genetic changes associated with disease severity in the u.s. 2014 enterovirus … · 2020-04-20 ·...

1
Genetic Changes Associated with Disease Severity in the U.S. 2014 Enterovirus D68 Outbreak Yun Zhang 1 , Guangyu Sun 2 , Christopher N. Larsen 2 , Hongtao Zhao 3 , Zhiping Gu 3 , Sherry He 3 , Edward B. Klem 3 and Richard H. Scheuermann 1,4 1 J. Craig Venter Institute, La Jolla, CA, USA; 2 Vecna Technologies, Greenbelt, MD, USA; 3 Northrop Grumman Health Solutions, Rockville, MD, USA and 4 Department of Pathology, University of California, San Diego, CA, USA Introduction 1 CDC Enterovirus D68 in the United States, 2014 http://www.cdc.gov/non-polio-enterovirus/outbreaks/EV-D68-outbreaks.html (accessed Jan 14, 2015). 2 Greninger, A.L., et al. A novel outbreak enterovirus D68 strain associated with acute flaccid myelitis cases in the USA (2012-14): a retrospective cohort study. Lancet Infect. Dis. 2015, 15, 671–682. 3 Messacar, K.; et al. A cluster of acute flaccid paralysis and cranial nerve dysfunction temporally associated with an outbreak of enterovirus D68 in children in Colorado, USA. Lancet 2015, 385, 1662–1671. 4 Ayscue, P., et al. Acute flaccid paralysis with anterior myelitis - California, June 2012-June 2014. MMWR Morb. Mortal. Wkly. Rep. 2014, 63, 903–906. 5 Lang, M., et al. Acute flaccid paralysis following enterovirus D68 associated pneumonia, France, 2014. Euro Surveill. Bull. Eur. Sur Mal. Transm. Eur. Commun. Dis. Bull. 2014, 19, pii: 20952. 6 Bragstad, K., et al. High frequency of enterovirus D68 in children hospitalised with respiratory illness in Norway, autumn 2014. Influenza Other Respir. Viruses 2015, 9, 59–63. 7 Pickett, B.E., et al. ViPR: an open bioinformatics database and analysis resource for virology research. Nucleic Acids Res. 2012, 40, D593–598. 8 Pickett, B.E., et al. Metadata-driven comparative analysis tool for sequences (meta-CATS): An automated process for identifying significant sequence variations that correlate with virus attributes. Virology 2013, 447, 45–51. 9 Liu, Y., et al. Virus structure. Structure and inhibition of EV-D68, a virus that causes respiratory illness in children. Science 2015, 347, 71–74. 10 Zhang, Y, et al. Genetic Changes Associated with Paralysis in Enterovirus D68 Isolates from the 2014 Outbreak. Viruses, submitted We would like to thank the primary data providers for the data that was used throughout this study. We also recognize the scientific and technical personnel responsible for supporting and developing ViPR, which has been wholly supported by the NIH/NIAID (No. HHSN272201400028C). Figure 4. Locations of B.1.2-unique substitutions in capsid protein structure (PDB ID: 4WM7). A. Space filling view of EV-D68 capsid proteins. B. Secondary structure view of EV-D68 capsid proteins. VP1/280 and VP1/290 (corresponding to VP1/268 and VP1/278 in the structure) are located on the surface and close to putative receptor binding site 9 . VP1/194 (corresponding to VP1/182 in the structure) and VP3/24 are located within the VP1 pocket 9 near the binding site for the anti-viral drug pleconaril. The VP1 pocket is thought to play an important role in the stabilization of virion particles and to facilitate virion uncoating following virus entry. Three distinct clades of EV-D68 were co-circulating during the 2014 outbreak with isolates associated with acute flaccid myelitis belonging exclusively to a single phylogenetic cluster B.1.2. The EV-D68 B.1.2 cluster has 28 unique substitutions in comparison with other EV-D68 lineages. 14 of these unique B.1.2 substitutions are observed at the equivalent positions in poliovirus, EV-D70, and/or EV-A71 isolates. These results suggest that the genetic substitutions found in isolates from the B.1.2 cluster may be responsible for the acquisition of neurological symptomatology associated with the 2014 EV-D68 outbreak. All sequences were retrieved from and analyzed in the Virus Pathogen Resource (ViPR) 7 - Picornaviridae family (http://www.viprbrc.org/brc/home.spg?decorator=picorna ). Figure 1: Comparative sequence analysis workflow B.1.2 Substitutions in 5’ UTR Summary Acknowledgements References B.1.2 Substitutions in Capsid Proteins Unique Substitutions in Cluster B.1.2 VP2 /222 VP1 /290 VP3 /24 VP1 /280 VP1 /194 VP1 /148 VP1 /290 VP2 /222 VP1 /308 VP1 /148 VP1 /280 ca ny on VP1 VP2 VP3 VP4 VP1 pocket pleconaril B.1.2 substitutions Figure 5. Locations of B.1.2-unique substitutions in 5’UTR structure of poliovirus. Mapping of EV-D68 B.1.2-unique substitutions to this secondary structure representation shows that six substitutions (127U, 188A, 262C, 280C, 339T, and 389G) are positioned in the IRES element: 127U and 188A (corresponding to 123 and 185 on PV-1 Mahoney, respectively) are positioned one nucleotide upstream of the stem loop structures II and III with the substitutions predicted to add an additional base pair at the base of these stems; 262C, 280C, 339T, and 389G are positioned within stem loop structure IV. Search for sequences Construct phylogenetic tree Compare EV-D68 AFP cluster with other clusters Compare EV-D68 AFP cluster with related enteroviruses Infer structural and functional implications of substitutions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ear N/A 1996-2001 2003-2007 2008-2012 2013 2014 * AFM case * * * * * * Genome Region Position (UTR: NT; Mature Peptides: AA) Non-B.1.2 EV-D68 NT/AA Distribution B.1.2 EV-D68 NT/AA Distribution P-value B.1.2 Representative NT/AA Sensitivity Specificity Observed in Other Viruses 5’UTR 127 10 A 1 G, 11 T 6.54E-05 T 92% 100% 123 A 128 T 125 C D70 5’UTR 188 85 C, 28 T 11 A, 2 T 8.78E-23 A 85% 100% 185 A 190 A 189 A PV, D70, A71 5’UTR 262 1 C, 143 T 11 C, 2 T 1.31E-25 C 85% 99% 259 C/T 264 T 264 A PV 5’UTR 280 24 C, 132 T 13 C 7.09E-11 C 100% 85% 277 C/T 282 T # - PV 5’UTR 339 155 C, 1 T 1 C, 12 T 1.41E-30 T 92% 99% 337 C/T 341 A 338 C PV 5’UTR 389 155 A, 1 G 3 A, 10 G 1.05E-24 G 77% 99% 387 G 391 A 388 C PV 5’UTR 669 1 C, 42 T 11 C, 2 T 9.94E-09 C 85% 98% # - # - # - 5’UTR 680 41 C, 2 T 13 T 4.97E-10 T 100% 95% # - # - # - 5’UTR 697 28 A, 1 C, 1 G, 13 T 1 A, 11 C, 1 T 9.57E-09 C 85% 98% # - # - # - VP2 222 15 M, 9 V 1 M, 11 T 1.26E-07 T 92% 100% 242 E/D 224 T 228 A D70 VP3 24 24 V 10 A, 1 V 3.001E-07 A 91% 100% 24 A 24 A 24 I PV, D70 VP1 98 12 A, 4 I, 1 Q, 369 T 29 A, 2 T 4.28E-57 A 94% 97% # - 98 I # - VP1 148 10 A, 196 M, 120 T, 31 V 1 A, 1 M, 29 V 4.34E-34 V 94% 91% # - 148 S # - VP1 194 1 I, 223 M 13 I, 15 M 1.00E-21 I* 46% 100% 194 I 194 L 190 V PV VP1 280 22 K, 129 R 27 K 4.68E-19 K 100% 85% 287 K 282 V 280 A PV VP1 290 150 N 3 N, 24 S 8.91E-34 S 89% 100% # - 292 T # - VP1 308 3 L, 119 T 25 N, 1 T 2.25E-31 N 96% 100% # - 310 L # - 2A 22 2 I, 11 T 13 A, 3 T 5.93E-05 A 81% 100% 24 Q/K/T 22 D 25 H 2A 66 13 D 1 D, 15 N 0.00000331 N 94% 100% 68 R 66 N 69 R D70 2C 1 13 S 12 G 4.25E-06 G 100% 100% 1 G 1 S 1 S PV 2C 102 8 A, 1 I, 4 T 12 V 1.55E-05 V 100% 100% 102 Q 102 S 102 Y 2C 273 12 D, 1 N 12 G 3.74E-06 G 100% 100% # - 273 K # - 3A 46 13 I 3 I, 9 V 4.91E-04 V 75% 100% ^ - 46 M ^ - 3A 53 12 L, 1 V 9 I, 3 L 4.57E-04 I 75% 100% 51 Q 53 V 50 N 3D 41 2 P, 11 S 11P 1.89E-04 P 100% 85% 45 K 41 S 45 S 3D 135 1 S, 12 T 11 S 4.20E-05 S 100% 92% 139 K 135 T 139 S A71 3D 274 31 R 10 K, 1 R 1.43E-08 K 91% 100% 278 K 274 R 279 K PV, A71 3D 345 31 H 11 Q 1.19E-09 Q 100% 100% 349 D 345 E 350 E EV-D68 numbering is based on US/CO/13-60. PV numbering is based on PV-1 Mahoney NC_002058. # Hypervariable region ^ Gap ! N/A * US strains PV-1/2/3 EV-D70 EV-A71 Materials and Methods Figure 2: Lineage relationships of EV-D68 isolates inferred by phylogenetic analysis of VP1 nucleotide sequences. Recent EV-D68 isolates from 2013 and 2014 distribute among three clades, suggesting that three separate linages of EV-D68 are currently co-circulating. Of note, all isolates associated with AFP belong to the single B.1.2 cluster. Background: In the 2014, a major outbreak of Enterovirus D68 (EV-D68) occurred in the US, with 1,153 confirmed cases including 14 deaths 1 . In parallel, between 2012 and 2014, there were several clusters of Acute Flaccid Paralysis (AFP) cases in Colorado 2-3 , California 2,4 , France 5 , and Norway 6 that were later determined to be EV-D68 positive. This led to the hypothesis that a novel EV-D68 lineage had emerged that was causing AFP. Objective: To explore the potential link between genetic changes in the recent EV-D68 isolates and the apparent changes in symptomatology associated with the 2014 EV-D68 outbreak. EV-D68 Lineage Relationships Table 1. Twenty-eight unique substitutions were identified in isolates from the EV-D68 B.1.2 cluster in comparison with non-B.1.2 EV-D68 using the Meta-CATS 8 algorithm. Fourteen of new substitutions are found in equivalent positions of other enteroviruses known to cause neurological symptoms, including EV-D70, poliovirus (PV), and EV- A71 viruses. D68 D68: A D68: C D68: B.1.2 D68: B.4 D70 PV A71 * * * * VP2/222T VP3/24A VP1/98A VP1/148V VP1/194I VP1/280K VP1/290S VP1/308N 2A/22A 2A/66N D68 D68: A D68: C D68: B.1.2 D68: B.4 D70 PV A71 * * * * 2C/1G 2C/102V 2C/273G 3A/46V 3D/41P 3D/135S 3D/274K 3D/345Q 3A/53I 5’UTR/127T 5’UTR/188A 5’UTR/262C 5’UTR/280C 5’UTR/339T 5’UTR/389G 5’UTR/669C 5’UTR/680T 5’UTR/697C D68 D68: A D68: C D68: B.1.2 D68: B.4 D70 PV A71 * * * * Figure 3. Unique substitutions in EV-D68 cluster B.1.2 in comparison with representative isolates of non-B.1.2 EV-D68, EV- D70, PV, and EV-A71 viruses. Multiple sequence alignments including the twenty-eight unique substitution positions are shown at the amino acid level in protein coding regions and at the nucleotide level in the 5’ untranslated region. Isolates positively associated with acute flaccid myelitis/paralysis cases 2 are marked with an asterisk. Hypervariable regions are masked out. Coding region I II III IV V VI 88 124 162 186 220 234 440 448 556 561 625 Variable region 743 Pyrimidine- rich region GNRA sequence IRES 262C 280C 339T 389G 188A (185) 127U (123)

Upload: others

Post on 01-Aug-2020

2 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

Page 1: Genetic Changes Associated with Disease Severity in the U.S. 2014 Enterovirus … · 2020-04-20 · enterovirus D68 in children in Colorado, USA. Lancet 2015 , 385 , 1662–1671

Genetic Changes Associated with Disease Severity in the U.S. 2014 Enterovirus D68 Outbreak

Yun Zhang1, Guangyu Sun2, Christopher N. Larsen2, Hongtao Zhao3, Zhiping Gu3,

Sherry He3, Edward B. Klem3 and Richard H. Scheuermann1,4 1J. Craig Venter Institute, La Jolla, CA, USA; 2Vecna Technologies, Greenbelt, MD, USA;

3Northrop Grumman Health Solutions, Rockville, MD, USA and 4Department of Pathology, University of California, San Diego, CA, USA

Introduction

1 CDC Enterovirus D68 in the United States, 2014 http://www.cdc.gov/non-polio-enterovirus/outbreaks/EV-D68-outbreaks.html (accessed Jan 14, 2015).

2 Greninger, A.L., et al. A novel outbreak enterovirus D68 strain associated with acute flaccid myelitis cases in the USA (2012-14): a retrospective cohort study. Lancet Infect. Dis. 2015, 15, 671–682.

3 Messacar, K.; et al. A cluster of acute flaccid paralysis and cranial nerve dysfunction temporally associated with an outbreak of enterovirus D68 in children in Colorado, USA. Lancet 2015, 385, 1662–1671.

4 Ayscue, P., et al. Acute flaccid paralysis with anterior myelitis - California, June 2012-June 2014. MMWR Morb. Mortal. Wkly. Rep. 2014, 63, 903–906.

5 Lang, M., et al. Acute flaccid paralysis following enterovirus D68 associated pneumonia, France, 2014. Euro Surveill. Bull. Eur. Sur Mal. Transm. Eur. Commun. Dis. Bull. 2014, 19, pii: 20952.

6 Bragstad, K., et al. High frequency of enterovirus D68 in children hospitalised with respiratory illness in Norway, autumn 2014. Influenza Other Respir. Viruses 2015, 9, 59–63.

7 Pickett, B.E., et al. ViPR: an open bioinformatics database and analysis resource for virology research. Nucleic Acids Res. 2012, 40, D593–598.

8 Pickett, B.E., et al. Metadata-driven comparative analysis tool for sequences (meta-CATS): An automated process for identifying significant sequence variations that correlate with virus attributes. Virology 2013, 447, 45–51.

9 Liu, Y., et al. Virus structure. Structure and inhibition of EV-D68, a virus that causes respiratory illness in children. Science 2015, 347, 71–74.

10Zhang, Y, et al. Genetic Changes Associated with Paralysis in Enterovirus D68 Isolates from the 2014 Outbreak. Viruses, submitted

We would like to thank the primary data providers for the data that was used throughout this study. We also recognize the scientific and technical personnel responsible for supporting and developing ViPR, which has been wholly supported by the NIH/NIAID (No. HHSN272201400028C).

Figure 4. Locations of B.1.2-unique substitutions in capsid protein structure (PDB ID: 4WM7). A. Space filling view of EV-D68 capsid proteins. B. Secondary structure view of EV-D68 capsid proteins. VP1/280 and VP1/290 (corresponding to VP1/268 and VP1/278 in the structure) are located on the surface and close to putative receptor binding site9. VP1/194 (corresponding to VP1/182 in the structure) and VP3/24 are located within the VP1 pocket9 near the binding site for the anti-viral drug pleconaril. The VP1 pocket is thought to play an important role in the stabilization of virion particles and to facilitate virion uncoating following virus entry.

•  Three distinct clades of EV-D68 were co-circulating during the 2014 outbreak with isolates associated with acute flaccid myelitis belonging exclusively to a single phylogenetic cluster B.1.2.

•  The EV-D68 B.1.2 cluster has 28 unique substitutions in comparison with other EV-D68 lineages.

•  14 of these unique B.1.2 substitutions are observed at the equivalent positions in poliovirus, EV-D70, and/or EV-A71 isolates.

These results suggest that the genetic substitutions found in isolates from the B.1.2 cluster may be responsible for the acquisition of neurological symptomatology associated with the 2014 EV-D68 outbreak.

All sequences were retrieved from and analyzed in the Virus Pathogen Resource (ViPR)7 - Picornaviridae family (http://www.viprbrc.org/brc/home.spg?decorator=picorna).

Figure 1: Comparative sequence analysis workflow

B.1.2 Substitutions in 5’ UTR

Summary

Acknowledgements

References

B.1.2 Substitutions in Capsid Proteins Unique Substitutions in Cluster B.1.2

VP2 /222

VP1 /290

VP3 /24

VP1 /280

VP1 /194

VP1 /148

VP1 /290

VP2 /222

VP1 /308

VP1 /148

VP1 /280

canyon

VP1 VP2 VP3 VP4

VP1 pocket pleconaril B.1.2 substitutions !!

Figure 5. Locations of B.1.2-unique substitutions in 5’UTR structure of poliovirus. Mapping of EV-D68 B.1.2-unique substitutions to this secondary structure representation shows that six substitutions (127U, 188A, 262C, 280C, 339T, and 389G) are positioned in the IRES element: 127U and 188A (corresponding to 123 and 185 on PV-1 Mahoney, respectively) are positioned one nucleotide upstream of the stem loop structures II and III with the substitutions predicted to add an additional base pair at the base of these stems; 262C, 280C, 339T, and 389G are positioned within stem loop structure IV.

Sequence Analysis Workflow

Search for sequences

Construct phylogenetic tree

Compare EV-D68 AFP cluster with other clusters

Compare EV-D68 AFP cluster with related

enteroviruses

Infer structural and functional implications of

substitutions

Figure 1

! !!!!!!!!!!!!!!!!! !

&$����_1$_86$95����_1$_1$

95�����_1$_1$)HUPRQ_1$_86$)HUPRQ_1$_86$

&$����_1$_86$&$����_1$_86$

1<��_1$_86$01��_1$_86$0'��_1$_86$

6$����_�������_6RXWK�$IULFD9���_����������_1HWKHUODQGV9���_����������_1HWKHUODQGV

380&+����$XJ��_����_&KLQD380&+����$XJ��_����_&KLQD

380&+����6HS��_����_&KLQD380&+����$XJ��_����_&KLQD

380&+����6HS��_����_&KLQD380&+����2FW��_����_&KLQD

380&+����6HS��_����_&KLQD380&+����$XJ��_����_&KLQD

380&+����2FW��_����_&KLQD380&+����$XJ��_����_&KLQD

380&+����$XJ��_����_&KLQD81.12:1�$%���������_����������_3KLOLSSLQHV&63���_����������_&DPERGLD&63���_����������_&DPERGLD&63���_����������_&DPERGLD&63���_����������_&DPERGLD&63���_����������_&DPERGLD&63���_����������_&DPERGLD

&63���_����������_&DPERGLD&4�����'��_����_&KLQD

81.12:1�$%���������_����������_3KLOLSSLQHV%&+���$_����������_&KLQD�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ

6+$3+&����7�6+�&+1���_�������_&KLQD&4�����'��_����_&KLQD

����������B1/��_����������_1HWKHUODQGV,7$���������_����������_ , WD O\

����������B1/��_����������_1HWKHUODQGV86�.<����������(9�'��_�������_86$

����������B1/��_����������_1HWKHUODQGV62����_����������_6SDLQ

����������B1/��_����������_1HWKHUODQGV����������_����������_1HWKHUODQGV

����������_����������_1HWKHUODQGV����������_����������_1HWKHUODQGV

7;��_1$_86$�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ

����������_����������_1HWKHUODQGV����������_����������_1HWKHUODQGV

����������_����������_1HWKHUODQGV),1���(19�7XUNX_����������_)LQODQG

),1���(19�,PDWUD_����������_)LQODQG),1���(9�����_����������_)LQODQG

380&+����$XJ��_����_&KLQD�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ*$���_�������_*DPELD

*$���_�������_*DPELD*$���_�������_*DPELD*$���_�������_*DPELD*$���_�������_*DPELD

&$�5(63�������_����_86$����������B1/��_����������_1HWKHUODQGV

+(9������_����_.HQ\D����������_����������_1HWKHUODQGV

����������_����������_1HWKHUODQGV����������_����������_1HWKHUODQGV

����������_����������_1HWKHUODQGV95���_����������_1HWKHUODQGV

����������_����������_1HWKHUODQGV1<&���_�������_86$

(9��B1/B����������(9��_����_1HWKHUODQGV����������_����������_1HWKHUODQGV(9��B1/B����������(9��_����_1HWKHUODQGV����������_����������_1HWKHUODQGV����������_����������_1HWKHUODQGV����������_����������_1HWKHUODQGV����������_����������_1HWKHUODQGV(9��B1/B����������(9��_����_1HWKHUODQGV����������_����������_1HWKHUODQGV����������_����������_1HWKHUODQGV����������_����������_1HWKHUODQGV����������_����������_1HWKHUODQGV����������_����������_1HWKHUODQGV����������_����������_1HWKHUODQGV

���������_����������_8QLWHG�.LQJGRP���������_����������_8QLWHG�.LQJGRP

����������_����������_1HWKHUODQGV����������_����������_1HWKHUODQGV(9��B1/B����������(9��_����_1HWKHUODQGV

����������_����������_1HWKHUODQGV����������_����������_1HWKHUODQGV����������_����������_1HWKHUODQGV

����������_����������_1HWKHUODQGV����������B1/��_����������_1HWKHUODQGV

(9��B1/B����������(9��_����_1HWKHUODQGV�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ

1<&���_�������_86$+(9������_����_.HQ\D

1<&���_�������_86$(9B�������B$'$0B1/��_����_1HWKHUODQGV

(9��B1/B����������(9��_����_1HWKHUODQGV���������_����������_8QLWHG�.LQJGRP���������_����������_8QLWHG�.LQJGRP(9��B1/B����������(9��_����_1HWKHUODQGV

(9��B1/B����������(9��_����_1HWKHUODQGV(9��B1/B����������(9��_����_1HWKHUODQGV

6(1��_�������_6HQHJDO����������_����������_1HWKHUODQGV

81.12:1�$%���������_����������_3KLOLSSLQHV77D����3K���B93�_����������_3KLOLSSLQHV81.12:1�$%���������_����������_3KLOLSSLQHV

1<&���_�������_86$1<&���_�������_86$

���������_����������_8QLWHG�.LQJGRP(9��B1/B����������(9��_����_1HWKHUODQGV(9��B1/B����������(9��_����_1HWKHUODQGV

����������_����������_1HWKHUODQGV���������_����������_8QLWHG�.LQJGRP����������_����������_1HWKHUODQGV����������B1/��_����������_1HWKHUODQGV

,7$���������_����_, WD O\����������_����������_1HWKHUODQGV,7$���������_����_, WD O\

(9��B1/B����������(9��_����_1HWKHUODQGV,7$���������_����_, WD O\���������_����������_8QLWHG�.LQJGRP���������_����������_8QLWHG�.LQJGRP(9��B1/B����������(9��_����_1HWKHUODQGV(9��B1/B����������(9��_����_1HWKHUODQGV

1<&���_�������_86$1<&���_�������_86$

��������_����������_8QLWHG�.LQJGRP1=����������_����������_1HZ�=HDODQG

1=���������_����������_1HZ�=HDODQG1=���������_����������_1HZ�=HDODQG1=���������_����������_1HZ�=HDODQG1=���������_����������_1HZ�=HDODQG1=���������_����������_1HZ�=HDODQG1=���������_����������_1HZ�=HDODQG1=���������_����������_1HZ�=HDODQG1=���������_����������_1HZ�=HDODQG1=���������_����������_1HZ�=HDODQG

����������_����������_1HWKHUODQGV(9��B1/B����������(9��_����_1HWKHUODQGV����������_����������_1HWKHUODQGV

(9���2NLQDZD���������_����������_-DSDQ����������B1/��_����������_1HWKHUODQGV

����������B1/��_����������_1HWKHUODQGV����������B1/��_����������_1HWKHUODQGV

62����_����������_6SDLQ����������B1/��_����������_1HWKHUODQGV62����_����������_6SDLQ

,7$���������_����_, WD O\���������_����������_8QLWHG�.LQJGRP

(9��B1/B����������(9��_����_1HWKHUODQGV,7$���������_����_, WD O\

�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ

�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ

1<&���_�������_86$1<&���_�������_86$1<&���_�������_86$1<&���_�������_86$����������_����������_1HWKHUODQGV����������_����������_1HWKHUODQGV

1<&���_�������_86$����������_����������_1HWKHUODQGV

����������_����������_1HWKHUODQGV,7$���������_����_, WD O\

����������_����������_1HWKHUODQGV,7$���������_����_, WD O\,7$���������_����_, WD O\,7$���������_����_, WD O\

,7$���������_����_, WD O\+(9������_����_.HQ\D+(9������_����_.HQ\D

+(9������_����_.HQ\D6(1��_�������_6HQHJDO6(1��_�������_6HQHJDO

+(9������_����_.HQ\D+(9������_����_.HQ\D

+(9������_����_.HQ\D+(9������_����_.HQ\D

+(9������_����_.HQ\D+(9������_����_.HQ\D

����������_����������_1HWKHUODQGV��������������_1$_1$

������+(9�'_1$_)UDQFH����������_����������_1HWKHUODQGV

7;��_1$_86$6$���_�������_6RXWK�$IULFD

6$���_�������_6RXWK�$IULFD6$���_�������_6RXWK�$IULFD6$���_�������_6RXWK�$IULFD

01��_1$_86$����������_����������_1HWKHUODQGV

+(9������_����_.HQ\D6$���_�������_6RXWK�$IULFD6$���_�������_6RXWK�$IULFD6$���_�������_6RXWK�$IULFD

����������_����������_1HWKHUODQGV7;����_1$_86$

7;����_1$_86$����������_����������_1HWKHUODQGV

:,��_1$_86$02��_1$_86$

9���_����������_1HWKHUODQGV9���_����������_1HWKHUODQGV

9���_����������_1HWKHUODQGV9���_����������_1HWKHUODQGV

����������_����������_1HWKHUODQGV,&(�������_����������_,FHODQG

0'����_1$_86$0'����_1$_86$

95���_����������_1HWKHUODQGV95���_����������_1HWKHUODQGV�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ����������_����������_1HWKHUODQGV95���_����������_1HWKHUODQGV�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ

�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ

����������_����������_1HWKHUODQGV�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ����������_����������_1HWKHUODQGV

,7$���������_����_, WD O\,7$���������_����_, WD O\����������_����������_1HWKHUODQGV

����������_����������_1HWKHUODQGV����������_����������_1HWKHUODQGV

,7$���������_����_, WD O\95���_����������_1HWKHUODQGV����������_����������_1HWKHUODQGV

95���_����������_1HWKHUODQGV����������_����������_1HWKHUODQGV,7$���������_����_, WD O\,7$���������_����_, WD O\,7$���������_����_, WD O\

,&(�������_����������_,FHODQG,7$���������_����_, WD O\

,&(�������_����������_,FHODQG�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ-32&������_����_-DSDQ

1���_����_&KLQD-32&������_����_-DSDQ

-32&������_����_-DSDQ�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ-32&������_����_-DSDQ-32&������_����_-DSDQ-32&������_����_-DSDQ-32&������_����_-DSDQ-32&������_����_-DSDQ-32&������_����_-DSDQ-32&������_����_-DSDQ-32&������_����_-DSDQ

�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ&$�5(63�������_����_86$

-32&������_����_-DSDQ-32&������_����_-DSDQ

-32&������_����_-DSDQ$5,���_�������_86$

+(9������_����_.HQ\D81.12:1�$%���������_����������_3KLOLSSLQHV

81.12:1�$%���������_����������_3KLOLSSLQHV81.12:1�$%���������_����������_3KLOLSSLQHV81.12:1�$%���������_����������_3KLOLSSLQHV81.12:1�$%���������_����������_3KLOLSSLQHV

81.12:1�$%���������_����������_3KLOLSSLQHV81.12:1�$%���������_����������_3KLOLSSLQHV81.12:1�$%���������_����������_3KLOLSSLQHV81.12:1�$%���������_����������_3KLOLSSLQHV81.12:1�$%���������_����������_3KLOLSSLQHV

81.12:1�$%���������_����������_3KLOLSSLQHV81.12:1�$%���������_����������_3KLOLSSLQHV81.12:1�$%���������_����������_3KLOLSSLQHV81.12:1�$%���������_����������_3KLOLSSLQHV81.12:1�$%���������_����������_3KLOLSSLQHV81.12:1�$%���������_����������_3KLOLSSLQHV81.12:1�$%���������_����������_3KLOLSSLQHV81.12:1�$%���������_����������_3KLOLSSLQHV

81.12:1�$%���������_����������_3KLOLSSLQHV81.12:1�$%���������_����������_3KLOLSSLQHV

81.12:1�$%���������_����������_3KLOLSSLQHV81.12:1�$%���������_����������_3KLOLSSLQHV

81.12:1�$%���������_����������_3KLOLSSLQHV81.12:1�$%���������_����������_3KLOLSSLQHV77D����3K���B93�_����������_3KLOLSSLQHV81.12:1�$%���������_����������_3KLOLSSLQHV

81.12:1�$%���������_����������_3KLOLSSLQHV&63���_����������_&DPERGLD

81.12:1�$%���������_����������_3KLOLSSLQHV81.12:1�$%���������_����������_3KLOLSSLQHV

&$�$)3��������_����_86$����������B1/��_����������_1HWKHUODQGV

&4�����'��_����_&KLQD,7$���������_����_, WD O\&$�$)3�Y��7�����_����_86$&$�$)3�Y��7�����_����_86$86�&$���������(9�'��_�������_86$&$�$)3�Y��7�����_����_86$86�&$��������6,%�(9�'��_�������_86$86�&$���������(9�'��_�������_86$86�&$����5�_�������_86$86�&2������_�������_86$86�02����������(9�'��_�������_86$

86�02����������(9�'��_�������_86$86�&$��������_�������_86$(9�'��B67/B����B��_����_86$

86�02����������(9�'��_�������_86$����������B1/��_����������_1HWKHUODQGV86�02����������(9�'��_�������_86$86�&$����5�_�������_86$

����������B1/��_����������_1HWKHUODQGV86�&2�������(9�'��_�������_86$

86�&2������_�������_86$,7$���������_����������_ , WD O\,7$���������_����������_ , WD O\

,7$���������_����������_ , WD O\,7$���������_����������_ , WD O\,7$���������_����������_ , WD O\

,7$���������_����������_ , WD O\,7$���������_����������_ , WD O\

,7$���������_����������_ , WD O\(9��B1/B����������(9��_����_1HWKHUODQGV����������_����������_1HWKHUODQGV�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ

�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ

(9��B1/B����������(9��_����_1HWKHUODQGV(9��B1/B����������(9��_����_1HWKHUODQGV(9��B1/B����������(9��_����_1HWKHUODQGV(9��B1/B����������(9��_����_1HWKHUODQGV(9��B1/B����������(9��_����_1HWKHUODQGV

(9��B1/B����������(9��_����_1HWKHUODQGV(9���2NLQDZD���������_�������_-DSDQ

���������_����������_8QLWHG�.LQJGRP��������_����������_8QLWHG�.LQJGRP

��������_����������_8QLWHG�.LQJGRP���������_����������_8QLWHG�.LQJGRP��������_����������_8QLWHG�.LQJGRP

����������_����������_1HWKHUODQGV���������_����������_8QLWHG�.LQJGRP

���������+XPDQ�HQWHURYLUXV�'_����������_)UDQFH���������+XPDQ�HQWHURYLUXV�'_����������_)UDQFH

���������+XPDQ�HQWHURYLUXV�'_����������_)UDQFH���������+XPDQ�HQWHURYLUXV�'_����������_)UDQFH

����������_����������_1HWKHUODQGV(9��B1/B����������(9��_����_1HWKHUODQGV

����������_����������_1HWKHUODQGV(9��B1/B����������(9��_����_1HWKHUODQGV(9��B1/B����������(9��_����_1HWKHUODQGV

62����_����������_6SDLQ,7$���������_����_, WD O\,7$���������_����_, WD O\,7$���������_����_, WD O\

����������B1/��_����������_1HWKHUODQGV����������B1/��_����������_1HWKHUODQGV

62����_����������_6SDLQ62����_����������_6SDLQ62����_����������_6SDLQ62����_����������_6SDLQ

����������B1/��_����������_1HWKHUODQGV62����_����������_6SDLQ62����_����������_6SDLQ62����_����������_6SDLQ,'��_����������_6SDLQ

86�.<����������(9�'��_�������_86$86�,/����������(9�'��_�������_86$����������B1/��_����������_1HWKHUODQGV����������B1/��_����������_1HWKHUODQGV����������B1/��_����������_1HWKHUODQGV

����������B1/��_����������_1HWKHUODQGV����������B1/��_����������_1HWKHUODQGV����������B1/��_����������_1HWKHUODQGV����������B1/��_����������_1HWKHUODQGV

����������B1/��_����������_1HWKHUODQGV����������B1/��_����������_1HWKHUODQGV����������B1/��_����������_1HWKHUODQGV

����

&$����_1$_86$95����_1$_1$

95�����_1$_1$)HUPRQ_1$_86$)HUPRQ_1$_86$

&$����_1$_86$&$����_1$_86$

1<��_1$_86$01��_1$_86$0'��_1$_86$

6$����_�������_6RXWK�$IULFD9���_����������_1HWKHUODQGV9���_����������_1HWKHUODQGV

380&+����$XJ��_����_&KLQD380&+����$XJ��_����_&KLQD

380&+����6HS��_����_&KLQD380&+����$XJ��_����_&KLQD

380&+����6HS��_����_&KLQD380&+����2FW��_����_&KLQD

380&+����6HS��_����_&KLQD380&+����$XJ��_����_&KLQD

380&+����2FW��_����_&KLQD380&+����$XJ��_����_&KLQD

380&+����$XJ��_����_&KLQD81.12:1�$%���������_����������_3KLOLSSLQHV&63���_����������_&DPERGLD&63���_����������_&DPERGLD&63���_����������_&DPERGLD&63���_����������_&DPERGLD&63���_����������_&DPERGLD&63���_����������_&DPERGLD

&63���_����������_&DPERGLD&4�����'��_����_&KLQD

81.12:1�$%���������_����������_3KLOLSSLQHV%&+���$_����������_&KLQD�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ

6+$3+&����7�6+�&+1���_�������_&KLQD&4�����'��_����_&KLQD

����������B1/��_����������_1HWKHUODQGV,7$���������_����������_ , WD O\

����������B1/��_����������_1HWKHUODQGV86�.<����������(9�'��_�������_86$

����������B1/��_����������_1HWKHUODQGV62����_����������_6SDLQ

����������B1/��_����������_1HWKHUODQGV����������_����������_1HWKHUODQGV

����������_����������_1HWKHUODQGV����������_����������_1HWKHUODQGV

7;��_1$_86$�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ

����������_����������_1HWKHUODQGV����������_����������_1HWKHUODQGV

����������_����������_1HWKHUODQGV),1���(19�7XUNX_����������_)LQODQG

),1���(19�,PDWUD_����������_)LQODQG),1���(9�����_����������_)LQODQG

380&+����$XJ��_����_&KLQD�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ*$���_�������_*DPELD

*$���_�������_*DPELD*$���_�������_*DPELD*$���_�������_*DPELD*$���_�������_*DPELD

&$�5(63�������_����_86$����������B1/��_����������_1HWKHUODQGV

+(9������_����_.HQ\D����������_����������_1HWKHUODQGV

����������_����������_1HWKHUODQGV����������_����������_1HWKHUODQGV

����������_����������_1HWKHUODQGV95���_����������_1HWKHUODQGV

����������_����������_1HWKHUODQGV1<&���_�������_86$

(9��B1/B����������(9��_����_1HWKHUODQGV����������_����������_1HWKHUODQGV(9��B1/B����������(9��_����_1HWKHUODQGV����������_����������_1HWKHUODQGV����������_����������_1HWKHUODQGV����������_����������_1HWKHUODQGV����������_����������_1HWKHUODQGV(9��B1/B����������(9��_����_1HWKHUODQGV����������_����������_1HWKHUODQGV����������_����������_1HWKHUODQGV����������_����������_1HWKHUODQGV����������_����������_1HWKHUODQGV����������_����������_1HWKHUODQGV����������_����������_1HWKHUODQGV

���������_����������_8QLWHG�.LQJGRP���������_����������_8QLWHG�.LQJGRP

����������_����������_1HWKHUODQGV����������_����������_1HWKHUODQGV(9��B1/B����������(9��_����_1HWKHUODQGV

����������_����������_1HWKHUODQGV����������_����������_1HWKHUODQGV����������_����������_1HWKHUODQGV

����������_����������_1HWKHUODQGV����������B1/��_����������_1HWKHUODQGV

(9��B1/B����������(9��_����_1HWKHUODQGV�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ

1<&���_�������_86$+(9������_����_.HQ\D

1<&���_�������_86$(9B�������B$'$0B1/��_����_1HWKHUODQGV

(9��B1/B����������(9��_����_1HWKHUODQGV���������_����������_8QLWHG�.LQJGRP���������_����������_8QLWHG�.LQJGRP(9��B1/B����������(9��_����_1HWKHUODQGV

(9��B1/B����������(9��_����_1HWKHUODQGV(9��B1/B����������(9��_����_1HWKHUODQGV

6(1��_�������_6HQHJDO����������_����������_1HWKHUODQGV

81.12:1�$%���������_����������_3KLOLSSLQHV77D����3K���B93�_����������_3KLOLSSLQHV81.12:1�$%���������_����������_3KLOLSSLQHV

1<&���_�������_86$1<&���_�������_86$

���������_����������_8QLWHG�.LQJGRP(9��B1/B����������(9��_����_1HWKHUODQGV(9��B1/B����������(9��_����_1HWKHUODQGV

����������_����������_1HWKHUODQGV���������_����������_8QLWHG�.LQJGRP����������_����������_1HWKHUODQGV����������B1/��_����������_1HWKHUODQGV

,7$���������_����_, WD O\����������_����������_1HWKHUODQGV,7$���������_����_, WD O\

(9��B1/B����������(9��_����_1HWKHUODQGV,7$���������_����_, WD O\���������_����������_8QLWHG�.LQJGRP���������_����������_8QLWHG�.LQJGRP(9��B1/B����������(9��_����_1HWKHUODQGV(9��B1/B����������(9��_����_1HWKHUODQGV

1<&���_�������_86$1<&���_�������_86$

��������_����������_8QLWHG�.LQJGRP1=����������_����������_1HZ�=HDODQG

1=���������_����������_1HZ�=HDODQG1=���������_����������_1HZ�=HDODQG1=���������_����������_1HZ�=HDODQG1=���������_����������_1HZ�=HDODQG1=���������_����������_1HZ�=HDODQG1=���������_����������_1HZ�=HDODQG1=���������_����������_1HZ�=HDODQG1=���������_����������_1HZ�=HDODQG1=���������_����������_1HZ�=HDODQG

����������_����������_1HWKHUODQGV(9��B1/B����������(9��_����_1HWKHUODQGV����������_����������_1HWKHUODQGV

(9���2NLQDZD���������_����������_-DSDQ����������B1/��_����������_1HWKHUODQGV

����������B1/��_����������_1HWKHUODQGV����������B1/��_����������_1HWKHUODQGV

62����_����������_6SDLQ����������B1/��_����������_1HWKHUODQGV62����_����������_6SDLQ

,7$���������_����_, WD O\���������_����������_8QLWHG�.LQJGRP

(9��B1/B����������(9��_����_1HWKHUODQGV,7$���������_����_, WD O\

�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ

�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ

1<&���_�������_86$1<&���_�������_86$1<&���_�������_86$1<&���_�������_86$����������_����������_1HWKHUODQGV����������_����������_1HWKHUODQGV

1<&���_�������_86$����������_����������_1HWKHUODQGV

����������_����������_1HWKHUODQGV,7$���������_����_, WD O\

����������_����������_1HWKHUODQGV,7$���������_����_, WD O\,7$���������_����_, WD O\,7$���������_����_, WD O\

,7$���������_����_, WD O\+(9������_����_.HQ\D+(9������_����_.HQ\D

+(9������_����_.HQ\D6(1��_�������_6HQHJDO6(1��_�������_6HQHJDO

+(9������_����_.HQ\D+(9������_����_.HQ\D

+(9������_����_.HQ\D+(9������_����_.HQ\D

+(9������_����_.HQ\D+(9������_����_.HQ\D

����������_����������_1HWKHUODQGV��������������_1$_1$

������+(9�'_1$_)UDQFH����������_����������_1HWKHUODQGV

7;��_1$_86$6$���_�������_6RXWK�$IULFD

6$���_�������_6RXWK�$IULFD6$���_�������_6RXWK�$IULFD6$���_�������_6RXWK�$IULFD

01��_1$_86$����������_����������_1HWKHUODQGV

+(9������_����_.HQ\D6$���_�������_6RXWK�$IULFD6$���_�������_6RXWK�$IULFD6$���_�������_6RXWK�$IULFD

����������_����������_1HWKHUODQGV7;����_1$_86$

7;����_1$_86$����������_����������_1HWKHUODQGV

:,��_1$_86$02��_1$_86$

9���_����������_1HWKHUODQGV9���_����������_1HWKHUODQGV

9���_����������_1HWKHUODQGV9���_����������_1HWKHUODQGV

����������_����������_1HWKHUODQGV,&(�������_����������_,FHODQG

0'����_1$_86$0'����_1$_86$

95���_����������_1HWKHUODQGV95���_����������_1HWKHUODQGV�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ����������_����������_1HWKHUODQGV95���_����������_1HWKHUODQGV�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ

�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ

����������_����������_1HWKHUODQGV�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ����������_����������_1HWKHUODQGV

,7$���������_����_, WD O\,7$���������_����_, WD O\����������_����������_1HWKHUODQGV

����������_����������_1HWKHUODQGV����������_����������_1HWKHUODQGV

,7$���������_����_, WD O\95���_����������_1HWKHUODQGV����������_����������_1HWKHUODQGV

95���_����������_1HWKHUODQGV����������_����������_1HWKHUODQGV,7$���������_����_, WD O\,7$���������_����_, WD O\,7$���������_����_, WD O\

,&(�������_����������_,FHODQG,7$���������_����_, WD O\

,&(�������_����������_,FHODQG�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ-32&������_����_-DSDQ

1���_����_&KLQD-32&������_����_-DSDQ

-32&������_����_-DSDQ�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ-32&������_����_-DSDQ-32&������_����_-DSDQ-32&������_����_-DSDQ-32&������_����_-DSDQ-32&������_����_-DSDQ-32&������_����_-DSDQ-32&������_����_-DSDQ-32&������_����_-DSDQ

�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ&$�5(63�������_����_86$

-32&������_����_-DSDQ-32&������_����_-DSDQ

-32&������_����_-DSDQ$5,���_�������_86$

+(9������_����_.HQ\D81.12:1�$%���������_����������_3KLOLSSLQHV

81.12:1�$%���������_����������_3KLOLSSLQHV81.12:1�$%���������_����������_3KLOLSSLQHV81.12:1�$%���������_����������_3KLOLSSLQHV81.12:1�$%���������_����������_3KLOLSSLQHV

81.12:1�$%���������_����������_3KLOLSSLQHV81.12:1�$%���������_����������_3KLOLSSLQHV81.12:1�$%���������_����������_3KLOLSSLQHV81.12:1�$%���������_����������_3KLOLSSLQHV81.12:1�$%���������_����������_3KLOLSSLQHV

81.12:1�$%���������_����������_3KLOLSSLQHV81.12:1�$%���������_����������_3KLOLSSLQHV81.12:1�$%���������_����������_3KLOLSSLQHV81.12:1�$%���������_����������_3KLOLSSLQHV81.12:1�$%���������_����������_3KLOLSSLQHV81.12:1�$%���������_����������_3KLOLSSLQHV81.12:1�$%���������_����������_3KLOLSSLQHV81.12:1�$%���������_����������_3KLOLSSLQHV

81.12:1�$%���������_����������_3KLOLSSLQHV81.12:1�$%���������_����������_3KLOLSSLQHV

81.12:1�$%���������_����������_3KLOLSSLQHV81.12:1�$%���������_����������_3KLOLSSLQHV

81.12:1�$%���������_����������_3KLOLSSLQHV81.12:1�$%���������_����������_3KLOLSSLQHV77D����3K���B93�_����������_3KLOLSSLQHV81.12:1�$%���������_����������_3KLOLSSLQHV

81.12:1�$%���������_����������_3KLOLSSLQHV&63���_����������_&DPERGLD

81.12:1�$%���������_����������_3KLOLSSLQHV81.12:1�$%���������_����������_3KLOLSSLQHV

&$�$)3��������_����_86$����������B1/��_����������_1HWKHUODQGV

&4�����'��_����_&KLQD,7$���������_����_, WD O\&$�$)3�Y��7�����_����_86$&$�$)3�Y��7�����_����_86$86�&$���������(9�'��_�������_86$&$�$)3�Y��7�����_����_86$86�&$��������6,%�(9�'��_�������_86$86�&$���������(9�'��_�������_86$86�&$����5�_�������_86$86�&2������_�������_86$86�02����������(9�'��_�������_86$

86�02����������(9�'��_�������_86$86�&$��������_�������_86$(9�'��B67/B����B��_����_86$

86�02����������(9�'��_�������_86$����������B1/��_����������_1HWKHUODQGV86�02����������(9�'��_�������_86$86�&$����5�_�������_86$

����������B1/��_����������_1HWKHUODQGV86�&2�������(9�'��_�������_86$

86�&2������_�������_86$,7$���������_����������_ , WD O\,7$���������_����������_ , WD O\

,7$���������_����������_ , WD O\,7$���������_����������_ , WD O\,7$���������_����������_ , WD O\

,7$���������_����������_ , WD O\,7$���������_����������_ , WD O\

,7$���������_����������_ , WD O\(9��B1/B����������(9��_����_1HWKHUODQGV����������_����������_1HWKHUODQGV�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ

�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ�����<DPDJDWD�����_����_-DSDQ

(9��B1/B����������(9��_����_1HWKHUODQGV(9��B1/B����������(9��_����_1HWKHUODQGV(9��B1/B����������(9��_����_1HWKHUODQGV(9��B1/B����������(9��_����_1HWKHUODQGV(9��B1/B����������(9��_����_1HWKHUODQGV

(9��B1/B����������(9��_����_1HWKHUODQGV(9���2NLQDZD���������_�������_-DSDQ

���������_����������_8QLWHG�.LQJGRP��������_����������_8QLWHG�.LQJGRP

��������_����������_8QLWHG�.LQJGRP���������_����������_8QLWHG�.LQJGRP��������_����������_8QLWHG�.LQJGRP

����������_����������_1HWKHUODQGV���������_����������_8QLWHG�.LQJGRP

���������+XPDQ�HQWHURYLUXV�'_����������_)UDQFH���������+XPDQ�HQWHURYLUXV�'_����������_)UDQFH

���������+XPDQ�HQWHURYLUXV�'_����������_)UDQFH���������+XPDQ�HQWHURYLUXV�'_����������_)UDQFH

����������_����������_1HWKHUODQGV(9��B1/B����������(9��_����_1HWKHUODQGV

����������_����������_1HWKHUODQGV(9��B1/B����������(9��_����_1HWKHUODQGV(9��B1/B����������(9��_����_1HWKHUODQGV

62����_����������_6SDLQ,7$���������_����_, WD O\,7$���������_����_, WD O\,7$���������_����_, WD O\

����������B1/��_����������_1HWKHUODQGV����������B1/��_����������_1HWKHUODQGV

62����_����������_6SDLQ62����_����������_6SDLQ62����_����������_6SDLQ62����_����������_6SDLQ

����������B1/��_����������_1HWKHUODQGV62����_����������_6SDLQ62����_����������_6SDLQ62����_����������_6SDLQ,'��_����������_6SDLQ

86�.<����������(9�'��_�������_86$86�,/����������(9�'��_�������_86$����������B1/��_����������_1HWKHUODQGV����������B1/��_����������_1HWKHUODQGV����������B1/��_����������_1HWKHUODQGV

����������B1/��_����������_1HWKHUODQGV����������B1/��_����������_1HWKHUODQGV����������B1/��_����������_1HWKHUODQGV����������B1/��_����������_1HWKHUODQGV

����������B1/��_����������_1HWKHUODQGV����������B1/��_����������_1HWKHUODQGV����������B1/��_����������_1HWKHUODQGV

����

A

B.1.1

B.1.2

B.2.1

B.2.2.1

B.2.2.2

C

B

LEGEND Year N/A 1996-2001 2003-2007 2008-2012 2013 2014

* AFM case

*

* *

*

* *

Table 1. Substitutions that distinguish the B.2 cluster EV-D68 isolates from other isolates

Genome Region

Position (UTR: NT;

Mature Peptides:

AA)

Non-B.1.2 EV-D68 NT/AA Distribution

B.1.2 EV-D68 NT/AA Distribution P-value

B.1.2 Representative

NT/AASensitivity Specificity Observed in

Other Viruses

5’UTR 127 10 A 1 G, 11 T 6.54E-05 T 92% 100% 123 A 128 T 125 C D705’UTR 188 85 C, 28 T 11 A, 2 T 8.78E-23 A 85% 100% 185 A 190 A 189 A PV, D70, A715’UTR 262 1 C, 143 T 11 C, 2 T 1.31E-25 C 85% 99% 259 C/T 264 T 264 A PV5’UTR 280 24 C, 132 T 13 C 7.09E-11 C 100% 85% 277 C/T 282 T # - PV5’UTR 339 155 C, 1 T 1 C, 12 T 1.41E-30 T 92% 99% 337 C/T 341 A 338 C PV5’UTR 389 155 A, 1 G 3 A, 10 G 1.05E-24 G 77% 99% 387 G 391 A 388 C PV5’UTR 669 1 C, 42 T 11 C, 2 T 9.94E-09 C 85% 98% # - # - # -5’UTR 680 41 C, 2 T 13 T 4.97E-10 T 100% 95% # - # - # -5’UTR 697 28 A, 1 C, 1 G, 13 T 1 A, 11 C, 1 T 9.57E-09 C 85% 98% # - # - # -

VP2 222 15 M, 9 V 1 M, 11 T 1.26E-07 T 92% 100% 242 E/D 224 T 228 A D70VP3 24 24 V 10 A, 1 V 3.001E-07 A 91% 100% 24 A 24 A 24 I PV, D70VP1 98 12 A, 4 I, 1 Q, 369 T 29 A, 2 T 4.28E-57 A 94% 97% # - 98 I # -VP1 148 10 A, 196 M, 120 T, 31 V 1 A, 1 M, 29 V 4.34E-34 V 94% 91% # - 148 S # -VP1 194 1 I, 223 M 13 I, 15 M 1.00E-21 I* 46% 100% 194 I 194 L 190 V PVVP1 280 22 K, 129 R 27 K 4.68E-19 K 100% 85% 287 K 282 V 280 A PVVP1 290 150 N 3 N, 24 S 8.91E-34 S 89% 100% # - 292 T # -VP1 308 3 L, 119 T 25 N, 1 T 2.25E-31 N 96% 100% # - 310 L # -2A 22 2 I, 11 T 13 A, 3 T 5.93E-05 A 81% 100% 24 Q/K/T 22 D 25 H2A 66 13 D 1 D, 15 N 0.00000331 N 94% 100% 68 R 66 N 69 R D702C 1 13 S 12 G 4.25E-06 G 100% 100% 1 G 1 S 1 S PV2C 102 8 A, 1 I, 4 T 12 V 1.55E-05 V 100% 100% 102 Q 102 S 102 Y2C 273 12 D, 1 N 12 G 3.74E-06 G 100% 100% # - 273 K # -3A 46 13 I 3 I, 9 V 4.91E-04 V 75% 100% ^ - 46 M ^ -3A 53 12 L, 1 V 9 I, 3 L 4.57E-04 I 75% 100% 51 Q 53 V 50 N3D 41 2 P, 11 S 11P 1.89E-04 P 100% 85% 45 K 41 S 45 S3D 135 1 S, 12 T 11 S 4.20E-05 S 100% 92% 139 K 135 T 139 S A713D 274 31 R 10 K, 1 R 1.43E-08 K 91% 100% 278 K 274 R 279 K PV, A713D 345 31 H 11 Q 1.19E-09 Q 100% 100% 349 D 345 E 350 E

EV-D68 numbering is based on US/CO/13-60. PV numbering is based on PV-1 Mahoney NC_002058.# Hypervariable region^ Gap! N/A* US strains

PV-1/2/3 EV-D70 EV-A71

Materials and Methods

Figure 2: Lineage relationships of EV-D68 isolates inferred by phylogenetic analysis of VP1 nucleotide sequences. Recent EV-D68 isolates from 2013 and 2014 distribute among three clades, suggesting that three separate linages of EV-D68 are currently co-circulating. Of note, all isolates associated with AFP belong to the single B.1.2 cluster.

Background: In the 2014, a major outbreak of Enterovirus D68 (EV-D68)

occurred in the US, with 1,153 confirmed cases including 14 deaths1. In parallel, between 2012 and 2014, there were several clusters of Acute Flaccid Paralysis (AFP) cases in Colorado2-3, California2,4, France5, and Norway6 that were later determined to be EV-D68 positive. This led to the hypothesis that a novel EV-D68 lineage had emerged that was causing AFP.

Objective:

To explore the potential link between genetic changes in the recent EV-D68 isolates and the apparent changes in symptomatology associated with the 2014 EV-D68 outbreak.

EV-D68 Lineage Relationships

Table 1. Twenty-eight unique substitutions were identified in isolates from the EV-D68 B.1.2 cluster in comparison with non-B.1.2 EV-D68 using the Meta-CATS8 algorithm. Fourteen of new substitutions are found in equivalent positions of other enteroviruses known to cause neurological symptoms, including EV-D70, poliovirus (PV), and EV-A71 viruses.

Figure 2

D68 D68: A D68: C D68: B.1.2 D68: B.4 D70 PV A71

*!*! !*!*! !

VP2/222T! VP3/24A! VP1/98A! VP1/148V! VP1/194I! VP1/280K! VP1/290S! VP1/308N! 2A/22A! 2A/66N!

D68 D68: A D68: C D68: B.1.2 D68: B.4 D70 PV A71

*!*! !*!*! !

2C/1G! 2C/102V! 2C/273G! 3A/46V! 3D/41P! 3D/135S! 3D/274K! 3D/345Q!3A/53I!

5’UTR/127T 5’UTR/188A 5’UTR/262C 5’UTR/280C 5’UTR/339T 5’UTR/389G 5’UTR/669C 5’UTR/680T 5’UTR/697C!

D68 D68: A D68: C D68: B.1.2 D68: B.4 D70 PV A71

*!*! !*!*! !

Figure 3. Unique substitutions in EV-D68 cluster B.1.2 in comparison with representative isolates of non-B.1.2 EV-D68, EV-D70, PV, and EV-A71 viruses. Multiple sequence alignments including the twenty-eight unique substitution positions are shown at the amino acid level in protein coding regions and at the nucleotide level in the 5’ untranslated region. Isolates positively associated with acute flaccid myelitis/paralysis cases2 are marked with an asterisk. Hypervariable regions are masked out.

Coding region

I II III

IV

V

VI

88 124 162 186 220 234 440

448 556

561 625

Variable region

743

Pyrimidine- rich region

GNRA sequence

IRES

262C 280C 339T 389G

188A (185)

127U (123)