Gelová permea ční chromatografie

•separace molekul na základě molekulové hmotnosti, velikosti a tvaru molekuly

•stacionární fáze – gel (obvykle prokřížený cukr)

•velké molekuly se eluují dříve, malé molekuly se eluují později

•možnost stanovení molekulových hmotností

•odstraňování nízkomolekulárních sloučenin (odsolování)

Typický elu ční diagram

Vt

V0

Vt V0 Vt – V0

mobilní fáze stacionární fáze

0

0

VV

VVK

t

eav −

−=gelut

e

s

ed VVV

VV

V

VVK

−−−=−=0

00

eV

VR 0=

Vliv tvaru molekuly

Kalibrace

•eluční čas (eluční objem) standardů je vynesen v závislostina molekulové hmotnosti•kolona by měla být pravidelně kalibrována•stálý průtok•kolona separuje podle velikosti ne molekulové hmotnosti,proto je získaná molekulová hmotnost jen relativní

Kalibra ční křivka

A28

0nm

Ve/Vt

Vztah mezi velikostí částic a rozlišením

VELIKOST ČÁSTIC [µµµµm]

Coarse 100–300Medium 50–150Fine 20–80Superfine 10–40

Vztah mezi velikostí částic a pr ůtokem

Vztah mezi rozlišením a objemem vzorku

Rozlišení

221 ww

VR e

+∆=

eV∆

1w 2w

objem nanášeného vzorku [% Vt]

ideální objem nanášeného vzorku ~ 1 - 2 %

konc

entr

ace

čas

zvyšováníprůtoku

snižovánídélky

průtok[ml/min]

výška kolony [cm]

Vztah mezi rozlišením, pr ůtokem a délkou kolony

krátká a silnákolona

dlouhá a tenkákolona

silná kolona nemá dostačující rozlišení

ale má lepší průtok a kapacitu

Tvar kolony

Stacionární fáze

Pharmacia

Bio-Rad

Sephadex glukosa (dextrosa)Sepharose agarosaSephacryl glukosa + akryamidSephacel cellulosa

FPLCSuperoseSuperdex

BioGel P akrylamidBioGel A agarosa

pór

glukosovájednotka

Sephadex

Vlastnosti Sephadexu

malé proteiny

cross- linkN, N´-methylen bis-akt ŕylamid

Sephacryl HR

Ve [ml]

Sepharose

Sepharose CL

LSepharoseCpanoldibromoproSepharose NaOH →−+ 3,2

•lepší teplotní a chemická stabilita•extrémě malé množství ionizovatelných skupin

Sephadex

Sephacryl

velké proteiny

rozsah ~ 10000 - 10000000

Superose

prokřížená poresní agarosa

Bio -Gel P

Bio-Gel P gely – poresní polyakrylamidové částice vzniklé kopolymerací akrylamidu a N,N'-methylene-bis-akrylamidu.•extremě hydrofilní•nenabité

Bio-Gel A gely – agarosa•minimalní nespecifické interakce•výborné průtokové vlastnosti

Bio -Gel A

Použití gelové permea ční chromatografie

vysoké rozlišení skupinová separace

separace molekul na základě velikosti (tvaru)

odsolení

vhodná jako závěrečný krok purifikace

výměna pufru

separace polymerů od monomerů

odstranění vysokomolekulárních a nízkomolekulárních látek

separace denaturovaných forem proteinů od nativních

Experiment

vysoké rozlišení skupinová separace

stacionární fáze

výběr podle frakcionačního rozsahu lepší strmá selektivitapro úzké píky malé částice

Sephadex G-25

kolona dlouhá a tenká kolona30-100 cm

nezáleží na délce kolony

mobilní fáze kompatibilní, střední iontová síla kompatibilní

průtok nižší průtok i střední průtok

objem vzorku 0,5 - 5% objemu kolony až ¼ objemu kolony

Před purifikací:•zkontrolujte viskozitu vzorku •zfiltrujte nebo odstřeďte vzorek

Pro zvýšení rozlišení: 1. optimální frakcionační rozsah 2. co nejmenší objem vzorku 3. co nejmenší částice gelu (x průtok)4. dvě kolony do série5. snížit průtok

Nespecifická adsorbcevzácně na agarosu a dextranpokud Kav > 1 iontové nebo hydrofobní interakce •pufr > 0.05M NaCl •Hydrofobní interakce - 25% acetonitrile, EtOH nebo isopropopanol, 10% etyleneglycol

Ionexová chromatografie

• Určena pro separaci látek nesoucích kladný nebo záporný náboj

• Afinita iontů k ionexu závisí na velikosti náboje

• V případě proteinů hraje zásadní roli pH !

Princip ionexové chromatografie

Ionexy

• Katexy – záporný náboj � vazba kationtůAnexy – kladný náboj � vazba aniontů

0,1 M NaOH

Q Sepharosa

silný anex

Nosiče

•polystyren – Amberlit, Dowex

•celulosa – X-Sephacel

•dextran – X-Sephadex

•prok řížená agarosa – X-Sepharosa

•syntetické polymery – MonoBeads, MiniBeads (Q, S)

X-Sepharosa

Sepharose High Performance (34 µm), Sepharose Fast Flow (90 µm), Sepharose Big Beads (100 – 300 µm), Sepharose CL-6B (90 µm, lepší chemická a fyzikální stabilita)

Vzorek: 0,8 mg cytochrom C (pI 10,3)0,8 mg lysozym (pI>11)3 mg ribonukleasa A (pI 9,3)

Startovací pufr: 20mM fosfátový pufr pH 6,8Eluční pufr: 20mM fosfátový pufr pH 6,8+0,5 M NaClPrůtok: 1 ml/minKolona: 1mlPrůběh separace:

ekvilibrace – 20 ml startovacího pufruaplikace vzorku – 2 mlpromytí - 5 ml startovacího pufrueluce – 40 ml, lineární gradient, 0-100 % elučního pufru

Vzorek: 0,8 mg α-laktoglobulin (pI 5,8)0,4 mg conalbumin (pI 6,3)1,2 mg trypsin inhibitor (pI 4,5)

Startovací pufr: 20mM Tris/HCl pH 7,4Eluční pufr: 20mM Tris/HCl pH 7,4 + 0,5 M NaClPrůtok: 1 ml/min (150cm/h)Kolona: 1mlPrůběh separace:

ekvilibrace – 20 ml startovacího pufruaplikace vzorku – 2 mlpromytí - 5 ml startovacího pufrueluce – 40 ml, lineární gradient, 0-80 % elučního pufru

Údaje od výrobce

MonoBeads, MiniBeads (Q, S)

vysoké rozlišeníMiniBeads – mikropurifikace, analysa

vyšší pracovní tlak – FPLC/HPLCMonoBeads -FPLC

Rozlišení

Vzorek: pankreatinEluce: gradient iontové síly

Výběr vhodného pH pro ionexovou chromatografii

Eluční gradient

pH gradient

gradient iontové síly – lineární x skokový

Vliv strmosti gradientu

Vliv elu čního objemu

Koncentra ční efekt

Alfa-amylasová aktivita byla měřena s využitím rozpustného škrobu jako substrátu a produkty reakce byly detekovány reakcí s dinitrosalicylovou kyselinou. Reakční směs obsahovala 0,2 ml enzymu, 0,3 ml 1% škrobu a 0,5 ml 50 mM Tris pufru pH 8,2. Reakce probíhala 1 minutu při 37 °C a byla ukon čena přídavkem 4ml dinitrosalicylové kyseliny. Směs byla povařena 5 minut. Absorbance výsledných produktů při 530 nm byla 1,235 v 1cm kyvetě. Vypočítejte aktivitu amylasy.

y = 0,1107xR² = 0,9672

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

0 2 4 6 8 10 12

A 5

30nm

koncentrace glukosy / mmol/l

Kalibrace postup: Byla připravena koncentračnířada glukosy (2, 4, 6, 8, 10mM glukosa) a 1ml byl smíchán se 4 ml dinitrosalicylovékyseliny. Směs byla povařena 5 minut.Absorbance výsledných produktů bylaměřena při 530 nm.

Vypočítejte aktivitu malátdehydrogenasy. Reakční směs obsahovala0,5 ml NAD+ (100mM), 0,5 ml malátu (200 mM), 1 ml enzymovéhopreparátu (konc. bílkovin 1,5 mg/ml) a 2 ml pufru (100 mM Tris, pH7,5). Reakce probíhala při teplotě 37 °C a byl sledován přírůstekabsorbance při 340 nm. Po 5 minutách vzrostla absorbance z 0,2 na1,45. Vypočítejte celkovou a specifickou aktivitu malátdehydrogenasyv enzymovém preparátu. (ε=6220 l/mol/ cm). Měření absorbanceprobíhalo v jednocentimetrové kyvetě a všechny substráty byly vreakční směsi v nadbytku.

Chromatofokusace

• separace protein ů na základ ě jejich pI• vysoké rozlišení

• není pot řeba připravovat pH gradient• zaost řovací efekt• jednoduchost

Polypufry - amfolyty

Polybuffer 96 - pH 9-6Polybuffer 74 - pH 7-4

Pharmalyte - pH 8-10,5

Stacionární fáze

PBE94

PBE118

Princip fokusace

MonoP Beads – směs kvartérních a terciálních aminů

Dvoudimension ální chromatografieBeckman Coulter – PF 2D

pH

frakce

hydr

ofob

icita

Dvoudimension ální chromatografie