gene to protein 핸드북 - thermo fisher scientific · 화합물의 우수한 실험 대조 ......

Gene to protein 핸드북Engineer innovation

ContentsGene to protein 1

Choosing an expression system 3

Building your gene 5

GeneArt® Gene Synthesis 5

Optimizing expression 6

GeneArt® Strings™ DNA Fragments 8

Gene assembly 9

Mammalian expression systems 10

Selecting a mammalian expression system 10

Expi293™ Expression System 12

GeneArt® Algae Engineering Kits 15

Gateway® technology for multiple expression systems 17

Protein production services 18

Creating improved proteins 21

GeneArt® Directed Evolution 21

lifetechnologies.com/proteinexpress에서 더 자세한 내용을 확인해 보세요

1Life Technologies | Gene to protein

귀하의 유전자부터 단백질을 발현하는 모든 것들에 대한 다양한 서비스와 제품, 그리고 발현시스템을 라이프 테크놀로지스에서 만나보실 수 있습니다. 이 모든 서비스와 제품은 사용하기 쉽고 시간을 절약해주며 downstream 어플리케이션에서 더 높은 단백질 수득률을 보여 줄 것입니다(그림 1). 이 핸드북은 귀하의 연구에 필요한 최고의 제품과 서비스에 대해 설명해 줄 것이며 또한 직접 실험하는 것보다 몇 주의 시간을 단축 할 수 있는 다양한 서비스에 대해 소개 해 줄 것입니다. 또한 자사에서는 유전자에서 부터 단백질까지의 전반에 대한 완전한 워크플로우를 서비스로 제공하고 있습니다.

Expression

Gene to protein

Delivery Plasmid purificationCloning

Gateway®, TOPO®, or Type IIs cloning

GeneArt® gene synthesis

BenchPro® 2100

PureLink® HiPure kits

Lipofectamine® 2000

Expi293™ system

Neon® Transfection System

PichiaPink™ systemLipofectamine® LTX

Champion™ pET system

Baculovirus system

Algae or other system

GeneArt® Gene-to-Proteins service

ExpressionDelivery Plasmid purificationGene synthesis

그림 1. 단백질 발현을 위한 일반적인 워크플로우

3Life Technologies | Choosing an expression system

Choosing an expression system표 1. 단백질 발현 시스템 및 어플리케이션. 발현 시스템 선택 시에는 각 시스템마다의 장점과 해결해야 하는 과제들이 있습니다.

숙주 생물 가장 일반적인 어플리케이션 장점 해결 과제 추가 정보 참조:

원핵 생물 Prokaryotic

• 구조 분석

• 항체 생산

• 기능 분석

• 단백질 상호작용

• 확장 가능

• 저비용

• 간편한 배양 조건

• Gateway® 클로닝과 호환 가능

• 단백질 용해도 • Posttranslation modification

이 잘 안됨

• 포유류 기능 단백질의 발현이 어려울 수 있음

lifetechnologies.com/ bacterialexpression

효모Yeast

• 구조 분석

• 항체 생산

• 기능 분석


• 진핵세포의 단백질 처리

• 발효까지 확장 가능( g/L )• 단순한 배지 요건

• 매우 높은 수율을 위해 발효 필요

• 성장 조건에 최적화가 필요할 수 있음

lifetechnologies.com/ yeastexpression

곤충Insect

• 기능 분석

• 구조 분석

• 항체 생산

• 포유류 시스템과 유사한 posttranslation midification

• 대개 포유류 시스템 보다 높은 수율 획득


• 어려운 배양 조건 lifetechnologies.com/ insectexpression

포유류Mammalian

• 기능 분석


• 항체 생산

• 가장 높은 수준의 올바른 posttranslation midification

• 가장 기능적인 인간 단백질 획득 확률 최고


• 현탁 배양에서만 mg/L 수율 가능

• 어려운 배양 조건

lifetechnologies.com/ mammalianexpression

조류Algal

• 기본 조류 연구

• 식물 과학

• 단백질 생성

• 빠르게 성장하는 광합성 모델 생물체

• 생물연료, 기능성 식품 및 특수 화합물의 우수한 실험 대조

• 확실한 선택 및 발현에 최적화된 시스템

• 세포 보관 및 재생의 어려움

• 관심 유전자의 발현 silencing• 광합성 육지 식물의 긴 성장

주기

lifetechnologies.com/ algaeexpression

라이프 테크놀로지스 발현 시스템의 전체 목록은 lifetechnologies.com/proteinexpress에서 확인할 수 있습니다.

재조합 단백질 발현 기술은 여러 어플리케이션에 필수적입니다. 신약 탐색 및 개발을 위한 단백질 기능 연구에서부터 대규모 단백질 생산에 이르기까지의 성공을 위해서는 어플리케이션에 맞는 발현 시스템을 사용하는 것이 중요합니다. 단백질 용해도, 기능성, 정제 속도, 수율 등이 발현 시스템 선택 시 고려해야 할 중요한 요인들입니다. 라이프 테크놀로지스에는 다양한 발현 시스템이 마련되어 있어 여러분에게 필요한 적합한 제품을 분명히 찾으실 수 있습니다(표 1). 발현 성능을 증강시킬 수 있는 포유류 및 조류(algal)관련 제품과 서비스가 다음 페이지에 설명되어 있습니다.

5Life Technologies | Building your gene

lifetechnologies.com/genesynthesis에서 편리하게 유전자를 주문할 수 있습니다.

표 2. 라이프 테크놀로지스의 유전자 합성 옵션.

Do-it-yourself gene synthesis Custom DNA fragments Custom gene synthesis

제품 또는 서비스 GeneArt® Gene Synthesis Kit GeneArt® Strings™ DNA Fragments GeneArt® Gene Synthesis and Subcloning Service

장점 • 모든 비용 관리 가능

• 모든 단계 관리 가능

• 신속하고 적절한 비용

• 설계의 유연성

• 유전자 최적화

• 물리적 탬플릿 불필요

• 신뢰할 수 있는 기법으로 완전한 유전자 구성 가능(예: GeneArt® Seamless PLUS Cloning and Assembly Kit

• 100% 검증된 염기서열

• 편리한 주문

• 설계의 유연성

• 유전자 최적화

• 합성 및 클로닝 작업 불필요

• 속도 업그레이드 선택 가능 (예: SuperSPEED [그림 2 참조])

실험실 작업 정도 높음 중간 낮음

표준 소요 시간 해당 없음 1,000 bp 이하의 분절의 경우 영업일 5일 1,200 bp 이하의 유전자의 경우 영업일 9일

5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘G

A

A

G

G

AG

www

A C G C A

Day 3Cloning

Day 2GeneAssembler™

process

Day 4Sequencing &quality control

Day 5Ready for shipment

Day 1Ordering until

3:00 pm (CET)

Oligosynthesisovernight

자체적으로 유전자를 합성하고자 한다면 합성 분절을 성공적으로 생성하기 위해 필요한 모든 고품질 시약을 제공하는 GeneArt® Gene Synthesis Kit를 사용할 수 있습니다. 표 2는 라이프 테크놀로지스에서 이용할 수 있는 유전자 합성 옵션에 대한 요약입니다.

그림 2. GeneArt® SuperSPEED 생산 일정. 영업일 5일 내에 유전자 합성, 클로닝, 배송 준비가 가능합니다.

Building your gene GeneArt® Gene Synthesis이제 유전자 합성은 원하는 DNA 구조를 거의 모두 얻을 수 있는 비용 효율적이며 시간을 단축하는 방법이 되었습니다. 원하는 염기서열만 제공하면 유전자 합성과 클로닝이 이루어집니다(그림 2). 유전자 합성과 유전자 최적화를 함께 실시하면 기존의 분자 생물학 기법을 이용하여 만든 구조를 능가하는 클론이 생성됩니다. GeneArt® Gene Synthesis 도구를 사용하면 전통적인 클로닝 외에도 다음이 가능합니다.• GeneOptimizer®로 단백질 발현 향상

• 길고 복잡한 DNA 등 어려운 구조의 클로닝이 가능 • 유전자 또는 벡터의 설계상 제약 극복

• 스크리닝 실험을 위한 돌연변이 무제한 생성

• 효소 활성과 항체의 결합 친화도를 높이는 단백질 조작

라이프 테크놀로지스는 유전자 합성 외에도 GeneArt® Strings™ DNA Fragment도 제공합니다. 이는 선형 이중 가닥 DNA 분절로 제공됩니다.

6 Life Technologies | Gene to protein 핸드북

AAAAAA

PABPPABP

PABPAAAAAA

Remove sequencerepeats

Adjust codon usage Optimize GC content

Remove splice sites Avoid RNA secondarystructure

Eliminate killer motifs

Optimized gene

그림 3. GeneOptimizer® 알고리즘은 여러분의 실험에 맞는 최적의 유전자 염기서열을 결정합니다.이 알고리즘은 DNA 염기서열 반복을 제거하여 코돈 사용과 GC 함량을 최적화하며 단백질 수율을 낮출 수 있는 RNA 이차 구조의 형성을 최소화합니다. 이 최적화 과정은 단백질 염기서열에 영향을 주지 않습니다.

Optimizing expression발현 수율이 낮으면 생물의학 연구와 제품 개발을 위한 재조합 단백질 생산에 지장을 받을 수 있습니다. 이러한 발현 문제는 연구자가 구조 및 기능 분석을 수행하는 데 제약이 되어 탐색 과정을 지연시키거나 중단시킬 수 있습니다. 유전자 최적화는 기존의 단백질 발현이 갖는 제약을 해결할 수 있습니다. 이제 수율, 용해도, 기능성 등 단백질 발현과 관련된 일반적인 문제점을 합리적이고 체계적으로 해결할 수 있습니다.

GeneOptimizer® 알고리즘은 실제 다중 파라미터 접근법의 일부로 발현 시스템에 맞는 최적의 유전자 염기서열을 결정합니다(그림 3). GeneOptimizer® 기술은 관련된 발현 파라미터를 동시에 평가하여 혁신적인 방법으로 표적 염기서열의 다양한 변이체를 생성하고 여러분의 요건에 가장 적합한 염기서열을 선택합니다. GeneOptimizer® 소프트웨어 처리를 사용한 염기서열 최적화가 모든 GeneArt® Gene Synthesis 서비스와 GeneArt® Strings™ DNA Fragment에 옵션으로 포함됩니다.


CREB1x 2.8

SMARCD1x 1.8

JNK3x 15.0

AQP5x 9.0

IL-2x only opt

wild type

Rel

ativ

e ex

ress

ion

Rel

ativ

e ex

ress

ion

Rel

ativ

e ex

ress

ion

Rel

ativ

e ex

ress

ion

Rel

ativ

e ex

ress

ion

60

35

60

40

60

40

60

30

20

15

CREB1

SMARCD1

JNK3

AQP5

IL-2

moc

k

PP1

PP2

PP3

PP1

PP2

PP3

Optimized

optimized

wild type optimized

wild type optimized

wild type optimized

Wild Type

그림 4. 여러 단백질 클래스를 나타내는 야생형(wild type) vs 최적화 유전자 발현 비교 분석. (A) 세포 배양 상층액(분비 단백질) 또는 세포 용해물(기타 모든 단백질)을 anti-His 항체를 이용해 Western blot으로 분석하였습니다. 각 단백질 클래스의 한 예가 제시됩니다. 단백질 양의 표준화에 사용된 60 kDa 단백질과 빈 벡터의 음성 대조 물질이 표시되어 있습니다. 각 이미지의 좌측: kDa 단위의 분자량 값. 각 이미지의 우측: 특정 단백질 밴드 식별자. (B) 상대 발현 수준은 야생형 또는 최적화 구조에 대해 도출하였습니다(3가지 별개 transfection의 평균). 최적화된 유전자의 발현 증가 배수가 각 단백질에 대해 제시되어 있습니다. 야생형 염기서열 사용 시 IL-2에 대해 검출 가능한 발현이 없었습니다.≠ 그림 출처: Fath et al., 2011 [1].

이에 대해 처음 실시된 시험[1]에서 최적화에 중요한 5가지 단백질 클래스 (즉 단백질 키나아제, 전사 인자, 리보솜 단백질, 사이토카인, 막 단백질)가 선택되었습니다. 그 후, NCBI 데이터베이스에서 이 다섯 단백질 클래스를 대표하는 인간 유전자 50개를 선택하였습니다. 선택된 유전자는 GeneOptimizer® 알고리즘을 사용해 각각 최적화하였습니다[2]. 비교를 위해 NCBI 데이터베이스에서 이용할 수 있는 native 염기서열을 사용해 해당하는 야생형 유전자(wild type)를 subcloning하였습니다. 그리고 각 유전자를 HEK 293T 세포에 3번 발현시켰습니다. 최적화 후 50개 유전자 모두 확실히 발현되었고 86%에서 발현이 증가했습니다. 추가 분석에서 단백질 용해도에 유해한 영향이 없었으며 JNK1, JNK3, CDC2에 대한 기능이 변하지 않은 것으로 밝혀졌습니다(데이터 미제시). GeneOptimizer® 알고리즘을 사용한 이 시험에서 다음과 같은 결과가 나타났습니다:

• 최적화 유전자의 86%에서 단백질 발현이 크게 증가했습니다.• 최적화된 유전자에서 단백질 수율이 최대 15배 높아졌습니다.• 최적화된 유전자는 100%가 발현된 반면 야생형 유전자의 발현율은

88%이었습니다.

References1. Fath S, Bauer AP, Liss M et al. (2011) Multiparameter RNA and codon optimization: a standardized tool to assess and

enhance autologous mammalian gene expression. PLoS One 6:e17596.2. Raab D, Graf M, Notka Fet al. (2010) The GeneOptimizer® algorithm: using a sliding window approach to cope with the vast

sequence space in multiparameter DNA sequence optimization. Syst Synth Biol 4:215–225.

유전자 최적화에 대한 추가 정보는 lifetechnologies.com/genesynthesis 에서 확인할 수 있습니다.

A B


GeneArt® Strings™ DNA Fragments

Plasmid isolation

플라스미드 DNA를 필요한 순도와 크기로 분리할 수 있는 키트를 찾고 계십니까?

GeneArt® Strings™ DNA Fragment는 맞춤형 선형 이중 가닥 DNA 분절입니다. 200 ng 이상의 GeneArt® Strings™ DNA Fragment가 영업일 5일 이내에 배송되어 실험실에서 바로 클로닝에 사용할 수 있습니다. GeneArt® Strings™ DNA Fragment는 온라인에서 주문 가능하며 기존의 PCR 기반 클로닝 대신 적절한 비용으로 신속하고 편리하게 사용할 수 있습니다.

GeneArt® Strings™ DNA Fragment는 GeneArt, Gene Synthesis에 사용되는 동일한 기술로 생산됩니다. 우수한 품질의 합성 올리고뉴클레오티드에서 DNA 분절을 조립한 후 전체적으로 염기서열을 분석하여 원하는 유전자가 분절 풀(pool)에서 제대로 나타나는지 확인합니다.

실험 데이터를 보면 완전한 길이의 삽입물(insert)을 포함한 4개 이상의 군집(colony)에 대해 염기서열을 분석하는 경우 올바른 클론을 찾을 수 있는 확률이 높습니다(그림 5). 라이프 테크놀로지스는 TOPO® cloning, Gateway® cloning, GeneArt® Seamless Cloning, and GeneArt® Type IIs Assembly Kit 등 신뢰할 수 있고 효율적인 몇 가지 클로닝 시스템을 제공합니다. 먼저 적절한 클로닝 시스템을 선택한 후 해당 요건에 따라 Strings™ DNA Fragment를 설계하는 것이 권장됩니다.

그림 5. 제한 효소 클로닝을 사용한 Strings™ DNA Fragment 클로닝. 기존 제한 효소 클로닝의 성공률은 본사 표준 유전자 합성 제조 과정에서 직접 취한 1,000개 이상의 분절에서 평가하였습니다. 100–500 bp 및 501–1,000 bp의 서로 다른 크기 범위의 분절이 제한 효소 클로닝에 이용되었습니다. Colony PCR로 박테리아 군집을 분석하여 클로닝 효율을 평가한 후 염기서열을 분석하였습니다. 100-500 bp 범위의 전체 길이 분절 최대 4개, 501 -1,000 bp 범위의 전체 길이 클론 최대 6개에 대해 염기서열을 분석한 결과 올바른 클론을 찾을 수 있는 성공률이 각각 90%와 85%이었습니다.

Fragment size

Succ

ess

rate

(%)

82

86

90

94

98 97%96%

90%

85%

78100–500 bp 501–1,000 bp

84

88

92

96

80

Cloning efficiency Correct sequence

자세한 정보는 lifetechnologies.com/strings 를 참조하십시오.

Go to lifetechnologies.com/plasmidprep


GeneArt® Type IIs 클로닝에 대한 더 많은 정보는 lifetechnologies.com/typeiis에서 확인할 수 있습니다.

Gene assembly GeneArt® Type IIs Assembly KitsGeneArt® Type IIs Assembly Kit를 사용하면 단일 반응에서 절단과 결합을 동시에 실시하여 최대 8개의 DNA 분절을 완벽하게 클로닝하고 어셈블리할 수 있습니다(그림 6). 이 키트는 Type IIs 제한 효소의 Golden Gate 클로닝과 유사한 기술을 사용하며 사전에 결정된 순서로 여러 분절을 호환 가능한 벡터에 구성하는데 사용할 수 있습니다. Type IIs 어셈블리는 상동 재조합을 기반으로 하지 않으므로 재배열 위험이 적고 최종 구조의 염기서열을 확인할 필요성이 최소화됩니다. 라이프 테크놀로지스는 AarI, BsaI, BbsI의 3가지 Type IIs 제한 효소 중 하나를 갖는 3가지 키트를 제공하며 모든 키트에 all-in-one 효소 믹스, 클로닝 벡터, 클로닝 대조군이 포함됩니다. 본사의 개선된 새로운 GeneArt® Primer & Construct Design Tool에는 분절에 적합한 GeneArt® 어셈블리 키트가 추천되며 구조를 설계하고 프라이머를 생성 및 주문(필요한 경우)할 수 있는 사용이 용이한 인터페이스를 제공합니다. GeneArt® Type IIs Assembly Kit를 사용하면 다음이 가능합니다.

• 여러 DNA 분절을 어떤 순서와 상관없이 흠 없이 호환 가능한 벡터에 구성 가능

• 상동 또는 반복 염기서열 클로닝 시 상동 재조합과 관련 재배열 방지

• GeneArt® Strings™ DNA Fragment, GeneArt® Precision TAL, 유전자 변이, 반복 또는 작은 염기서열 조립

• 맞춤형 벡터 물질로 자체 클로닝 및 발현 벡터 생성

• 최종 구조의 염기서열 확인 최소화

• 무료 온라인 GeneArt® Primer & Construct Design Tool을 사용해 어셈블리를 위한 최대 8개 DNA 분절 설계

Cloning efficiency, flexibility, and precision클로닝 효율에 영향을 미치는 주요 인자는 DNA 요소의 크기, 최종 분자의 전체 크기, 분절의 품질과 특이성입니다. pType Ils 벡터에

Type IIs RET4 Ligase

그림 6. Type IIs 클로닝. Type IIs 제한효소 (restriction endonuclease)는 인지 부위

(recognition site)에서 정해진 거리에 있는 비대칭 염기서열을 인지하여 절단합니다. DNA 말단은 이들 분절 절단이 효소 인지 부위를 제거하고 보상적 돌출부위를 생성하도록 Type IIs 제한 부위 측면에 배치되도록 설계될 수 있습니다. 이런 말단은 완벽히 결합되어 원래 부위가 없는 접합(junction) 부위를 생성할 수 있습니다.

클로닝된 분절 갯수에 대한 전형적인 클로닝 효율은 다음과 같습니다.

• 1 kb 분절 5개의 클로닝 효율 >95%• 1 kb 분절 8개의 클로닝 효율 >60%• 각각 1 kb의 동일 분절 2개의 클로닝 효율 >85%


Mammalian expression systems Selecting a mammalian expression system라이프 테크놀로지스는 여러분의 필요에 맞는 다양한 포유류 발현 시스템을 제공합니다. 다음 3가지 질문을 살펴보고, 표 3을 이용해 여러분의 필요에 가장 적합한 시스템을 선택하십시오.

1. 얼마나 많은 단백질이 필요한가?단백질 수율은 매우 가변적이며 발현되는 특정 단백질에 따라 크게 좌우됩니다. 일반적으로 플라스미드 DNA를 다양한 세포에 일시적으로 이입하여 소량의 단백질(나노그램에서 마이크로그램)을 쉽게 생성할 수 있습니다. Lipofectamine® LTX 또는 Lipofectamine® 2000 reagent 등의 효과적인 tramsfection 시약을 사용하여 가능한 최고의 transfection 효율성을 달성하는 것이 매우 중요합니다.

보다 많은 단백질(밀리그램에서 그램)을 생성하려면 더 많은 세포가 필요합니다. 따라서 종종 안정한 세포주를 사용해 관심 단백질을 안정적으로 발현하는 선택된 대량의 세포 군집을 생성합니다. 그렇지 않으면 HEK 293 또는 CHO 세포와 같은 현탁 적응된 세포를 일시적으로 대량 이입하여 안정 세포를 이용했을 때보다 훨씬 짧은 기간 내에 많은 단백질을 생성할 수 있습니다. 대량의 단백질 생성에 사용되는 Expi293™ Expression System이 본 자료집 다음 항에 논의됩니다.

2. 얼마나 빨리 단백질을 얻어야 하는가?일시적 transfection을 이용한 발현은 수일 또는 일주일 내에 높은 수준의 발현을 달성할 수 있습니다. 따라서 신속한 단백질 생산과 빠른 데이터 생성에는 일시적 발현이 이상적입니다. FreeStyle™ 293, FreeStyle™ MAX CHO, Expi293™ 시스템 등의 일시적 발현 시스템은 1 mL~100 L 크기 배양에 현탁 적응된 293 또는 CHO 세포를 이용하여 대량의 단백질을 생성합니다. 새로운 Expi293™ Expression System은 세포 배양액 1 L당 최대 1g의 단백질을 생성하는 것으로 입증되었습니다.

오랜 실험 기간 또는 여러 실험에 걸쳐 사용할 수 있는 세포주를 생성하려면 안정적인 세포주를 생성하여 발현 구조를 숙주 게놈에 삽입하여야 합니다. 배지에 첨가하는 선택 제제(Selective antibiotics)는 유전자가 삽입된 구조를 갖는 세포를 선택하는데 사용됩니다. 발현 지점을 표적으로 삽입된 세포주를 만들고자 한다면 Jump-In™ 시스템을 추천합니다. 임의로 삽입된 세포주의 경우, Lipofectamine® LTX reagent 등의 양이온 지질(cationic lipid) 기반 transfectin 시약으로 전달되는 모든 pcDNA™ 벡터를 이용할 수 있습니다. Transfection이 어려운 세포에는 Neon® Transfection System 또는 ViraPower™ Lentiviral Expression System을 사용할 수 있습니다.

3. 발현 시작 시 통제가 중요한가?항시성 프로모터(constitutive promoter)를 갖는 발현 벡터는 발현을 통제할 수 없습니다. 무독성 유전자로 작업하고 발현 시간이 중요하지 않다면 pcDNA™ vector 등의 항시 발현 벡터를 선택하십시오.

유도성 프로모터(inducible promoter)를 갖는 발현 시스템에는 발현 시작을 위한 유도제를 첨가하여 유전자 발현 시간을 통제할 수 있습니다. 유도제가 없다면 유전자가 발현되지 않습니다. 이 옵션은 독성 단백질 발현에 이상적입니다. Tetracycline으로 유도되는 발현에는 T-REx™ Expression System 또는 표적 게놈이 통합된 tetracycline 유도 발현에는 Flp-In™ T-REx™ System을 선택하십시오.

선택 가이드와 도구에 대한 자세한 내용은 lifetechnologies.com/mammalianexpression을 참조하십시오.

11Life Technologies | Mammalian expression systems

포유류 발현 시스템에 대한 더 많은 정보는 lifetechnologies.com/mammalianexpression 에서 확인할 수 있습니다.

표 3. 포유류 단백질 발현 시스템.

어플리케이션 시스템 주요 특징

항시성 발현(CMV promoter)

Constitutive expression (CMV promoter)pcDNA™ vectors 선택한 몇 가지 epitope 태그 및 선택 표지자를 통한 항시성 CMV 발현

일시적 발현

Transient expressionpcDNA™ vectors and cationic transfection reagents

Adenoviral expression systems

분할 또는 미분할 포유류 세포 유형에서 높은 수준의 유전자 발현

확장 가능한 일시적 발현

Scalable, transient expressionFreeStyle™ 293 Expression System 1 mL에서 100 L까지 확장 가능한 현탁 배양 세포에 transfection

FreeStyle™ MAX CHO Expression System 수일 또는 1주 이내 단백질 획득

Expi293™ Expression System 배양액 1 L 당 최대 1 g 단백질 생성

안정 세포주, 표적 통합

Stable cell lines, targeted integrationJump-In™ Fast Gateway® System 발현 지점에 삽입하는 안정 세포주를 신속하게 생성

Jump-In™ TI™ Gateway® System 미리 선택한 게놈 부위에 삽입된 세포주 확립

Flp-In™ T-REx™ System CMV promoter에서 조절된 발현

유도성 발현

Inducible expressionT-REx™ System, Flp-In™ T-REx™ System T-REx™ System, Flp-In™ T-REx™ System 조절된 발현 세포주를 신속하게 확립

ViraPower™ Lentiviral T-REx™ System 분할 또는 미분할 포유류 세포 유형에서 발현 조절

Transfection

귀하의 plasmid를 전달해 줄 Transfection 시약을 찾고 계신가요?

아래에서 선택해 보세요:Lipofectamine® 2000 Transfection ReagentLipofectamine® LTX with PLUS™ Reagent

Go to lifetechnologies.com/transfection


그림 7. Expi293™ Expression System에서 인간 IgG 및 Fc-tagged Cripto 단백질의 발현이 > 1 g/L의 수준으로 달성되었습니다.

Expi293™ Expression SystemHigh-density mammalian transient protein expressionExpi293™ Expression System은 포유류 세포에서 신속하게 고수율 단백질을 생성할 수 있는 최신의 일시적 발현 기술입니다. 이는 Expi293™ Expression Medium에서 Expi293F™세포의 고밀도 배양을 기초로 합니다. 일시적 발현은 새로운 양이온 지질(cationic lipid) 기반 ExpiFectamine™ 293 transfection 시약과 특별히 이러한 transfection 시약에 사용하도록 최적의 transfection 증강인자(transfection enhancer)를 함께 사용하여 이루어집니다.

모든 구성물질이 함께 어우러져 FreeStyle™ 293 Expression System 같은 기존 일시적 시스템보다 2-10배 높은 단백질 수율을 제공합니다. IgG 및 non-IgG 단백질에서 1 g/L 이상의 발현이 이루어졌습니다(그림 7). 인간이나 다른 포유류 단백질의 발현의 경우, 인간 유래 293 세포에서의 발현이 E. coli, 효모, 또는 곤충 세포와 같은 숙주 기반 발현 시스템보다 많은 native folding과 glycosylation 같은 post-translation midification을 갖는 장점이 있습니다.

FreeStyle™ 293 Expi293™

30 mL culture

Human LgG

hLgG

(µg/

mL)

200

800

1,000

0

400

600

1,200

30 mL culture

Cripto

Crip

to (µ

g/m

L)

200

800

1,000

0

400

600

1,200

이 시스템의 구성품을 확인해 보세요. 키트에 포함되는 구성요소는 다음과 같습니다:

• 동결 Expi293F™ 세포 2 바이알

• 1 L Expi293™ Expression Medium• 1 ExpiFectamine™ 293 Transfection Kit:

배양액 1L transfection에 충분

• OptiMEM® Reduced Serum Medium• 항체 발현 양성 대조물질

ExpiFectamine™ 293 Reagent 및 ExpiFectamine™ 293 Transfection Enhancers 1 및 2는 ExpiFectamine™ 293

Transfection Kit로 함께 판매됩니다. 그 외 다른 모든 시스템 구성요소는 별도로 구입할 수 있습니다.

13Life Technologies | Mammalian expression systems

그림 8. Expi293™ Expression Medium과 다른 293 배양 배지에서 성장한 세포에 대한 시간에 따른 생존 세포 밀도 및 세포 생활성

0

2

4

6

8

10

12

14

16

0 21 43 65 87

Viab

ility

(%)

Days in culture

Expi293™ medium Test medium 2Test medium 1 Test medium 3

0

25

50

75

100

2 43 65 87

Viab

le c

ell d

ensi

ty(c

ells

/mL

x 10

6 )

Days in culture

그림 9. Transfection 증강인자(Transfection enhancer) 유무에 따른 인간 IgG의 발현.

무엇이 Expi293™ Expression System을 특별하게 만들까요?Expi293™ Expression Medium은 화학적으로 규명된(chemically defined) 무혈청, 무단백질 배지입니다. Expi293™ Expression Medium은 고밀도 세포 배양(그림 8)과 transfection을 가능하게 하여 기존 배양 시스템보다 훨씬 많은 양의 단백질을 얻을 수 있습니다.

ExpiFectamine™ 293 transfection reagent은 고밀도 293 배양의 transfection 효율성을 높이며 transfection 증강인자(transfection enhancer)와 결합해 transfection의 성능과 발현 수준을 더욱 배가시킵니다(그림 9).

시스템 작동 방식Expression System에는 실험실에서 높은 수준의 재조합 단백질을 쉽게 만들기 위해 필요한 모든 요소가 들어있습니다. 필요한 단 한 가지 추가 물질은 관심 단백질에 대한 DNA를 포함한 포유류 발현 벡터입니다. Expi293F™ cell은 해동 후 Expi293™ Expression Medium에서 현탁 배양으로 성장합니다. 세포는 일반적으로 CO2 세포 배양기내에서 플라스크에 넣어 shaker 플랫폼 혹는 bioreactor에서 배양합니다. 이 세포를 ExpiFectamine™ 293 Reagent를 사용해 transfection합니다. 그리고 transfection 후 16-18시간째에 transfection 증강인자(transfection enhancer) 1과 2를 배양액에 첨가합니다. 단백질 생성 중 배양 배지를 바꾸거나 배양액에 보충제를 첨가할 필요가 없습니다. 관심 단백질의 발현 양상에 따라 transfection 이 후 2-7일째에 단백질을 회수할 수 있습니다. 재조합 항체 발현의 경우, 최대 수율은 대개 transfection 후 5-7일째에 관찰됩니다.

Enhancer 1 - + - +Enhancer 2 - - + +

Expression of human LgG with and without transfection enhancers

Rel

ativ

e ex

pres

sion

of h

LgG

1.0

2.5

3.0

0

0.5

1.5

2.0

3.5


Expi293F™ cell은 Expi293™ Expression System에 사용 시 전형적인 293 세포 보다 높은 생산성을 나타내고 Freestyle™ 293F 보다 많은 단백질을 생성하도록 특이적으로 적응됩니다(그림 10). 이 시스템은 확장성이 매우 높아 24-well 플레이트의 1 mL 배양액에서 진탕 플라스크(shake flask)를 이용하여 최대 1 L 배양액까지의 transfection 형식에서 비슷한 양의 단백질을 생성합니다. Expi293™ Expression System을 사용하여 단백질 수율을 2-10배 높일 수 있어 기존 방법보다 탁월한 가치를 제공합니다(표 4).

그림 10. Fc-tagged Cripto 단백질 발현이 서로 다른 3가지 크기에서 비슷한 단백질 수율 달성.

표 4. Expi293™ Expression System 비용 비교.

PEI with FreeStyle™

Expression Medium(1 L culture)

Expi293™ system(335 mL culture)

Expi293™ system(200 mL culture)

총 비용 $548 $1,531 $1,531

배지 비용 $458 $893 $893

Transfection 시약 비용

$0 $548 $548

예상 플라스미드 비용 $90 $90 $90

단백질 수율 차이* 1x 3x 5x

동등 단백질 수율의 배양 부피

1 L 335 mL 200 mL

대략적 배양 용기 비용† $59 $26 $18

동등한 단백질 수율에 대한 총 비용

$607 $536 $324

* Protein yields in each culture are expressed as normalized values, based on the amount obtained using 1 L of FreeStyle™ Expression Medium and polyethylenimine (PEI) as the transfection reagent.

† Disposable Erlenmeyer shake flasks, cost/unit: 500 mL, nonbaffled, vent cap: $18.00 1,000 mL, nonbaffled, vent cap: $25.81 3,000 mL, Fernbach-style, nonbaffled, vent cap: $58.51

Expi293™ Expression System에 대한 추가 정보는 lifetechnologies.com/expi293 을 참조하십시오.

FreeStyle™ 293Expi293™

200

800

1,000

0

400

600

1,200Expi293™ vs. FreeStyle™ 293 systems

1 mL in 24-well plate 30 mL in 125 mL flask 1 L in 3 L flask

Scale

Crip

to (µ

g/m

L)

15Life Technologies | GeneArt® Algae Engineering Kits

GeneArt® Algae Engineering Kits광합성 미세조류(microalgae)의 유전자 변형 및 발현 시스템Chlamydomonas reinhardtii 137c 및 Synechococcus elongatus

PCC 7942에 대한 GeneArt® Algae Expression & Engineering

Kit는 광합성 미세조류에 대한 최초의 상용 유전자 변형 및 발현

시스템입니다. 본사의 최신 조류 GeneArt® kit는 높은 수준의 단백질

발현에 최적화되어 있으며 검출 및 정제용 이중 단백질 태그를 가지고

Chlamydomonas에서 종종 관찰되는 침묵 유전자(gene silencing)

를 선택적으로 제거합니다(그림 11). 반면 본사의 1세대 조류 키트는

경로 조작 같은 강력한 발현이나 정상적으로 낮게 발현되는 돌연변이

유전자의 상보성으로 저해되는 어플리케이션에서 조류를 생성할 수

있는 유연한 유전자 조작 옵션을 제공하도록 설계되었습니다.

• 총 수용성 단백질의 >10%를 관심 유전자로 발현

• 여러 번의 계대배양에서도 Chlamydomonas에서 침묵 유전자 (gene silencing)를 선택적으로 제거

• 6xHis-TEV 또는 6xHis-V5 epitope 태그로 관심 유전자 검출 및 정제

0

20

40

60

80

100

120

140

160

pSyn_6-GUS pSyn_6-GUS-V5-6xHis

Rel

ativ

e G

US

activ

ity (O

D75

0)

그림 11. 단백질 발현 수준. (A) Trichoderma reesei에서 가수분해 효소 xylanase 유전자(Xyn1)가 벡터 pChlamy_4에 클로닝하여 Chlamydomonas reinhardtii 137C으로 형질전환하였습니다. Xylanase 활성을 EnzChek® Ultra Xylanase Assay Kit (Cat. No. E33650)로 측정하였는데 기존 시스템에서 관찰된 수준의 17.6배였습니다. (B) β-glucuronidase 유전자(GUS)를 벡터 pSyn_6에 클로닝한 후 권장 프로토콜에 따라 Synechococcus elongatus (GUS 활성에 대해 음성)로 형질전환하였습니다. GUS 활성 수준은 기존 시스템 보다 >100배 높았습니다.

A

B

1

501

1001

1501

2001

2501

1 2 3 4

Average

Xyla

nase

act

ivity

Protein exp. kitN-terminal tag

Protein exp. kitC-terminal tag

Genetic eng.N-terminal tag

Genetic eng.C-terminal tag


Versatility(활용성)이 최대인 두 가지 조류 균주

Chlamydomonas reinhardtii 137c 및 Synechococcus elongatus PCC7942는 광합성, 식물 생물학, 지질 대사 등의 연구에 사용하는 모델 조류입니다. 이들은 생물연료, 기능성 식품, 특수 화합물의 생물생산 플랫폼으로도 역할 합니다.

Chlamydomonas reinhardtii

• 광합성, 영양 관련 유전자 발현, 편모 운동성, 단백질 발현, 지질 대사 연구용 모델 조류

• 게놈 크기가 큰(121 Mb) 진핵 생물

• 빠른 성장

Synechococcus elongatus

• 광합성, 원핵생물 일주기(circadian rhythm), 영양 조절, 환경 반응, 지질 대사 연구용 모델 시아노박테리아(cyanobacteria)

• 게놈 크기가 작은(2.7 Mb) 원핵 생물

• 조작 용이

조류 발현 시스템에 대한 더 많은 정보는 lifetechnologies.com/algaeexpression 을 참조하십시오.

미세조류의 냉동 보관 및 형질전환에 최적화된 솔루션 GeneArt® Cryopreservation Kit for Algae를 사용해 조류 균주 및 클론을 –80°C에서 수 년 동안 보관할 수 있어 클론의 유지관리를 위한 일환으로 질소 보관과 지속 배양이 필요하지 않습니다. 또한, 본사의 MAX Efficiency® Transformation Reagent for Algae는 Chlamydomonas 종의 여러 균주에 대한 형질전환 효율을 높이도록 만들어졌습니다.

• Chlamydomonas 및 Chlorella 균주와 클론을 –80°C에서 보관 가능

• 액체 질소 보관 불필요

• 연속 배양에서 전형적으로 발생하는 오염 및 유전적 부동(genetic drift) 방지

• Chlamydomonas 균주의 형질전환 효율성 ≥100배 증가

17Life Technologies | Gateway® technology for multiple expression systems

Gateway® technology for multiple expression systems전형적인 제한 효소 클로닝 워크플로우에는 성공을 제한할 수 있는 많은 단계가 포함됩니다. 예를 들어, 특정 제한 효소는 관심 유전자를 잘라 삽입부를 절단하고 이후 발현에서 유전자를 쓸모 없게 만들 수 있기 때문에 사용할 수 있습니다. 제한 효소 클로닝에는 또한 추가적인 DNA 정제 단계가 필요하고 큰 분절의 클로닝에서 재조합 회수율이 낮으며 필요한 클론을 찾는데 시간이 많이 걸립니다.

Gateway® 클로닝 기술은 이런 문제를 없애 실제로 모든 발현 시스템에 접근할 수 있게 합니다(그림 12). Gateway® 재조합 기반 클로닝은 제한 효소, 연결효소(ligase), 추가 하위클로닝 단계나 여러 군집(colony)의 스크리닝 없이 1시간 내에 이루어지는 효율성이 99%인 가역적인 재조합 반응을 사용합니다. 출시 이후 연구 집단에 폭넓게 사용되고 1,500건 이상 인용된 Gateway® 기술은 여러 연구 분야의 공동 작업을 쉽고 편리하게 만들고 이들 연구 집단에서 여러 벡터에 접근할 수 있게 하여 진정한 다분야 과학 연구를 실현시킵니다. 그 외 Gateway® 기술의 장점은 다음과 같습니다.

• 바로 발현이 가능한 클론의 경우, 반응 후에도 삽입부의 방향 및 해독 프레임(reading frame)이 유지됩니다.

• Gateway® 반응 후 염기서열 재분석이 필요하지 않아 시간이 절약되고 일관적인 결과를 보장하는데 도움이 됩니다.

• Insert DNA를 한 발현 백터에서 다른 벡터로 이동시켜 활용도를 높이고 클로닝 워크플로우를 간편하게 합니다.

그림 12. Gateway® 클로닝 기술의 개요. Gateway® 기술은 부위 특이적 재조합을 통해 여러 벡터에 유전자를 쉽게 클로닝할 수 있게 합니다. 유전자가 삽입 클론(entry clone)에 클로닝되면 이 DNA 분절을 하나 이상의 목표 벡터(destination vector)에 옮길 수 있습니다.

DNA fragments from:

Polymerasechain reaction

Restrictionendonuclease

digestion and ligationcDNA library

Gene

E. coli

Gene

Your vector

Gene

Two-hybrid

Gene

Entry clone

Gene

Yeast

Gene

Insect

Gene

Mammalian

더 많은 내용은 lifetechnologies.com/gateway을 참조하십시오.


더 많은 내용은 lifetechnologies.com/G2Pservice를 참조하십시오.

Protein production services포유류 세포로부터의 신속하고 신뢰할 수 있는 단백질 생산

짧은 기간에 원하는 단백질을 받아 볼 수 있는 가장 편리한 서비스

그리고

in-house work에 사용할수

있는 발현 벡터에 삽입된 최적화된

유전자

• 시간 절약: 유전자 합성부터 단백질 발현까지 영업일 기준 30일이면 완료

• 자체 생산 시스템 : 유전자 합성부터 단백질 정제까지 자체 생산 시스템 구축

• 믿을수 있고 향상된 발현 시스템: FreeStyle™ 293, Expi293™과 FreeStyle™ CHO와 더불어 모든 제품을 구매 가능함

• 1mL에서 20 L까지의 생산 규모: Shaker와 WAVE cell culture를 이용하며 큰 규모의 프로젝트 수행 경험

• 간편하면서도 편리한 주문 시스템: 완벽한 질의 응답 및 하나의 통합된 메일 계정으로 주문 가능

• 헌신적이고 경험이 많은 PMO팀: 모든 과정에 대해 쉽게 확인이 가능

완전한 서비스Gene to protein

향상된 성능

편리함

GeneArt® Genes-to-Proteins 서비스는 일시적으로 transfection된 포유류 세포에서 올바르게 folding된 native 단백질을 얻을 수 있는 매우 빠른 방법입니다. 뉴클레오티드 염기서열에서 시작하여 영업일 30일 내에 정제된 단백질을 제공할 수 있습니다(그림 13). 발현에 최적화된 유전자를 본사 발현 벡터 중 하나에 클로닝하여 transfection grade의 플라스미드 DNA를 생성한 후 본사의 첨단 발현 시스템을 사용해 높은 발현 수율을 얻을 수 있습니다. 그리고 친화 크로마토크래피를 이용해 분비 또는 세포 내 단백질을 정제합니다(예: Fc tag, His tag). 고정제 단백질이 필요하다면 추가 정제 단계를 이용할 수 있습니다. 모든 정제 단백질에 Coomassie- stained PAGE gel 및 western blot 등을 포함한 자세한 문서가 제공됩니다. 각 프로젝트에 대상 단백질과 이입에 사용되는 발현 벡터가 제공됩니다. 이 서비스에 대한 자세한 정보는 표 5를 참조하십시오.

그림 13. GeneArt® Genes-to-Proteins service의 장점.

13-11-28 Protein Expression Se...

19Life Technologies | Protein production services

표 5. 단백질 생산 서비스 요약.

서비스 설명 제공물

Genes-to-proteins pilot 일시적 발현(transition exppressed)된 293 또는 CHO 세포에서 생산 수율 측정을 위한 타당성 시험

• 고객이 규정한 단백질 양의 생성에 대한 가격 견적서

• Coomassie gel 및 western blot을 포함한 문서 • 정제 단백질

Genes-to-proteins purification

고객이 요청한 배양 규모에서 일시적 발현(transition exppressed)된 293 또는 CHO 세포의 배양물에서 단백질 발현 및 정제

• 명시된 배양 용적으로부터 정제된 모든 단백질 (또는 배양 상층액 또는 세포)

• Coomassie gel 및 western blot을 포함한 문서

Genes-to-proteins complete

일시적 발현(transition exppressed)된 293 또는 CHO 세포를 이용하여 고객이 요청한 단백질 용량의 발현 및 정제 Pilot 서비스 필수

• 명시된 정제 단백질 양• Coomassie gel 및 western blot을 포함한 문서

IL-2x only opt

Wild type Optimized

Rel

ativ

e ex

pres

sion

그림 14. 유전자 최적화로 개선된 단백질 발현. (A) 야생형과 최적화된 IL-2 구조의 3가지 독립적 이입을 western blot으로 분석하였습니다. (B) 얻어진 밴드를 농도계(densitometry)로 분석하였습니다. 출처: Fath et al., 2011; 7쪽의 그림 4 참조.

B라이프 테크놀로지스의 GeneArt® 발현 최적화와 첨단 발현 시스템(예: Expi293™)을 함께 사용하면 최적화되지 않은 유전자에서 얻을 수 있는 수준보다 높은 프로젝트 신뢰도와 발현 수율을 얻을 수 있습니다(그림 14).

추가 정보나 견적 문의는 [email protected] 으로 이메일을 보내주십시오.

A

Mock Wild type OptimizedkDa

çIL-2

20-

15-

1 2 3 1 2 3


wild type GVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFIC TF58AF59AF60AF61A

GVVPILVELDGDVNGH KASVSGEGEGDATYGKLTLKFICTGVVPILVELDGDVNGHK FAVSGEGEGDATYGKLTLKFIC TGVVPILVELDGDVNGHKF SASGEGEGDATYGKLTLKFIC TGVVPILVELDGDVNGHKFSV AGEGEGDATYGKLTLKFIC T

50 60 70 80

wild type GVVPILVELDGDVNG HKFSVSGEGEGDATYGKLTLKF ICTF58AF58CF58DF58E

GVVPILVELDGDVNG HKASVSGEGEGDATYGKLTLKF ICTGVVPILVELDGDVNGH KCSVSGEGEGDATYGKLTLKFI CTGVVPILVELDGDVNGH KDSVSGEGEGDATYGKLTLKF ICTGVVPILVELDGDVNGHK ESVSGEGEGDATYGKLTLKF ICT

50 60 70 80

GVVPILVELDGDVNGH KXXVSGXGEXXATYGKLTLKFIC TGVVPILVELDGDVNGH KRQVSGGGEGDATYGKLTLKFIC TGVVPILVELDGDVNGH KAGVSGEGEGDATYGKLTLKFIC TGVVPILVELDGDVNGH KIYVSGLGEGDATYGKLTLKFIC TGVVPILVELDGDVNGH KLKVSGPGEGDATYGKLTLKFIC T

50 60 70 80

wild typepeer A01peer A02peer A03peer A04

wild type GVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLXXIC Tpeer A01peer A02peer A03peer A04

GVVPILVELDGDVNGHK FTVSGEGEGDATYGKLTLLKIC TGVVPILVELDGDVNGH KTSVSGEGE DDATYGKLTLIGICTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSG AGEGDATYGKLTLQDIC TGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEG YATDGKLTLLPIC T

50 60 70 80

GVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGD ATYGKLTLKFICTVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFI CT

GVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLT LKILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLK FI

DGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLK

50 60 2702 80

wild typepeer A01peer A02peer A03peer A04

Creating improved proteins GeneArt® Directed Evolution인위적 진화(Directed evolution) 전략은 개선된 또는 새로운 속성을 갖는 단백질을 생성할 수 있는 가장 효율적인 방법입니다. GeneArt® Directed Evolution 기술은 목표 지향적인 체계적 과정으로 단백질을 진화시킵니다

Site-directed mutagenesis기존 DNA 염기서열에 단일 또는 다중 돌연변이(치환, 삽입 또는 결실)를 도입합니다.장점: 염기서열이 모두 검증된 클론, 원치 않는 원형주(backbone) 돌연변이 없음, 가장 빠른 전환 시간어플리케이션: 융합 단백질, 태그 단백질, 대체 스플라이스(splice) 형태 및 alanin scan으로 구성

Site-saturation mutagenesis부위 포화 돌연변이(site-saturation mutagenesis) 별로 단백질 영역을 스캔하여 기능 증강을 위해 모든 유익한 치환부를 파악합니다.장점: 최고의 비용 효율성, 단백질 개선을 위한 구조 데이터 불필요 어플리케이션: 산업용 단백질 개선 및 단백질에서 특허 염기서열 제외

Combinatorial libraries선택된 부위에 대해서만 정의된 무작위화를 실시하는 매우 합리적인 설계로 최고의 프레임워크 완전성을 제공합니다.장점: 최저 보조 돌연변이율, 최고의 다양성 어플리케이션: 재조합 항체 라이브러리, 프로모터 라이브러리, 부위 지정 돌연변이로 파악된 치환부 결합 구성

Controlled randomization libraries재조합 항체 라이브러리, 프로모터 라이브러리, 부위 지정 돌연변이로 파악된 치환부 결합 구성장점: 돌연변이율의 정확하고 정밀한 조정 및 완전 개방 무작위화 어플리케이션: 항체의 친화도 성숙, 산업용 효소 개선, 효소의 거울상 선택성(enantioselectivity) 조작

Truncation libraries최대 40,000개의 in-frame 절단 구조를 갖는 사용자 지정 군집 생성장점: Out-of-frame 돌연변이를 방지해 고품질 보장 어플리케이션: 용해도 스크리닝, 최소 기능 크기 평가, 영역 식별, 저해요인 스크리닝, epitope 맵핑

더 많은 정보는 lifetechnologies.com/directedevolution을 참조하십시오.

21Life Technologies | Creating improved proteins

Notes: ________________________________________________________________________________________________

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For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. ©2013 Life Technologies Corporation. All rights reserved. The trademarks mentioned herein are the property of Life Technologies Corporation and/or its affiliate(s) or their respective owners. CO34472 1213

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대한 민국 Tel: 02-2023-0600 Fax: 02-2023-0603 E-mail: [email protected]

gene to protein 핸드북 - thermo fisher scientific · 화합물의 우수한 실험 대조 ......

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