくつかの BSP 用プライマーが設計されます。

• 「Yes」 - 表示される「Customize Settings」ダイアログボックスで、ソフトウェアによって設定されたパラメータ値を調整し、「OK」をクリックします。



メモ

重要！「Customize Settings」ダイアログボックスの各パラメータ値は、ソフトウェアがプライマーを設計する際に使用されます。デフォルト設定は推奨される値ですが、実験目的に応じて設定を修正することができます。

注：ソフトウェアをいったん終了して再度起動すると、プライマー設計がデフォルトの設定に戻ります。



メモ

3

プライマーペアの選択

1.「BSP Primers」ウィンドウで、プライマーペアを選択します。

次の図に示すように、プライマーは一対の向き合う矢印のペアとして示されます。また、横軸に近いプライマーペアほど検索条件に近いことを示します。

2. 矢印のペアをクリックし、最適なプライマーを選択します。選択したプライマーペアの色が白に変化し、フォワードプライマーとリバースプライマーのシーケンスが画面上の「Selected Sequences」パネルに表示されます。

注：この時点では、バイサルファイト処理のシミュレーションにより、C 塩基があった位置に T 塩基が表示されます。ただし、メチル化された C 塩基はバイサルファイト処理から保護されますので、CpG 部位に含まれるC 塩基は、ここではC 塩基で表示されます。



メモ

BSP プライマーレポートの作成

1.「BSP Primer Report」をクリックすると、選択したプライマーペアの BSP プライマーレポートが作成できます。

2. BSP プライマーレポートをスクロールして、設計されたプライマーの詳細を確認します。

初期状態ヌクレオチドシーケンス



メモ

3

バイサルファイト処理後の DNA シーケンスとそれを増幅するフォワード及びリバースプライマー

PCR 産物

その他の候補プライマー

ここで、次の操作を行うことができます。

• 「File」「Save As」を選択して、レポートに名前を付ける。

• Microsoft® Word 文書（.doc）として保存してレポートをエクスポートする。

• レポートを印刷する。

第 3章　プライマーの設計プライマーの設計に関する留意事項


メモ

プライマーの設計に関する留意事項

バイサルファイトシーケンシング（BSP）に関する留意事項

インポートしたシーケンス中に上流や下流のシーケンス情報が付加されていたり、あるいは、元の gDNAの相補鎖シーケンス情報が保存されていると、プライマーを最適化する上で役に立つ場合があります。

バイサルファイトシーケンシング（BSP）に関する留意事項

• バイサルファイトシーケンシング用プライマーは、メチル化状態に関わらず特定領域を増幅できるよう設計されるため、単一のフォワードまたはリバースプライマーを設定します。

• Methyl Primer Express ソフトウェアによって設計されるプライマーでは、そのシーケンスに CpG 部位が含まれないため、PCR による解析時にメチル化および非メチル化の両方の DNA が PCR で増幅されます。シーケンスデータが限られているためやむを得ずプライマーに CpG 部位が含まれる場合、このソフトウェアでは、プライマーシーケンスの CpG 部位にミックスベースが設計されます。フォワードプライマーでは入力「Y」によって「C」および「T」が、またリバースプライマーでは「R」によって「G」および「A」が表されます。

注：一般に、アニーリング温度の違いによって増幅が偏る可能性があるため、塩基の混合したプライマーはお勧めしません。

• バイサルファイト処理された DNA のみを効率よく増幅するには、プライマーのシーケンスに CpG 以外の「C」ができるだけ多く含まれている必要があります。

• できる限り多くの CpG 部位をマッピングするために、プライマーペアは、CpG に富んだ領域にまたがっている必要があります。

メチル化特異的 PCR（MSP）に関する留意事項

MSP には、完全なメチル化シーケンスを想定したものと、完全な非メチル化シーケンスを想定したものの 2 つのプライマーセットが必要です。バイサルファイト処理したメチル化シーケンスでは、メチル化 C を除くすべての C が T に変換されます。これに対しバイサルファイト処理した非メチル化シーケンスでは、CpG を含むすべての C が T で表されます。

メチル化特異的 PCR（MSP）に関する留意事項

• メチル化 DNA と非メチル化 DNA を最大限に識別するためには、各プライマーのシーケンスに少なくとも 3 つの CpG 部位が含まれ、CpG 部位の 1 つがシーケンスの 3’ 末端に存在している必要があります。

• バイサルファイト処理された DNA のみを増幅するには、プライマーのシーケンスに CpG 以外の C ができるだけ多く含まれている必要があります。

• メチル化 DNA のプライマーペア（M ペア）と非メチル化 DNA のプライマーペア（Uペア）には、それぞれのシーケンス内に同一の CpG 部位が含まれている必要があります。たとえば、M ペアのフォワードプライマーにシーケンス ATTAGTTTCGTTTAAGGTTCGA が含まれている場合、U ペアのフォワードプライマーにも 2 つの CpG 部位が必要です。ただし、シーケンス長および開始位置は異なっていても構いません。

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