g z - science.ncagp.ruscience.ncagp.ru/upfiles/pdf/diss_saveljevaem.pdf · 1 f b g b k l ? j k l...
TRANSCRIPT
1
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ
РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
федеральное государственное бюджетное учреждение
«НАУЧНЫЙ ЦЕНТР АКУШЕРСТВА, ГИНЕКОЛОГИИ
И ПЕРИНАТОЛОГИИ ИМЕНИ АКАДЕМИКА В.И. КУЛАКОВА»
На правах рукописи
САВЕЛЬЕВА
Елена Маратовна
ОПТИМИЗАЦИЯ ТАКТИКИ ВЕДЕНИЯ ЛЮТЕИНОВОЙ ФАЗЫ
В ПРОГРАММЕ ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНОГО ОПЛОДОТВОРЕНИЯ
С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ АГОНИСТА ГОНАДОТРОПИН—РИЛИЗИНГ
ГОРМОНА
14.01.01 — Акушерство и гинекология
Диссертация на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Научные руководители:
доктор медицинских наук
С.Г. Перминова
доктор медицинских наук
Т. А. Демура
Москва 2016
2
ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ……………………………………………………………………………………....5
Глава 1. СОВРЕМЕННЫЕ ПОДХОДЫ К ВЕДЕНИЮ ЛЮТЕИНОВОЙ ФАЗЫ В
ПРОГРАММЕ ЭКСТАКОРПОРАЛЬНОГО ОПЛОДОТВОРЕНИЯ (ОБЗОР
ЛИТЕРАТУРЫ)…………………………………………………………………………………14
1.1. Лютеиновая фаза……………...………………………....……………………………...14
1.2. Причины недостаточности лютеиновой фазы………………………………………...16
1.3. Частота встречаемости недостаточности лютеиновой фазы…………........................17
1.4. Препараты применяемые для поддержки лютеиновой фазы ……………........……18
1.4.1. Препараты прогестерона …………………..………………………………………...…..18
1.4.2. Препараты эстрогенов ……………………………..………………………………...…..21
1.4.3. Препараты хорионического гонадотропина человека ………...……............................23
1.5. Возможность применения препаратов aGnRH для поддержки лютеиновой фазы в
программе ЭКО…………………..……………………………………………………..25
1.6. Механизм действия aGnRH в лютеиновую фазу стимулированного цикла ……….30
1.5.1. Влияние aGnRH на эмбрион……………………………..…..……………………...….30
1.5.2. Влияние aGnRH на желтое тело………..………………..…..…………………………32
1.5.3. Влияние aGnRH на эндометрий………..………………..…..…………………………33
1.5.4. Безопасность применения aGnRH для поддержки ЛФ в программе
ЭКО……………………………………………………...……………………….........................34
Глава 2. МАТЕРИАЛА И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Материал исследования………………………………………….………………………..37
2.2. Методы исследования…………………………………………….…….………………....40
2.2.1 Общеклинические методы исследования………………..…….………………………..41
2.2.2 Гинекологическое обследование………………………………..……………………….42
2.2.3 Лабораторные и инструментальные методы исследования……...................................43
2.2.4 Гормональное исследование…………………………………………………………......43
2.2.5 Ультразвуковое исследование органов малого таза.......................................................45
2.2.6 Спермиологическое исследование эякулята.................................................................46
2.2.7 Специальные методы исследования. Морфологическое исследование
функционального слоя эндометрия……………………………...……………………………46
2.2.8 Иммуногистохимическое исследование эндометрия………………….......................47
2.2.9 Молекулярно–генетические методы исследования……………………………………48
2.2.10 Протокол стимуляции функции яичников…………………………………………….51
2.2.11 Трансвагинальная пункция яичников………………..……….…………......................52
3
2.2.12 Эмбриологический этап, перенос эмбрионов и посттрансферный период программы
ЭКО/ICSI ...…………………..……………………....................................................................53
2.3. Статистический анализ полученных результатов……………………………………….54
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1 Клинико–анамнестическая и лабораторная характеристики пациенток.......................57
3.1.1 Перенесенные заболевания ...…………………..……………………............................57
3.1.2 Менструальная функция обследованных пациенток...……………………………..…61
3.1.3 Репродуктивный анамнез...…....……………….………………………………………..61
3.1.4 Ранее проведенное лечение бесплодия ...…....……………….………………………...61
3.1.5 Гормональные параметры исследуемых пациенток…………………………………..62
3.2 Сравнительный анализ исходных клинико–анамнестических показателей в
зависимости от режима ведения лютеиновой фазы……………..…………………………...63
3.2.1 Возрастная характеристика пациенток………………………….................................63
3.2.2 Менструальная функция обследованных пациенток…….…………….......................64
3.2.3 Репродуктивный анамнез пациенток………………….………....................................65
3.3. Результаты оценки морфофункционального состояния и имплантационного
потенциала эндометрия пациенток……………………………………………………………67
3.3.1 Морфологическая характеристика эндометрия……………………….......................67
3.3.2 Иммуногистохимическое исследование эндометрия…………………........................68
3.3.3 Оценка экспрессии LIF в ткани эндометрия у пациенток с бесплодием и фертильных
женщин………………………………………………………………………………………….70
3.3.4 Оценка экспрессии GnRH и GnRHR в ткани эндометрия в «окно имплантации»
естественного цикла у пациенток с трубно–перитонеальным фактором бесплодия и
фертильных женщин…………………..………………...........................................................72
3.3.5 Оценка экспрессии HOXA 10 в ткани эндометрия у пациенток с бесплодием и
фертильных женщин…………………………………………………………………………...78
3.4 Сравнительный анализ параметров индуцированного цикла и исходов программы ЭКО
при комбинированном режиме и стандартном режиме поддержки лютеиновой
фазы……………………….……………………………………………………………………..82
3.4.1 Сравнительный анализ основных параметров цикла и эмбриогенеза
индуцированного цикла……………………….………………………….……………………82
3.4.2 Клинические исходы программы ЭКО в зависимости от режима ведения
ЛФ…………………………………………………………………...…………………………...85
3.5 Механизм влияния aGnRH в лютеиновую фазу стимулированного цикла в программе
ЭКО………….……….…………....………....……....………………………………………….86
4
3.5.1 Анализ базальных концентраций сывороточных гормонов пациенток включенных в
исследование, в зависимости от режима поддержки лютеиновой фазы……………………87
3.5.2 Анализ гормональных параметров лютеиновой фазы в зависимости от режима
поддержки лютеиновой фазы ………….……………………………...................................88
3.5.3 Анализ гормональных параметров лютеиновой фазы у пациенток с наступившей
беременностью в зависимости от режима поддержки лютеиновой фазы …………………90
3.5.4 Определение уровня ХГч у пациенток с наступившей беременностью в зависимости
от режима поддержки лютеиновой фазы …………………………………….......................93
3.5.5. Анализ влияния aGnRH в лютеиновую фазу программы ЭКО на имплантационный
потенциал и рецептивность эндометрия……...........................................................................95
3.6. Ассоциация полиморфизма исследуемых генов с частотой наступления беременности
в зависимости от режима ведения лютеиновой фазы………………………….…………...98
Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ ….…………….…………….109
ВЫВОДЫ……………………………………………………………………………………...123
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ……………………………………………………..126
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ………………………………………………………….……….128
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ………..…………………………………………………………...131
5
ВВЕДЕНИЕ
АКТУЛЬНОСТЬ ТЕМЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Распространенность бесплодия среди супружеских пар детородного
возраста в разных регионах России составляет от 10% до 15% и тенденции к
снижению этого показателя не наблюдается [8]. Таким образом, проблема
бесплодия приобретает не только медицинское, но и социально–
демографическое значение [3]. В связи с этим все большее распространение
получает метод лечения бесплодия путем экстракорпорального
оплодотворения (ЭКО) и переноса эмбрионов (ПЭ). Повышение
эффективности методов вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ)
является актуальной задачей современной репродуктивной медицины. Более
80 млн пар по всему миру прибегают к лечению методом ВРТ, но, несмотря
на многочисленные исследования в этой области, эффективность одной
попытки ЭКО не превышает 33%, а частота родов живым плодом 24,8%
[110,60]. Таким образом, неуклонно растет потребность во ВРТ, для развития
которых, необходимы разработки новых наиболее эффективных и
безопасных подходов [13]. В качестве одной из причин неудач программы
ЭКО предполагают потери на этапе имплантации эмбриона. Это связывают с
тем, что методы ВРТ оказывают отрицательное влияние на раннее
функционирование желтого тела. По данным литературы, недостаточность
лютеиновой фазы (ЛФ) в циклах ВРТ развивается в большинстве случаев в
протоколах с аналогами гонадотропин–рилизинг гормона (GnRH) и
проявляется подавлением секреции лютеинизирующего гормона (ЛГ)
аналогами GnRH, что может приводить к неудачам имплантации [92].
Таким образом, ожидаемый результат лечения методом ЭКО в
значительной степени зависит от эффективности проводимой поддержки ЛФ,
являющейся интегральным этапом программы ЭКО. В настоящее время для
восполнения недостаточности ЛФ используются различные режимы ее
6
поддержки, включающие препараты прогестерона (Р), хорионического
гонадотропина человека (ХГч), эстрадиола (E2) [77,84,85]. В Кокрановском
систематическом обзоре с включением 69 исследований и участием 16 327
женщин (Cochrane Database Syst. Rev., 2011) отмечен значительный эффект
препаратов Р и не доказано улучшения исходов ВРТ при добавлении к
препаратам Р препаратов эстрогенов и ХГч [84], аналогичные данные были
опубликованы в недавнем Кокрановском систематическом обзоре 2015г. [85].
Кроме того, было отмечено, что использование препаратов ХГч для
поддержки ЛФ ассоциировано с более высоким риском развития синдрома
гиперстимуляции яичников (СГЯ) [84,96,97].
На сегодняшний день не существует идеального режима поддержки
ЛФ в циклах ВРТ. В связи с этим обсуждаются индивидуальные особенности
рецептивности эндометрия женщин с бесплодием, проводятся попытки
идентифицировать профиль экспрессии генов, ответственных за
трансформацию эндометрия в «окно имплантации», который мог бы быть
полезным прогностическим инструментом для пациенток ЭКО с повторными
неудачами имплантации [54]. Кроме того, изучаются полиморфизмы генов,
которые участвуют в ответе яичников на стимуляцию суперовуляции и могут
влиять на адекватность течения ЛФ в программе ЭКО [104].
В последние годы появились работы, в которых было показано
существенное повышение частоты имплантации, клинической беременности,
развивающейся беременности и частоты родов живым плодом при
добавлении к стандартному режиму поддержки ЛФ микронизированным Р
препаратов агониста GnRH (aGnRH) [84]. Положительные эффекты aGnRH
для поддержки ЛФ циклов ВРТ отмечены в протоколах как с aGnRH, так и с
антагонистами GnRH (antGnRH) [84,85].
Механизм действия препаратов aGnRH в ЛФ стимулированного цикла
не вполне ясен и, в соответствии с представленными гипотезами, может
реализовываться на различных уровнях. Согласно одной из гипотез, aGnRH
осуществляет поддержку желтого тела через центральные механизмы,
7
стимулируя секрецию ЛГ гонадотрофами гипофиза, согласно другой –
воздействуя прямо на эндометрий через локальную экспрессию рецепторов
GnRH [24]. Было также показано, что назначение aGnRH в ЛФ повышает
частоту наступления беременности в циклах донации ооцитов у реципиентов
с подавленной овуляцией и отсутствием желтого тела, что предполагает
прямое влияние aGnRH на эмбрион [126]. В работе Tesarik et al. (2006) в
группе пациенток с комбинированным режимом поддержки ЛФ были
зафиксированы более высокие уровни Р и Е2, что свидетельствует в пользу
теории о действии aGnRH на желтое тело, а увеличение уровня ХГч
свидетельствует о его возможном влиянии на эмбрион [24]. Напротив, Ata и
Urman (2010), оценивая эффективность циклов с использованием
однократной дозы aGnRH на 6 – й день после оплодотворения в дополнение
к стандартной поддержке ЛФ, отметили достоверное снижение частоты
имплантации и частоты прогрессирующей беременности в группе пациенток
с комбинированным режимом поддержки ЛФ по сравнению с пациентками
использовавшими стандартный режим поддержки ЛФ [23]. В другом
исследовании Hugues et al. (2006) в протоколах с antGnRH не выявили
различий в гормональном профиле пациенток в ЛФ индуцированных циклов
с использованием для поддержки ЛФ однократной дозы aGnRH на 6–й день
после ЭКО и интрацитоплазматической инъекции сперматозоида в ооцит
(ICSI) по сравнению с контрольной группой [18].
Несмотря на обнадеживающие результаты адъювантного применения
препаратов aGnRH для поддержки ЛФ в ряде публикаций, недостатками этих
работ являются гетерогенность выборок, различные режимы поддержки ЛФ в
группах сравнения, а также отсутствие ясности в механизме влияния
обсуждаемого режима поддержки ЛФ циклов ВРТ.
В связи с вышесказанным, представляется актуальным, современным и
перспективным является изучение эффективности комбинированного метода
поддержки ЛФ, механизмов его действия, а так же разработка
персонифицированного подхода к ведению ЛФ программы ЭКО в
8
зависимости от клинико–лабораторных, иммуногистохимических и
молекулярно – генетических предикторов, чему и посвящено данное научное
исследование.
Цель исследования: повышение эффективности программы ЭКО
путем усовершенствования режимов ведения лютеиновой фазы с
использованием агониста гонадотропин–рилизинг гормона на основании
оценки иммуногистохимических и молекулярно – генетических предикторов.
Задачи исследования:
1. Изучить клинико–анамнестические данные и лабораторные параметры
пациенток, включенных в исследование.
2. Оценить морфологические и иммуногистохимические параметры
эндометрия пациенток с бесплодием в «окно имплантации» в цикле,
предшествующем программе ЭКО с исследованием зрелых пиноподий,
LIF, PR, ER, а также GnRH, GnRHR и HOXA10.
3. Провести сравнительный анализ исходов программы ЭКО (частоты
имплантации, клинической, развивающейся беременности, родов
живым плодом) при различных режимах ведения лютеиновой фазы.
4. Уточнить таргетный механизм влияния aGnRH, используемого в
посттрансферном периоде программы ЭКО, на основании оценки
гормональных параметров лютеиновой фазы (Р,Е2,ЛГ), уровня ХГч и
показателей рецептивности эндометрия (экспрессия GnRH, GnRHR,
HOXA 10).
5. Провести анализ эффективности программ ЭКО при использовании
стандартного и комбинированного режимов поддержки ЛФ в
зависимости от полиморфизма генов рецептора
фолликулостимулирующего гормона (FSHR), лютеинизирующего
гормона (LHR), эстрадиола (ESRs) и прогестерона (PGR).
6. Разработать прогностическую модель персонификации назначения
комбинированного режима поддержки в лютеиновую фазу программы
9
ЭКО и алгоритм подбора оптимального режима ведения лютеиновой
фазы в программе ЭКО на основании выявленных,
иммуногистохимических и молекулярно–генетических предикторов.
Научная новизна
Проведена оценка эффективности комбинированного режима ведения
лютеиновой фазы (aGnRH в сочетании с микронизированным Р) программы
ЭКО в сравнении со стандартным режимом (микронизированным Р).
Доказано, что применение комбинированного режима поддержки ЛФ
повышает частоту наступления беременности в протоколах с antGnRH
программы ЭКО.
Впервые проведено исследование иммуногистохимической экспрессии
GnRH и GnRHR в эндометрии пациенток с бесплодием с целью оценки его
рецептивности и установлено снижение данных параметров в период «окна
имплантации» у женщин с трубно – перитонеальным фактором бесплодия и
неудачными попытками ЭКО в анамнезе. Определены диагностические
возможности GnRH и GnRHR как маркеров рецептивности эндометрия.
Установлено позитивное влияние комбинированного режима поддержки
(aGnRH +микронизированный Р) в ЛФ программы ЭКО на рецептивность
эндометрия.
Получены свидетельства действия aGnRH на желтое тело через
центральные механизмы, путем стимуляции секреции ЛГ гонадотрофами
гипофиза. Сформулирована гипотеза о связи эффективности поддержки
лютеиновой фазы aGnRH с повышенной чувствительностью рецептора ЛГ.
Впервые изучено сочетанное влияние полиморфизма генов FSHR, PGR и
LHCGR на эффективность программы ЭКО при различных режимах ведения
ЛФ. Впервые выявлены молекулярно–генетические предикторы, влияющие
на эффективность программы ЭКО при различных режимах поддержки ЛФ.
Впервые выявлены благоприятные генотипы для назначения стандартного и
10
комбинированного режимов поддержки ЛФ. Создана прогностическая модель
неудачи программы ЭКО на основании молекулярно–генетических маркеров.
Практическая значимость
В результате проведенного исследования определена целесообразность
добавления препарата aGnRH для поддержки ЛФ на 6–й день после
оплодотворения in vitro в стимулированных циклах программы ЭКО.
Исследование экспрессии GnRH, GnRHR и НОХА10 в эндометрии в «окно
имплантации» у пациенток с бесплодием может быть рекомендовано в
качестве значимых маркеров рецептивности эндометрия. Отмечено
существенное увеличение частоты наступления беременности у пациенток с
комбинированным режимом поддержки ЛФ. Показано, что у женщин со
сниженной рецептивностью эндометрия назначение комбинированного
режима поддержки ЛФ существенно повышает частоту наступления
беременности в программе ЭКО.
Представлены практические рекомендации по поддержке ЛФ
программы ЭКО у пациенток в зависимости от генотипа и
иммуногистохимических показателей, позволяющие оптимизировать и
индивидуализировать программы ВРТ с точки зрения предиктивной
медицины.
Создана прогностическая модель персонификации назначения
комбинированного режима поддержки ЛФ стимулированного цикла в
зависимости от иммуногистохимических и молекулярно–генетических
предикторов.
Положения, выносимые на защиту
1. У пациенток с трубно–перитонеальным фактором бесплодия при
нормальных параметрах овариального резерва и наличии секреторной
трансформации эндометрия выявлены нарушения имплантационных свойств
эндометрия, что проявляется уменьшением количества зрелых пиноподий,
11
снижением экспрессии LIF, дисбалансом РR и ER, а также снижением
экспрессии GnRH, GnRHR, HOXA 10.
2. При сопоставимых исходных клинико–лабораторных
характеристиках, параметрах стимулированного цикла, оогенеза и раннего
эмбриогенеза использование комбинированного режима поддержки
лютеиновой фазы (агонист гонадотропин–рилизинг гормона в сочетании с
микронизированным прогестероном) оказывает более позитивное влияние на
исходы программы ЭКО по сравнению со стандартным режимом
(микронизированным прогестероном), что подтверждается повышением
частоты имплантации в 1,8 раза, клинической беременности – в 1,5 раза,
прогрессирующей беременности – в 1,8 раза, частоты родов живым плодом –
в 1,6 раза. Высокая частота многоплодной беременности при
комбинированном режиме поддержки лютеиновой фазы свидетельствует о
целесообразности его совмещения с селективным переносом одного
эмбриона.
3. Позитивное влияние aGnRH в лютеиновую фазу на исходы
программы ЭКО реализуется путем сочетанного воздействия на желтое тело,
эмбрион и эндометрий, что подтверждают: достоверное повышение уровней
ЛГ, Р, Е2 в динамике лютеиновой фазы; более высокий уровень ХГч на 15–й
день после оплодотворения как при одноплодной, так и многоплодной
беременности; более высокая частота наступления беременности у пациенток
со сниженной экспрессией GnRH, GnRHR и HOXA10 в эндометрии при
использовании комбинированного режима поддержки лютеиновой фазы в
сравнении со стандартным режимом.
4. Максимальная частота наступления беременности при стандартном
режиме поддержки имеет место при наличии благоприятного генотипа G/G
или G/A гена FSHR 2039 G>A Asn680Ser [rs6166] независимо от генотипов
PGR и LHCGR, а при комбинированном режиме – у пациенток с
благоприятным сочетанием генотипов PGR и LHCGR. Применение
12
комбинированного режима поддержки лютеиновой фазы при наличии
неблагоприятного генотипа А/А гена FSHR2039, ассоциированного со
снижением эффективности программы ЭКО, позволяет увеличить шанс
наступления беременности в 2,5 раза по сравнению со стандартным режимом
поддержки лютеиновой фазы.
Личный вклад автора
Автор непосредственно участвовал в выборе научного направления
исследования, разработке цели и задач исследования, анализе и
статистической обработке полученных данных. Автор лично принимал
участие в ведении пациенток на всех этапах лечения бесплодия методом ЭКО
и переноса эмбрионов (ПЭ), в сборе материала, анализе и научной
интерпретации результатов исследования.
Соответствие диссертации паспорту полученной специальности
Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности
14.01.01 – «акушерство и гинекология». Результаты проведенного
исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно
пунктам 4 и 5 паспорта «акушерство и гинекология».
Апробация работы
Основные положения диссертации и результаты работы представлены и
доложены на XVI Всероссийском научном форуме «Мать и дитя» (Москва,
2015), конференция ВРТ, (Москва, 2015). Работа обсуждена на
межклинической конференции сотрудников 1–го гинекологического
отделения (07.04.2016г.) и заседании апробационной комиссии ФГБУ
«НЦАГиП им. В.И. Кулакова» МЗ РФ (20.05.2016г., протокол № 6).
Внедрение результатов исследования в практику
Разработанная на основании результатов исследования тактика ведения
ЛФ с добавлением препаратов aGnRH к стандартной поддержке препаратами
микронизированного Р в протоколе с antGnRH в программе ЭКО внедрена в
13
практическую деятельность 1–го гинекологического отделения ФГБУ
«НЦАГиП им. В.И. Кулакова» Минздрава России.
По теме диссертации опубликовано 6 научных работ в ведущих
рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 146 страницах компьютерного текста, состоит
из введения и 4 глав (обзор литературы, материал и методы исследования,
результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение),
выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа
иллюстрирована 23 таблицами и 16 рисунками. Использованная литература
включает 14 работ отечественных авторов и 125 источников зарубежных
авторов.
14
Глава 1. СОВРЕМЕННЫЕ ПОДХОДЫ К ВЕДЕНИЮ ЛЮТЕИНОВОЙ
ФАЗЫ В ПРОГРАММЕ ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНОГО
ОПЛОДОТВОРЕНИЯ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)
1.1. Лютеиновая фаза.
Лютеиновая фаза – это вторая фаза яичникового цикла, которая следует
за овуляцией и продолжается до момента установления беременности или до
начала менструации, в том случае, если беременность не наступила. В
естественном цикле ЛФ характеризуется образованием желтого тела после
овуляции, которое вырабатывает стероидные гормоны, в том числе Р и E2.
Если имплантация происходит, то в клетках синцитиотрофобласта и
цитотрофобласта начинается секреция хорионического гонадотропина
человека (ХГч). Благодаря его достаточному количеству жёлтое тело, в
норме существующее лишь около двух недель в течение каждого
менструального цикла, не подвергается обратному развитию, увеличивается
в размерах и остаётся функционально активным до 10–12 недель
беременности. Синтез ХГч усиливается на 6–8–й день после оплодотворения,
то есть с момента имплантации [1]. На ранних сроках беременности ХГч
стимулирует секреторную активность желтого тела, увеличивая секрецию Р и
эстрогенов [101]. Кроме того, клетками желтого тела синтезируется релаксин
– гормон семейства инсулинов, который снижает тонус миометрия и
уменьшает плотность лонного сочленения, что также важно для успешного
развития беременности. Активность стероидогенеза достигает своего
максимума к 5–й неделе беременности, к 16–й неделе беременности
гормональная функция практически полностью переходит к
фетоплацентарному комплексу. С этого времени уровень ХГч снижается, а
секреция Р в плаценте продолжает увеличиваться до конца беременности,
что является необходимым условием ее нормального развития и завершения.
15
После дегенерации желтого тела на его месте формируется
соединительнотканный рубец, называемый белым телом.
Нарушение восприимчивости эндометрия к бластоцисте является
одной из причин снижения имплантационной способности эмбриона в
циклах ЭКО. Известно, что Р является ключевым гормоном, индуцирующим
экспрессию многочисленных генов стромы и эпителия желез в эндометрии в
течение секреторной фазы цикла и беременности. Р необходим для
адекватной прегравидной трансформации эндометрия, успешной
имплантации эмбриона и его последующего развития. Снижение количества
и продолжительности секреции Р желтым телом или недостаточная
секреторная трансформация эндометрия, приводят к недостаточности ЛФ,
что в свою очередь ведет к неудачам имплантации [78].
Вследствие исключительной важности желтого тела и Р для успешного
течения беременности имеется целый ряд механизмов обратной связи,
которые поддерживают определенный уровень Р на протяжении всей
беременности. Первые 8–9 недель беременности размер желтого тела
остается относительно постоянным, но с 10–й недели происходит его
значительный регресс. Исключительно важная роль Р в ЛФ на первых
неделях беременности была показана в ряде исследований [36,37,134]. Так в
работе Csapo, Pulkkinen (1978) удаление желтого тела до 8–й недели
беременности без адекватной гормональной заместительной терапии
препаратами Р приводило к прерыванию беременности, в то время как его
удаление после 8–й недели беременности влекло за собой только
транзиторное снижение уровня Р [37].
В программах ВРТ, термин «поддержка ЛФ» используется при
применении лекарственных препаратов, действие которых направлено на
поддержание имплантации и повышение вероятности наступления
беременности [20].
16
1.2. Причины недостаточности лютеиновой фазы
Возможные причины формирования недостаточности ЛФ обсуждаются
на протяжении более 2–х десятилетий. Впервые о недостаточности ЛФ в
циклах ЭКО писал еще Edwards R. в 1980 году [45]. Существовало несколько
гипотез, пытающихся объяснить патофизиологические механизмы
формирования недостаточности ЛФ в циклах ЭКО, однако единого мнения
по поводу этого вопроса до настоящего времени не существует. Сначала
предполагали, что одной из возможных причин недостаточности ЛФ в
программе ЭКО может быть аспирация и повреждение части клеток
гранулезы во время трансвагинальной пункции (ТВП), что ведет к снижению
продукции Р желтым телом. Однако, это предположение не подтвердилось,
так как было установлено, что аспирация преовуляторного ооцита в
естественном цикле не приводила к нарушению синтеза гормонов ЛФ и не
влияла на ее продолжительность [71]. Еще одна гипотеза о механизме
формирования недостаточности ЛФ – введение овуляторной дозы ХГч в
стимулированных циклах может приводить к подавлению секреции ЛГ по
механизму отрицательной обратной связи [122]. Однако, в более поздних
исследованиях было показано, что у пациенток с нормальной овуляцией
назначение ХГч в естественном цикле не оказывает негативного влияния на
секрецию ЛГ [124].
С внедрением в рутинную практику ВРТ аналогов GnRH для
предотвращения преждевременного пика ЛГ стали считать, что механизм
формирования недостаточности ЛФ обусловлен действием aGnRH в длинных
протоколах стимуляции суперовуляции. Влияние aGnRH заключается в
десенситизации гипоталамо–гипофизарной системы, приводящей к
длительной блокаде секреции гонадотропинов, особенно ЛГ, что влияет на
функциональную активность желтых тел, формируя недостаточность ЛФ.
Существуют работы, которые как подтверждают [117], так и опровергают
[80] связь недостаточности ЛФ с назначением aGnRH. Появление новой
группы аналогов GnRH – antGnRH и внедрение их в рутинную практику ВРТ
17
вызвали предположение, что в связи с отсутствием длительного подавления
гонадотропной функции гипофиза и благодаря ее быстрому восстановлению
[69] отсутствуют причины для формирования недостаточности ЛФ [53]. Это
предположение подтвердилось в исследованиях Ragni et al. (2001), где было
отмечено, что antGnRH не оказывают неблагоприятного влияния на
концентрации Р в ЛФ и на ее продолжительность [33]. Однако, результаты
дальнейших исследований опровергли эти предположения, выявив
негативное влияние antGnRH на течение ЛФ [92].
Наиболее вероятной причиной недостаточности ЛФ в программе ЭКО
в настоящее время считают супрафизиологические уровни стероидных
гормонов, секретируемых большим количеством желтых тел в начале ЛФ,
которые непосредственно ингибируют секрецию ЛГ [59,78]. Дефицит ЛГ
приводит к нарушению стероидогенеза и нормального функционирования
желтого тела на протяжении ЛФ в программе ЭКО [28].
1.3. Частота встречаемости недостаточности лютеиновой фазы
в стимулированных циклах программы ЭКО
Недостаточность ЛФ может встречаться как в естественных циклах, так
и после стимуляции суперовуляции в программе ЭКО. В естественном цикле
частота недостаточности ЛФ составляет примерно 8,1% [109], тогда как
стимуляция суперовуляции в циклах ЭКО приводит к недостаточности ЛФ в
большинстве случаев, независимо от протокола стимуляции. Так, в
исследовании Beckers et al. (2003) изучали особенности течения ЛФ цикла
ЭКО у 40 женщин в протоколах с antGnRH. В качестве триггера овуляции
после рандомизации 11 женщин получали 250 мкг рекомбинантного ХГч
(рХГч), 13 женщин – 1 мг рекомбинантного ЛГ (рЛГ) и 15 пациенток – 0,2 мг
aGnRH [92]. Перенос эмбрионов осуществляли на 3 – 4 день после ТВП.
Поддержка ЛФ пациенткам не проводилась. Оценивали уровни Е2, Р и ХГч в
течение ЛФ и ее продолжительность. Авторы выявили недостаточность ЛФ
во всех трех группах, а частота наступления беременности не превышала
18
7,5%. В меньшей степени дефекты ЛФ были отмечены в группе с рХГч, что
авторы объясняли пролонгированным клиренсом рХГч из микроциркуляции.
Результаты этого исследования подтвердили необходимость обязательной
поддержки ЛФ в протоколах с antGnRH в программе ЭКО [92].
Таким образом, поддержка ЛФ остается обязательным этапом как в
протоколах с aGnRH, так и с antGnRH и имеет решающее значение особенно
в период времени между снижением экзогенного ХГч, назначаемого для
финального созревания ооцитов и повышением эндогенного ХГч в ранние
сроки имплантации эмбриона.
1.4 Препараты применяемые для поддержки лютеиновой фазы
Несмотря на то, что в настоящее время ведется активная тактика в
отношении восполнения недостаточности ЛФ в программах ВРТ,
используются различные режимы поддержки, а препараты и схемы их
введения зачастую выбираются врачами эмпирически. Идеальный режим для
поддержки ЛФ в стимулированных циклах является предметом дебатов со
времени появления ВРТ. Для восполнения недостаточности ЛФ применяют
препараты Р, ХГч, E2, aGnRH [63,84,85].
1.4.1 Препараты прогестерона
В механизмах благополучного наступления, течения и завершения
беременности существенную роль играет Р. Повышение концентрации Р в
течение ранней секреторной фазы влияет на экспрессию белков, которые
необходимы для нормальной имплантации эмбриона [62]. Влияние Р может
быть как прямым, через рецепторы Р в эпителиоцитах, так и
опосредованным, через стромальные факторы, стимулирующие
определенные эпителиальные генные структуры [68]. Недостаточная
секреция Р в ЛФ спонтанного или стимулированного цикла может приводить
к снижению рецептивности эндометрия и оказывает негативное влияние на
имплантацию эмбриона в циклах ЭКО [100]. Таким образом, Р вызывает
секреторную трансформацию эндометрия, способствует децидуализации
19
эндометрия, что обеспечивает полноценную инвазию трофобласта. В работе
Bourgain (1988) было показано, что в 70% циклов стимуляции
суперовуляции, в которых поддержка ЛФ не проводилась, гистологическая
структура эндометрия не соответствовала фазе более чем на два дня [91].
Однако, при назначении препаратов Р для поддержки ЛФ в 80% циклов
асинхронизм не был выявлен [91]. Роль Р в ЛФ цикла и в течение
беременности была показана в ряде исследований [36,134]. В работе Csapo,
Pulkkinen (1972) у пациенток удаление желтого тела на 49–й день
беременности приводило к падению уровня Р и самопроизвольному
выкидышу, в то время как его удаление на 61–й день влекло за собой только
транзиторное снижение уровня Р [134]. Однако, в другом исследовании этих
авторов было показано, что даже после удаления желтого тела можно
сохранить беременность при адекватной гормональной заместительной
терапии препаратами Р [36]. Кроме того известно, что Р снижает
сократительную активность миометрия, ингибируя активность
простагландинов и уменьшая плотность и экспрессию рецепторов к
окситоцину, а также снижает поступление кальция в цитоплазму гладких
мышечных клеток, ингибируя тем самым прохождение электрического
импульса, побуждающего матку к сокращению. Повышенная сократительная
активность миометрия (повышение тонуса миометрия) может приводить к
внематочным беременностям и выкидышам [26]. Однако основные защитные
эффекты Р связывают с изменением иммунной реакции матери [9]. При
нормально протекающей беременности формируется иммунный ответ,
действие которого направлено на защиту эмбриона от абортогенных реакций.
В лимфоцитах периферической крови присутствуют рецепторы Р которые,
при его достаточном количестве продуцируют защитный белок –
прогестерон–индуцируемый блокирующий фактор (PIBF), который
препятствует отторжению плодного яйца, содержащего чужеродные для
матери отцовские антигены, стимулируя выработку асимметричных антител
[9]. Было показано, что дефицит PIBF и/или прогестероновых рецепторов
20
блокирует выработку ассиметричных антител, что увеличивает риск
прерывания беременности [9]. Таким образом, основные свойства Р,
направленные на адекватную секреторную трансформацию эндометрия,
полноценную имплантацию эмбриона, развитие и сохранение беременности
позволяют широко использовать препараты Р в акушерско–
гинекологической практике.
В настоящее время имеется широкий арсенал пероральных,
вагинальных, инъекционных форм Р и его аналогов [58,85,114,136].
Натуральный Р быстро превращается при пероральном использовании в 5α и
5β – редуцированные метаболиты [101] которые, связываясь с рецепторами γ
– аминобутировой кислоты, могут оказывать выраженное седативное
действие, снижая переносимость препарата [112]. Вскоре были созданы
синтетические прогестины, устойчивые к ферментативному разрушению,
однако их применение сопровождалось андрогенными эффектами и
повышенным риском врожденных пороков развития плода. Натуральный Р
не имеет тератогенных свойств и более эффективен в индукции секреторной
трансформации эндометрия, чем его производные, такие как дидрогестерон
[101]. Создание микронизированного Р позволило повысить его
биодоступность, причем только парентеральное введение Р может
преодолеть негативные последствия перорального Р. Установлено, что при
вагинальном введении 100 мг Р его уровень в плазме крови остается в
пределах 4 – 5 нг/мл в течение более 24 часов, а при пероральном введении Р
после краткого подъема снижается за несколько часов до 1,5 нг/мл и
сохраняется значительно меньшее время. Однако, результаты проведенных
исследований не выявили статистически значимых различий в частоте
наступления беременности при использовании как пероральных, так и
вагинальных форм [84,85], а также при сравнении вагинального и
внутримышечного пути введения Р [15,35,94,135]. На сегодняшний день
вагинальная форма введения Р считается наиболее приемлемой, так как
полная диффузия Р в миометрии матки происходит за 6 часов и
21
поддерживается более постоянная концентрация Р, чем при
внутримышечном введении. При вагинальном введении Р вызывает более
физиологическую трансформацию эндометрия со снижением сократительной
активности матки, что ведет к повышению вероятности имплантации. Кроме
того, инъекции масляного раствора менее удобны для пациенток, так как
могут приводить к осложнениям в виде инфильтратов, абсцессов [15] и даже
к более серьезным последствиям, таким как острая эозинофильная
пневмония [137]. При использовании препаратов вагинального Р женщины
могут испытать дискомфорт во влагалище, зуд, сухость, выделения и боль
[120]. Результаты исследования Saharkhiz et al. (2015), посвященные
сравнительной оценке эффективности дидрогестерона (40 мг/сут) и
микронизированного Р (800 мг/сут) у 210 женщин в программе ЭКО/ICSI в
протоколе с aGnRH, не выявили достоверных различий ни в частоте
имплантации (22,0% и 24,0%; p = 0,254), ни в частоте клинической
беременности (31% и 33%; p = 0,888), ни в частоте самопроизвольных
выкидышей (5,0% и 3,0%; p = 0,721), ни в частоте прогрессирующей
беременности (30,0% и 30,0%; p = 1,000), что позволяет считать эти
препараты сопоставимыми по эффективности [32].
1.4.2. Препараты эстрогенов
Стероидные гормоны являются основными регуляторами
морфологических и структурно – функциональных изменений эндометрия на
протяжении менструального цикла и в периимплантационном периоде.
Основная роль в механизмах благополучного наступления и течения
беременности отводится Р и эстрогенам – это два самых важных гормона,
которые вырабатывает желтое тело. От их комбинированного действия
зависит нормальное секреторное развитие и созревание эндометрия [130].
Было показано, что ключевую роль в успешной имплантации играет
рецептивность эндометрия – количество функционально полноценных
рецепторов ткани эндометрия к соответствующим стероидным гормонам
22
[11]. В пролиферативную фазу эстрогены одновременно с пролиферацией
клеток эпителия стимулируют развитие секреторного аппарата клетки и
синтез рецепторов к Р и эстрогенам, которые определяют чувствительность
эндометрия и децидуальной ткани к этим гормонам и опосредуют их
действие на клетку [11]. Эстрадиол (Е2)–главный медиатор
пролиферативных изменений в эндометрии [2], он влияет на синтез не только
собственных рецепторов, но и усиливает синтез рецепторов Р и андрогенов, в
то время как Р оказывает противоположное действие, подавляя синтез
собственных рецепторов и рецепторов Е2. Полноценная пролиферация
эндометрия в течение I фазы нормального менструального цикла возможна
при концентрации Е2 в периферической крови в пределах 200 – 400 пг/мл
при одновременном содержании Р не более 4 нг/мл [5]. Для нормальной
имплантации эмбриона необходима концентрация Е2 50 – 100 пг/мл в
сыворотке крови [111]. Следовательно, при избытке, дефиците или
дисбалансе этих гормонов может нарушаться морфология и рецептивность
эндометрия [12]. Нарушение рецептивности эндометрия – одна из главных
причин неудач ВРТ [10]. Стимуляция яичников в программах ВРТ изменяет
стероидогенез, негативно влияет на рецептивность эндометрия и ведет к
неудачам имплантации эмбрионов. Только подготовленный циклическим
стероидным воздействием эндометрий готов к приему бластоцисты и
восприятию ее гуморальных сигналов [89]. Было показано, что в
стимулированных циклах в 80% случаев происходит десинхронизация
созревания эндометрия и отмечено, что назначение для поддержки ЛФ
только препаратов Р недостаточно для устранения нарушений в
формировании эндометрия [48]. Было высказано предположение, что
добавление Е2 для поддержки ЛФ будет способствовать лучшему
созреванию эндометрия, его подготовке к имплантации и последующему
прогрессированию беременности. Тем не менее, на сегодняшний день
остается нерешенным вопрос о необходимости дополнительной поддержки
препаратами эстрогенов. В ряде исследований оценивали целесообразность
23
добавления эстрадиола валерата к стандартной поддержке ЛФ
микронизированным Р [19,22,29,43,56,83,87,93,129]. В некоторых из этих
работ был отмечен благоприятный эффект от его добавления [83,87], однако
в значительно большем количестве исследований эти результаты не
подтвердились [19,22,29,56,93,129].
Таким образом, в настоящее время нет достоверных данных о
благоприятном эффекте и целесообразности назначения препаратов
эстрогенов для поддержки ЛФ в циклах ЭКО.
1.4.3. Препараты хорионического гонадотропина человека
Роль ХГч заключается не только в обеспечении полноценного
функционирования желтого тела и его секреторной способности: он также
может выступать в качестве фактора роста и дифференцировки во время
беременности. Назначение ХГч может значительно повлиять на паракринные
параметры дифференцировки и имплантации. Добавление ХГч в циклах ВРТ
с использованием aGnRH и antGnRH стимулирует продукцию эндогенного Р,
Е2, 17–ОП, плацентарных белков, интегрина и релаксина, что обеспечивает
полноценность всех процессов, происходящих в течение ЛФ и на ранних
сроках беременности. Частота наступления беременности в протоколах с
aGnRH была выше (OR: 2,38, 95 % CI: 1.32 – 4.29), а показатели
самопроизвольного аборта ниже (OR: 0,12 , 95 % CI: 0.03 – 0.50) при
добавлении ХГч для поддержки ЛФ по сравнению с аналогичными
протоколами, где ХГч для поддержки ЛФ не использовали [40]. Поддержка
ЛФ с назначением ХГч стала стандартом поддержки ЛФ, начиная с конца
1980 – х годов [45]. Дальнейшее изучение доз и режимов назначения ХГч
показало, что нет преимуществ при введении препарата в дозах 5000 ЕД,
2500 ЕД, 1500 ЕД, в режимах 1, 2, 3 и 5 раз в течение ЛФ. Однако, вскоре
стало ясно, что при дополнительном назначении ХГч значительно
увеличивалась частота развития умеренно выраженного или тяжелого СГЯ.
При тяжелых проявлениях СГЯ смертность от осложнений составляет 3
24
случая на 100 тыс. стимулированных циклов [71]. Важная роль в патогенезе
СГЯ отводится сосудисто–эндотелиальному фактору роста (СЭФР),
избыточная секреция которого происходит в ответ на стимуляцию
суперовуляции [118]. В ряде исследований было показано, что после
введения препаратов ХГч увеличивается экспрессия СЭФР в
лютеинизированных клетках гранулезы [119]. Таким образом, повышенная
концентрация СЭФР в сыворотке крови после введения ХГч может
свидетельствовать о высоком риске развития СГЯ, хотя, по мнению других
авторов, уменьшение дозы ХГч (500 МЕ через день) способно обеспечить
поддержку ЛФ и при этом минимизировать риск развития СГЯ [79].
Очевидно, что поддержка ЛФ препаратами ХГч не приемлема для пациенток
с высоким риском развития СГЯ: СГЯ в анамнезе, с синдромом
поликистозных яичников (СПКЯ), при высоком преовуляторном уровне Е2 >
2500 – 2700 пг/мл, при наличии более 14 антральных фолликулов, более 13
созревающих фолликулов диаметром более 11 мм, уровне антимюллерова
гормона (АМГ) – более 3,36 нг/мл. Кроме того, было отмечено, что после
подтвержденного наступления беременности назначение ХГч
нецелесообразно. Результаты исследования Qureshi et al. (2005) показали, что
у 183 пациенток, получавших ХГч в первом триместре беременности,
отмечались кровянистые выделения (при подтвержденном сердцебиении у
плода по данным ультразвукового исследования (УЗИ)), при этом частота
самопроизвольного выкидыша достоверно не отличалась от группы плацебо
– 11% и 12% [61]. По данным большинства исследований при сравнении двух
методов поддержки ЛФ препаратами ХГч и препаратами Р не было выявлено
достоверных различий в частоте наступления беременности между группами
[27,49], однако было показано, что частота развития СГЯ была существенно
выше в группе пациенток, использовавших ХГч для поддержки ЛФ
[84,96,97]. Таким образом, не получены подтверждения благоприятного
влияния ХГч в ЛФ на исходы программ ЭКО.
25
1.5. Возможность применения препаратов aGnRH для поддержки ЛФ в
программе ЭКО
Возможность применения препаратов aGnRH как адъювантного метода
поддержки ЛФ в программе ЭКО находится в центре внимания
исследователей в последние годы, особенно после публикации работ, в
которых было показано положительное влияние одной или нескольких доз
aGnRH для поддержки ЛФ на исходы программы ЭКО [24,46,65,76,88,86,
106,115,128].
В обзоре Кокрановского сообщества 2011 и 2015 гг., было отмечено
существенное повышение частоты имплантации, клинической,
развивающейся беременности и частоты родов живым плодом при
использовании этого нового комбинированного режима поддержки ЛФ
(препараты микронизированного Р в сочетании с препаратами aGnRH) по
сравнению со стандартным режимом (препараты микронизированного Р)
[84,85]. Следует отметить, что положительные эффекты от применения
aGnRH для поддержки ЛФ циклов ВРТ получены в протоколах как с aGnRH
[24,65,76,88,106,128], так и с antGnRH [24,46,115].
В литературе представлены результаты исследований с различным
дизайном, опубликованных в 2006 – 2015 гг., посвященных оценке влияния
aGnRH для поддержки ЛФ на исходы программы ЭКО/ICSI [23,24,39,46,
64,65,76,86,88,106,115,128].
В «длинных» протоколах для супрессии ЛГ пациентки получали
трипторелин [24,65,115] и бусерелин [49,64,86]. В исследовании
Aynaoglu et al. (2014) пациенткам назначали лейпролида ацетат [46]. В двух
исследованиях Isik et al. (2009) и Ata и Urman (2010) в протоколах с antGnRH
использовали цетрореликса ацетат [115,23]. В большинстве исследований
стимуляцию суперовуляции проводили рекомбинантным ФСГ (рФСГ)
[23,24,39,46,64,65,106,115]. В работе Hsiao–Fan Kung et al. (2014)
стимуляцию суперовуляции проводили препаратами рФСГ и/или
человеческого менопаузального гонадотропина (ЧМГ) [86]. В качестве
26
триггера овуляции в шести исследованиях использовали мочевой ХГч в дозе
10 тыс. МЕ [23,46,65,76,106,128]; в исследовании Tesarik et al. (2006) – 250
мкг рХГч [24]; в работах Dattaprasad (2011) и Hsiao – Fan Kung et al. (2014)
применяли 500 мкг р ХГч [39,86], а в работе Isik et al. (2009) назначали
препараты как мочевого, так и рХГч [115]. В работе Aboulghar et al. (2014)
препарат не был указан [64]. ТВП проводилась через 34 – 36 часов после
введения триггера овуляции. В большинстве приведенных выше
исследованиях оплодотворение проводилось методом ICSI
[23,24,39,46,64,65,76,86,106,115,128]. Перенос эмбрионов осуществляли на
стадии дробления или на стадии бластоцисты. Вид поддержки ЛФ, доза и
путь введения препаратов, а также время начала и продолжительность ЛФ
варьировали в обсуждаемых исследованиях. Однократное введение aGnRH
для поддержки ЛФ на 6–й день после оплодотворения было отмечено в
большинстве работ [23,24,46,65,106,115]: в исследовании Dattaprasad (2011)
aGnRH назначали на 6–й, 7–й и 8–й дни после оплодотворения [39]; в работе
Qublan et al. (2008) aGnRH вводили в день оплодотворения, затем в день ПЭ,
и в последующие три дня [88], а в работе Isikoglu et al. (2007) aGnRH
назначали ежедневно до 12–14 дня после оплодотворения [76].
В исследовании Aboulghar et al. (2014) препараты aGnRH назначали
ежедневно с момента оплодотворения и до результата крови на ХГч (12 – 14
день после оплодотворения [64]. В работе Aynaoglu et al. (2014) aGnRH
назначали ежедневно в течение 3–х дней после оплодотворения в группе А, а
в группе В препарат назначали на 3 – й и 6 – й дни после оплодотворения
[128]. В большинстве приведенных выше исследований применяли 0,1 мг
трипторелина [24,65,106,23,64,86,46]. В работе Isikoglu et al. (2007)
использовали 0,25 мг aGnRH (препарат не указан) [76]. В работе Dattaprasad
(2011) применяли 1 мг лейпролида ацетат [39], а в работе Isik et al. (2009)
0,5 мг лейпролида ацетат [115]. В исследовании Aynaoglu et al. (2014)
лейпролида ацетат назначали 1 мг в группе А и 2 мг в группе В [128].
27
В контрольных группах в обсуждаемых исследованиях для поддержки
ЛФ применяли: эстрадиола валерат 4 мг и микронизированный Р 400 мг,
вагинально, ежедневно со дня оплодотворения в течение 17 дней и рХГч 250
мкг в день переноса эмбрионов [24]; микронизированный Р в виде
вагинального геля (90 мг) ежедневно со дня оплодотворения [65];
микронизированный Р 600 мг ежедневно со дня оплодотворения [64,88,115];
2,5% р–р–2,0 мл ежедневно со дня оплодотворения [76]; микронизированный
Р 800 мг ежедневно со дня оплодотворения [106]; микронизированный Р в
виде вагинального геля ежедневно со дня оплодотворения (90 мг) [23];
микронизированный Р (400 мг) вагинально ежедневно со дня оплодотворения
[39]; микронизированный Р (600 мг) и эстрадиола валерат (4 мг) ежедневно
со дня трансвагинальной пункции [128]; микронизированный прогестерон в
виде вагинального геля (90 мг) ежедневно со дня оплодотворения [86];
микронизированный Р (400 мг) в день забора ооцитов, со следующего дня по
(800 мг) ежедневно [46].
Влияние использования препаратов aGnRH для поддержки ЛФ в
программе ЭКО на частоту имплантации было оценено в девяти
исследованиях с участием 3163 пациенток [23,24,39,46,65,86,115,106,128].
Анализ полученных данных показал, что в пяти из вышеназванных
исследований с включением 1830 пациенток, частота имплантации была
значительно выше в группе пациенток, которые получали для поддержки ЛФ
комбинированную поддержку ЛФ по сравнению с группой контроля: (27,1 %
и 17,4%, р<0,05 и 29,8% и 18,2 р<0,05) [24]; р<0,05 [115]; 12,3% и 7,3%
р<0,05 [106]; 24,5% и 17,0%, р = 0,023 [86]; р<0,041 [46]. В исследовании
Aynaoglu et al. (2014) с участием 300 пациенток не было выявлено
достоверной разницы между группами в частоте имплантации (р=0,099),
однако отмечено, что в группах с комбинированной поддержкой частота
имплантации была выше (20,7%, 25,8% против 13,3%) [128]. В двух
исследованиях Ata et al. (2008); Dattaprasad (2011), включающих 996
пациенток, частота имплантации была сопоставима между группами (21,1% и
28
20,1% р=0,67; 17,57% и 17,07, р>0,05) [65,39]. В исследовании Ata и Urman
(2010) частота имплантации была ниже в группе комбинированного режима
поддержки ЛФ по сравнению со стандартным режимом и составила (12% и
33% р=0,02) [23].
Влияние использования адъювантной терапии aGnRH в ЛФ в
программе ЭКО на частоту клинической беременности было оценено в
двенадцати исследованиях с участием 3889 пациенток
[23,24,39,46,64,65,76,115,86,88,106,128]. Данные пяти из вышеназванных
исследований с включением 1297 пациенток свидетельствовали в пользу
применения aGnRH: частота клинической беременности была значительно
выше в группе женщин, которые получали комбинированную поддержку ЛФ
по сравнению со стандартной: 40,5% и 20%, р<0,05 [115]; 36,6% и 13,3%
р<0,05 [88]; 25,5% и 10% р<0,05 [106]; 49% и 33,3% р<0,05 [86]; 46,7 и 29,2,
р<0,02 и 32,6% и 12,5%, р<0,05 [46] соответственно.
В шести работах с включением 2502 пациенток не было выявлено
статистически значимой разницы в частоте клинической беременности
между исследуемыми группами: 42,8% и 42,1% [65]; 49,45% и 37,7% [76];
36,62% и 38,21% р=0,841 [39]; 36,2% и 30,6% [64]; 40%, 46,4% и 31,6%
р=0,123 [128]. В исследовании Tesarik et al. (2006) с участием 600 пациенток
было отмечено увеличение частоты наступления клинической беременности
у пациенток с комбинированной поддержкой ЛФ в протоколе с aGnRH (48%
и 39,3%) и antGnRH (46% и 36%), однако не было достигнуто статистически
значимой разницы между группами (р>0,05) [24].
В работе Ata и Urman (2010) с включением 90 пациенток, напротив,
было отмечено снижение частоты клинической беременности в группе с
aGnRH по сравнению с группой плацебо (31,6% и 48,1% р=0,12) что,
вероятно, было связано с малой выборкой пациенток [23].
Влияние использования aGnRH в ЛФ на частоту развивающейся
беременности было оценено в шести исследованиях. В исследовании
Tesarik et al. (2006) частота развивающейся беременности была достоверно
29
выше в группе пациенток, которые получали в ЛФ комбинированную
поддержку по сравнению с группой контроля в протоколе с aGnRH (46,8 и
38, р<0,05) и antGnRH (44,8% и 31,9% р<0,05) [24]. В четырех исследованиях
не было зафиксировано статистически значимой разницы между группой
aGnRH и контрольной группой 42% и 41,6% р=0,82 [65]; 27,69% и 26,29%
р=0,827 [39]; 30,4 и 25,7 р>0,05 [64]; 36%,42% и 27,4% р=0,093 [128]. В
работе Ata и Urman (2010) были отмечены противоположные результаты:
частота развивающейся беременности была ниже в группе
комбинированного режима по сравнению с группой со стандартным
режимом и составила 18,4% и 42,31% соответственно (р=0,02) [23].
Для оценки влияния aGnRH на частоту родов живым плодом было
проанализировано пять работ с включением 1295 пациенток
[24,76,88, 115,128]. Объединенные данные трех исследований показали, что
частота живорождения была достоверно выше в группе пациенток, с
комбинированной поддержкой ЛФ по сравнению со стандартной
поддержкой: 35,1% и 16,2%, р<0,05 [115]; 27,4 и 18,2,р<0,05 и 25,2% и 14,6,
р<0,05 [24]; 41,5% и 28.0%; р<0,05 [86]. В работах Isikoglu et al. (2007),
Qublan et al. (2008) статистически значимых различий не было выявлено
49,4% и 37,7% р>0,05 [76]; 31,6% и 5% р=0,05 [88], возможно, в связи с
малой выборкой пациенток.
Влияние aGnRH на возможность наступления многоплодной
беременности оценено в пяти исследованиях с участием 1533 пациентки
[39,46,65,115,128]. Результаты двух исследований Isik et al. (2009), Aynaoglu
et al. (2014) показали, что в группе с комбинированной поддержкой частота
многоплодной беременности была достоверно выше по сравнению со
стандартной поддержкой ЛФ: 22,9% и 16,2% р<0,05 [115]; 12%, 17,9% и 4,2%
р=0,014 [128]. В работе Ata (2008) частота наступления многоплодной
беременности была выше у пациенток, получавших aGnRH, но не было
выявлено статистически значимых различий между группами: (32,8% и
30,8%; р=0,74) [65]. В исследовании Dattaprasad (2011), частота
30
многоплодной беременности была сопоставима между группами (20,9% и
20,5%; р>0,99) [39]. В другой работе Zafardoust et al. (2015) все беременности
были одноплодными [46].
Влияние добавления aGnRH в ЛФ цикла ЭКО на частоту выкидышей
оценивали в трех исследованиях, с включением 992 пациенток [88,39,64].
Было показано, что добавление aGnRH в ЛФ не влияло на частоту
выкидышей и было сопоставимо между гуппами: 8,3% и 5% р=0,47 [64];
24,36% и 30,86%, р=0,46 [39]; 0,4 и 1,8 р>0,05 [88].
Таким образом, на сегодняшний день не существует единой точки
зрения на использование препаратов aGnRH в ЛФ программ ЭКО.
1.6. Механизм действия aGnRH в лютеиновую фазу стимулированного
цикла
В настоящее время механизм благоприятного влияния препаратов
aGnRH в ЛФ стимулированного цикла не ясен и, в соответствии с
представленными ниже гипотезами, может реализовываться на различных
уровнях: эмбрион, желтое тело и/или эндометрий.
1.6.1 Влияние aGnRH на эмбрион
Гипотеза о прямом благоприятном влиянии aGnRH на эмбрион на
ранней стадии имплантации поддерживается в ряде работ. Результаты
экспериментального исследования на животных показали, что aGnRH могут
улучшить развитие эмбриона in vitro и благоприятно влияют на уровень
имплантации [66,132]. В исследовании Klemmt (2009) было показано, что
aGnRH являются потенциальными промоутерами развития эмбрионов и
имплантации [50]. Было высказано предположение, что aGnRH могут играть
важную роль в контроле синтеза и секреции ХГч путем стимуляции синтеза и
секреции ХГч в преимплантационном эмбрионе и в плаценте. В работе
Seshagiri et al. (1994) было показано, что иммунореактивный GnRH и ХГч
продуцируются in vitro в культуре эмбрионов rhesus макак в
преимплантационный период, от стадии морулы до стадии бластоцисты;
31
было установлено, что секреция GnRH предшествует секреции ХГч
бластоцистой [113]. Интересным фактом является то, что эмбрионы, которые
не достигали хэтчинга, секретировали меньшие количества GnRH в среду в
отличие от эмбрионов, которые достигли поздних стадий развития. Гипотеза
о прямом влиянии aGnRH на эмбрион также высказывается в работе
Tesarik et al. (2004), в которой aGnRH назначали в ЛФ в циклах донации
ооцитов у реципиентов с подавленной овуляцией и отсутствием желтого тела
[126]. Ооциты от каждого донора (n=138) были разделены между двумя
группами реципиенток, одной из которых помимо стандартной поддержки
ЛФ вводилась однократная доза aGnRH (0,1 мг трипторелина) через 6 дней
после оплодотворения эмбрионов методом ICSI, другая группа пациенток
получала стандартную поддержку ЛФ и плацебо. В группе aGnRH была
отмечена более высокая частота имплантации (36,9% и 25,1%, р<0,05),
частота многоплодной беременности (16,7% и 3,6%, р<0,05), родов живым
плодом (31,1% и 21,5%, р<0,05) и частота родов двойней (13,8% и 2,2%,
р<0,05). Частота прерывания беременности была сопоставима между
группами (p>0,05) [126]. Сделан вывод о вероятном прямом влиянии aGnRH
на эмбрионы. Эта гипотеза также поддерживается и в более поздней работе
Tesarik et al. (2006), в которой пациентки, находящиеся в программе ЭКО в
протоколе с antGnRH и aGnRH, получали aGnRH для поддержки ЛФ на 6–
й день после оплодотворения [24]. Была выявлена более высокая частота
имплантации у пациенток, которые получали комбинированный режим
поддержки ЛФ (в протоколе с antGnRH и aGnRH) по сравнению со
стандартным режимом (27,1% и 17,4%, р<0,05) и (29.8 и 18,2%, р<0,05);
прогрессирующей беременности (44,8% и 31,9%, р<0,05) и (46,8% и 38%,
р<0,05) и живорождения (25,2% и 14,6%, р<0,05) и (27,4% и 18,2%, р<0,05)
[24]. Кроме того было отмечено, что пациентки, у которых впоследствии
наступили беременности, имели более высокую концентрацию ХГч на 15–й
день после оплодотворения по сравнению с группой контроля [24]. Ранее в
работе Iwashita et al. (1993) сообщалось, что aGnRH повышает уровень ХГч в
32
сыворотке крови у беременных женщин [67], по–видимому, воздействуя на
рецепторы GnRH плаценты [82]. GnRH является одним из
паракринных/аутокринных регуляторов ХГч, продуцируемых человеческим
трофобластом. Одна из основных функций ХГч на ранней стадии
беременности – стимуляция продукции Р желтым телом и повышение
рецептивности эндометрия, так как Р обладает иммуносупрессивными
свойствами, что потенциально предотвращает отторжение плода матерью.
Известно, что после эмбрионально – эндометриальной адгезии эмбриона в
эндометрий, по мере того, как происходит инвазия эмбриона в строму,
происходит дифференцировка трофобласта в цитотрофобласт и
синцитотрофобласт, которые экспрессируют GnRH и его рецептор в I
триместре беременности. Таким образом, экспрессируемый плацентой GnRH
был выделен как один из основных регуляторов синтеза и секреции ХГч.
Роль GnRH в контроле плацентарной продукции и секреции ХГч была
продемонстрирована в работах как in vitro [72], так и in vivо [47,67], особенно
в I триместре беременности. Кроме того, в работе Siler–Khodr (1997) было
установлено, что антитела к GnRH присутствовали в крови беременных
женщин с предшествующими выкидышами и низким уровнем ХГч, что
подтверждает важную роль GnRH в имплантации и плацентации [47].
1.6.2 Влияние aGnRH на желтое тело
В работе Tesarik et al. (2006) обсуждалась гипотеза о влияние aGnRH на
желтое тело через центральные механизмы, путем стимуляции секреции ЛГ
гонадотрофами гипофиза [24]. Напротив, в работе Herman (1992) сообщалось
об ухудшении функции желтого тела при введении aGnRH [60]. Однако
попытки прервать беременность или предотвратить имплантацию с помощью
aGnRH оказались неудачными [127]. В небольшом рандомизированном
исследовании Pirard et al. (2005) показано, что низкие дозы aGnRH (100 мкг
бусерелина) способны оказывать стимулирующее действие на желтое тело
[102]. В исследованиях Tesarik et al. (2006) и Qublan et al. (2008) наблюдали
33
увеличение концентрации Р и Е2 в сыворотке крови у женщин, которые
получали комбинированный режим поддержки ЛФ [24,88]. Напротив, в
исследовании Hugues et al. (2006), не было зафиксировано различий в уровне
гормонов у женщин, получавших комбинированный режим поддержки ЛФ,
и группой контроля [18]. Пока неизвестно, является ли увеличение синтеза
Е2 и Р результатом прямого действия aGnRH на яичники у женщин,
получавших дополнительно aGnRH в ЛФ. В работе Tesarik et al. (2006) у
пациенток в группе комбинировонной поддержки ЛФ не было
зафиксировано заметного увеличения концентрации ЛГ в сыворотке крови в
динамике ЛФ, что не указывает на роль гипофиза в механизме действия
aGnRH [24]. Однако необходимо учитывать тот факт, что для получения
этого эффекта достаточно даже короткого пика ЛГ, который мог не быть
зарегистрирован с учетом дизайна исследования [24].
1.6.3 Влияние aGnRH на эндометрий
Известно, что благоприятный исход программы ЭКО во многом
зависит от двух важных факторов: качества эмбрионов и рецептивности
эндометрия, что, необходимо для прикрепления и инвазии бластоцисты в
эндометрий [4]. Результаты исследования Devroey (2004) показали, что
использование аналогов GnRH в стимулированных циклах ЭКО ускоряет
созревание эндометрия, оказывает негативное влияние на его рецептивность
и восприимчивость к имплантации эмбрионов [108]. Однако, в более поздних
работах Klemmt et al. (2009), проанализировав in vitro действие аналогов
GnRH на децидуализированный эндометрий, инвазию бластоцисты и
экспрессию рецепторов GnRH у фертильных женщин, показали, что аналоги
GnRH не оказывают существенного влияния на степень децидуализации
эндометриальных стромальных клеток, а также авторами не было отмечено
никаких неблагоприятных эффектов на инвазию бластоцисты [50].
Благоприятное действие aGnRH на эндометрий было отмечено в
исследовании Qublan et al. (2008), в котором участвовало 120 пациенток с
34
тонким эндометрием (<7 мм) [88]. Исследуемые пациентки были разделены
на 2 группы в зависимости от режима ведения ЛФ, в 1–й группе в
дополнение к стандартной поддержке ЛФ добавляли aGnRH (0,1 мг
трипторелина в день ТВП, в день ПЭ и в течение трех дней после ПЭ), во
2–й группе пациентки получали плацебо. Полученные результаты показали
более высокую частоту наступления беременности в группе aGnRH, что
связали с благоприятным влиянием aGnRH на эндометрий [88]. Влияние
aGnRH на эндометрий можно объяснять тем, что GnRH и его рецепторы
присутствуют в эндометрии женщин на протяжении всего менструального
цикла в эпителиальных и стромальных клетках с повышением экспрессии
рецепторов GnRH в децидуализированных стромальных клетках в ЛФ [105].
Локальная экспрессия GnRH трофобластом и присутствие его рецепторов в
децидуализированном эндометрии может играть важную роль в диалоге
между бластоцистой и эндометрием на стадии ранней имплантации, за счет
модуляции баланса между матриксными металлопротеиназами (MMP) и их
ингибиторами [44,75]. Повышается инвазивная способность трофобласта
путем специфического ингибирования тканевых ингибиторов
металлопротеиназ (TIMP), что способствует более успешной имплантации
бластоцисты [75]. Также было показано, что GnRH индуцирует апоптоз в
клетках эндометрия in vitro. Однако, результаты другого исследования
показали, что GnRH не оказывает влияния на экспрессию генов
эпителиальных клеток эндометрия человека [42].
Таким образом, эффект от использования aGnRH может
реализовываться на любом из перечисленных уровней или, возможно, имеет
место сочетанное воздействие на желтое тело, эндометрий и/или эмбрион.
1.6.4. Безопасность применения aGnRH для поддержки ЛФ
В настоящее время нет убедидельных данных о том, что применение
aGnRH оказывает негативное влияние на эмбрион. В ряде исследований
[Tan et al. (2006); Fatima et al. (2011); Gartner et al. (1997)] было показано, что
35
непреднамеренное введение aGnRH беременным женщинам не
сопровождалось повышенным риском потери беременности или врожденных
дефектов у плода [123,95,17]. Возможное влияние комбинированного режима
поддержки ЛФ на прерывание беременности обсуждалось в работах:
Qublan et al. (2008), Dattaprasad (2011), и авторы не выявили разницы в
частоте прерывания беременности при использовании стандартного режима
и комбинированного [88,39]. Кроме того, Skarin et al. в 1982г., проводившие
клиническое исследование о возможном посткоитальном и
постимплантационном контрацептивном действии aGnRH, показали, что
высокие дозы aGnRH не только не смогли блокировать имплантацию, но и
повышали ее [116]. Однако, есть единичное исследование, в котором
сообщают о нарушениях неврологического развития при долгосрочном
наблюдении 9–и детей, у которых aGnRH непреднамеренно вводился во
время цикла зачатия [99].
Таким образом, на сегодняшний день большой интерес представляет
изучение применения aGnRH как адъювантного метода поддержки ЛФ в
программе ЭКО. Несмотря на то, что положительное влияние aGnRH в ЛФ
стимулированного цикла на исходы программ ЭКО подтверждено рядом
клинических исследований, недостатком приведенных выше работ является
гетерогенность изучаемых выборок, использование различных режимов
поддержки ЛФ в группе контроля, что могло способствовать получению
различных результатов. В связи с этим открытым остается вопрос об
эффективности применения aGnRH для поддержки ЛФ. Кроме того, нет
ясности в механизме действия aGnRH в ЛФ. Не разработана оптимальная
тактика ведения ЛФ с добавлением aGnRH. Остаются не выясненными
патогенетические аспекты применения aGnRH для поддержки ЛФ.
Отсутствуют молекулярно–генетические предикторы назначения aGnRH. Не
установлены группы пациенток, для которых данный режим поддержки ЛФ
был бы наиболее эффективен.
36
Таким образом, проблема поиска нового наиболее оптимального
режима ведения ЛФ в программах ВРТ является актуальной и перспективной
задачей и требует дальнейшего изучения и научного анализа.
37
Глава 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Материал исследования
Работа была выполнена в 1 гинекологическом отделении (руководитель
– к.м.н. Абубакиров А.Н.) ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и
перинатологии им. академика В.И. Кулакова» Минздрава России. В
соответствии с целью и поставленными для ее достижения задачами
исследования были включены 221 женщина, в т.ч. 207 пациенток с
бесплодием, обусловленным трубно–перитонеальным фактором (основная
группа), и 14 здоровых фертильных женщин, имеющих здоровых детей
(контрольная группа для изучения эндометрия).
Критериями включения в исследование служили:
возраст ≤ 38 лет на момент включения в исследование;
трубно–перитонеальный фактор бесплодия или сочетанние с мужским
фактором бесплодия (патозооспермия I – II степени);
уровень ФСГ < 12 МЕ/л;
регулярный менструальный цикл 21–35 дней;
не более 2 безуспешных попыток ЭКО в анамнезе;
Критериями исключения служили:
эндокринный фактор бесплодия;
бесплодие неясного генеза;
распространенные формы эндометриоза, соответствующие III–IV
стадии;
миома матки с величиной узла > 4 см в диаметре или с
центрипетальным ростом;
пороки развития внутренних половых органов, включая состояния
после хирургической коррекции;
патозооспермия III–IV степени;
38
развитие синдрома гиперстимуляции яичников средней или тяжелой
степени на фоне стимуляции функции яичников в данном цикле ЭКО;
наличие соматическиой и эндокринной патологии, которая может
повлиять на репродуктивную функцию (нарушения функции
щитовидной железы, сахарный диабет, ожирение II–III степени,
сердечно–сосудистые заболевания, ревматические заболевания, при
которых противопоказано наступление беременности и роды);
гидросальпинкс и/или тубоовариальное образование по данным
гистеросальпингографии и/или ультразвукового исследования
патология эндометрия;
приобретенные деформации полости матки, при которых невозможна
имплантация эмбрионов или вынашивание беременности;
наличие злокачественных новообразований;
проведение переноса криоконсервированных/размороженных
эмбрионов в цикле, предшествующем циклу стимуляции.
Все пациентки, включенные в исследование, обратившиеся для
проведения программы ЭКО/ICSI и ПЭ, прошли обследование, строго
соответствовали критериям включения/исключения, подписали
добровольное информированное согласие на участие в исследовании.
Исследование было одобрено комиссией по этике биомедицинских
исследований при ФГБУ «НЦАГиП им. В.И. Кулакова» МЗ РФ (протокол
№1 от 08.02.2013 г).
В исследование включена 221 женщина. Основную группу
исследования составили 207 пациенток с трубно – перитонеальным фактором
бесплодия, которым проведена программа ЭКО в протоколе с antGnRH и
стимуляцией суперовуляции препаратами рФСГ. Из них у 41 пациентки с 1–2
неудачными попытками программы ЭКО в анамнезе в рамках подготовки к
настоящей программе ЭКО была произведена аспирационная пайпель–
биопсия эндометрия (исследуемая группа для изучения эндометрия).
39
Контрольную группу для изучения эндометрия составили 14 здоровых
фертильных женщин, имеющие здоровых детей (рисунок 1).
Рисунок 1. Дизайн исследования.
Пациентки с бесплодием (n=207) в зависимости от режима поддержки
ЛФ стимулированного цикла были разделены на 2 группы. Разделение на
группы осуществлялось методом случайного выбора.
1–ю группу составили пациентки, которые получали препараты
микронизированного прогестерона (Р) в дозе 600 мг/день с 1 – ых суток
после оплодотворения и однократную дозу трипторелина 0,1 мг п/к на 6 – е
сутки после оплодотворения (n=92).
40
2–ю группу составили пациентки, которые для поддержки ЛФ
получали только микронизированный Р в дозе 600 мг/день с 1 – ых суток
после оплодотворения (n=115).
Гормональный мониторинг ЛФ включал определение уровней ЛГ, Р,
Е2 и ХГч на 5 – й, 7 – й и 15 – й дни после оплодотворения. Концентрацию
гормонов в сыворотке крови определяли с использованием
иммуноферментных тест – систем фирмы «Hoffmann La Roche» на
автоматическом анализаторе Elecsys 2010 этой же фирмы (Швейцария), а
также хемилюминесцентных тест – систем фирмы DPC на автоматическом
анализаторе Immulite (USA).
В естественном цикле, предшествующем лечебному циклу ЭКО, на 7 – й
день после пика ЛГ в моче (ЛГ +7) у 41 пациентки с бесплодием и у 14
фертильных женщин была выполнена аспирационная пайпель – биопсия
эндометрия для проведения гистологического и иммуногистохимического
(ИГХ) исследования. День овуляции устанавливали по мочевому тесту на
овуляцию и при диагностическом УЗИ в течение изучаемого цикла.
2.2. Методы исследования
В соответствии с приказом № 107н Министерства здравоохранения
Российской Федерации от 30 августа 2012 года “О порядке использования
вспомогательных репродуктивных технологий, противопоказаниях и
ограничениях к их применению” проводили предварительное обследование
супружеской пары в рамках подготовки к программе ЭКО с использованием
общеклинических и специальных методов обследования:
1. общее и специальное гинекологическое обследование;
2. ультразвуковое исследование органов малого таза;
3. определение группы крови и резус – фактора;
4. клинический анализ крови;
5. гемостазиограмма;
41
6. анализ крови на сифилис, вирус иммунодефицита человека (ВИЧ),
гепатиты В и С;
7. исследование на флору из уретры, цервикального канала,
влагалища;
8. цитологическое исследование мазков шейки матки, кольпоскопия;
9. инфекционное обследование (уреаплазмоз, хламидиоз,
микоплазмоз, вирус простого герпеса, цитомегаловирус,
токсоплазмоз, краснуха);
10. гормональное обследование: ЛГ, ФСГ, АМГ, Е2, пролактин,
тестостерон, кортизол, ТТГ, Т4св;
11. заключение терапевта о состоянии здоровья;
12. заключение других специалистов по показаниям;
13. проводили обследование супруга пациентки: сбор анамнеза,
спермограмма, анализ мазков на наличие хронических инфекций,
исследование крови на сифилис, ВИЧ, гепатит В и С; при наличие
показаний – консультация и лечение у андролога;
14. по показаниям проводили медико–генетическое консультирование
супружеской пары.
2.2.1 Общеклинические методы исследования
Всех пациенток подвергали углубленному клиническому обследованию
по специально разработанной единой схеме – индивидуальной карте
обследования с изучением общего и акушерско–гинекологического анамнеза.
При сборе анамнеза обращали внимание на наследственность,
аллергоанамнез, перенесенные инфекционные и хронические соматические
заболевания. Детально оценивали характер менструального цикла и
особенности его становления (возраст менархе, регулярность и
продолжительность цикла, характер менструации, дисменорею), а также
репродуктивный анамнез пациенток (количество беременностей,
наступивших естественным путем и с помощью ВРТ, срочных и
42
преждевременных родов, абортов, самопроизвольных выкидышей,
неразвивающихся, внематочных беременностей, наличие осложненных
беременностей и родов, наличие живых детей и их развитие), уточнялось,
наступали беременности с настоящим или иным половым партнером.
Уделяли внимание анализу жалоб женщин, учитывали имеющиеся в
анамнезе генитальные инфекции, передающиеся половым путем (ИППП),
возраст начала половой жизни. Особое внимание обращали на наличие в
анамнезе оперативных вмешательств на органах малого таза, с обязательным
предоставлением выписки об объеме операции, течении послеоперационного
периода и результатах гистологического исследования.
Уделяли внимание изучению ранее проведенного лечения бесплодия, в
особенности предыдущие циклы ЭКО (клинические и эмбриологические
параметры), а также уделяли внимание толщине и структуре эндометрия при
мониторинге в стимулированных циклах.
Объективно оценивали такие параметры, как общее состояние
пациентки, тип телосложения, состояние кожных покровов, измерение роста
и массы тела пациенток, давали оценку состояния систем органов дыхания,
кровообращения, пищеварения, мочевыделения, нервной системы. По
данным общего осмотра проводилось вычислением индекса массы тела
(ИМТ), или индекса Brey G., по формуле [25].
ИМТ = масса тела (кг) / рост (м2).
Значения ИМТ от 19 до 24 кг/м2 расценивались как показатель
нормальной массы тела, от 25 кг/м2 до 29 кг/ м
2 — как избыточная масса,
более 29 кг/м2 — как ожирение.
2.2.2 Гинекологическое обследование
При оценке гинекологического статуса пациенток проводилось
бимануальное исследование, осмотр наружных половых органов, осмотр в
зеркалах влагалища и шейки матки, определяли состояние тела матки,
придатков, выявляли наличие объемных образований органов малого таза.
43
2.2.3 Лабораторные и инструментальные методы исследования
Выполняли микроскопическое исследование выделений из половых
путей (окраска мазков метиленовым синим, по Граму) и проводили
соответствующее лечение.
Материал для бактериологического исследования забирали
стерильными ватными тампонами из цервикального канала и боковых стенок
влагалища и помещали в стерильную пробирку. В условиях
микробиологической лаборатории проводили посев на питательные среды.
Оценивали рост в аэробных и анаэробных условиях через 7 дней с момента
посева.
Методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) определяли ДНК
хламидий, микоплазм, уреаплазм, вируса простого герпеса (ВПГ) и вируса
папилломы человека (ВПЧ).
2.2.4 Гормональное обследование
Гормональные методы исследования проводили в научно –
диагностической лаборатории ФГБУ «НЦАГиП имени академика В.И.
Кулакова» МЗ России (руководитель лаборатории – к.м.н. Т.Ю. Иванец).
Концентрацию гормонов в сыворотке крови определяли с использованием
иммуноферментных тест–систем фирмы «Hoffmann La Roche» на
автоматическом анализаторе Elecsys 2010 этой же фирмы (Швейцария), а
также хемилюминесцентных тест – систем фирмы DPC на автоматическом
анализаторе Immulite (USA).
За нормативные значения гормонов в плазме крови у включенных в
исследование пациенток репродуктивного возраста принимали данные,
представленные в таблице 1.
44
Таблица 1
Нормативные показатели концентрации гормонов в сыворотке крови
у женщин репродуктивного возраста
Гормональное исследование
(единицы измерения)
Нормативные показатели
ЛГ (МЕ/л) 2,3–15,0
ФСГ (МЕ/л) 2,0–10,0
Е2 (пкмоль/л) 150–480
Т (нмоль/л) 1,0–2,5
Прл (мМЕ/л) 100–500
К (нмоль/л) 100–500
Р (нмоль/л) 16–95
АМГ(нг/мл) 1,0–2,5
ДГЭА–С (мкмоль/л) 0,9–11,7
17–ОП (нмоль/л) 1,1–7,0
ТТГ (мМЕ/л) 1,0–3,8
Т4св ( нмоль/л) 9,0–20,0
Т3св (нмоль/л) 4,4–9,3
Антитела к ТРО (МЕ/л) до 60
Гормональный мониторинг ЛФ в программе ЭКО включал
определение уровней ЛГ, Е2, Р и ХГч на 5 – й, 7 – й и 15 – й дни после
оплодотворения.
45
Диагностика биохимической беременности осуществлялась на 15 – й
день после оплодотворения эмбрионов при концентрации ХГч в сыворотке
крови >20 МЕ/л.
2.2.5.Ультразвуковое исследование органов малого таза
Исследование выполняли на аппарате «Sonoline Sienna» («Siemens»,
Германия) с использованием трансвагинального датчика с частотой 6,5 МГц.
Измерения проводились при опорожненном мочевом пузыре с
использованием одноразового презерватива. В процессе обследования
определяли расположение, размеры, строение матки и яичников, оценивали
число антральных фолликулов, отсутствие объемных образований в малом
тазу, структуру и толщину эндометрия.
В цикле, предшествующем стимуляции овуляции, перед проведением
аспирационной пайпель – биопсии эндометрия на 6–7–й дни после пика ЛГ в
моче (19 – 23 – й день менструального цикла), также осуществляли УЗИ для
оценки толщины и структуры эндометрия, подтверждение наличия желтого
тела.
Первое УЗИ органов малого таза в стимулированном цикле выполнялось
на 2 – 3 – й день менструального цикла, далее – на 5 – 6 – й день
гонадотропной стимуляции и затем в день введения овуляторной дозы ХГч, в
день ТВП и в день переноса эмбрионов в полость матки.
Имплантацию подтверждали при визуализации плодного яйца по
данным УЗИ. Клиническую беременность подтверждали по данным УЗИ при
визуализации одного или двух плодных яиц, содержащих живые эмбрионы
через 5–6 недель после переноса. Прогрессирующей считалась беременность,
продолжающаяся после 12 – и недель после ПЭ.
2.2.6 Спермиологическое исследование эякулята
Оценка показателей сперматогенеза производилась дважды: при
предварительном обследовании в рамках подготовки к программе ЭКО и в
день ТВП. Перед проведением ТВП пациенту был рекомендован
46
соответствующий половой режим. Сбор материала производился в
стерильный контейнер.
Оценка показателей спермограммы производилась в соответствии с
нормативами всемирной организации здравоохранения ВОЗ (2010) (таблица
2) [139].
Таблица 2
Показатель Нормативы ВОЗ
Объем эякулята >2,0 мл
pH 7,2 – 8,0 ед
Вязкость 0,1 – 2,0 см
Время разжижения 10 – 60 мин
Лейкоциты <1 000 000 кл/мл
Концентрация сперматозоидов >20 млн/мл
Общее количество
сперматозоидов
>40 млн
Активноподвижные (А ) >25%
Активные и малоподвижные
(А + В ) >50%
Морфология ≥ 4 % нормальных форм
Жизнеспособных 75% или более
Агглютинация отсутствует
Клетки сперматогенеза 2 – 4 кл/100
Эритроциты отсутствуют
2.2.7 Специальные методы исследования.
Морфологическое исследование функционального слоя эндометрия
Аспирационная пайпель – биопсия эндометрия проводилась из области
дна матки с помощью аспирационной кюретки Pipelle de Cornier («Laboratoire
C.C.D.», Франция) на 6 – 7–й дни после пика ЛГ в моче (пик ЛГ + 7).
47
Материалы биоптатов фиксировали в 10% нейтральном формалине в
течение 24ч. Образцы были обработаны по общепринятой стандартной
методике и заключены в парафин. Срезы толщиной 4мкм готовили на
роторных микротомах и окрашивали гематоксилином и эозином.
Исследование гистологических препаратов проводилось в световом
микроскопе Carl Zeiss Axio Imager A2 при увеличении от х50 до х600.
Гистологическое датирование эндометрия, оценку процента клеток
поверхностного эпителия с наличием зрелых пиноподий осуществляли на
том же световом микроскопе при увеличении х400 в 5 полях зрения.
Пиноподии оценивались, как изобилующие, умеренные и
незначительные в зависимости от % занимаемой ими поверхности
эндометрия (> 40, 20 – 40 и <20 соответственно).
Гистологическое исследование эндометрия проводили в лаборатории
патоморфологии ФГБУ «НЦАГиП имени академика В.И. Кулакова»
МЗ России (руководитель лаборатории д.м.н., профессор Е.А. Коган).
Заключения формулировали в соответствии с современными стандартами,
изложенными в общепринятых фундаментальных руководствах [7].
2.2.8 Иммуногистохимическое исследование эндометрия
ИГХ реакции проводили так же в лаборатории патоморфологии ФГБУ
«НЦАГиП имени академика В.И. Кулакова» МЗ России на серийных
депарафинированных срезах толщиной 3–4 мкм по общепринятым
методикам (DAKO protocols).
Определение стероидных рецепторов проводили с использованием
мышиных моноклональных антител к эстрогеновым рецепторам (ER) (клон
1D5 RTU«DAKO», Дания) и прогестероновым рецепторам (РR – А) (клон 636
RTU«DAKO», Дания). Для выявления экспрессии лейкемия–ингибирующего
фактора (LIF) использовали первичные антитела к LIF (R@DSystems, USA,
clone: 9824, 1:100).
48
Для выявления экспрессии GnRH использовали первичные антитела к
GnRH (поликлональные кроличьи антитела Abcam 1:400). Для выявления
экспрессии GnRHR и HOXA 10 использовали первичные антитела к GnRHR
и HOXA 10 (поликлональные кроличьи антитела Gene Tex 1:100).
Анализ результатов ИГХ реакций для ER и РR – А проводили с учетом
количества окрашенных клеток и интенсивности окраски в железах и строме
эндометрия, используя метод гистологического счета Н – score по формуле:
HS=1a±2b±3c, где а – процент слабо окрашенных клеток, b – процент
умеренно окрашенных клеток, с – процент интенсивно окрашенных клеток;
1,2,3 – интенсивность окрашивания, выраженная в баллах.
Степень выраженности экспрессии ER и РR – А расценивали
следующим образом: 0 – 10 баллов – отсутствие экспрессии, 11 – 100 баллов
– слабая экспрессия, 101 – 200 баллов – умеренная экспрессия, 201 – 300
баллов – выраженная экспрессия. Рассматривали также коэффициент PR/ ER,
рассчитанный по строме.
Результаты ИГХ реакции для LIF, GnRH, GnRHR и HOXA 10 оценивали
полуколичественным методом в баллах по общепринятой методике:
отсутствие иммунокрашенных клеток (–) – 0 баллов, менее 5%
иммуноокрашенных клеток (±) – 0,5 баллов, менее 20% иммунокрашенных
клеток (+) – 2 балла, от 20 до 40% окрашенных клеток (++) – 4 балла, более
40% окрашенных клеток (+++) – 6 баллов.
2.2.9 Молекулярно – генетические методы исследования
Анализ полиморфизма генов в генотипе пациенток производился в
лаборатории молекулярно – генетических методов ФГБУ «НЦАГиП им.
академика В.И. Кулакова» МЗ РФ (заведующий – д.б.н. Трофимов Д.Ю.).
Дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) для проведения генотипирования
выделяли из образцов периферической крови. Определение замен
однонуклеотидных последовательностей проводили с применением
полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Пациенткам проводилось генотипирование по указанным локусам:
49
Ген эстрогеновых рецепторов (ESR)1 Pvull T>С [rs2234693];
ESR1 Xbal A>G [rs9340799];
ESR1 2014 G>A [rs2228480];
ESR2 984 G>A(Val328Val) [rs4986938];
Ген рецептора фолликулостимулирующего гормона (FSHR) 2039 G>A
(Asn680Ser) [rs6166];
Ген рецептора лютеинизирующего гормона (LHCGR):935 A>G (Asn312Ser)
rs2293;
LHCGR:872 A>G(Asn291Ser) Rs12470652;
Ген рецептора прогестерона (PGR): 331 G>A rs10895068;
PGR: 38 T>C Rs484389.
ПЦР и определение температуры плавления олигонуклеотидных проб
проводили при помощи детектирующего амплификатора ДТ – 96 (ООО
«НПО ДНК – Технология», Россия). ДНК для генотипирования выделяли из
образцов периферической крови взятой с ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная
кислота) в качестве антикоагулянта. До типирования полученные образцы
ДНК находились в морозильных установках при температуре – 20°С. Из
полученных образцов крови ДНК выделяли методом Higuchi (1989) с
модификациями. Полученную кровь объемом 0,5 мл, взятую на ЭДТА в
качестве антикоагулянта, смешивали в микроцентрифужных пробирках
(объемом 1,5 мл) типа Эппендорф с лизирующим раствором (0,5 мл),
состоящим из 10 мМ Трис – HCl рН 7,5, 0,32М сахарозы, 5 мМ MgCl, 1%
Тритона Х – 100 центрифугировали. Далее проводилось центрифугирование
в течение 1 мин при 10 000 об/мин, после чего супернатант удалялся, а
осадки клеточных ядер двукратно отмывали соответствующим буфером. В
дальнейшем протеолиз проводили в буферном растворе (50 мкл),
содержащем 10 мМ Трис – HCl рН 8,3, 50мМ KCl, 0,45% NP40, 045% Твина
20 и 250 мкг/мл протеиназы К, 2,5мМ MgCl, в течение 20 минут при
температуре 37°С. Инактивация протеиназы К производилась в течение 20
минут при температурном режиме 98°С. Определялась концентрация ДНК на
50
ДНК – минифлуориметре (Ноеfer, США), которая составляла примерно 50 –
100 мкг/мл. Идентификацию однонуклеотидных полиморфизмов проводили
с помощью модифицированного метода «примыкающих проб» (adjacent
probes, kissing probes) с применением оригинальных олигонуклеотидов.
Определение SNPs (одиночные нуклеотидные полиморфизмы)
проводилось ПЦР с праймерами, которые связываются с комплементарными
последовательностями, и между циклами нагревания (для денатурации ДНК)
и охлаждения (для обеспечения синтеза) происходит синтез копии данной
области гена [14]. Праймеры были общими для обоих вариантов
нуклеотидной последовательности, после чего температуру реакционной
смеси для гибридизации матрицы с олигонуклеотидными пробами снижали.
Для определения типа последовательности использовали два варианта
олигонуклеотидов. В первом случае олигонуклеотиды метили флуорофором,
во втором – гасителем флуоресценции. Этот процесс протекал при помощи
ферментов, которые способны соединять нуклеотидные основания и
выдерживать необходимые для денатурации температурные режимы [14]. В
качестве такого фермента использовалась Taq – полимераза, блокированная
специфическими антителами, чтобы предотвратить неспецифический отжиг
праймеров и повысить чувствительность тест – систем.
В процессе генотипирования использовался один общий олигонуклеотид
с гасителем флуоресценции и два олигонуклеотида сиквенс – специфичных,
несущих различные флуорофоры. Соответствующие тому или другому типу
последовательности олигонуклеотидные пробы метили флуорофорами, это
позволяло определять два типа в одной пробирке. Далее в режиме реального
времени измерялся уровень флуоресценции в процессе температурной
денатурации дуплексов олигонуклеотидов и полученных матриц.
Определение генотипа происходило путем анализа кривых плавления. В том
случае, если в анализируемом образце содержался только один тип
нуклеотидной последовательности гена, т.е. гомозиготен по данному
полиморфизму, температура плавления для пробы, образующей
51
совершенный дуплекс, была выше, чем для пробы, образующей
несовершенный дуплекс. В том случае, если анализировался гетерозиготный
образец, содержащий два типа нуклеотидной последовательности, каждый из
вариантов проб мог образовать совершенный дуплекс, поэтому температуры
плавления были одинаковы. При использовании описанных выше методик
стало возможным выявить изменения даже в одном нуклеотидном основании
в пределах исследуемого гена [14].
2.2.10 Протокол стимуляции суперовуляции
Стимуляцию яичников проводили по стандартному протоколу с
antGnRH с использованием препаратов рФСГ. Со 2–4 дня менструального
цикла (т.е. в раннюю фолликулиновую фазу) при подтвержденном по данным
УЗИ отсутствии функциональных кист яичников, толщине эндометрия не
более 4 мм и наличии более 4 антральных фолликулов. Стартовая доза
препаратов рФСГ подбиралась индивидуально и колебалась от 150 МЕ до
300 МЕ в зависимости от индивидуальных параметров пациентов (возраст,
уровень фолликулостимулирующнго гормона, уровень АМГ, количество
антральных фолликулов и ответ на предыдущую стимуляцию). Доза
индуктора увеличивалась или снижалась в зависимости от ответа яичников
на проводимую стимуляцию.
Для предотвращения паразитарного пика эндогенного ЛГ, при
достижении фолликулов диаметра 14–15мм начиналось введение препарата
antGnRH в дозе 0,25мг/сут подкожно.
Для финального созревания ооцитов назначали овуляторную дозу ХГч
10000 МЕ при визуализации трех и более фолликулов ≥17мм в диаметре и
толщине эндометрия ≥8 мм по данным УЗИ. Аспирацию ооцитов
осуществляли через 35 – 36 часов после введения триггера овуляции
(рисунок 2).
52
Рисунок 2. Стандартный протокол с antGnRH
2.2.11 Трансвагинальная пункция яичников
ТВП яичников проводилась в асептических условиях через 35 – 36 часов
после инъекции препарата ХГч под кратковременным внутривенным
наркозом посредством вакуумной аспирации фолликулов под
трансвагинальным ультразвуковым мониторингом с использованием
одноразовых игл (Vitrolife IVF Media). Аспирация фолликулярной жидкости
проводилась под отрицательным давлением в диапазоне 90 – 100 мм водного
столба в подогретые стерильные пробирки, содержащие среду с гепарином
(0,5мл) (2500 ЕД/мл), предотвращающую образование кровяных сгустков.
Пробирки незамедлительно передавались эмбриологу. Содержимое каждой
из доставленных пробирок помещалось в чашку Петри, после чего
содержимое изучалось на предмет присутствия ооцит – кумулюсного
комплекса, а также оценивалась степень зрелости полученных ооцитов.
53
2.2.12 Эмбриологический этап, перенос эмбрионов и
посттрансферный период программы ЭКО/ICSI
На эмбриологическом этапе ооциты идентифицировались сразу же после
аспирации фолликулов при помощи диссекционного микроскопа на нагретой
поверхности. Клетки преинкубировались in vitro в течение 2 – 3 часов при
температуре 37°С в атмосфере с 5% СО2. Преинкубация, оплодотворение
ооцитов или ICSI, а также культивирование эмбрионов осуществлялось в
средах для культивирования фирмы «ORIGIO» (Дания).
При нормальных результатах спермограммы по критериям (ВОЗ, 2010)
[139] проводилось классическое ЭКО. Оплодотворение методом ICSI
выполнялось при сочетании умеренной патозооспермии и наличии 2 – х
неудачных попыток классического ЭКО.
На эмбриологическом этапе оценивали количество и качество
полученных ооцитов, количество полученных эмбрионов (морул,
бластоцист) и качество полученных эмбрионов (класс A, B, C)
Оплодотворение расценивали как нормальное в случае наличия двух
пронуклеусов через 14 – 16 часов после ЭКО/ICSI. При отсутствии двух
пронуклеусов оплодотворение считали несостоявшимся, а в случае
определения 1 – о или более 2 – х пронуклеусов – аномальным. Качество
полученных эмбрионов оценивалось через 42 – 44ч.
Оценка качества эмбрионов осуществлялась на основании совокупности
следующих параметров: скорость дробления эмбрионов, симметричность
бластомеров, степень цитоплазматической фрагментации (<10%, 10–30%,
>30%), мультинуклеарность бластомеров. К эмбрионам 1–2 степени качества
были отнесены эмбрионы, находящиеся на стадии развития двух
бластомеров в конце первых суток культивирования, 4–6 бластомеров – на 2
сутки, 7–9 бластомеров (или имеющие признаки компактизации) – на 3–е
сутки культивирования. Степень фрагментации эмбрионов 1–ой степени
качества не превышала 10%. Эмбрионы 2–й степени качества были
фрагментированы на 10–30%. Наличие цитоплазматической фрагментации
54
более 30%, также как монуклеарность в одном или более бластомерах
эмбриона, расценивалась как маркер эмбрионов, имеющих низкий
имплантационный потенциал.
К эмбрионам хорошего качества отнесены также эмбрионы, достигшие
стадии бластоцисты на 5 сутки культивирования. Бластоциста, имеющая,
примерно 150–200 клеток, компактную внутреннюю клеточную массу и
хорошо структурированный трофектодерм, расценивалась как «хорошая».
Перенос эмбрионов в полость матки осуществлялся на 3 или 5 сутки
культивирования в асептических условиях с использованием катетера
Wallace. Количество переносимых эмбрионов не превышало двух.
Оставшиеся эмбрионы 1 – 2 степени качества были криоконсервированы.
Поддержку посттрансферного периода осуществляли в зависимости от
рандомизации, пациентки в 1 – й группе получали комбинированную
поддержку ЛФ (aGnRH + микронизированный Р) – 0,1 мг трипторелина
вводился на 6 – й день после оплодотворения in vitro и 600 мг
микронизированного прогестерона вагинально со следующего дня после
ТВП. Во 2 – й группе пациентки получали стандартную поддержку ЛФ
(микронизированный Р) – 600 мг микронизированного прогестерона
вагинально со следующего дня после ТВП.
2.3 Статистический анализ полученных результатов
Статистическая обработка данных выполнена на индивидуальном
компьютере с использованием программы IPM SРSS Statistics, версия 21.
Все полученные в нашем исследовании количественные
анамнестические, клинические, лабораторные и инструментальные данные
обработаны методом вариационной статистики. Для каждого
количественного параметра были определены: среднее значение (М),
среднеквадратичное отклонение (δ), ошибка среднего (m), медиана (Ме), 95%
доверительный интервал (ДИ), для качественных данных – частоты (%).
55
При нормальном характере распределения данных результаты
представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего (М±m). При
распределении данных, отличных от нормального (значение теста
Колмогорова – Смирнова менее 0,05), исследованные количественные
показатели представлены в виде Ме (L–H), где Ме – медиана, L – 25
(нижний) квартиль, H – 75 (верхний) квартиль.
Для сравнения непараметрических данных применяли метод Манна–
Уитни (для 2–х групп) для несвязанных совокупностей; критерий χ2 для
таблиц сопряженности признаков 2*2, 2*3 и 2*4 (для сравнения частот
встречаемости признаков в анализируемых группах).
Статистически значимыми считали отличия при р<0,05 (95% уровень
значимости).
Качественные показатели оценивались с помощью метода χ2 с
поправкой Йетса на непрерывность и точный критерий Фишера для малых
выборок.
Критерием значимости статистических различий принимали 95%–ный
уровень значимости (р<0,05).
Для создания математической модели использовался метод бинарной
логистической регрессии. При построении уравнения бинарной
логистической регрессии использовался метод обратной селекции. Качество
приближения регрессионных моделей при каждом последующем шаге
оценивалось при помощи функции подобия – отрицательного удвоенного
значения логарифма этой функции (-2LL). Оценка качества полученных
моделей проводилась с помощью ROC-анализа.
Для расчёта оптимального значения величины порога отсечения Р
(точки cut off) и оценки качества модели использовали ROC-анализ (Receiver
Operator Characteristic - операционная характеристика приёмника). Основой
данного анализа является построение так называемой ROC-кривой. ROC-
кривая показывает зависимость количества верно классифицированных
положительных наблюдений от количества неверно классифицированных
56
отрицательных наблюдений. При этом предполагается, что у классификатора
имеется некоторый параметр, варьируя который, мы будем получать то или
иное разбиение на два класса. Этот параметр часто называют порогом, или
точкой отсечения (cut-off value). В зависимости от него будут получаться
различные величины ошибок I и II рода.
Для получения численного значения клинической значимости теста, а также
для сравнения двух тестов, используется показатель AUC (Area Under Curve),
который может быть рассчитан при помощи численных методов.
Теоретически AUC изменяется от 0 до 1.0, но, поскольку модель всегда
характеризуются кривой, расположенной выше положительной диагонали, то
обычно говорят об изменениях от 0.5 ("бесполезный" классификатор) до 1.0
("идеальная" модель). Непосредственная оценка эффективности
классификации и качества модели была получена путем расчета AUC с
помощью метода трапеций и приводится с 95% доверительным интервалом.
Оценка качества модели проводилась на основании экспертной шкалы
(таблица 3).
Для установления порога отсечения («cut-off») проводился пересмотр
значений классификационной функции от максимального до минимального
значения. Для каждого значения проводилось разделение групп с
определением чувствительности и специфичности. Критерием выбора порога
отсечения выбрано требование максимальной суммарной чувствительности и
специфичности модели.
Таблица 3
Интервал AUC Качество модели
0,9-1,0 Отличное
0,8-0,9 очень хорошее
0,7-0,8 Хорошее
0,6-0,7 Среднее
0,5-0,6 неудовлетворительное
57
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
В соответствии с целью исследования и поставленными задачами в
исследование была включена 221 женщина, из них основную группу
составили 207 пациенток с трубно – перитонеальным фактором бесплодия,
которые получали лечение в программе ЭКО, из них 41 пациентка с
1–2 неудачными попытками программ ЭКО в анамнезе (исследуемая группа
для изучения эндометрия). Контрольную группу для изучения
эндометрия составили 14 здоровых фертильных женщин, имеющих здоровых
детей.
Обследование пациенток в протоколе с antGnRH проводилось по
общепринятому алгоритму, установленному приказом Министерства
здравоохранения РФ «О порядке использования ВРТ, противопоказаниях и
ограничениях к их применению» № 107 Н от 30.08.2012 г. На момент
проведения исследования по результатам общеклинических методов
обследования, а также при гормональном и инфекционном скрининге
патологии у включенных в исследование пациенток с бесплодием выявлено
не было. У всех пациенток с бесплодием отсутствовали противопоказания
для проведения программы ЭКО со стимуляцией суперовуляции. Все
пациентки были ознакомлены с целью и поставленными задачами
исследования, подписали информированное согласие.
3.1. Клинико–анамнестическая и лабораторная характеристика
включенных в исследование пациенток
Возраст обследуемых пациенток с бесплодием колебался от 20 до 38 лет,
медиана составила 32 года (интерквартильный интервал 29–35 лет). Медиана
возраста фертильных женщин составила 31 год (интерквартильный интервал
28–35 лет).
3.1.1 Перенесенные заболевания
Хронические экстрагенитальные заболевания встречались у каждой
третьей больной с бесплодием. В структуре преобладали болезни
58
желудочно–кишечного тракта и мочевыделительной системы. Так,
хронический гастрит отмечен у 27,5%, хронический пиелонефрит у 15,5%,
хронический холецистит – у 9,7% пациенток. Хронический тонзиллит
отмечен – у 18,8% пациенток.
Данные о хронических экстрагенитальных заболеваниях пациенток с
бесплодием представлены в таблице 4.
Таблица 4
Хронические экстрагенитальные заболевания у пациенток с бесплодием
Нозологические формы хронических
экстрагенитальных заболеваний
Основная группа
(n=207)
Хронический гастрит 27,5%
Хронический пиелонефрит 15,5%,
Хронический холецистит 9,7%
Хронический тонзиллит 18,8%
У фертильных женщин наиболее часто встречался хронический
тонзиллит (39,1%), хронический гастрит (20%) и хронический пиелонефрит
(10%).
Данные хронические заболевания у пациенток с бесплодием были в
стадии ремиссии и не являлись противопоказанием для проведения
программы ЭКО, наступления и вынашивания беременности.
В структуре перенесенных гинекологических заболеваний у пациенток с
бесплодием преобладал хронический сальпингоофорит (41,5%), при этом на
перенесенные ИППП указывали 29,3 % пациентки. Патология шейки матки
была выявлена у 19,3% женщин, из них каждой второй ранее были
выполнены деструктивные методы лечения. Полипы эндометрия встречались
у 11,3% пациенток, вместе с тем отмечена низкая частота гиперплазии
эндометрия–2,4%. Хронический эндометрит, подтвержденный
гистологическим исследованием соскоба слизистой тела матки, был выявлен
59
у 5,3% женщин. Наружный генитальный эндометриоз отмечен в анамнезе у
18,4% пациенток. Миома матки встречалась у 15,5% женщин, из них каждой
второй ранее было выполнено оперативное лечение в объеме консервативной
миомэктомии. Данные о перенесенных гинекологических заболеваниях
представлены в таблице 5.
Таблица 5
Структура гинекологических заболеваний у пациенток с бесплодием
Перенесенные гинекологические
заболевания
Основная группа
(n=207)
Хронический сальпингоофорит 41,5%
ИППП 29,3%
Миома матки 15,5%
Наружный генитальный эндометриоз 18,4%
Патология шейки матки 19,3%
Полип эндометрия 11,3%
Хронический эндометрит 5,3%
Полип цервикального канала 1%
Гиперплазия эндометрия 2,4%
Из перенесенных гинекологических заболеваний у 35,7% у фертильных
женщин наблюдалась патология шейки матки, у 28,5% – хронический
сальпингоофорит. Полип эндометрия в анамнезе был в 14,2% случаев.
Оперативные вмешательства на органах брюшной полости имелись в
анамнезе у 5,3% пациенток с бесплодием, из них у 3% – аппендэктомия без
осложнений, у 1,3% – аппендэктомия, осложненная перитонитом, у 0,5%
показанием к хирургическому лечению явилась острая кишечная
непроходимость, у 0,5% – резекция толстого кишечника с наложением и
последующим закрытием колоностомы.
60
Оперативное лечение на органах малого таза было выполнено у 48,8%
пациенток с бесплодием. Наиболее часто показанием для оперативного
лечения явились внематочная беременность – у 20,7% пациенток и спаечный
процесс органов малого таза – у 19,3%, наружный генитальный эндометриоз
I–II степени распространения – у 11,8% пациенток с бесплодием.
Консервативная миомэктомия выполнена у 7,2% женщин. Реконструктивно –
пластические операции на трубах перенесли 2,4% женщин. Ни у одной
пациентки после операции беременность не наступила. Показания к
хирургическому лечению представлены в таблице 6.
Таблица 6
Показания к хирургическому лечению на органах малого таза у
пациенток с бесплодием
Нозологические формы
гинекологических заболеваний
Основная группа
(n=207)
Спаечный процесс органов малого
таза
40 (19,3%)
Наружный генитальный
эндометриоз
25 (11, 8%)
Внематочная беременность 43 (20,7%)
Миома матки 43 (15,6%)
Гидросальпинкс 11(5,3%)
Апоплексия яичника 6 (2,9%)
У фертильных женщин оперативных вмешательств на органах малого
таза и брюшной полости не было.
Гистероскопия с раздельным диагностическим выскабливанием
слизистой тела матки и цервикального канала была выполнена у 30%
пациенток с бесплодием.
61
3.1.2 Менструальная функция обследованных пациенток
Анализ становления и характера менструального цикла показал, что
средний возраст менархе был в пределах от 10 до 18 лет (13,0±0,1).
Продолжительность менструального цикла в среднем составила 28,1±0,1
дней при средней длительности кровотечения 4,4±0,05 дня. Изменений
характера становления и продолжительности менструального цикла, а также
длительности кровотечения у пациенток с бесплодием и фертильных женщин
выявлено не было.
3.1.3 Репродуктивный анамнез
Длительность бесплодия колебалась от 1 до 18 лет и в среднем
составила 5,6±0,2 лет. Первичное бесплодие было выявлено у 124 (59,9%),
вторичное – у 83 (40,1%) пациентов. Бесплодие было обусловлено трубно –
перитонеальным фактором у 148 (71,4%) женщин, у 59 (28,6%) женщин
трубно-перитонеальный фактор бесплодия в сочетании с умеренной
патозооспермией.
Изучение репродуктивного анамнеза пациенток с вторичным
бесплодием показало, что у 26,5% из них были своевременные роды.
Наиболее частыми исходами беременности были искусственный аборт
(30,1%) и внематочная беременность (32,5%). Неразвивающаяся
беременность имела место у 24,1% пациенток, а самопроизвольный выкидыш
отмечался в анамнезе у 13,7% пациенток.
3.1.4 Ранее проведенное лечение бесплодия
Анализ характера и результатов проведенного ранее лечения бесплодия,
предшествующего проведению программы ЭКО показал, что у 26 (12,6%)
женщин проведено от 1 до 3 циклов контролируемой индукции овуляции
(КИО). У 1 (0,5%) из них наступила беременность, которая закончилась
самопроизвольным выкидышем на раннем сроке беременности. КИО в
сочетании с внутриматочной инсеминацией (ВМИ) спермой мужа была
проведена у 6 (2,9%) женщин.
62
Попытки ЭКО или ЭКО/ICSI имели в анамнезе 46,3% пациенток,
в том числе у 52% пациенток была 1 попытка, у 48% – 2 попытки
ЭКО. Беременность наступила в 10 случаях, из них у 3 женщин закончилась
самопроизвольным выкидышем, у 6 – неразвивающейся беременностью и у 1
– внематочной беременностью. Программа криопереноса была проведена у
10 (4,8%) пациенток, из них у 1 (0,5%) наступила беременность, которая
закончилась родами.
3.1.5 Гормональные параметры исследуемых пациенток
Уровни гонадотропных и стероидных гормонов в сыворотке крови у
всех обследованных женщин на 2 – 3 день менструального цикла на момент
вступления в программу ЭКО находились в пределах нормальных значений.
Данные гормональных параметров исследуемых пациенток представлены в
таблице 7.
Таблица 7
Базальные уровни гормонов исследуемых пациенток
Параметры Исследуемые пациентки (n=207)
Ме (L–H)*
ФСГ, МЕ/л 7,0
(5,7–8,0)
ЛГ, МЕ/л 4,1
(3,25–5,2)
Е2, пмоль/л 144,5
(99–189)
АМГ, нг/мл 2,3
(1,5–3,7) * показатели представлены в виде Ме (L–H), где Ме – медиана, L – 25 (нижний) квартиль,
H – 75 (верхний) квартиль.
Оценка структуры патозооспермии показала, что у 59 супругов (28,8%)
наблюдались умеренные нарушения сперматогенеза, которые наиболее часто
проявлялись в виде астенозооспермии I–II степени (49,8%) и
астенотератозооспермии I–II степени (26,9%).
63
Таким образом, анализ клинико – анамнестических и лабораторных
данных показал, что исследуемые пациентки представлены соматически
здоровыми женщинами репродуктивного возраста преимущественно с
трубно – перитонеальным фактором бесплодия (71,4%), нормальными
показателями овариального резерва, у 24,1% женщин отмечена одна
неудачная попытка ЭКО в анамнезе, две неудачные попытки ЭКО в
анамнезе были у 22,2%.
3.2. Сравнительный анализ исходных клинико–анамнестических
показателей в зависимости от режима ведения лютеиновой фазы
В программе ЭКО в зависимости от используемого режима ведения ЛФ
пациентки были разделены на 2 группы (n=207):
1 группа – пациентки, которые для поддержки ЛФ получали препараты
микронизированного Р в дозе 600 мг/день с 1–ых суток после ТВП и
однократную дозу трипторелина 0,1 мг п/к на 6–е сутки после
оплодотворения (комбинированный режим поддержки ЛФ) (n=92).
2 группа – пациентки, которые для поддержки ЛФ получали только
микронизированный Р в дозе 600 мг/день с 1–ых суток после ТВП
(стандартный режим поддержки ЛФ) (n=115).
3.2.1. Возрастная характеристика пациенток
На основании проведенного анализа распределения пациенток,
включенных в исследование, в зависимости от возрастных характеристик
статистически значимых возрастных различий у женщин в группах
стандартного и комбинированного режима поддержки ЛФ не было выявлено.
Медиана возраста включенных в исследование пациенток была одинакова в
обеих группах сравнения – 32 года (интерквартильный интервал в этих
группах составил 29–35 лет), р=0,749. Данные о возрасте пациенток
представлены на рисунке 3.
64
Рисунок 3. Распределение возраста в исследуемых группах
3.2.2. Менструальная функция пациенток
В группе пациенток, получавших комбинированный режим
поддержки ЛФ, средний возраст менархе составил 13,1±0,2 года, что было
сопоставимо с аналогичным показателем пациенток в группе сравнения
(13,3±0,1), р=0,110. Продолжительность менструального цикла была
сопоставима в двух группах и составила в 1 – й группе 28,5±0,3 дня, во 2 – й
— 28,8±0,1 дня (р=0,053). Также не было выявлено достоверных различий в
длительности менструального кровотечения у пациенток в группе с
комбинированным и стандартным режимом поддержки ЛФ (соответственно
4,5±0,07 и 4,8±0,1 дня; р=0,110).
Таким образом, мы не выявили статистически значимых различий в
менструальной функции пациенток обеих групп.
Особенности менструальной функции пациенток обеих групп
представлены в таблице 8.
65
Таблица 8
Характеристика менструальной функции в исследуемых группах
Параметры Основная группа (n=207)
1 группа
Комбинированный
режим поддержки
ЛФ (n=92)
2 группа
Стандартный
режим поддержки
ЛФ (n=115)
p
Возраст менархе, (М±m) 13,1±0,1 13,3±0,1 0,110
Длительность
менструации, (М±m)
4,5±0,07 4,8±0,1 0,053
Длительность
менструального цикла,
(М±m)
28,5±0,3 28,8±0,1 0,110
3.2.3 Репродуктивный анамнез пациенток
В результате проведения предыдущих программ ЭКО и ПЭ
беременность наступила у 12,1% пациенток 1–й группы и у 16,6% пациенток
2–й группы.
Для пациенток с вторичным бесплодием был проведен анализ
репродуктивного анамнеза. У женщин в 1–й группе в 20,5% случаев
беременность закончилась родами, в 29,4% – абортом на раннем сроке
беременности, в 26,4% случаев произошло самопроизвольное прерывание
беременности, в 44,1% была диагностирована внематочная беременность, у
20,5% пациенток – неразвивающаяся беременность. У пациенток 2–й группы
роды были в 32,6% случаев, у 32,6% беременность завершилась абортом на
раннем сроке, в 8,1% случаев произошло самопроизвольное прерывание
беременности, внематочная и неразвивающаяся беременность была
диагностирована с одинаковой частотой – в 27,6% случаев.
Сравнительная характеристика типа бесплодия представлена в таблице
9.
66
Таблица 9
Сравнительная характеристика типа бесплодия в исследуемых группах
Параметры Основная группа (n=207)
1 группа
Комбинированный
режим
поддержки ЛФ
(n=92)
2 группа
Стандартный
режим
поддержки ЛФ
(n=115)
p
Длительность бесплодия,
(М±m)
5,5 ±0,4 5,7±0,3 0,446
Характер бесплодия:
первичное
вторичное
58 (63%)
34 (37%)
67 (58,3%)
48 (41,7%)
0,486
Фактор бесплодия:
Трубно-перитонеальный
фактор
Сочетанный фактор
66 (71,8%)
26 (28,2%)
82 (71,4%)
33 (28,6%)
0,974
0,876
Как видно из представленных в таблице данных, длительность
бесплодия в группе пациенток с комбинированным режимом поддержки ЛФ
составила в среднем – 5,5 ±0,4 лет, что было сопоставимо с группой со
стандартной поддержкой ЛФ – 5,7±0,3 лет, р=0,446. Первичное бесплодие в
группе комбинированной поддержки ЛФ выявлено у 58 (63%) пациенток,
вторичное – у 34 (37%), в группе стандартной поддержки ЛФ первичное
бесплодие выявлено у 66 (57,5%) пациенток, вторичное – у 49 (42,5%),
р=0,486. При проведении анализа данных об этиологии бесплодия у
обследованных пациенток не были выявлены статистически значимые
различия между группами (р>0,05). Трубно – перитонеальный фактор
бесплодия был выявлен у 71,8% пациенток в группе комбинированного
режима поддержки ЛФ и 71,4% – в группе пациенток, получавших
67
стандартную поддержку ЛФ (р>0,05), сочетанное бесплодие наблюдалось у
28,2% и 28,6% соответственно (р>0,05).
3.3. Результаты оценки морфофункционального состояния и
имплантационного потенциала эндометрия пациенток
На этапе подготовки к программе ЭКО с целью оценки
морфофункционального состояния и имплантационного потенциала
эндометрия было проведено морфологическое и ИГХ исследование на
материале Pipelle биопсий эндометрия, полученных в «окно имплантации»
естественного цикла, в день определяемый по мочевому тесту на овуляцию
(пик ЛГ+7) от 41 пациентки с бесплодием, имеющих 1–2 неудачные попытки
ЭКО в анамнезе, которые обратились для продолжения лечения бесплодия
(основная группа) и от 14 фертильных женщин, имеющих здоровых детей
(группа сравнения).
3.3.1. Морфологическая характеристика эндометрия
Анализ морфологической структуры эндометрия показал, что у
большинства пациенток исследуемой группы наблюдалась секреторная
трансформация эндометрия, при этом ранняя стадия фазы секреции
обнаружена у 5 (12,2%), средняя стадия фазы секреции – у 32 (78%) и
поздняя стадия фазы секреции – у 4 (9,8%). В группе контроля также
превалировал эндометрий средней стадии фазы секреции у 13 (92,9%),
ранняя стадия фазы секреции наблюдалась – у 1 (7,1%) женщины (таблица
10).
Таблица 10
Результаты морфологического исследования эндометрия
Стадия фазы
секреции
Группы
Пациентки с бесплодием (n=41)
Фертильные женщины
(n=14)
Ранняя 5 (12%) 1 (7,1 %)
Средняя 32 (78%) 13 (92,9%) Поздняя 4 (9,8%) 0 (0%)
68
Результаты морфологического исследования эндометрия показали, что
в исследуемой группе зрелые пиноподии наблюдались у 35 (85,4%),
регрессирующие у 6 (14,6%) пациенток, тогда как в контрольной группе у
всех женщин выявлялись зрелые пиноподии (100%). При этом количество
клеток поверхностного эпителия, содержащих зрелые пиноподии у
пациенток с бесплодием было ниже (медиана 20%, интерквартильный
интервал 17–25%), чем в группе фертильных женщин (медиана 30%,
интерквартильный интервал 20–35%; р=0,003).
Таким образом, в обеих группах преобладала средняя фаза секреции,
при этом количество клеток поверхностного эпителия, содержащих зрелые
пиноподии, было существенно ниже у пациенток с бесплодием по сравнению
с группой контроля (рисунок 4).
а б
Рисунок 4. Микрофотографии препаратов эндометрия (окраска
гематоксилином и эозином):
a — основная группа: эндометрий ранней стадии секреции, зрелые
пиноподии не определяются ×400;
б — контрольная группа: эндометрий средний стадии секреции, зрелые
пиноподии развиты умеренно ×400
3.3.2. Иммуногистохимическое исследование эндометрия
Известно, что Р влияет на эндометрий преимущественно через
активацию прогестероновых рецепторов (РR), которые относятся к семейству
ядерных рецепторов [4]. РR широко изучаются в контексте рецептивности
69
эндометрия. В их структуре выделяют два различных по размеру белка РR –
А и РR – В. РR – А и РR – В экспрессируются в эпителиальных и
стромальных клетках в фазу пролиферации, их экспрессия снижается в
секреторную фазу в клетках эпителия, а в строме остается преимущественно
РR – А. Нарушение функции или структуры одного или обоих рецепторов
неизбежно вызовет препятствие для взаимодействия с Р с последующим
развитием устойчивости к Р [6].
РR выявлялись в виде коричневого окрашивания ядер клеток эпителия и
стромы эндометрия. Анализ ИГХ экспрессии маркера в эндометрии в «окно
имплантации» (ЛГ+7) у пациенток с бесплодием показал высокий уровень
РR в железах и строме эндометрия в обеих группах. В железах экспрессия РR
колебалась от 10 до 180, в строме – от 10 до 220. Следует отметить, что
количество РR в железах (медиана 165 и 160, интерквартильный интервал
140–180 и 132,5–180; р=0,980) и строме эндометрия (медиана 160 и 170,
интерквартильный интервал 112,5–177 и 110–180; р=0,445) у пациенток с
бесплодием было сопоставимо с таковыми показателями у фертильных
женщин (таблица 11).
Таблица 11
Экспрессия РR и ER в эндометрии в «окно имплантации» у пациенток с
бесплодием и фертильных женщин
Параметры Пациентки с
бесплодием (n=41)
(Ме, L–H)*
Фертильные
женщины (n=14)
(Ме, L–H)
р
РR железы 165(140–180) 160(132,5–180) 0,980
РR строма 160(112,5–177) 170(110–180) 0,445
ER железы 120(82,5–147,5) 80(62,5–102,5) 0,012
ER строма 35(20–47) 75(60–101) 0,001
РR/ER строме 5,5(2,45–8,85) 2,7(2,5–3,14) 0,035
* показатели представлены в виде Ме (L–H), где Ме – медиана, L – 25 (нижний) квартиль,
H – 75 (верхний) квартиль.
70
Другим немаловажным фактором, влияющим на имплантацию,
являются эстрогеновые рецепторы (ER). В настоящее время установлены α –
и β – субтипы ER. Известно, что их экспрессия увеличивается в
эпителиальных и стромальных клетках эндометрия в фазу пролиферации и
снижается в секреторную фазу. Экспрессия β – рецептора достигает своего
наивысшего уровня в преовуляторном периоде в эпителиальных клетках, а
также в секреторную фазу в строме и эндотелиоцитах. Экспрессия α –
рецепторов достигает своего максимума в периовуляторный период [4].
Экспрессия β – рецепторов выражена значительно в меньшей степени, за
исключением поздней секреторной фазы менструального цикла, что
указывает на связь β – рецепторов эстрогенов с активным ангиогенезом в
этот период [81].
ER выявлялись в виде коричневого окрашивания ядер клеток
эпителия и стромы эндометрия. Показатели экспрессии ER в железах
эндометрия у пациенток с бесплодием в период «окна имплантации» были
умеренными, а в строме низкими. ИГХ экспрессия ER у пациенток с
бесплодием в железах находилась в пределах от 20 до 190, медиана составила
120% (интерквартильный интервал 82,5–147,5). В строме уровень ER
колебался от 10 до 90, медиана составила 35% (интерквартильный интервал
20–47).
У фертильных женщин экспрессия ER в железах колебалась от 40 до 120
(медиана 80%, интерквартильный интервал 62,5–102,5), что было
существенно ниже, чем в группе пациенток с бесплодием (р=0,012). В строме
экспрессия ER составила от 30 до 120 (медиана 75%, интерквартильный
интервал 60–101) и в два раза превышала этот показатель по сравнению с
группой пациенток с бесплодием (р=0,001) (таблица 11).
Коэффициент РR/ER в строме эндометрия в группе пациенток с
бесплодием был значительно выше (медиана 5,5, интерквартильный интервал
2,45–8,85, р=0,035), чем в контрольной группе (медиана 2,7,
71
интерквартильный интервал 2,5–3,14), что, вероятно, связано с высокой
экспрессией РR и низкой ER в строме в группе пациенток с бесплодием.
3.3.3 Оценка экспрессии LIF в ткани эндометрия у пациенток с
бесплодием и фертильных женщин
Лейкемия ингибирующий фактор (LIF) является гликопротеином,
относящимся к семейству цитокинов, и играет важную роль в процессе
развития и имплантации эмбриона, являясь промежуточным звеном во
взаимодействии между материнскими децидуальными лейкоцитами и
внедряющимся трофобластом [38]. LIF был обнаружен не только
практически во всех тканях и клетках репродуктивной системы человека
[41,98], но и в бластоцисте человека [90].
Экспрессию LIF в ткани эндометрия оценивали путем исследования
иммуноокрашивания цитоплазмы клеток эпителия и стромы в виде
коричневого окрашивания. Однако в нашем исследовании была оценена
только эпителиальная экспрессия LIF в эндометрии, т.к. именно данная
локализация маркера принципиальна для имплантации.
Полученные результаты оценки экспрессии LIF в ткани эндометрия в
«окно имплантации» (ЛГ+7) представлены в таблице 12.
Таблица 12
Экспрессия LIF в ткани эндометрия в окно имплантации у пациенток с
бесплодием и у фертильных женщин
Уровень экспрессии Пациентки с бесплодием
(n=41)
Фертильные женщины
(n=14)
Низкий (2 балла) 4 (9,8%) 0 (0%)
Умеренный (4 балла) 24 (58,5%)* 2 (14,3%)
Высокий (6 баллов) 13 (31,7%)* 12 (85,7%)
* р <0,05 по сравнению с группой фертильных женщин (U–критерий
Манна—Уитни).
72
Как видно из представленных данных в группе пациенток с бесплодием
в большинстве случаев наблюдалась умеренная экспрессия LIF (58,5%),
низкая экспрессия LIF наблюдалась – у 9,8%, высокая – у (31,7%)
пациенток. В группе контроля экспрессия LIF была высокой в 85,7% случаев,
умеренной в 14,3%.
Результаты оценки ИГХ экспрессии LIF в обеих группах представлены
на рисунке 5.
р <0,05 по сравнению с группой с фертильными женщинами (U–критерий
Манна—Уитни).
Рисунок 5. Анализ ИГХ экспрессии LIF в ткани эндометрия у женщин с
бесплодием и у фертильных женщин в «окно имплантации» естественного
цикла (пик ЛГ+7)
В среднем экспрессия LIF в исследуемой группе составила 4,4±0,1
балла, что достоверно ниже, чем в контрольной группе – 5,8±0,2, р=0,02
(рисунок 5).
Таким образом, в целом у пациенток с бесплодием по сравнению с
фертильными женщинами в «окно имплантации» отмечено снижение
73
количества клеток поверхностного эпителия, содержащих зрелые пиноподии,
а также уменьшение экспрессии LIF, увеличение соотношения PR/ER в
строме эндометрия, что свидетельствует о нарушении рецептивности
эндометрия и снижении его имплантационных свойств у данного
контингента женщин.
В работе проведен анализ экспрессии GnRH, GnRHR и HOXA 10 в
эндометрии в естественном цикле (пик ЛГ+7) у пациенток с бесплодием
(n=41) (исследуемая группа) и фертильных женщин (n=14) (группа
контроля).
3.3.4 Оценка экспрессии GnRH и GnRHR в ткани эндометрия в
«окно имплантации» естественного цикла у пациенток с трубно–
перитонеальным фактором бесплодия и фертильных женщин
GnRH – один из паракринных/аутокринных регуляторов ХГч,
продуцируемого человеческим трофобластом, который является
иммунологически, биологически и химически идентичным гормону
гипоталамуса [72]. Наличие этого декапептида в цитотрофобласте и
синцитиотрофобласте было широко продемонстрировано в работах
Seppala (1980), Siler–Khodr (1997) [47,72]. В работе Raga (1998) исследовали
экспрессию мРНК GnRH и GnRHR в эндометрии женщин в пременопаузе в
динамике менструального цикла. Было показано, что GnRH и GnRHR
присутствуют в эндометрии женщин на протяжении всего менструального
цикла, как в эпителии, так и в строме, с повышением экспрессии в
секреторную фазу по сравнению с фазой пролиферации [105]. Кроме того,
были выявлены наиболее высокие уровни мРНК GnRH и GnRHR в ЛФ в
эпителиальных и стромальных клетках [105].
Таким образом, экспрессия GnRH трофобластом и присутствие его
рецепторов в децидуализированном эндометрии, по – видимому, играет
важную роль на стадии имплантации и плацентации как молекулярный
аутокринно/паракринный регулятор взаимоотношений эмбрион/эндометрий,
74
что проявляется в регуляции баланса между матриксными
металлопротеиназами и их ингибиторами [44,75].
В связи с этим в работе впервые была проведена оценка экспрессии
GnRH и GnRHR в «окно имплантации» у пациенток с трубно–
перитонеальным фактором бесплодия и 1–2 неудачными попытками
программ ЭКО в анамнезе.
GnRH экспрессировался в виде коричневого окрашивания цитоплазмы
клеток поверхностного эпителия, эпителия желез и стромы эндометрия
(рисунок 6).
а
б
Рисунок 6. GnRH в ткани эндометрия пациенток исследуемых групп
(иммунопероксидазная реакция) (×200):
а — основная группа (низкая экспрессии);
б — контрольная группа (высокая экспрессия).
75
Результаты сравнительной оценки экспрессии GnRH в ткани
эндометрия у пациенток с бесплодием и фертильных женщин представлены в
таблице 13.
Таблица 13
Сравнительная характеристика ИГХ экспрессии GnRH в «окно
имплантации» естественного цикла у пациенток с бесплодием и
фертильных женщин
Локализация
маркера
Пациентки с
бесплодием
(баллы) (n=41)
(Ме, L–H)*
Фертильные
женщины
(баллы) (n=14)
(Ме, L–H)*
P
GnRH, поверхностный
эпителий
2
(2–4)
5
(4–6)
0,0001
GnRH, эпителий
желез
2
(1–2)
4
(2,75–4)
0,0001
GnRH, строма 1
(1–2)
2
(2–4)
0,0001
* показатели представлены в виде Ме (L–H), где Ме – медиана, L – 25
(нижний) квартиль, H – 75 (верхний) квартиль.
Как видно из представленных данных, экспрессия GnRH у пациенток с
бесплодием была значительно ниже по сравнению с группой фертильных
женщин в поверхностном эпителии (медиана 2 и 5 интерквартильный
интервал 2–4 и 4–6, р=0,0001), в эпителии желез (медиана 2 и 4
интерквартильный интервал 1–2 и 2,75 – 4, р=0,0001) и в строме (медиана 1 и
2 интерквартильный интервал 1–2 и 2–4, р=0,0001).
Результаты оценки средних уровней экспрессии GnRH в обеих группах
представлены на рисунке 7.
76
р <0,05 по сравнению с группой фертильных женщин (U–критерий Манна—
Уитни).
Рисунок 7. Экспрессия GnRH в эндометрии в «окно имплантации»
естественного цикла у пациенток с бесплодием и фертильных женщин
В среднем экспрессия GnRH в группе пациенток с бесплодием составила
2,9 балла в поверхностном эпителии, 1,9 балла в эпителии желез и 1,3 балла в
строме, что было достоверно ниже, чем в контрольной группе (5,1 балла в
поверхностном эпителии, 3,7 балла в эпителии желез и 2,6 балла в строме), р
<0,05.
Таким образом, у пациенток исследуемой группы по сравнению с
контрольной группой отмечено снижение экспрессии GnRH в поверхностном
эпителии – в 1,75 раза, в эпителии желез – в 1,9 раза и в строме – в 2 раза.
ИГХ экспрессию GnRHR в эндометрии оценивали путем исследования
иммуноокрашивания цитоплазмы клеток эпителия и стромы эндометрия.
GnRH выявлялся в цитоплазме клеток эндометрия в виде коричневого
окрашивания (рисунок 8).
77
а б
Рисунок 8. GnRHR в ткани эндометрия (иммунопероксидазная реакция)
(×400):
а — основная группа (низкая экспрессия)
б — контрольная группа (высокая экспрессия);
Результаты сравнительной оценки экспрессии GnRHR у пациенток с
бесплодием и фертильных женщин в ткани эндометрия представлены в
таблице 14.
Таблица 14
Сравнительная характеристика ИГХ экспрессии GnRHR у пациенток с
бесплодием и фертильных женщин
Локализация
маркера
Пациентки с
бесплодием
(баллы)
(n=41) (Ме, L–H)*
Фертильные
женщины (баллы)
(n=14) (Ме, L–H)*
p
GnRHR,
поверхностный
эпителий
1
(0,5–1)
4
(3,2–4) 0,0001
GnRHR, эпителий
желез
1
(0,5–1)
3,7
(2,5–4)
0,0001
GnRHR, строма 0,75
(0,5–1)
4
(2,3–4) 0,0001
* показатели представлены в виде Ме (L–H), где Ме – медиана, L – 25 (нижний) квартиль,
H – 75 (верхний) квартиль.
Как видно из представленных в таблице данных, уровни экспрессии
GnRHR были существенно ниже в группе пациенток с бесплодием по
сравнению с фертильными женщинами в поверхностном эпителии (медиана
78
1 и 4, интерквартильный интервал 0,5–1 и 3,2–4, р=0,0001), в эпителии желез
(медиана 1 и 3,7, интерквартильный интервал 0,5–1 и 2,5–4, р=0,0001) и
строме (медиана 0,75 и 4, интерквартильный интервал 0,5–1 и 2,3–4,
р=0,0001).
Результаты оценки средних уровней экспрессии GnRHR в обеих группах
представлены на рисунке 9.
р <0,05 по сравнению с группой фертильных женщин (U–критерий Манна—
Уитни).
Рисунок 9. Экспрессия рецепторов GnRHR в эндометрии в «окно
имплантации» у пациенток с бесплодием и фертильных женщин
В среднем экспрессия GnRHR в группе пациенток с бесплодием
составила 0,9 балла в поверхностном эпителии, 0,8 балла в эпителии желез и
0,7 балла в строме эндометрия, что было достоверно ниже, чем в
контрольной группе (3,8 балла в поверхностном эпителии, 3,3 балла в
эпителии желез и 3,3 балла в строме), р <0,05.
79
Таким образом, в исследуемой группе уровни экспрессии GnRHR были
ниже по сравнению с контрольной в поверхностном эпителии – в 4,2 раза, в
эпителии желез – в 4,1 раза, в строме – в 4,5 раза.
3.3.5 Оценка экспрессии HOXA 10 в ткани эндометрия у пациенток с
бесплодием и фертильных женщин
НОХА 10–ген, участвующий в росте, дифференцировке и рецептивности
эндометрия. НОХА10 экспрессируется в ядрах эпителия желез и стромы
эндометрия. Экспрессия маркера зависит от секреции половых стероидов,
значительно возрастает в период «окна имплантации» и остается
повышенной до конца менструального цикла [138]. НОХА10 кодирует
транскрипционные факторы, влияющие на процесс синхронизации между
эмбрионом и рецептивным эндометрием. В литературе описано около 40
генов, регулируемых HOXA10. Известно, что на рецептивность эндометрия
влияют гены кластерина, фосфоглицерат 3 – дегидрогеназы и опухоль–
ассоциированного переносчика кальциевых сигналов – 2.
Экспрессию HOXA 10 в эндометрии оценивали путем исследования
иммуноокрашивания цитоплазмы эпителиоцитов желез и стромы. HOXA 10
выявлялся в цитоплазме клеток эндометрия в виде коричневого окрашивания
(рисунок 10).
а
80
б
Рисунок 10. HOXA 10 в ткани эндометрия (иммунопероксидазная реакция)
(×200):
а — исследуемая группа (умеренная экспрессия)
б — контрольная группа (высокая экспрессия);
Результаты сравнительной оценки экспрессии HOXA 10 в ткани
эндометрия в обеих группах представлены в таблице 15.
Таблица 15
Сравнительная характеристика ИГХ экспрессии HOXA 10 у пациенток с
бесплодием и фертильных женщин
Локализация
маркера
Пациентки с
бесплодием
(баллы)
(n=41) (Ме, L–H)*
Фертильные
женщины
(баллы)
(n=14) (Ме, L–H)*
p
HOXA 10,
поверхностный
эпителий
4
(4–6)
6
(4–6)
0,043
HOXA 10, эпителий
желез
4
(4–6)
6
(4,3–6)
0,049
HOXA 10, строма
4
(4–4)
6
(4,4–6)
0,0001
* показатели представлены в виде Ме (L–H), где Ме – медиана, L – 25 (нижний) квартиль,
H – 75 (верхний) квартиль.
81
В исследуемой группе уровни экспрессии HOXA 10 были достоверно
ниже по сравнению с фертильными женщинами в поверхностном эпителии
(медиана 4 и 6, интерквартильный интервал 4–6 и 4–6, р=0,043), в эпителии
желез (медиана 4 и 6, интерквартильный интервал 4–6 и 4,3–6, р=0,049). В
строме была зафиксирована наиболее существенная разница экспрессии
HOXA 10 между двумя группами с более низкой экспрессией HOXA 10 у
пациенток с бесплодием (медиана 4 и 6, интерквартильный интервал 4–4 и
4,4–6, р=0,0001).
Результаты оценки средних уровней экспрессии HOXA 10 в обеих
группах представлены на рисунке 11.
р <0,05 по сравнению с группой с фертильными женщинами (U–критерий
Манна—Уитни).
Рисунок 11. Экспрессия рецепторов HOXA 10 в эндометрии в «окно
имплантации» у пациенток с бесплодием и фертильных женщин
В среднем экспрессия HOXA 10 в группе пациенток с бесплодием была
ниже по сравнению с фертильными женщинами в поверхностном эпителии
82
(4,5 и 5,2 балла), в эпителии желез (4,7 и 5,3 балла) и в строме (4,04 и 5,5
балла), р <0,05.
Уровни экспрессии HOXA 10 в группе пациенток с бесплодием в
сравнении с группой фертильных женщин были ниже в поверхностном
эпителии – в 1,1 раза, в эпителии желез – в 1,1 раза, в строме эндометрия –
в 1,3 раза.
Таким образом, было отмечено существенное снижение экспрессии
GnRH, GnRHR и HOXA 10 в эпителии и строме эндометрия в «окно
имплантации» естественного цикла у пациенток с бесплодием и неудачными
попытками программ ЭКО в анамнезе по сравнению с фертильными
женщинами, что также может свидетельствовать о нарушении рецептивности
эндометрия и, предположительно, может оказывать негативное влияние на
имплантацию эмбрионов в программе ЭКО.
3.4. Сравнительный анализ параметров индуцированного цикла и
исходов программы ЭКО в зависимости от режима поддержки
лютеиновой фазы
Пациентки с бесплодием (n=207) были рандомизированы на две группы
в зависимости от режима поддержки ЛФ. В 1–й группе пациентки получали
препараты микронизированного Р в дозе 600 мг/день с 1–ых суток после
оплодотворения и однократную дозу трипторелина 0,1 мг п/к на 6–е сутки
после оплодотворения (комбинированный режим поддержки ЛФ) (n=92). Во
2–й группе пациентки получали только микронизированный Р в дозе 600
мг/день с 1–ых суток после оплодотворения (стандартный режим поддержки
ЛФ) (n=115).
3.4.1 Сравнительный анализ основных параметров
индуцированного цикла и эмбриогенеза
Параметры стимулированного цикла и эмбриогенеза в обеих группах
представлены в таблице 16.
83
Таблица 16
Сравнительные характеристики основных параметров
индуцированного цикла и эмбриогенеза при различных режимах
поддержки лютеиновой фазы
Параметры Основная группа (n=207) Р
1 группа
Комбинированный
режим
поддержки ЛФ
(n=92)
2 группа
Стандартный
режим
поддержки ЛФ
(n=115)
Стартовая доза
гонадотропина, МЕ, (М±m)
223,6±6,7 220,0±6,1 0,386
Суммарная доза
гонадотропина, МЕ, (М±m)
1851,7±68,4 1982,0±65,3 0,166
Продолжительность
стимуляции, дни, (М±m)
8,76±0,1 9,02±0,1 0,061
Получено ооцитов
Из них на стадии метафазы
II (МII), М±m
9,72±0,4
7,33±0,3
9,01±0,3
6,8±0,3
0,130
0,247
Количество зигот (2PN),
М±m
7,3±0,3 6,8±0,3 0,247
Количество эмбрионов на
стадии дробления, М±m
5,6±0,2 5,9±0,2 0,792
Количество бластоцист,
М±m
4,5±0,3 4,9±0,3 0,549
Количество полученных
эмбрионов хорошего
качества, М±m
1,7±0,1 1,47±0,1 0,062
Перенесено эмбрионов,М±m 1,85±0,038 1,83±0,035 0,967
Перенесено эмбрионов
высокого качества, М±m
1,04±0,08 0,8±0,07 0,074
84
Оценка протоколов стимуляции показала, что стартовая доза
гонадотропина колебалась от 75 до 425 МЕ в обеих группах и составила в
среднем 223,6±6,7 – в группе с комбинированным режимом поддержки ЛФ и
220,0±6,1 МЕ – в группе со стандартным режимом поддержки ЛФ (р=0,386).
Суммарная доза индуктора в лечебном цикле была сопоставима в обеих
группах сравнения (1851,7±68,4 МЕ и 1982,0±65,3 МЕ; р=0,166), также не
отличалась продолжительность стимуляции суперовуляции (8,76±0,1 и
9,02±0,1 дня; р=0,061).
Эмбриологические параметры в двух группах сравнения были
сопоставимы по количеству аспирированных ооцитов (9,72±0,4 и 9,01±0,3;
р=0,130), зрелых ооцитов (М11) (7,33±0,3 и 6,8±0,3; р=0,247) и зигот (2 PN)
(7,3±0,3 и 6,8±0,3; р=0,814). Не наблюдалось различий в частоте дробления
(5,6±0,2 и 5,9±0,2; р=0,792) и развития эмбрионов до стадии бластоцисты
(4,5±0,3 и 4,9±0,3; р=0,549). Не было выявлено различий по количеству
полученных эмбрионов хорошего качества (1,7±0,1 и 1,47±0,1; р=0,062),
перенесенных эмбрионов (1,85±0,03 и 1,83±0,03; р=0,967) и перенесенных
эмбрионов хорошего качества (1,04±0,08 и 0,8±0,07; р=0,047).
Оплодотворение полученных ооцитов методом ЭКО у пациенток в 1 – й
группе произведено в 53,3 % случаев, во 2 – й – в 63,5%, а методом ICSI – в
46,7% и 36,5 % случаев соответственно.
В группе пациенток с комбинированным режимом поддержки ЛФ
перенос эмбрионов наиболее часто был выполнен на 5 сутки
культивирования – в 77,2 % случаев, на 3 сутки – в 16,3% случаев. В группе
пациенток со стандартным режимом поддержки ЛФ перенос эмбрионов на 5
сутки культивирования проводился в 69,6% – случаев, а на 3 – в 22,6%.
Количество перенесенных эмбрионов не различалось в двух группах
сравнения и составило 1,85±0,03 и 1,83±0,03 (р=0,799) соответственно.
Оставшиеся после переноса в полость матки эмбрионы хорошего качества
были подвергнуты криоконсервации. В среднем была произведена
криоконсервация 1,16±0,01 эмбрионов в группе пациенток с
85
комбинированной поддержкой ЛФ и 1,17±0,01 – в группе со стандартной
поддержкой ЛФ (р=0,996).
3.5. Клинические исходы программы ЭКО в зависимости от режима
ведения лютеиновой фазы
В таблице 17 представлены результаты оценки исходов эффективности
программы ЭКО в зависимости от режимов поддержки ЛФ.
Таблица 17
Клинические исходы программы ЭКО в зависимости от режимов
поддержки лютеиновой фазы
Параметры Основная группа (n=207) Р
1 группа
Комбинированный
режим поддержки
ЛФ (n=92)
2 группа
Стандартный
режим поддержки
ЛФ (n=115)
Положительный
анализ крови на ХГч 51,1% 34,8 % 0,02
Частота имплантации 30,6% 16,6% <0,05
Частота клинической
беременности 40,2% 26,9% 0,04
Прогрессирующая
беременность 36,9% 21,7% 0,01
Многоплодная
беременность
14,3% 4,3 % 0,005
Прерывание
беременности
8,7% 7,8% 0,82
Частота родов живым
плодом
31,5%
19,1%
0,04
Частота
преждевременных
родов
7,6% 1,7% 0,03
р <0,05 по сравнению с группой со стандартным режимом поддержки ЛФ
(U–критерий Манна—Уитни).
86
Как видно из представленных в таблице данных, в группе женщин с
комбинированным режимом поддержки ЛФ по сравнению с группой со
стандартным режимом поддержки ЛФ отмечена более высокая
эффективность программ ЭКО, о чем свидетельствует увеличение частота
биохимической беременности, подтвержденная положительным анализом
крови на ХГч (51,1% и 34,8%, р=0,02), частоты имплантации (30,6% и 16,6%,
р<0,05), клинической беременности (40,2% и 26,9%, р=0,04),
прогрессирующей беременности (36,9% и 21,7%, р=0,01) и родов живым
плодом (31,5% и 19,1%, р=0,04). Вместе с тем, следует отметить, что частота
наступления многоплодной беременности (14,1 % и 4,3%, р=0,005) и как
следствие, преждевременных родов (7,6% и 1,7%, р=0,03) была также
существенно выше у пациенток, получавших aGnRH для поддержки ЛФ по
сравнению со стандартным режимом, что может быть основанием для
переноса 1 эмбриона при использовании данного режима поддержки ЛФ.
Таким образом, анализ представленных данных показал, что, несмотря
на отсутствие различий в клинико – анамнестических показателях,
параметрах стимулированного цикла и эмбриологических показателяхяф в
двух группах, у пациенток, выявлена более высокая эффективность программ
ЭКО с использованием комбинированного режима поддержки ЛФ.
3.5 Механизм влияния aGnRH в лютеиновую фазу
стимулированного цикла в программе ЭКО
Механизм благоприятного влияния aGnRH в ЛФ в программе ЭКО не
изучен и, в соответствии с представленными гипотезами, может
реализовываться на различных уровнях, воздействуя на желтое тело,
эндометрий и эмбрион. В связи с этим, на следующем этапе исследования
для уточнения механизма действия aGnRH, используемого в
посттрансферном периоде программы ЭКО, была проведена сравнительная
динамическая оценка гормональных параметров ЛФ (Р,Е2,ЛГ), уровня ХГч у
пациенток с наступившей беременностью и показателей рецептивности
87
эндометрия (экспрессия GnRH, GnRHR и HOXA 10) в зависимости от
используемого режима поддержки ЛФ.
3.5.1 Анализ базальных концентраций сывороточных гормонов
пациенток, в зависимости от режима ведения лютеиновой фазы
Сравнительная характеристика концентраций сывороточных гормонов
на 2 – 3 день менструального цикла представлена в таблице 18.
Таблица 18
Сравнительная характеристика базальных концентрацией
сывороточных гормонов
Параметры Основная группа (n=207) p
1 группа
Комбинированный
режим поддержки ЛФ
(n=92) Ме (L–H)*
2 группа
Стандартный режим
поддержки ЛФ
(n=115) Ме (L–H)*
ФСГ, МЕ/л 7
(5,9–8,0)
7,1
(5,5–8,1)
0,789
ЛГ, МЕ/л 4,2
(3,3–5,6)
4,0
(3,2–4,8)
0,309
Е2, пмоль/л 141
(103–187)
149,5
(91,5–193)
0,831
АМГ, нг/мл 2,6
(1,7–3,7)
2,2
(1,5–3,7)
0,518
* показатели представлены в виде Ме (L–H), где Ме – медиана, L – 25
(нижний) квартиль, H – 75 (верхний) квартиль.
При оценке базальных концентраций сывороточных гормонов у
пациенток в группе комбинированного и стандартного режимов поддержки
ЛФ статистически значимых различий выявлено не было (р>0,05). Базальный
уровень ФСГ на 2 – 3 день менструального цикла был сопоставим в обеих
группах: медиана уровня ФСГ МЕ/Л в группе комбинированной поддержки
ЛФ составила 7,0 (интерквартильный интервал 5,9–8,0), в группе
стандартной поддержки ЛФ – 7,1 МЕ/Л (интерквартильный интервал 5,5 –
88
8,1), р=0,789, ЛГ МЕ/л (медиана 4,2 и 4,0 МЕ/л) (интерквартильный
интервал 3,3 – 5,6 и 3,2 – 4,8), р=0,309, Е2 – 141 пмоль/л (интерквартильный
интервал 103 – 187) и 149,5 пмоль/л (интерквартильный интервал 91,5–193),
р=0,831. Медиана уровня АМГ у пациенток в группе комбинированного
режима поддержки ЛФ составила 2,6 (интерквартильный интервал 1,7–3,7
нг/мл), в группе стандартной поддержки – 2,2 (интерквартильный интервал
1,5–3,7 нг/мл), статистически значимой разницы между группами не было,
р=0,518.
3.5.2 Анализ гормональных параметров лютеиновой фазы в
зависимости от режима поддержки лютеиновой фазы
Для возможного механизма действия aGnRH, используемого в
посттрансферном периоде программы ЭКО на желтое тело был проведен
сравнительный анализ гормональных параметров (ЛГ, Р и Е2) на 5–й, 7–й и
15–й день после оплодотворения (день ТВП) в зависимости от режима
поддержки ЛФ (таблица 19).
Таблица 19
Сравнительные характеристики гормональных параметров в
зависимости от режима ведения лютеиновой фазы
Основная группа (n=207) Р
1 группа
Комбинированный
режим поддержки
ЛФ (n=92)
*Ме (L–H)
2 группа
Стандартный
режим поддержки
ЛФ (n=115)
*Ме (L–H)
Е2, пмоль/л
5 день после
оплодотворения
7 день после
оплодотворения
15 день после
оплодотворения
5352 (3900–7753)
5126 (3248–7419)
2394 (675–5307)
4945 (2870–6885)
3501 (2168–6103)
1402 (635–3125)
0,215
0,002
0,105
89
Продолжение таблицы 19
Р, нмоль/л
5 день после
оплодотворения
7 день после
оплодотворения
15 день после
оплодотворения
346 (230–426)
335 (219–459)
206 (48–399)
300 (197–386)
170 (104–277)
108 (54–223)
0,062
0,0001
0,043
ЛГ, МЕ/л
5 день после
оплодотворения
7 день после
оплодотворения
15 день после
оплодотворения
0,15 (0,1–0,4)
13,9 (10–21,6)
0,3 (0,1–0,9)
0,1 (0,1–0,3)
0,1 (0,1–0,3)
0,1 (0,1–0,4)
0,081
0,0001
0,003
* показатели представлены в виде Ме (L–H), где Ме – медиана, L – 25
(нижний) квартиль, H – 75 (верхний) квартиль.
Как видно из представленных в таблице данных, на 5–й день после
оплодотворения уровни исследуемых гормонов не различались меду двумя
группами: медиана концентрации Е2 составила 5352 пмоль/л
(интерквартильный интервал 3900–7753) и 4945 пмоль/л (интерквартильный
интервал 2870–6885), р=0,215; медиана Р составила – 346 нмоль/л
(интерквартильный интервал 230–426) и 300 нмоль/л (интерквартильный
интервал 197–386), р=0,062; медиана ЛГ– 0,15 МЕ/л (интерквартильный
интервал 0,1–0,4) и 0,1 МЕ/л (интерквартильный интервал 0,1–0,3), р=0,081.
На 7 – й день после оплодотворения, уровень ЛГ был достоверно выше
в группе комбинированной поддержки ЛФ по сравнению с группой со
стандартной поддержкой: медиана концентрации составила 13,9 МЕ/л
(интерквартильный интервал 10–21,6), в группе стандартной поддержки – 0,1
МЕ/л (интерквартильный интервал 0,1–0,3), р=0,0001, уровни Р и Е2 также
были значительно выше в группе комбинированной поддержки ЛФ: медиана
90
Р – 335 нмоль/л (интерквартильный интервал 219–459) и 170 нмоль/л
(интерквартильный интервал 104–277), р=0,0001; медиана Е2 – 5126 пмоль/л
(интерквартильный интервал 3248–7419) и 3501 пмоль/л (интерквартильный
интервал 2168–6103), р=0,002.
На 15–й день после оплодотворения в группе комбинированного режима
поддержки ЛФ по сравнению со стандартным режимом поддержки отмечено
увеличение уровня ЛГ (медиана 0,3 и 0,1 МЕ/л), (интерквартильный интервал
0,1–0,9 и 0,1–0,4), р=0,003 и Р (медиана 206 и 108нмоль/л),
(интерквартильный интервал 48–399 и 54–223), р=0,043. Также в 1 – й группе
по сравнению со 2–й группой отмечены более высокие концентрации Е2
медиана 2394 пмоль/л (интерквартильный интервал 675–5307) и 1402
пмоль/л (интерквартильный интервал 635–3125), однако не было выявлено
статистически значимой разницы (р=0,105).
Таким образом, анализ концентраций сывороточных гормонов в
динамике ЛФ показал, что при одинаковых исходных уровнях гормонов в
обеих группах на 5 – й день после оплодотворения, существенно более
высокие значения ЛГ, Е2, и Р наблюдались на 7 – й день, ЛГ и Р на 15 – й день
после оплодотворения в группе пациенток с комбинированным режимом
поддержки ЛФ по сравнению с группой стандартного режима поддержки,
что свидетельствует о действии aGnRH на желтое тело, которое
осуществляется через центральные механизмы путем стимуляции
гонадотрофов гипофиза.
3.5.3 Анализ гормональных параметров лютеиновой фазы у
пациенток с наступившей беременностью в зависимости от режима
поддержки лютеиновой фазы
Результаты гормональных параметров у пациенток с наступившей
одноплодной и двуплодной беременностью в динамике ЛФ представлены в
таблице 20.
91
Таблица 20
Сравнительные характеристики гормональных параметров у
пациенток с наступившей одноплодной и двуплодной беременностью в
зависимости от тактики ведения лютеиновой фазы
Параметры
1 группа
Комбинированный режим
поддержки ЛФ (n=37) *Ме (L–H)
2 группа
Стандартный режим
поддержки ЛФ (n=31) *Ме (L–H)
Одноплодная
беременность
(n=24)
Двуплодная
беременность
(n=13)
Одноплодная
беременность
(n=27)
Двуплодная
беременность
(n=4)
ЛГ, МЕ/л
5 день после
оплодотворения
7 день после
оплодотворения
15 день после
оплодотворения
0,2
(0,1–0,6)
0,1
(0,1–0,1)
0,1**
(0,1–0,27)
0,1
(0,1–0,1)
13,1
(10,1–17,8)
17,3
(12,6–27,1)
0,1**
(0,1–0,27)
0,1***
(0,1–0,1)
0,3
(0,1–0,7)
0,3
(0,2–0,5)
0,1
(0,1–0,4)
0,1***
(0,1–0,2)
Е2, пмоль/л
5 день после
оплодотворения
7 день после
оплодотворения
15 день после
оплодотворения
5191
(3210–6416)
4453
(2624–9277)
6369
(2794–7994)
4545
(2675–7849)
5154
(3251–6449)
4295
(2992–6909)
3365
(1880–6541)
3319
(2617–6325)
4788
(2467–7505)
6559
(4366–10249)
3173
(1895–5591)
4734
(2171–8868)
Р, нмоль/л
5 день после
оплодотворения
7 день после
оплодотворения
15 день после
оплодотворения
347
(230–428)
307
(301–404)
291
(200–417)
312
(189–359)
317
(229–458)
349
(307–385)
146**
(92–299)
150***
(112–254)
389
(201–570)
630
(275–799)
238
(122–421)
112
(160–566)
* показатели представлены в виде Ме (L–H), где Ме – медиана, L – 25 (нижний) квартиль, H – 75 (верхний)
квартиль.
** р<0,05 по сравнению с группой со стандартным режимом поддержки ЛФ (U–критерий Манна—Уитни)
при одноплодной беременности.
*** р<0,05 по сравнению с группой со стандартным режимом поддержки ЛФ (U–критерий Манна—Уитни)
при двуплодной беременности.
92
Как видно из представленных в таблице данных, на 7–й день после
оплодотворения у пациенток получавших комбинированную поддержку ЛФ
с одноплодной беременностью концентрации ЛГ (медиана 13,1 МЕ/л,
интерквартильный интервал 10,1–17,8) и Р (медиана 317 нмоль/л,
интерквартильный интервал 229–458), были достоверно выше по сравнению
с группой контроля (медиана 0,1 МЕ/л, интерквартильный интервал 0,1–
0,27), р<0,05 и (медиана 146 нмоль/л, интерквартильный интервал 92–299),
р<0,05. Так же были выше уровни ЛГ и Р у пациенток с двуплодной
беременностью в 1 – й группе (медиана 17,3 и 0,1 МЕ/л), (интерквартильный
интервал 12,6–27,1 и 0,1–0,1), р<0,05 и (медиана 349 и 150 нмоль/л),
(интерквартильный интервал 307–385 и 112 – 254), р<0,05. Уровень Е2 на 7–
й день после оплодотворения у женщин с одноплодной беременностью был
выше в группе пациенток с комбинированным режимом поддержки ЛФ
(медиана 5154 пмоль/л, интерквартильный интервал 3251–6449 и медиана
3365 пмоль/л, интерквартильный интервал 1880–6541 соответственно),
однако разница не была достоверной (р>0,05). У пациенток с наступившей
двуплодной беременностью уровень Е2 также был выше в 1–й группе
(медиана 4295 пмоль/л интерквартильный интервал 2992–6909) по
сравнению с группой со стандартной поддержкой (медиана 3319 пмоль/л
интерквартильный интервал 2617–6325), но не было зафиксировано
статистически значимой разницы (р>0,05).
На 15–й день после оплодотворения медиана ЛГ у пациенток в группе
комбинированной поддержки ЛФ с наступившей двуплодной беременностью
составила – 0,3 МЕ/л (интерквартильный интервал 0,2–0,5 МЕ/л), что было
достоверно выше, чем в группе стандартной поддержки ЛФ (медиана
0,1МЕ/л, интерквартильный интервал 0,1–0,2), р<0,05. Концентрации Р и Е2
в этот день существенно не отличались в обеих группах (р>0,05).
93
3.5.4 Сравнительная оценка уровня ХГч у пациенток с
наступившей беременностью в зависимости от режима поддержки
лютеиновой фазы
Для оценки возможного влияния агониста гонадолиберина на эмбрион,
были проанализированы концентрации ХГч в сыворотке крови у пациенток с
наступившей беременностью в зависимости от режима поддержки ЛФ
(таблица 21).
Таблица 21
Сравнительные характеристики концентрации ХГч у пациенток с
наступившей одноплодной и двуплодной беременностью в зависимости
от используемого режима поддержки лютеиновой фазы
ХГч, Ме/л
1 группа
пациентки с наступившей
беременностью
Комбинированный режим
поддержки ЛФ
(n=37)
*Ме (L–H)
2 группа
пациентки с наступившей
беременностью
Стандартный режим
поддержки ЛФ
(n=31)
*Ме (L–H)
Одноплодная
беременность
(n=24)
Двуплодная
беременность
(n=13)
Одноплодная
беременность
(n=26)
Двуплодная
беременность
(n=5)
5 день после
оплодотворения
7 день после
оплодотворения
15 день после
оплодотворения
15
(10,3–21,1)
15,4
(11,5–17,4)
13,1
(9,6–18,7)
13,0
(7,8–20,3)
6,0
(3,8–8,2)
5,5
(2,8–8,3)
5,9
(3,4–7,4)
5,6
(4,6–8,8)
220
(159–267)
453
(378–490)
112**
(110–118)
244***
(127–276,5)
* показатели представлены в виде Ме (L–H), где Ме – медиана, L – 25 (нижний) квартиль,
H – 75 (верхний) квартиль.
** р<0,05 по сравнению с группой со стандартным режимом поддержки ЛФ (U–критерий
Манна—Уитни) при одноплодной беременности.
*** р<0,05 по сравнению с группой со стандартным режимом поддержки ЛФ (U–критерий
Манна—Уитни) при двуплодной беременности.
94
Как видно из представленных в таблице данных, уровни ХГч на 5 – й
день после оплодотворения у пациенток с наступившей одноплодной
беременностью в группе комбинированного и стандартного режимов
поддержки ЛФ были сопоставимы (медиана 13,1 Ме/л и 15,5),
(интерквартильный интервал 9,6–18,7 и 11,5–17,4), р>0,05, при двуплодной
беременности уровни ХГч так же были сопоставимы (медиана 15,4 и 13
Ме/л) (интерквартильный интервал 11,5–17,4 и 7,8–20,3), р>0,05. На 7 – й
день после оплодотворения у пациенток с наступившей одноплодной и
двуплодной беременностью уровней ХГч так же не различались между
группами (медиана 6 и 5,9 Ме/л), (интерквартильный интервал 3,8–8,2 и и
3,4–7,4), р>0,05 и (медиана 5,5 и 5,6 Ме/л), (интерквартильный интервал 2,8–
8,3 и 4,6 – 8,8), р>0,05.
На 15 – й день после оплодотворения зафиксирована статистически
значимая разница в уровне ХГч, медиана концентраций у женщин, которые
получали комбинированный режим поддержки ЛФ с одноплодной и
двуплодной беременностью составила – 220 Ме/л (интерквартильный
интервал 159–2267) и 453 Ме/л (интерквартильный интервал 378–490), что
было существенно выше, чем у пациенток в группе со стандартным режимом
поддержки ЛФ (медиана 112 Ме/л, интерквартильный интервал 110–118),
р<0,05 и (244 Ме/л, интерквартильный интервал 127–276,5), р<0,05.
Анализ концентраций ХГч в сыворотке крови у пациенток с
наступившей беременностью показал, что при одинаковых исходных уровнях
ХГч на 5–й и 7–й дни после оплодотворения, на 15–й день после
оплодотворения его уровень был существенно выше у пациенток в группе с
комбинированным режимом поддержки ЛФ по сравнению с группой со
стандартным режимом поддержки, как при одноплодной беременности, так и
при двуплодной, что косвенно подтверждает теорию о влиянии aGnRH на
эмбрион.
95
3.5.5 Анализ влияния aGnRH в лютеиновую фазу программы ЭКО
на имплантационный потенциал и рецептивность эндометрия
Существенное снижение GnRH, GnRHR и НОХА10 в эндометрии в
«окно имплантации» у пациенток с бесплодием в сравнении с фертильными
женщинами предположительно может свидетельствовать о нарушении
его рецептивности, что, возможно, оказывает негативное влияние на
имплантацию эмбрионов. Поскольку существуют данные о благоприятном
влияние aGnRH, используемого в посттрансферном периоде программы
ЭКО на эндометрий, мы разделили исследуемых пациенток с бесплодием
и нарушенной рецептивностью эндометрия (n=41) на две группы в
зависимости от назначаемого режима ведения ЛФ для изучения влияния
aGnRH в ЛФ программы ЭКО на имплантационный потенциал и
рецептивность эндометрия, в том числе 20 пациенток получали
комбинированный режим поддержки ЛФ (микронизированный Р +
aGnRH), 21 женщина – стандартный режим поддержки ЛФ
(микронизированный Р).
Был проведен сравнительный анализ экспрессии GnRH, GnRHR и
HOXA10 в эндометрии в зависимости от режима поддержки ЛФ. Результаты
анализа показали сопоставимое снижение исследуемых маркеров у
пациенток с бесплодием в группе комбинированного и стандартного
режимов поддержки ЛФ.
Сравнительная характеристика экспрессии GnRH , GnRHR и HOXA 10
в эндометрии у пациенток с бесплодием и неудачными программами ЭКО в
анамнезе в зависимости от режима ведения лютеиновой фазы представлена в
таблице 22
96
Таблица 22
Сравнительная характеристика ИГХ экспрессии GnRH , GnRHR и
HOXA 10 у пациенток с бесплодием в зависимости от режима ведения
лютеиновой фазы
Локализация маркера Пациентки с бесплодием (n=41) p
1 группа
Комбинированный
режим поддержки
ЛФ (баллы) (n=20)
(Ме, L–H)*
2 группа
Стандартный
режим поддержки
ЛФ (баллы)(n=21)
(Ме, L–H)*
GnRH, поверхностный
эпителий
2
(2 – 4)
2
(2 – 4)
0,708
GnRH, эпителий желез 2
(1 – 2)
2
(1 – 2)
0,848
GnRH, строма 1
(0,6 – 2)
1
(1 – 2)
0,899
GnRHR,поверхностный
эпителий
1
(0,1 – 1)
1
(0,5 – 1,5)
0,269
GnRHR, эпителий желез 0,75
(0,1 – 1)
1
(0,5 – 1)
0,222
GnRHR, строма 0,75
(0,5 – 1)
1
(0,5 – 1)
0,998
HOXA 10,поверхностный
эпителий
5
(4 – 6)
4
(4 – 6)
0,488
HOXA 10, эпителий желез 4
(2 – 4)
4
(4 – 4)
0,079
HOXA 10, строма 6
(4 – 6)
4
(4 – 6)
0,442
* показатели представлены в виде Ме (L–H), где Ме – медиана, L – 25 (нижний) квартиль,
H – 75 (верхний) квартиль.
Анализ полученных результатов показал, что экспрессия GnRH, GnRHR
и HOXA10 в поверхностном эпителии, эпителии желез и строме у пациенток
с бесплодием, которые получали комбинированную поддержку ЛФ, были
сопоставимы с группой пациенток со стандартной поддержкой ЛФ (р>0,05)
(рисунок 12).
97
*р >0,05 по сравнению с группой со стандартным режимом поддержки ЛФ (U–критерий
Манна—Уитни).
Рисунок 12. Экспрессия GnRH, GnRHR, HOXA10 в эндометрии в «окно
имплантации» у пациенток с бесплодием в зависимости от режима ведения
ЛФ
Далее была проведена оценка влияния aGnRH на частоту наступления
беременности у пациенток с бесплодием и нарушенной рецептивностью
эндометрия в зависимости от режима ведения ЛФ (рисунок 13).
* р <0,05 по сравнению с группой микронизированного Р (U–критерий Манна—Уитни).
Рисунок 13. Частота наступления беременности в программе ЭКО у
пациенток с нарушенной рецептивностью эндометрия и сниженной
экспрессией GnRH, GnRHR и НОХА 10 в зависимости от режима ведения
ЛФ
0%
20%
40%
60%
80%
100%
45% 55%
15%
85% комбинированная поддержка ЛФ
стандартная поддержка ЛФ р<0,05
р<0,05
беременность + беременность -
98
Как видно из представленных данных, частота наступления
беременности была существенно выше в группе комбинированной
поддержки ЛФ по сравнению со стандартной и составила 9 (45%) и 3 (15%)
соответственно (р=0,03).
Полученные данные могут быть аргументом в пользу гипотезы о
влиянии aGnRH на эндометрий за счет стимуляции рецепторов GnRH в
эндометрии.
Таким образом, анализ представленных данных показал, что
благоприятное действие aGnRH назначаемого для поддержки ЛФ на исходы
программы ЭКО может реализовываться путем сочетанного воздействия на
желтое тело, эмбрион и эндометрий. Подтверждением данных выводов
служит то, что несмотря на отсутствие различий в клинико –
анамнестических, эмбриологических и исходных гормональных параметрах в
обеих группах, у пациенток, использовавших комбинированный режим
поддержки наблюдались более высокие концентрации гормонов ЛГ, Р и Е2 в
динамике ЛФ; более высокий уровень ХГч на 15–й день после
оплодотворения как при одноплодной, так и многоплодной беременности;
более высокая частота наступления беременности у пациенток со сниженной
экспрессией GnRH, GnRHR и HOXA10 в эндометрии.
3.6 Результаты молекулярно – генетического исследования.
Ассоциация полиморфизма исследуемых генов с частотой
наступления беременности в зависимости от режима поддержки
лютеиновой фазы
Важным вопросом, имеющим практическое и научное значение,
является возможность выявления пациенток для которых использование
комбинированного или стандартного режимов поддержки ЛФ наиболее
эффективно.
Как известно, на индивидуальную реакцию пациентки, использующей
различные гормональные препараты могут влиять сотни генов, но лишь
99
небольшое количество SNPs полиморфизмов могут прогнозировать
эффективность применения данного препарата. В связи с этим, на
следующем этапе была проведена оценка возможности прогнозирования
наступления беременности в программе ЭКО у пациенток с различным
режимом поддержки ЛФ в зависимости от молекулярно – генетических
предикторов.
Для оценки ассоциации генотипа пациенток с частотой наступления
беременности при различных режимах поддержки ЛФ были
проанализированы распределения аллелей и генотипов исследуемых генов
(таблица 23).
Таблица 23
Ассоциация полиморфизма исследуемых генов с частотой
наступления беременности и различными режимами ведения ЛФ
Пол
им
ор
фи
зм
Ген
оти
п
Основная группа (n=207)
Различия в
распределение
аллелей между
пациентками с
наступившей и не
наступившей
беременностью, р
1 группа
Комбинированный
режим поддержки
ЛФ (n=92)
2 группа
Стандартный
режим поддержки
ЛФ (n=115)
1 группа
(n=92)
2 группа
(n=115)
Беременность Беременность
не
наступила
наступила не
наступила
наступила
ESR1 Pvull
T>С
[rs2234693]
С/С 5
(11,4%)
10
(20,8%)
18
(24,3%)
5
(12,8%)
0,93
0,41
Т/С 28
(63,6%)
22
(45,8%)
39
(52,7%)
25
(64,1%)
Т/Т 11
(25%)
16
(33,3%)
17
(23,0%)
9
(23,1%)
100
Продолжение таблицы 23
ESR1 Xbal
A>G
[rs9340799]
А/А 21
(47,7%)
22
(45,8%)
29
(39,%)
12
(30,8%)
0,48
0,63
A/G 20
(45,5%)
19
(39,6%)
34
(45,9%)
27
(69,2%)
G/G 3
(6,8%)
7
(14,6%)
11
(14,9%)
0
ESR1 2014
G>A
[rs2228480]
А/А 1
(2,3%)
1
(2,1%)
0 0
0,92
0,51 G/A 15
(34,1%)
16
(33,3%)
26
(35,1%)
11
(28,2%)
G/G 28
(63,6%)
31
(64,6%)
48
(64,9%)
28
(71,8%)
FSHR 2039
G>A
(Asn680Ser)
[rs6166]
A/A 13
(29,5%)
15
(31,3%)
22
(29,7%)
6
(15,4%)
0,71
0,05
A/G 23
(52,3%)
26
(54,2%)
33
(44,6%)
18
(46,2%)
G/G 8
(18,2%)
7
(14,6%)
19
(25,7%)
15
(38,5%)
LHCG
R:935
A>G
(Asn312Ser)
rs2293
C/C 18
(40,9%)
16
(33,3%)
22
(29,7%)
14
(35,9%)
0,88
0,68
T/C 19
(43,2%)
27
(56,3%)
41
(55,4%)
19
(48,7%)
T/T 7
(15,9%)
5
(10,4%)
11
(14,9%)
6
(15,4%)
LHCG
R:872
A>G
(Asn291Ser)
Rs12470652
С/С 0 0 0 0
0,07
0,32
Т/С 5
(11,4%)
1
(2,1)
8
(10,8%)
2
(5,1%)
Т/Т 39
(88,6%)
47
97,9%)
66
(89,2%)
37
(94,9%)
PGR:
331
G>A
rs10895068
А/А 0 0 0 1
(2,6%)
0,05
0,49 G/A 9
(20,5%)
3
(6,3%)
8
(10,8%)
4
(10,3%)
G/G 35
(79,5%)
45
(93,8%)
66
(89,2%)
34
(87,2%)
101
Продолжение таблицы 23
PGR:
38
T>C
Rs484389
C/C 3
(6,8%)
1
(2,1%)
4
(5,4%)
1
(2,6%)
0,03
0,51
T/C 18
(40,9%)
12
(25,0%)
28
(37,8%)
14
(35,9%)
T/T 23
(52,3%)
35
(72,9%)
42
(56,8%)
24
(61,5%)
ESR2
984
G>A
(Val328Val)
[rs4986938]
A/A 3
(6,8%)
4
(8,3%)
13
(17,6%)
3
(7,7%)
0,81
0,63
G/A 20
(45,5%)
22
(45,8%)
30
(40,5%)
21
(53,8%)
G/G 21
(47,7%)
22
(45,8%)
31
(41,9%)
15
(38,5%)
Проведенный анализ позволил сделать вывод о статистически
Проведенный анализ позволил сделать вывод о статистически значимой
ассоциации распределения аллелей полиморфных локусов генов PGR и FSHR
с частотой наступления беременности. Распространенные аллели гена PGR
38T и 331G ассоциированы с наступлением беременности. Влияние
полиморфизма PGR проявлялось у пациенток, получавших
комбинированную поддержку ЛФ, тогда как полиморфизм гена FSHR: 2039
G>A (Asn680Ser) ассоциирован с частотой наступления беременности в
группе пациенток, получавших только микронизированный Р.
Были исследованы 2 полиморфных локуса гена PGR (38 T>C и 331
G>A). Согласно аутосомно рецессивной модели наследования носительство
благоприятных аллелей повышало шанс наступления беременности в 2,46
(1,03 – 5,86) и 3,86 (0,97 – 15,32) соответственно. Для выяснения
молекулярных механизмов наследования был проведен анализ сцепления
указанных полиморфных локусов и гена PGR. Было выявлено
незначительное сцепление (D’=1 (0,2–0,99), LOD=1,18). Гаплотип GT был
ассоциирован с наступлением беременности, тогда как гаплотип GC чаще
встречался у пациенток с неудачной программой. Частота гаплотипа АТ
статистически значимо не различалась в указанных группах. На основании
102
полученных данных был сделан вывод о преимущественном влияние
полиморфизма PGR 38 Т>С на частоту наступления беременности в группе с
комбинированной поддержкой ЛФ.
Также наблюдалась погранично значимая ассоциация полиморфизма
гена LHCGR: 872A>G с частотой наступления беременности в группе
пациенток, получавших комбинированную поддержку ЛФ. Учитывая, что у
пациенток в группе aGnRH был зафиксирован более высокий уровень ЛГ,
несмотря на то, что не было получено статистически значимой ассоциации
распределения аллелей полиморфных локусов генов LHCGR, был проведен
многофакторный дискриминантный анализ распределения генотипов
LHCGR: 872 A>G, PGR: 38 T>C, а так же их сочетаний. В результате
дискриминантного анализа была получена прогностическая модель неудачи
программы ВРТ при различных тактиках ведения ЛФ в зависимости от
сочетаний генотипов риска (PGR 38C/C или PGR 38T/C) и LHCGR: 872T/C. В
качестве предиктора неудачи использовалась переменная, принимающая
значение 1, если в генотипе пациентки присутствовал хотя бы один генотип
риска по указанным маркерам и 2, если присутствовали оба генотипа риска.
При отсутствии генетических маркеров неудачи ВРТ переменная принимала
значение 0. Данная переменная продемонстрировала наилучшую
предсказательную способность (Лямбда Уилкса 0,968, р=0,011, площадь под
кривой при проведении ROC–анализа составила 0,59 (0,51–0,67), р=0,032).
Среди пациенток, получавших aGnRH, при значении переменной, равном 1
(т.е. при наличии хотя бы одного генотипа риска) вероятность наступления
беременности составляла 39,3%, тогда как при отсутствии генотипов риска
она возрастала до 63,2 % (р=0,032). Интересно отметить, что в группе
стандартной поддержки ЛФ суммарная частота наступления беременности
составила –35,7% и значимого влияния генотипа выявлено не было.
Для полиморфизма FSHR 2039 G>A (Asn680Ser) [rs6166] ассоциация
генотипа с вероятностью наступления беременности была менее
выраженной: несмотря на то, что распределение аллелей статистически
103
значимо различалось в группе с наступившей беременностью и без таковой,
разница в распределении генотипов не достигала статистической значимости,
что не позволило однозначно определить тип наследования данного
признака. Лучше всего наблюдаемая ассоциация описывалась с помощью
аутосомно–доминантной модели (наличие аллеля G ассоциировано с
наступлением беременности: OR=2,33 (0,85–6,34), p=0,09). Соответственно,
согласно аутосомно–рецессивной модели наличие генотипа А/А являлось
неблагоприятным фактором для наступления беременности. При этом,
указанное явление наблюдалось только в группе у пациенток со стандартным
режимом поддержки ЛФ, где наблюдалось статистически значимое снижение
вероятности наступления беременности при генотипе А/А по сравнению с
таковой в группе с комбинированным режимом поддержки ЛФ (21,2 %
против 53,6%, р=0,03, OR=0,24 (0,07 – 0,75). Применение комбинированной
поддержки ЛФ нивелировало неблагоприятное влияние генотипа А/А и
частота наступления беременности в группе с комбинированной поддержкой
ЛФ не зависела от данного генотипа (рисунок 14).
* р <0,05 по сравнению с группой со стандартной поддержкой ЛФ (критерий Фишера).
Рисунок 14. Частота наступления беременности в программе ЭКО у
пациенток с полиморфизмом FSHR 2039 G>A (Asn680Ser) [rs6166] в
зависимости от режима поддержки лютеиновой фазы
21,2%
35,2%
44,1%
53,6% 53,1%
46,6%
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
A/A A/G G/G
FSHR 2039 (Asn680Ser )[rs 6166];
стандартный режим поддержки ЛФ
комбинированный режим поддержки ЛФ
ЧНБ
р<0,05
104
Был проведен анализ влияния сочетания генотипов FSHR 2039 G>A
Asn680Ser, PGR T>C и LHCGR: 872 T>C на частоту наступления
беременности в программе ЭКО при различных режимах поддержки ЛФ. На
основании проведенного анализа в качестве фактора риска рассматривалось
наличие у пациентки генотипов PGR 38 C/C, PGR 38 T/C и LHCGR: 872 T/C
(рисунок 15).
* р <0,05 по сравнению с группой со стандартной поддержкой ЛФ
(критерий Фишера).
Рисунок 15. Частота наступления беременности в программе ЭКО у
пациенток с генотипом риска PGR или LHCGR (PGR 38 C/C, PGR 38 T/C и
LHCGR: 872 T/C) и наличием генотипа FSHR 2039А/А (Ser680Ser) или
генотипа FSHR (2039G/G или 2039G/A) при различных режимах поддержки
лютеиновой фазы
Установлено, что при наличии генотипа FSHR 2039 G>A Asn680Ser
[rs6166] (G/G или G/A) и отсутствие генотипа риска PGR или LHCGR
частота наступления беременности была максимальной в обеих группах, с
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
Норма Риск
Норма Риск
Генотип риска по сочетанию PGR: 38 T>C и
LHCGR: 872 T>C Генотип риска по
сочетанию PGR: 38 T>C и LHCGR: 872 T>C Генотипы FSHR 2039G/A
или 2039G/G Генотип FSHR 2039A/A (Ser680Ser)
39,1% 37,3%
29,3%
14,2%
65,4%
33,5%
59,1%
45,6%
част
ота
нас
туп
лен
ия
бер
емен
но
сти
Стандартный режим поддержки ЛФ
Комбинированный режим поддержки ЛФ
р<0,05
105
наибольшей в группе комбинированного режима поддержки ЛФ по
сравнению со стандартным режимом 65,4% против 39,1%, р=0,03 . Генотипы
риска PGR или LHCGR не оказывали влияния при благоприятном генотипе
FSHR 2039 G>A Asn680Ser [rs6166] (G/G или G/A) у пациенток со
стандартной поддержкой ЛФ на частоту наступления беременности (37,3% и
39,1% р>0,05). Наличие генотипа риска PGR и/или LHCGR при
благоприятном генотипе FSHR 2039 G>A Asn680Ser [rs6166] (G/G или G/A)
оказывало негативное влияние на эффективность программы ЭКО при
комбинированном режиме поддержки ЛФ, так частота наступления
беременности составила 33,5% при наличии генотипа риска PGR и/или
LHCGR и 65,4% при его отсутствии р=0,02. Таким образом, при наличии
благоприятного генотипа FSHR 2039 G>A Asn680Ser [rs6166] (G/G или G/A)
и наличии генотипа риска PGR и/или LHCGR частота наступления
беременности в группе с комбинированной поддержкой была сопоставима со
стандартной поддержкой (33,5% и 37,3%, р>0,05).
В группе стандартной поддержки ЛФ при сочетании факторов риска
(PGR 38 C/C, PGR 38 T/C и LHCGR: 872 T/C) с благоприятным генотипом
FSHR (G/G или G/A) частота наступления беременности составила 37,3%,
что было выше, чем у пациенток, имеющих сочетание факторов риска с
генотипом FSHR А/А (генотип риска) – 14,2%, однако не было достигнуто
статистической значимости (р>0,05) в связи с небольшим размером группы и
низкой частотой наступления беременности в данной группе. При сочетании
факторов риска (PGR 38 C/C, PGR 38 T/C и LHCGR: 872 T/C) и генотипа
риска FSHR А/А частота наступления беременности была в 3 раза выше в
группе комбинированного режима поддержки ЛФ и составила 45,6% против
14,2%, однако не было достигнуто статистической значимости (р>0,05) в
связи с небольшим размером группы и низкой частотой наступления
беременности в данной группе. При наличии генотипа FSHR А/А и
отсутствии генотипа риска PGR или LHCGR частота наступления
беременности у пациенток с комбинированным режимом поддержки ЛФ
106
возрастала до 59,1% и была существенно выше по сравнению со
стандартным режимом (59,1% против 29,3%), однако разница не достигала
статистической значимости (р>0,05).
Таким образом, результаты проведенного исследования показали, что
исследуемые пациентки были соматически здоровыми женщинами
репродуктивного возраста с нормальными показателями овариального
резерва. Ведущей причиной инфертильности у 71,4% пациенток был трубно
– перитонеальный фактор бесплодия, у 28,6% – трубно – перитонеальный
фактор в сочетании с умеренной патозооспермией. В анамнезе каждой пятой
пациентки (24,1%) отмечена одна неудачная попытка ЭКО, у 22,2% – две
неудачные попытки ЭКО.
Результаты оценки морфологического исследования эндометрия в
пайпель–биоптатах в «окно имплантации» у 41 пациентки с бесплодием и у
14 фертильных женщин показали, что у пациенток с бесплодием по
сравнению с фертильными женщинами отмечено более низкое количество
клеток поверхностного эпителия, содержащих зрелые пиноподии (р=0,003).
При ИГХ исследовании выявлен дисбаланс PR/ER в строме, что вероятно
связано с высокой экспрессией PR и низкой ER в строме эндометрия,
снижение экспрессии LIF (р=0,02).
Выявлено существенной снижение экспрессии GnRH, GnRHR и HOXA10
у пациенток с бесплодием в сравнении с фертильными женщинами (р<0,05).
Полученные данные свидетельствуют о нарушении рецептивности
эндометрия.
Проведенный анализ эффективности программы ЭКО в зависимости от
режима поддержки ЛФ показал более высокую частоту наступления
клинической беременности (р=0,04) при использовании комбинированного
режима поддержки ЛФ (aGnRH+микронизированный Р) по сравнению со
стандартным режимом поддержки ЛФ (микронизированный Р). Вместе с тем
выявленное повышение частоты многоплодной беременности при
использовании комбинированной поддержки ЛФ (р=0,005) свидетельствует о
107
целесообразности совмещения данного режима поддержки ЛФ с
селективным переносом 1 эмбриона.
Для уточнения возможного механизма влияния aGnRH, используемого в
ЛФ в программе ЭКО было проведено исследование гормональных
параметров в динамике ЛФ, оценены уровни ХГч, а также анализ исходов
программы ЭКО у пациенток с нарушенной рецептивностью эндометрия.
Результаты исследования гормональных параметров ЛФ показали, что
при одинаковых исходных уровнях ЛГ, Е2, Р в обеих группах, на 7 – ой и
15–й дни после оплодотворения концентрации ЛГ, Р и Е2 были выше в
группе пациенток, получавших комбинированную поддержку ЛФ по
сравнению с аналогичными показателями в группе со стандартным режимом
поддержки ЛФ. Существенное увеличение концентраций ЛГ, Р и Е2
свидетельствуют об эффектах aGnRH на желтое тело, осуществляемых через
центральные механизмы регуляции, путем стимуляции секреции ЛГ
гонадотрофами гипофиза.
Анализ концентраций ХГч показал достоверное увеличение ХГч на
15 – й день после оплодотворения у пациенток с комбинированным режимом
поддержки ЛФ с наступившей как одноплодной, так и двуплодной
беременностью (р<0,05), что косвенно свидетельствует о влиянии aGnRH на
имплантационный потенциал эмбриона.
Кроме того, у пациенток с нарушенной рецептивностью эндометрия при
использовании комбинированного режима поддержки ЛФ, было выявлено
увеличение частоты наступления беременности по сравнению со
стандартным режимом ведения ЛФ (р=0,03), что подтверждает влияние
aGnRH на эндометрий и может быть основанием для назначения данного
режима поддержки ЛФ пациенткам с нарушенной рецептивностью
эндометрия и неудачными программами ЭКО в анамнезе.
Для персонификации назначения режима поддержки ЛФ в программе
ЭКО было проведено молекулярно–генетическое исследование результаты
которого показали, что назначение комбинированного режима поддержки
108
ЛФ наиболее эффективно у пациенток с наличием генотипа FSHR 2039G/A
или генотипом 2039 А/А (Asn680Asn) гена FSHR, а также при сочетании
факторов риска (PGR 38 C/C, PGR 38 T/C и LHCGR: 872 T/C) и генотипа А/А
полиморфизма FSHR 2039 G>A Asn680Ser [rs6166], тогда как при наличии
неблагоприятного генотипа PGR и/или LHCGR (PGR 38 C/C, PGR 38 T/C и
LHCGR: 872 T/C) и при генотипе FSHR 2039G/G или 2039G/A, назначение
комбинированной поддержки ЛФ не приводило к существенному
увеличению частоты наступления беременности и не отличалось по
эффективности от стандартного режима поддержки ЛФ.
109
Глава 4.
ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ
Поддержка ЛФ является важным этапом программы ЭКО, во многом
определяющим ее исход. В последние годы предметом активного
обсуждения является возможность использования комбинированного режима
поддержки ЛФ препаратами aGnRH в сочетании с микронизированным Р и
его влияние на эффективность программы ЭКО. В ряде исследований было
показано, что при добавлении aGnRH к стандартному режиму поддержки ЛФ
повышается частота наступления беременности [84,85]. Однако, несмотря на
обнадеживающие результаты этих исследований, остается открытым вопрос
об эффективности применения aGnRH в ЛФ программы ЭКО, учитывая, что
в исследуемых группах и группах сравнения применяли различные
препараты для поддержки ЛФ. Кроме того, нет ясности в механизме действия
aGnRH в ЛФ стимулированного цикла. Представляет интерес изучение
влияния генотипа пациентки на эффективность программ ЭКО при
различных режимах поддержки ЛФ для выработки персонализированного
подхода к выбору того или иного режима поддержки ЛФ.
В соответствии с целью исследования и поставленными задачами на
первом этапе работы был проведен сравнительный анализ клинико –
анамнестических и лабораторных данных пациенток с бесплодием,
обратившихся для проведения программы ЭКО, который показал, что
исследуемые пациентки представлены соматически здоровыми женщинами
репродуктивного возраста и нормальными показателями овариального
резерва. Длительность бесплодия колебалась от 1 до 18 лет и в среднем
составила 5,6±0,2 лет. У 71,4% пациенток выявлен трубно– перитонеальный
фактор бесплодия, у 28,6% трубно–перитонеальный фактор в сочетании с
мужским бесплодием (астенозооспермии I – II степени в 49,8% случаев и
астенотератозооспермией I – II в 26,9% случаев). У 24,1 % женщин отмечена
110
одна неудачная попытка ЭКО в анамнезе, две неудачные попытки ЭКО в
анамнезе были у 22,2% пациенток.
На втором этапе работы для оценки состояния эндометрия у 41
пациентки с бесплодием, имевших 1–2 неудачные попытки программ ЭКО в
анамнезе, и у 14 фертильных женщин была проведена сравнительная оценка
морфологических и ИГХ характеристик, а также особенности экспрессии
GnRH, GnRHR и HOXA 10 в эндометрии в «окно имплантации» (пик ЛГ+7)
естественного цикла.
Результаты морфологического исследования показали, что у
большинства пациенток с бесплодием наблюдалась секреторная
трансформация эндометрия, при этом ранняя стадия фазы секреции
обнаружена у 12,2%, средняя стадия фазы секреции – 78% и поздняя стадия
фазы секреции – у 9,8% пациенток. В группе контроля также превалировал
эндометрий средней стадии фазы секреции у 92,9%, ранняя стадия фазы
секреции наблюдалась у–7,1% женщин. При этом было отмечено
существенное снижение количества клеток поверхностного эпителия
содержащих зрелые пиноподии, у пациенток с бесплодием по сравнению с
фертильными женщинами (медиана составила 20% и 30%, р=0,003).
Известно, что в эндометрии LIF присутствует на протяжении всего
менструального цикла, достигая своего пика в секреторную фазу [31] и
оказывает различные пролиферативные и дифференцирующие эффекты как
на эмбриональные и эндотелиальные клетки, так и на гематопоэтические
клетки и остеобласты [81]. В исследовании Tawfeek et al. (2012) было
продемонстрировано, что показатели LIF у бесплодных женщин были
значительно ниже, чем в контрольной группе [125]. Аналогичные результаты
были получены в нашем исследовании – отмечено снижение уровня
экспрессии LIF у пациенток с бесплодием в сравнении с группой фертильных
женщин (4,4±0,1 и 5,8±0,2 балла, р=0,021).
Уровни экспрессии PR были высокими в железах и строме у пациенток с
бесплодием и у фертильных женщин. Показатели экспрессии ER у пациенток
111
с бесплодием в железах эндометрия были достоверно выше по сравнению с
контрольной группой (р=0,012), а в строме в два раза ниже по сравнению с
контрольной группой (р=0,035). Таким образом, в исследуемой группе
уровни экспрессии ER в железах были умеренные, а в строме низкие. Кроме
того, коэффициент PR/ER в строме эндометрия был существенно выше у
пациенток с бесплодием по сравнению с контрольной группой (медиана 5,5 и
2,7, р=0,035), что вероятно связано с высокой экспрессией PR и низкой
экспрессией ER в строме эндометрия. Полученные данные свидетельствуют
о нарушении рецептивности эндометрия в группе пациенток с бесплодием.
В исследовании Raga et al. (1998) было показано, что GnRH и GnRHR
присутствуют в эндометрии фертильных женщин в эпителиальных и
стромальных клетках на протяжении всего менструального цикла, с
увеличением их экспрессии в децидуализированных стромальных клетках в
ЛФ [105]. Впервые было проведено ИГХ исследование экспрессии GnRH и
GnRHR у пациенток с бесплодием в «окно имплантации» естественного
цикла. Результаты исследования показали существенное снижение
экспрессии GnRH у пациенток с бесплодием по сравнению с фертильными
женщинами в поверхностном эпителии – в 1,75 раза, в эпителии желез – в
1,9 раза и в строме – в 2 раза (р=0,0001), GnRHR в поверхностном эпителии
– в 4,2 раза, в эпителии желез – в 4,1, в строме – в 4,5 раза (р=0,0001), что
может явиться значимым маркером, ассоциированным с нарушением
рецептивности и имплантационного потенциала эндометрия.
Поскольку известно, что процесс синхронизации между развитием
эмбриона и эндометрия регулируется молекулярным механизмом,
опосредованным генами гомеобокса (НOXА), которые кодируют факторы
транскрипции, предполагают ассоциацию HOXA 10 с нарушением
рецептивности у пациенток с бесплодием. По данным Vitielle et al. (2007),
экспрессия генов HOXA 10 и HOXA 11 в эндометрии достигает максимума в
«окно имплантации» естественного цикла [138]. В нашем исследовании была
зафиксирована более низкая экспрессия HOXA 10 у пациенток с бесплодием
112
по сравнению с фертильными женщинами в поверхностном эпителии – в
1,1 раза, в эпителии желез – в 1,1 раза и в строме – в 1,3 раза, р<0,05, что
свидетельствует о нарушении рецептивности эндометрия у данных пациенток.
На следующем этапе исследования была проведена программа ЭКО в
протоколе с antGnRH и оценка влияния комбинированного режима
поддержки ЛФ по сравнению со стандартным режимом поддержки ЛФ, на
эффективность программы ЭКО. Пациентки были рандомизированы в
зависимости от режима поддержки ЛФ на 2 группы. В 1–й группе для
поддержки ЛФ назначали микронизированный Р в дозе 600 мг/день с 1–ых
суток после оплодотворения и однократную дозу трипторелина 0,1 мг п/к на
6–е сутки после оплодотворения (комбинированный режим поддержки ЛФ)
(n=92). Во 2–й группе–только микронизированный Р в дозе 600 мг/день с
1–ых суток после оплодотворения (стандартный режим поддержки ЛФ)
(n=115).
Проведенный анализ показал преимущество комбинированного режима
поддержки ЛФ по сравнению со стандартным режимом, о чем свидетельствует
повышение частоты наступления биохимической беременности (51,1% и
34,8%), имплантации (30,6% и 16,6%), клинической беременности (40,2% и
26,9%) и родов живым плодом (31,5% и 19,1%) в группе комбинированной
поддержки ЛФ по сравнению с группой со стандартной поддержкой ЛФ
(р<0,05). Полученные в нашем исследовании результаты согласуются с
данными исследования Hsiao–Fan Kung et al. (2014), в котором частота
наступления клинической беременности была достоверно выше в группе с
aGnRH (49% и 33,3%, р<0,05) [86]. В нашем исследовании было отмечено
увеличение частоты прогрессирующей беременности у пациенток, получавших
комбинированную поддержку ЛФ (36,9% и 21,7%, р=0,01). Аналогичные
результаты были получены в работе Tesarik et al. (2006), в которой было
выявлено увеличение частоты прогрессирующей беременности в группе
комбинированной поддержки ЛФ по сравнению с контрольной как в
протоколе с aGnRH, так и с antGnRH: (46,8 и 38, р<0,05 и 44,8% и 31,9%,
113
р<0,05) [24]. Кроме того, в нашей работе была выявлена более высокая
частота родов живым плодом при использовании aGnRH для поддержки ЛФ
(31,5% и 19,1%, р=0,04), что согласуется с результатами, полученными в
исследовании Brigante et al. (2013) [52]. Результаты исследования показали,
что частота прерывания беременности была сопоставима в обеих группах
(8,7% и 7,8%, р=0,82). Аналогичные результаты были получены в работах:
Qublan et al. (2008) – 8,3% и 5% р=0,47; Aboulghar et al. (2014) – 0,4% и 1,8%
р>0,05 [88,64]. Приведенные данные подтверждают, что добавление aGnRH в
ЛФ не влияет на частоту ранних репродуктивных потерь. В ряде исследований
отмечено, что в группе пациенток, использовавших aGnRH для поддержки ЛФ,
имела место более высокая частота наступления многоплодной беременности.
Так, в исследовании Aynaoglu et al. (2014) частота наступления многоплодной
беременности была значительно выше в группе комбинированного режима
поддержки ЛФ (17,9% против 4,2%, р=0,014) [128]. Результаты нашего
исследования также показали существенное повышение частоты
многоплодной беременности в группе женщин с комбинированным режимом
поддержки ЛФ по сравнению со стандартным режимом (14,3% против 4,3%,
р=0,005). Высокая частота многоплодной беременности при комбинированном
режиме поддержки ЛФ является неблагоприятным исходом программ ВРТ, т.к.
ведет к увеличению преждевременных родов и другим осложнениям
беременности. В группе с aGnRH частота преждевременных родов была
достоверно выше по сравнению со стандартным режимом поддержки (7,6% и
1,7%, р=0,03). Полученные данные свидетельствует о целесообразности
совмещения комбинированного режима поддержки ЛФ с селективным
переносом 1 эмбриона [24].
Полученные нами данные о позитивном влиянии aGnRH на
эффективность программы ЭКО свидетельствуют о целесообразности его
назначения для поддержки ЛФ в программах ЭКО. Подтверждением этого
служат и результаты опубликованных обзоров Кокрановского сообщества
2011 и 2015 года, в которых было отмечено существенное повышение частоты
114
имплантации, клинической, развивающейся беременности и частоты родов
живым плодом при использовании комбинированного режима ведения ЛФ
[84,85].
Механизм благоприятного влияния aGnRH назначаемого для поддержки
ЛФ не изучен и, в соответствии с представленными гипотезами, может
реализовываться на различных уровнях: желтое тело, эндометрий, эмбрион,
[126,24,88].
Для уточнения механизма влияния на желтое тело, назначаемого в ЛФ
программы ЭКО, был проведен сравнительный анализ гормональных
параметров в динамике ЛФ (Р,Е2,ЛГ) в зависимости от режима поддержки ЛФ.
Для изучения возможного влияния aGnRH на эндометрий была
проанализирована эффективность программ ЭКО в зависимости от
показателей рецептивности эндометрия (GnRH, GnRHR, HOXA 10) и
используемого режима ведения ЛФ. Для оценки влияния aGnRH на эмбрион
были исследованы уровни ХГч у пациенток с наступившей беременностью в
зависимости от режима поддержки ЛФ.
Анализ концентраций сывороточных гормонов в зависимости от режима
поддержки ЛФ в группе пациенток с комбинированным режимом поддержки
ЛФ по сравнению с группой со стандартным режимом поддержки ЛФ показал,
что на 7 – ой день после оплодотворения были зафиксированы более высокие
уровни ЛГ у пациенток получавших aGnRH для поддержки ЛФ (медиана 13,9
МЕ/л и 0,1 МЕ/л, р=0,0001), Е2 (медиана 5126 и 3501 пмоль/л, р=0,002) и Р
(медиана 335 и 170 нмоль/л, р=0,0001). Достоверное увеличение концентрации
ЛГ (р=0,0001) на 7 – ой день после оплодотворения в группе комбинированной
поддержки ЛФ свидетельствует в пользу гипотезы о влиянии aGnRH на
функцию желтого тела, которое осуществляется через центральные
механизмы, путем стимуляции секреции ЛГ гонадотрофами гипофиза. Кроме
того, существенное увеличение концентрации Р (р=0,02) и Е2 (р=0,0001) в
группе комбинированного режима поддержки ЛФ также подтверждает теорию
о влиянии aGnRH на желтое тело. Вопрос о возможном механизме действия
115
aGnRH на желтое тело обсуждался в нескольких работах [102,24]. В
исследовании Pirard et al. (2005) было показано, что низкие дозы aGnRH
(100 мкг бусерелина) способны оказывать стимулирующее действие на желтое
тело [102]. Аналогичные результаты были получены в исследовании
Tesarik et al. (2006), где, также было отмечено существенное увеличение
концентрации Р (42 ± 8 и 29 ± 7, р < 0,05) и Е2 (405 ± 52
и 372 ± 48, р < 0,05) на
7 – ой день после оплодотворения у пациенток в программе ЭКО в протоколе с
antGnRH, которым для поддержки ЛФ добавляли aGnRH [24]. В работе
Tesarik et al. (2006) не удалось зафиксировать достоверного увеличения ЛГ,
однако необходимо учитывать тот факт, что для получения этого эффекта
достаточно даже короткого пика ЛГ, который мог не быть зарегистрирован с
учетом дизайна исследования [24].
Тем не менее, данные, указывающие на прямое влияние aGnRH в ЛФ на
желтое тело, не исключают и другие механизмы, действующие, возможно,
параллельно.
Результаты экспериментальных исследований на животных показали,
что aGnRH могут улучшить развитие эмбриона in vitro и благоприятно
влияют на имплантацию [66,132]. В исследовании Nam et al. (2005) было
показано, что экстрагипоталамический гонадолиберин играет важную роль
как молекулярный аутокринно–паракринный регулятор оплодотворения,
раннего развития эмбрионов и имплантации, поскольку и гаметы, и
преимплантационный эмбрион экспрессируют GnRH и его рецептор как на
уровне мРНК, так и на уровне белков [132]. В другой работе Klemmt et al.
(2009) также было показано, что aGnRH является потенциальным
промоутером развития эмбрионов и имплантации [50]. Tesarik et al. (2004)
было продемонстрировано, что назначение aGnRH для поддержки ЛФ
повышает частоту наступления беременности в циклах донации ооцитов у
реципиентов с подавленной овуляцией и отсутствием желтого тела, что
предполагает прямое влияние aGnRH на эмбрион [126]. Ранее сообщалось,
что GnRH повышает уровень ХГч в сыворотке крови у беременных женщин
116
[67], по – видимому, воздействуя на рецепторы GnRH плаценты [82]. Кроме
того, в работе Siler – Khodr et al. (1997) было установлено, что антитела к
GnRH присутствовали в крови беременных женщин с предшествующими
выкидышами и низким уровнем ХГч, что подтверждает важную роль GnRH в
имплантации эмбриона и плацентации [47]. Для изучения возможного
влияния aGnRH на эмбрион мы провели сравнительный анализ частоты
имплантации и оценка уровня ХГч в динамике ЛФ, у пациенток с
наступившей беременностью в зависимости от режима поддержки ЛФ. В
ряде работ было зафиксировано увеличение частоты имплантации у
пациенток с комбинированным режимом поддержки ЛФ по сравнению со
стандартным режимом поддержки ЛФ (27,1 % и 17,4%, р<0,05 и 29,8% и 18,2
р<0,05) [24]; р<0,05 (Isik et al. 2009) [115]; 12,3% и 7,3% р<0,05 (Razieh et al.
2009) [106]; 24,5% и 17,0%, р=0,023 (Hsiao–Fan Kung et al. 2014) [86],
результаты нашего исследования также показали существенное увеличение
частоты имплантации в группе пациенток с комбинированным режимом
поддержки ЛФ 30,6% и 16,6% (р<0,05). Кроме того, было зафиксировано
достоверное увеличение концентрации ХГч на 15–й день после
оплодотворения, у пациенток с комбинированной поддержкой ЛФ с
наступившей одноплодной и двуплодной беременностью–220 Ме/л
(интерквартильный интервал 159 – 2267) и 453 Ме/л (интерквартильный
интервал 378 – 490), по сравнению с группой женщин со стандартной
поддержкой ЛФ (медиана 112 Ме/л, интерквартильный интервал 110 – 118) и
244 Ме/л (интерквартильный интервал 127 – 276,5), (р<0,05). Полученные
данные согласуются с результатами проспективного исследования
Tesarik et al. (2006), проведенного при участии 600 пациенток, в ходе
которого также было установлено, что у пациенток с наступившей
беременностью концентрации ХГч на 15 – й день после оплодотворения
были существенно выше у пациенток в группе aGnRH по сравнению с
женщинами получавшими для поддержки ЛФ только микронизированный Р
(53 ± 6 и 34 ± 5, p<0,05) [24].
117
Также в нашем исследовании было показано, что назначение aGnRH для
поддержки ЛФ благоприятно влияет на имплантационный потенциал
эндометрия, т.к. отмечено повышение частоты наступления беременности у
пациенток с нарушенной рецептивностью эндометрия и сниженной
экспрессией GnRH и GnRHR в 3 раза (45% против 15%, р=0,03) по сравнению
с группой пациенток, не получавших aGnRH для поддержки ЛФ. Действие
aGnRH на эндометрий может объясняться тем, что локальная экспрессия
GnRH трофобластом и присутствие его рецепторов в децидуализированном
эндометрии играет важную роль в диалоге между бластоцистой и эндометрием
на стадии ранней имплантации, что осуществляется путем модуляции баланса
между матриксными металлопротеиназами (MMP) и их ингибиторами
[75,105]. Благодаря специфическому ингибированию тканевых ингибиторов
металлопротеиназ (TIMP), повышается инвазивная способность трофобласта,
что способствует более успешной имплантации бластоцисты [75,105].
Несмотря на полученные данные о благоприятном влиянии
комбинированного режима поддержки ЛФ на исходы программы ЭКО в
литературе нет данных о том для каких пациенток использование того или
иного режима поддержки ЛФ наиболее предпочтительно. Известно, что на
эффективность и приемлемость использования различных гормональных
препаратов могут влиять сотни генов, однако лишь небольшое количество
ключевых SNPs генов гормонов и их рецепторов могут прогнозировать
индивидуальную реакцию пациентки на применение данного препарата [103].
На следующем этапе нашего исследования был проведен анализ влияния
генетических полиморфизмов на исходы программы ЭКО при
комбинированном и стандартном режимах поддержки ЛФ. Был проведен
поиск возможной ассоциации полиморфизма ESR1 Xbal A>G, ESR1 2014 G>A,
ESR2 984 G>A, FSHR 2039 G>A, LHCGR 935 A>G, LHCGR 872 A>G, PGR 331
G>A, PGR 38 T>C с частотой наступления беременности в программах ЭКО с
различной тактикой ведения ЛФ. Согласно аутосомно – рецессивной модели
наследования носительство у пациенток полиморфизма PGR (38 T>C и 331
118
G>A) повышало шанс наступления беременности в 2,46 (1,03 – 5,86) и 3,86
(0,97 – 15,32) соответственно.
В результате дискриминантного анализа, проведенного на данной
выборке пациенток, была получена прогностическая модель неудачи
программы ВРТ в зависимости от сочетаний генотипов риска (PGR 38C/C
или PGR 38T/C) и LHCGR: 872T/C. Вероятность наступления беременности у
пациенток с комбинированным режимом поддержки ЛФ и отсутствием
генотипов риска составила 63,2 %, тогда как при наличии даже одного из них
снижалась до 39,3%. Предсказательная способность модели была достаточно
высокой, при ROC–анализе площадь под кривой составила 0,59 (0,51–0,67),
р=0,032. Таким образом, было выявлено, что при отсутствии генотипов
рисков добавление aGnRH к микронизированному Р для поддержки ЛФ
увеличивает частоту наступления беременности почти в 2 раза, тогда как при
наличии хотя бы одного из них назначение комбинированного режима
поддержки ЛФ нецелесообразно.
Важно отметить, что в нашем исследовании в группе стандартной
поддержки ЛФ значимого влияния генотипа LHCGR: 872A>G выявлено не
было, тогда как у пациенток с комбинированным режимом поддержки ЛФ
наблюдали изменение вероятности наступления беременности в зависимости
от особенностей гена, кодирующего рецептор LH. Полученные нами данные
можно объяснить с позиций гипотезы о механизме влияния поддержки
aGnRH на желтое тело путем стимуляции секреции ЛГ. Наличие генотипа
T/T повышало вероятность наступления беременности в группе с
комбинированным режимом ведения ЛФ, что может быть связано с
повышенной чувствительностью рецептора к ЛГ. В группе сравнения
наблюдалась аналогичная тенденция, но различия не достигали уровня
статистической значимости, что может свидетельствовать о менее
выраженном влиянии генотипа LHCG при использовании стандартного
режима поддержки ЛФ.
119
В недавнем исследовании Desai et al. (2013) изучали полиморфизм в
положении – 29 в 5' – не транслируемой области FSHR – 29G>A и было
показано, что генотип – 29А/А ассоциирован с «бедным» овариальным
ответом и сниженной экспрессией FSHR [21]. Аналогичные ассоциации
описаны для аллеля FSHR 2039A (680Asn) в работе Hanevik et al. (2010)
была выявлена положительная корреляция аллеля 2039G (680Ser)
полиморфизма гена FSHR 2039 G>A (Ser680Asn) с частотой наступления
беременности в программах ЭКО [16], что соответствовало нашим
результатам. Интересно, что указанное явление зафиксировано только в
группе у пациенток со стандартной поддержкой ЛФ, где наблюдалось
статистически значимая более низкая частота наступления беременности при
генотипе FSHR А/А по сравнению с таковой в группе с комбинированной
поддержкой ЛФ (21,2% против 53,6%, р=0,03, OR=0,24 (0,07 – 0,75)). Надо
отметить, что пациентки в двух группах сравнения были сопоставимы по
возрасту, (медиана–32 года, (интерквартильный интервал – 29 – 35 лет),
уровню АМГ в 1 – ой группе медиана – 2,6 (интерквартильный интервал 1,7–
3,7 нг/мл), во 2 – ой группе – 2,2 (интерквартильный интервал 1,5–3,7 нг/мл,
р=0,518)). Также не было выявлено различий по количеству полученных
ооцитов (9,72±0,4 и 9,01±0,3; р=0,130), полученных эмбрионов хорошего
качества (1,7±0,1 и 1,47±0,1; р=0,062), перенесенных эмбрионов (1,8±0,03 и
1,8±0,03; р=0,967) и перенесенных эмбрионов хорошего качества (1,04±0,08 и
0,8±0,07; р=0,047). Таким образом, добавление aGnRH для поддержки ЛФ
нивелировало неблагоприятное влияние генотипа А/А полиморфизма FSHR
2039 G>A (Asn680Ser) [rs6166] и частота наступления беременности в группе
с комбинированным режимом поддержки ЛФ была существенно выше по
сравнению со стандартным режимом поддержки ЛФ и не зависела от данного
генотипа.
Наличие генотипа FSHR 2039 G>A Asn680Ser [rs6166] (G/G или G/A)
являлось благоприятным фактором при использовании обоих режимов
поддержки ЛФ, с более высокой частотой наступления беременности в
120
группе комбинированного режима – 39,1% и 65,4%, р=0,03. При наличии
генотипа FSHR 2039 G>A Asn680Ser [rs6166] (G/G или G/A) у пациенток со
стандартным режимом поддержки ЛФ частота наступления беременности
была максимальной и практически не зависела от генотипов PGR и/или
LHCGR (39,1% и 37,3%, р>0,05). Однако, наличие генотипа риска PGR и/или
LHCGR при благоприятном генотипе FSHR 2039 G/G Asn680Asn негативно
влияло на эффективность применения комбинированного режима поддержки
ЛФ и значимого повышения частоты наступления беременности в группе
комбинированной поддержки в сравнении со стандартной поддержкой не
наблюдалось (33,5% и 37,3%, р>0,05).
Для пациенток с генотипом FSHR А/А (генотип риска) частота
наступления беременности при стандартной поддержке ЛФ была несколько
ниже, чем для пациенток с благоприятным генотипом FSHR (G/G или G/A) -
29,3% и 39,1% соответственно, р>0,05. У пациенток с наличием генотипа
FSHR А/А, получавших стандартную поддержку ЛФ, наблюдалось
выраженное влияние генотипа PGR и/или LHCGR на частоту наступления
беременности. Так, при отсутствии генотипа риска PGR или LHCGR частота
наступления беременности составляла 29,3%, а при наличии генотипа риска
PGR и/или LHCGR снижалась в 2 раза и составила 14,2%. Однако,
применение комбинированного режима поддержки ЛФ было наиболее
эффективным именно для этих пациентов: при использовании aGnRH
частота наступления беременности у пациенток с сочетанием факторов риска
(PGR 38 C/C, PGR 38 T/C и LHCGR: 872 T/C) и генотипа риска А/А
полиморфизма FSHR 2039 G>A увеличилась на 30% по сравнению с группой
пациенток, получавших стандартную поддержку ЛФ, 14,2% против 45,6%,
р>0,05 и даже несколько превышало частоту наступления беременности у
пациенток с благоприятным генотипом FSHR (G/G или G/A), получавших
стандартную поддержку ЛФ (45,6% против 39,1%, р>0,05). Это дало
основание рекомендовать комбинированную поддержку именно этой группе
пациенток.
121
В проведенных ранее исследованиях было выявлено, что генотип T/T
ESR1 [Pvull] ассоциирован со сниженным шансом наступления беременности
у женщин в программах ВРТ [55]. В нашем исследовании не было найдено
статистически значимых ассоциаций полиморфизма ESR1 с частотой
наступления беременности. Полученные данные согласуются с результатами
исследований (Ayvaz et al. (2009), Choi et al. (2009)) в ходе которых такой
связи также не обнаружили [57,51].
Таким образом, результаты исследования показали, что применение
комбинированного режима поддержки ЛФ по сравнению со стандартным
режимом оказывает более благоприятный эффект на исходы программы
ЭКО, что приводит к повышению частоты наступления беременности.
Увеличение частоты имплантации у пациенток, получавших aGnRH для
поддержки ЛФ по сравнению с группой женщин использовавших
стандартный режим поддержки ЛФ, указывает на повышенный риск
многоплодной беременности при использовании данного режима поддержки
ЛФ. Это свидетельствует о целесообразности совмещения комбинированного
режима поддержки ЛФ с селективным переносом 1 эмбриона.
Результаты исследования подтверждают благоприятное влияние aGnRH
в ЛФ стимулированного цикла на исходы программы ЭКО, которое
осуществляется путем сочетанного действия на эндометрий, желтое тело и
эмбрион. Выявлены молекулярно–генетические предикторы назначения как
стандартного, так и комбинированного режимов поддержки ЛФ в программе
ЭКО.
На основании полученных результатов разработан алгоритм
персонализированного назначения поддержки ЛФ в программах ЭКО с
учетом иммуногистохимических и молекулярно–генетических маркеров
(рисунок 16).
122
Рисунок 16. Алгоритм персонализированного назначения режимов
поддержки ЛФ в программах ЭКО с учетом иммуногистохимических и
молекулярно–генетических маркеров
123
ВЫВОДЫ
1. У пациенток с трубно–перитонеальным бесплодием и нормальными
параметрами овариального резерва, имеющих неудачные попытки ЭКО в
анамнезе, в «окно имплантации» наблюдалась секреторная трансформация
эндометрия с преобладанием средней стадии фазы секреции (78%), при этом
по сравнению с фертильными женщинами выявлено снижение количества
клеток поверхностного эпителия, содержащих зрелые пиноподии (р=0,003),
уменьшение экспрессии LIF (р=0,03) и увеличение соотношения PR/ER в
строме эндометрия (5,5 и 2,7; р=0,03).
2. У пациенток с трубно–перитонеальным фактором бесплодия и
неудачными попытками ЭКО в анамнезе снижение экспрессии GnRH в
поверхностном эпителии эндометрия – в 1,75 раза, в железах – в 1,9 раза и в
строме – в 2 раза, GnRHR в эпителии – в 4,2 раза, в железах – в 4,1 раза, в
строме – в 4,5 раза, HOXA 10 в эпителии – в 1,1 раза, в железах – в 1,1
раза и в строме – в 1,3 раза в сравнении с группой фертильных женщин в
«окно имплантации» (р<0,05) ассоциируется с нарушением
имплантационного потенциала эндометрия.
3. Использование aGnRH в рамках комбинированного режима поддержки
лютеиновой фазы оказывает более позитивное влияние на исходы
программы ЭКО, что подтверждается более высокой частотой имплантации
(30,6% и 16,6%, р<0,05), клинической беременности (40,2% и 26,9%, р=0,04),
прогрессирующей беременности (36,9% и 21,7 %, р=0,01) и родов живым
плодом (31,5% и 19,1%, р=0,04), по сравнению со стандартным режимом.
4. Более высокая частота многоплодной беременности (14,3% и 4,3%,
р=0,005) и преждевременных родов (7,6% и 1,7%, р=0,03) при
комбинированном режиме поддержки является основанием для селективного
переноса 1 эмбриона.
124
5. При комбинированном режиме поддержки лютеиновой фазы отмечено
статистически значимое повышение уровней ЛГ (медиана 13,9 МЕ/л и 0,1
МЕ/л, р=0,0001) , Р (медиана 335 нмоль/л и 170 нмоль/л, р=0,0001) и Е2
(медиана 5126 пмоль/л и 3501 пмоль/л р=0,002) на 7–й день после
оплодотворения, а также уровней ЛГ (медиана 0,3 МЕ/л и 0,1 МЕ/л, р=0,003)
и Р (медиана 206 нморль/л и 108 нмоль/л, р=0,043) на 15–й день, что
свидетельствует о воздействии aGnRH на функцию желтого тела через
центральные механизмы за счет стимуляции секреции ЛГ гонадотрофами
гипофиза.
6. Концентрации ХГч у пациенток с наступившей беременностью в группе с
комбинированной поддержкой лютеиновой фазы на 15–й день после
оплодотворения достоверно выше по сравнению со стандартной поддержкой,
как при одноплодной (медиана 220 Ме/л и 112 Ме/л, р<0,05), так и при
двуплодной беременности ( медиана 453 Ме/л и 224 Ме/л , р<0,05), что
может быть косвенным подтверждением действия aGnRH на эмбрион.
7. Применение aGnRH для поддержки ЛФ у пациенток со снижением
экспрессии GnRH, GnRHR, HOXA 10 повышает частоту наступления
беременности в 3 раза (45% и 15% соответственно, р=0,03), что
свидетельствует о благоприятном воздействии aGnRH на рецептивность
эндометрия, предположительно за счет стимуляции aGnRH рецепторов
GnRH.
8. Получена прогностическая модель неудачи программы ВРТ в зависимости
от сочетаний генотипов риска (PGR 38C/C или PGR 38T/C) и LHCGR: 872T/C
у пациенток с различной тактикой ведения лютеиновой фазы (Лямбда Уилкса
0,968, р=0,011, площадь под кривой при проведении ROC–анализа составила
0,59 (0,51–0,67), р=0,032).
9. Генотип 2039 А/А (Asn680Asn) гена FSHR является значимым маркером,
ассоциированным со сниженным шансом наступления беременности в
группе со стандартной поддержкой лютеиновой фазы по сравнению с
комбинированной поддержкой (21% против 54%, р=0,03, OR=0,24 (0,07 –
125
0,75)). Добавление aGnRH для поддержки лютеиновой фазы нивелировало
неблагоприятное влияние генотипа FSHR2039 А/А и частота наступления
беременности увеличивалась в 2,5 раза.
10. Наличие генотипа G/G или G/A гена FSHR 2039 G>A Asn680Ser [rs6166]
ассоциировалось с максимальной частотой наступления беременности при
стандартном режиме и не зависело от генотипов PGR и LHCGR. Назначение
комбинированной поддержки лютеиновой фазы при наличии генотипа FSHR
2039 G/G Asn680Asn нецелесообразно, т.к. не приводит к дополнительному
повышению частоты наступления беременности. При комбинированном
режиме максимальная эффективность программы наблюдалась у пациенток с
благоприятным сочетанием генотипов PGR и LHCGR.
126
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1. Для поддержки лютеиновой фазы в программе ЭКО помимо стандартного
режима микронизированным прогестероном (600 мг/д вагинально)
целесообразно использовать комбинированный режим (микронизированный
прогестерон в дозе 600 мг/день с 1–ых суток после оплодотворения и
однократную дозу трипторелина 0,1 мг п/к на 6–е сутки после
оплодотворения).
2. Комбинированный режим поддержки ЛФ следует сочетать с селективным
переносом 1 эмбриона.
3. Выбор режима поддержки ЛФ в программе ЭКО следует осуществлять с
учетом результатов морфологического и иммуногистохимического
исследования эндометрия и молекулярно–генетических маркеров в крови.
4. У пациенток с трубно–перитонеальным фактором бесплодия
целесообразно проведение комплексного морфологического (датирование
эндометрия, изучение формирования и созревания пиноподий)
иммуногистохимического исследования (определение уровня экспрессии ER,
PR, LIF, GnRH и GnRHR, HOXA 10) ткани эндометрия в период «окна
имплантации».
5. Оценка уровня экспрессии GnRH, GnRHR в эндометрии в «окно
имплантации» может быть рекомендована для использования в клинической
практике как маркер имплантационного потенциала эндометрия.
6. У пациенток с трубно–перитонеальным фактором бесплодия и
неудачными программами ЭКО количеством клеток поверхностного
эпителия, содержащих зрелые пиноподии ˂ 20%, соотношением PR/ ER > 4,
умеренной или низкой экспрессией LIF, снижением экспрессии GnRH,
GnRHR, HOXA 10 целесообразно назначение комбинированного режима
поддержки лютеиновой фазы с использованием агониста GnRH.
127
7. При носительстве генотипа FSHR 2039 G/G Asn680Asn и/или генотипов
риска (PGR 38 C/C, PGR 38 T/C и LHCGR: 872 T/C) учитывая прогноз об
отсутствии существенного повышения частоты наступления беременности
при использовании комбинированного режима поддержки лютеиновой фазы,
рекомендовано назначение стандартного режима поддержки лютеиновой
фазы.
8. При наличии генотипа 2039 А/А (Asn680Asn) гена FSHR или генотипа G/A
гена FSHR 2039 G>A Asn680Ser [rs6166] или его сочетании с генотипом PGR
или LHCGR (PGR 38 C/C, PGR 38 T/C и LHCGR: 872 T/C) целесообразно
назначение комбинированного режима поддержки лютеиновой фазы с
использованием aGnRH.
128
Список сокращений
АМГ – антимюллеровый гормон
Антитела к ТПО – антитела к тиреопероксидазе
ВМИ – внутриматочная инсеминация
ВОЗ – Всемирная организация здравоохранения
ВРТ – вспомогательные репродуктивные технологии
ВПГ – вируса простого герпеса
ВПЧ – вируса папилломы человека
ВИЧ – вирус иммунодефицита человека
ДГЭА–С – дегидроэпиандростерон–сульфат
ДИ – доверительный интервал
ДНК– дезоксирибонуклеиновая кислота
Е2 – эстрадиол
ИГХ исследование – иммуногистохимическое исследование
ИППП – инфекции, передающиеся половым путем
ИМТ – индекса массы тела
КИО – контролируемая индукция овуляции
ЛГ – лютеинизирующий гормон
НЦАГиП – научный центр акушерства гинекологии и перинатологии
ЛФ – лютеиновая фаза
Прл – пролактин
ПЦР – полимеразная цепная реакция
рФСГ – рекомбинантный фолликулостимулирующий гормон
рХГч – рекомбинантный человеческий хорионический гонадотропин
СГЯ – синдром гиперстимуляции яичников
СПКЯ – синдром поликистозных яичников
ТВП – трансвагинальная пункция
Т–тестестерон
ТТГ – тиреотропный гормон
129
Т3св –Т3 свободный
Т4св – Т4 свободный
УЗИ – ультразвуковое исследование
ФСГ – фолликулостимулирующий гормон
ХГч – хорионический гонадотропин человека
ЧМг – человеческий менопаузальный гонадотропин
ЭКО и ПЭ – экстракорпоральное оплодотворение и перенос эмбрионов
ЭДТА – этилендиаминтетрауксусная кислота
AUC - Area Under Curve (площадь под кривой)
aGnRH – агонист гонадотропин – рилизинг гормона
antGnRH – антагонист гонадотропин – рилизинг гормона
ER – эстрогеновые рецепторы
ESR1, ESR2 – ген эстрогеновых рецепторов
FSHR – ген рецептора фолликулостимулирующего гормона
GnRH – гонадотропин – рилизинг гормон
GnRHR – рецептор гонадотропин – рилизинг гормона
LHCGR – ген рецептора лютеинизирующего гормона
HOXA10 – ген гомеобокса 10
LIF – лейкемия – ингибирующий фактор
MMP – матриксная металопротеиназа
Р – прогестерон
РR – прогестероновые рецепторы
PGR – ген рецептора прогестерона
PIBF – прогестерон индуцируемый блокирующий фактор
ROC-анализ (Receiver Operator Characteristic - операционная характеристика
приёмника)
SNPs – одиночные нуклеотидные полиморфизмы
TIMP – тканевой ингибитор металлопротеиназ
VEGF – сосудистый эндотелиальный фактор роста
17–ОП –гидроксипрогестерон
130
ICSI – интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида в ооцит
IVF – in vitro fertilisation (экстракорпоральное оплодотворение)
131
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Алексеева М.Л. «Хорионический гонадотропин. Структура, функция,
диагностическая значимость (обзор литературы)» / Алексеева М.Л. //
«Проблемы репродукции», 3, 2006
2. Алиева К.У. Новые возможности подготовки эндометрия в программах
вспомогательных репродуктивных технологий / Алиева К.У. [и др.] //
Вестник новых медицинских технологий 2007;3:6—8.
3. Бесплодный брак. Современные подходы к диагностике и лечению / Под
ред. Г. Т. Сухих, Т. А. Назаренко. – М. : ГЭОТАР–Медиа, 2010. – 518 c.
4. Бурлев В.А. Функциональная активность эндометрия влияет на
результаты ЭКО и перенос эмбрионов: молекулярные механизмы
регуляции фертильности / Бурлев В.А., Кузьмичев Л.Н., Онищенко А.C.,
Ильясова. Н.А., Щетинина Н.C. // Проблемы репродукции. – 2010. – № 2.
– С. 41–52.
5. Вартанян Э.В. Причины неудач ЭКО // Э.В. Вартанян, И.В. Айзикович,
А.Р. Антонов // Проблемы репродукции. – 2010. – № 3. – С. 57–61.
6. Калинина Е.А. Рецептивность эндометрия у пациенток с
эндометриозассоциированным бесплодием (обзор литературы) // Е.А.
Калинина, А.В. Колотовкина, Е.А. Коган, Л.В. Адамян // Проблемы
репродукции. – 2012. – № 4. – С. 55–62.
7. Кондриков Н.И. Структурно–функциональные изменения эндометрия под
воздействием стероидных гормонов // Журнал практического гинеколога.
—1999. — Т. 1. — № 1. — С. 12–19.
8. Крутова В.А., Галустян С.А., Белкина Н.В. Комплексное лечение женщин,
страдающих бесплодием, ассоциированным с генитальным
эндометриозом. Рос вестн акуш гинекол 2008; 2: 59—63.
9. Назаренко Т.А. Современные подходы к применению прогестинов у
женщин репродуктивного возраста // Назаренко Т.А., Дуринян Э.Р.,
132
Ревишвили Н.А., Мишиева Н.Г. // ВЕСТНИК Репродуктивного Здоровья •
Декабрь • 2010. — С. 6–8.
10. Ольховская М.А. Биомаркеры ≪имплантационного окна≫ (обзор
литературы). Пробл репрод 2007;1:72—77.
11. Побединский Н.М. Стероидные рецепторы нормального эндометрия
/ Н.М. Побединский, О.И. Балтуцкая, А.И. Омельяненко // Акушерство и
гинекология. — 2000. — № 3. — С. 5–8.
12. Принципы терапии патологии эндометрия у пациенток с бесплодием
/ Серебренникова К.Г., [и др.] // В кн.: Клиническая гинекология. Под ред.
В.Н. Прилепской. М: МЕДпресс–информ 2007;249—268.
13. Современные технологии лечения бесплодия у женщин с
оперированными яичниками / К. Г. Серебренникова [и др.] //
Международный журнал экспериментального образования. – 2010. – № 9.
– С. 115– 117.
14. Элдер, К. Экстракорпоральное оплодотворение / К. Элдер, Б. Дэйл. – М //
МЕДпресс–информ, 2008. – 276 c.
15. A randomized study comparing Crinone 8% and intramuscular progesterone
supplementation in in vitro fertilization–embryo transfer cycles / Propst, A.M.
[et al.] // Fertil. Steril. — 2001— Vol. 76. – Р. 1144–1149.
16. A single nucleotide polymorphisms in the anti—Mullerian hormone signalling
pathway do not determine high or low response to ovarian stimulation / H. I.
Hanevik [et al.] // Reprod. Biomed. Online. – 2010. – Vol. 21, №5. – P. 616—
623.
17. Accidental exposure to daily long–acting gonadotrophin–releasing hormone
analogue administration and pregnancy in an in–vitro fertilization cycle / B.
Gartner [et al.] // Hum Reprod. — 1997 — Vol. 12 – Р. 2557–2559.
18. Administration of gonadotropin–releasing hormone agonist during the luteal
phase of GnRH–antagonist IVF cycles / J.N. Hugues [et al.] // Hum Reprod.
— 2006 — Vol. 21. – Р. i3.
133
19. Aghahosseini, M. Estradiol supplementation during the luteal phase in poor
responder patients undergoing in vitro fertilization: a randomized clinical trial
/ M. Aghahosseini [et al.] // Journal of Assisted Reproduction and Genetics. –
2011 — Vol.28. — Р. 785–90.
20. An update of luteal phase support in stimulated IVF cycles / H. Fatеmi [et
al.] // Human Reproduction Update. – 2007. — Vol. 13. — № 6. — Р.
581–590.
21. Association of allelic combinations of FSHR gene polymorphisms with ovarian
response / S. S. Desai [et al.] // Reprod. Biomed. Online. – 2013. – Vol. 27, №
4. – P. 400—406.
22. Ata, B. Effect of highdose estrogen in luteal phase support on live birth rates
after assisted reproduction treatment cycles / B. Ata [et al.] // Journal of
Reproductive Medicine for the Obstetrician and Gynecologist – 2010. — Vol.
55. – Р. 485–90.
23. Ata, B. Single dose GnRH agonist administration in the luteal phase of assisted
reproduction cycles: is the effect dependent on the type of GnRH analogue used
for pituitary suppression? / B. Ata, B. Urman //Reprod Biomed Online – 2010.
– Vol. 20. – Р. 165–166.
24. Beneficial effect of luteal–phase GnRH agonist administration on embryo
implantation after ICSI in both GnRH agonist– and antagonist–treated ovarian
stimulation cycles / J. Tesarik [et al.] // Hum Reprod – 2006. — Vol. 21. – Р.
2572–2579.
25. Brey, G. Neuroendocrine control of development of obesity: understanding
gained from studies of experimental animal models / G. Brey, J.S. Fisler,
D.A. York // Front. Neuroendocrinol. — 1990. — Vol. 1. — P. 128–181.
26. Bulletti, C. Uterine contractility and embryo implantation / C. Bulletti, D. de
Ziegler. // Curr Opin Obstet Gynecol. — 2005. — Vol. 17. – Р. 265–276.
27. Caligara, C. Luteal phase support in IVF patients at low risk for OHSS:
Progesterone vs. progesterone plus HCG. A prospective randomized study
/ C. Caligara, F. [et al.] // Fertility and Sterility. – 2007. — Vol. 88. Р.163.
134
28. Casper, R. Induction of luteolysis in the human with a long–acting analog of
luteinizing hormone–releasing factor / R. Casper, S.S. Yen // – 1979. — Vol.
205. Р. 408–410.
29. Ceyhan, S. Use of luteal estrogen supplementation in normal responder patients
treated with fixed multidose GnRH antagonist: a prospective randomized
controlled study / S. Ceyhan [et al.] // Fertility and Sterility. – 2008 — Vol. 89.
— № 6. — Р. 1827–30.
30. Chakravarty, B. Oral dydrogesterone versus intravaginal micronised
progesterone as luteal phase support in assisted reproductive technology (ART)
cycles: Results of a randomised study / B. Chakravarty [et al.] // Journal of
Steroid Biochemistry and Molecular Biology. — 2005— Vol. 97. — №5. – Р.
416–20.
31. Coculture of human embryos with autologous human endometrial epithelial
cells in patients with implantation failure / C. Simon, A. Mercader, J. Garcia–
Velasco [et al.] // J. Clinical Endocrinology Metabolism. —1999. — Vol. 84.
— P. 2638–2646.
32. Comparative Study of Dydrogesterone and Micronized Progesterone for Luteal
Phase Support During in VitroFertilization (IVF) Cycles /Saharkhiz N. [et al.] //
Gynecol Endocrinol– 2016 – Vol.32 № 3. – Р. 213– 7.
33. Comparison of luteal phase profile in gonadotrophin stimulated cycles with or
without a gonadotrophin—releasing hormone antagonist / G. Ragni [et al.] //
Hum Reprod – 2001— Vol. 16. – Р. 2258–2262.
34. Comparison of oral dydrogesterone with progesterone gel and micronized
progesterone for luteal support in 1,373 women undergoing in vitro
fertilization: a randomized clinical study / A. Ganesh [et al.] // Fertility and
Sterility. – 2011 — Vol. 95. — № 6. Р. 1961–5.
35. Crinone vaginal gel is equally effective and better tolerated than intramuscular
progesterone for luteal phase support in in vitro fertilization–embryo transfer
cycles: A prospective randomized study / E. Yanushpolsky [et al.] // Fertility
and Sterility – 2010. — Vol. 94. – №7. – Р. 2596–9.
135
36. Csapo, A. Effects of luteectomy and progesterone replacement therapy in early
pregnant patients / A. Csapo, M.O. Pulkkinen, W.G. Wiest // Am J Obstet
Gynecol. —1973— Vol. 115. – Р. 759–765.
37. Csapo, A. Indispensability of the human corpus luteum in the maintenance of
early pregnancy. Luteectomy evidence / A. Csapo, M. Pulkkinen // Obstet
Gynecol Surv. — 1978— Vol. 33. – Р. 69–81.
38. Cullinan, E. Leukemia inhibitory factor (LIF) and LIF receptor expression in
human endometrium saggests a potential autocrine/paracrine function in
regulating embryo implantation / E. Cullinan, S.J. Abbondanzo, P.S. Anderson
// Proc Natl Acad Sci USA. — 1996— Vol. 93.— Р. 3115—3120.
39. Dattaprasad, B. Evaluation of the impact of gonadotropin‑releasing hormone
agonist as an adjuvant in luteal‑phase support on IVF outcome / B.
Dattaprasad, M. Abha // Journal of Human Reproductive Sciences. — 2012—
Vol. 5. – Р. 279–284.
40. Daya, S. Luteal phase support in assisted reproduction cycles / S. Daya,
J. Gunby // Cochrane Database Syst. Rev.— 2004. CD004830.
41. Dix, E. Successful pregnancies following embryo transfer despite very thin late
proliferative endometrium / E. Dix, J.H. Check // Clinical Experimental
Obstetrics Gynecology. — 2010. — Vol. 37. — P. 15–16.
42. Do GnRH analogues directly affect human endometrial epithelial cell gene
expressi / X. Zhang [et al.] // Mol Hum Reprod – 2010. — Vol. 16. – Р.
347—360.
43. Does luteal estradiol supplementation have a role in long agonist cycles? / E.
Elgindy [et al.] // Fertility and Sterility. —2010— Vol. 93. — №7. – Р. 2182–8.
44. Dose–dependent effects of gonadotropin releasing hormone on matrix
metalloproteinase (MMP)–2, and MMP–9 and tissue specific inhibitor of
metalloproteinases–1 messenger ribonucleic acid levels in human decidual
Stromal cells in vitro / C. Chou [et al.] // J Clin Endocrinol Metab. – 2003. —
Vol. 88. — Р. 680–688.
136
45. Edwards, R. Establishing full–term human pregnancies using cleaving embryos
grown in vitro / R.G. Edwards, P.C. Steptoe, J.M. Purdy // Br J Obstet
Gynaecol. – 1980 — Vol. 87. – Р. 737–756.
46. Effect of Administration of Single Dose GnRH Agonist in Luteal Phase on
Outcome of ICSI–ET Cycles in Women with Previous History of IVF/ICSI
Failure: A Randomized Controlled Trial / S. Zafardoust [et al.] // J Reprod
Infertil. – 2015. — Vol. 16. – № 2. – Р. 96–101.
47. Effect of excessive GnRH–binding substance on circulating maternal hCG in
human pregnancy / T.M. Siler–Khodr [et al.] // Early Pregnancy – 1997. —
Vol. 3. – Р. 10–14.
48. Effect of exogenous gonadotropins on endometrial maturation in oocyte donors
/ W. Meyer [et al.] // Fertil Steril – 1999 — Vol. 71. – Р. 109–114.
49. Effects of early luteal–phase vaginal progesterone supplementation on the
outcome of in vitro fertilization and embryo transfer / P. Lam [et al.] //
Gynecological Endocrinology – 2008— Vol. 24. — №12 — Р. 674–80.
50. Effects of gonadotrophin releasing hormone analogues on human endometrial
stromal cells and embryo invasion in vitro / P. Klemmt [et al.] // Hum Reprod
— 2009, — Vol. 24. — Р.2187–2192.
51. Efficacy of ER—alpha polymorphisms and the intrafollicular IGF system for
predicting pregnancy in IVF—ET patients / Y. S. Choi [et al.] // Gynecol.
Obstet. Invest. – 2009. – Vol. 67, № 2. – P. 73—80.
52. Efficacy of luteal phase support with GnRH agonists: a preliminary
comparative study / C.M. Brigante [et al.] // Fertility and Sterility 2013. – Vol.
100. – P– 521.
53. Elter, K. Use of third generation gonadotropin–releasing hormone antagonists
in in vitro fertilization–embryo transfer: a review / K. Elter, L.R. Nelson //
Obstet Gynecol Surv. — 2001 — Vol. 56. – Р. 576–588.
54. Endometrial expression of selected genes in patients achieving pregnancy
spontaneously or after ICSI and patients failing at least two ICSI cycles
137
/ A. Allegra [et al.] // Reprod Biomed Online. – 2012. – Vol. 25. — №5. — Р.
481–91.
55. ESR1, ESR2 and FSH receptor gene polymorphisms in combination: a useful
genetic tool for the prediction of poor responders / E. Anagnostou [et al.] //
Curr. Pharmac. Biotech. – 2012. – Vol. 13, № 3. – P. 426—434.
56. Estradiol supplementation during the luteal phase of IVF–ICSI patients: a
randomized, controlled trial / J. Serna [et al.] // Fertility and Sterility – 2008.
— Vol. 90. – № 6. – Р. 2190–5.
57. Evaluation of in vitro fertilization parameters and estrogen receptor alpha gene
polymorphisms for women with unexplained infertility / O. U. Ayvaz [et al.] //
J. Assist. Reprod. Genet. – 2009. – Vol. 26, № 9—10. – P. 503—510.
58. Examining the evidence: progesterone supplementation during fresh and frozen
embryo transfer / D. Shapiro [et al.] // Reprod Biomed Online – 2014. – Vol.
29 – Р. 15‐16.
59. Fatemi, H.M. The luteal phase after 3 decades of IVF: what do we know?
/ H.M. Fatemi // Reprod Biomed Online 2009;9 Suppl 4: 4331.
60. Ferraretti A., Goossens V., Bhattacharya S. et al Assisted reproductive
tehnology in Europe, 2010: results generated from European registers by
ESHRE. Preliminary results European Society of Human Reproduction and
Embriology 29 Annual Meeting, London, United Kingdom, 7–10 July 2013.
61. First trimester threatened miscarriage treatment with human chorionic
gonadotrophins: a randomised controlled trial / N.S. Qureshi [et al.] //
BJOG. — 2005 — Vol. 112. — №11. – Р.1536–41.
62. Genes targeted by the estrogen and progesterone receptors in the human
endometrial cell lines HEC1A and RL95–2 / K. Tamm // Reprod Biol
Endocrinol – 2009. — Vol. 7. – Р. 150— 154.
63. GnRH agonist during luteal phase for women undergoing assisted reproductive
techniques: systematic review and meta‐analysis of randomized controlled trials
/ W.P. Martins [et al.] // Ultrasound Obstet Gynecol – 2016. – Vol. 47 №2. –
Р.144– 51.
138
64. GnRH agonist plus vaginal progesterone for luteal phase support in ICSI
cycles: a randomized study / Aboulghar M.A. [et al.] // Reproductive
BioMedicine Online — 2015— Vol. 30. – Р. 52–56.
65. GnRH agonist protocol administration in the luteal phase in ICSI–ET cycles
stimulated with the long GnRH agonist protocol: a randomized, controlled
double blind study / B. Ata [et al.] // Hum Reprod. – 2008. – Vol. 23. – Р. 668–
673.
66. Gonadotropin–releasing hormone I analog acts as an antiapoptotic factor in
mouse blastocysts / K. Kawamura [et al.] // Endocrinology — 2005— Vol.
146. — Р. 4105–4116.
67. Gonadotropin–releasing hormone increases serum human chorionic
gonadotropin in pregnant women / M. Iwashita [et al.] // Endocr J — 1993—
Vol. 40. — Р. 539–544.
68. Harduf, H. Progesterone receptor A and c–Met mediates spheroids–
endometrium attachment / H. Harduf, S. Goldman, E. Shalev // Reprod Biol
Endocr. — 2009 — Vol. 16. – Р. 7—14.
69. Hormonal profile during the follicular phase in cycles stimulated with a
combination of human menopausal gonadotrophin and gonadotrophin–releasing
hormone antagonist (Cetrorelix) / C. Albano [et al.] // Hum Reprod. – 1996. –
Vol.11.— Р. 2114–2118.
70. Humaidan, P. Preventing ovarian hyperstimulation syndrome: guidance for the
clinician / P. Humaidan, J. Quartarolo, E. G. Papanikolaou // Fertil. Steril. –
2010. – Vol. 94 (2). – Р. 389– 400.
71. Human luteal phase function following oocyte aspiration from the immediately
preovular graafian follicle of spontaneous ovular cycles / J. Kerin [et al.] // Br J
Obstet Gynaecol — 1981— Vol. 88. — Р.1021–1028.
72. Immunohistochemical demonstration of luteinizing hormone–releasing factor–
like material in human syncytiotrophoblast, and trophoblastic tumors
/ M. Seppala // Clin Endocrinol – 1980. — Vol. 12. – Р. 441–451.
139
73. Impaired corpus luteum function and other undesired results of pregnancies
associated with inadvertent administration of a long–acting agonist of
gonadotrophin–releasing hormone / A. Herman [et al.] // Hum Reprod. – 1992
— Vol. 7. — Р.465–468.
74. Increased live birth rates with GnRH agonist addition for luteal support in
ICSI/IVF cycles: a systematic review and meta–analysis / D. Kyrou [et al.] //
Human Reproduction Update, Advanced Access publication on July 6, — 2011
— Vol. 17, №.6 — Р. 734–740.
75. Independent regulation of matrix metalloproteinase–9, tissue inhibitor of
metalloproteinase–1 (TIMP–1), and TIMP–3 in human endometrial stromal
cells by gonadotropin–releasing hormone: implications in early human
implantation / F. Raga [et al.] // J Clin Endocrinol Metab – 1999 — Vol. 84. –
Р. 636–642.
76. Isikoglu, M. Extension of GnRH agonist through the luteal phase to improve
the outcome of intracytoplasmic sperm injection / M. Isikoglu, K. Ozgur, S.
Oehninger // Hum Reprod 2001, 16:1671–1675 Journal of Reproductive
Medicine — 2007— Vol. 52 № 7. – Р. 639–44.
77. Jindal UN, Verma S, editors. Luteal Phase Support. London– United Kingdom:
Jaypee Brothers, Medical Publishers (Rao KA, Carp HJA, Fischer F. Textbook
of In Vitro Fertilization; – 2013 – Vol. 2– Р. 622.
78. Jones, G. Luteal phase defect: a review of pathophysiology / G.S. Jones // Curr
Opin Obstet Gynecol — 1991— Vol. 3. — Р. 641–648.
79. Krause, B. Safety and efficacy of low dose hCG for luteal support after
triggering ovulation with GnRH agonist in cases with polyfollicular
development / B. Krause, R. Ohlinger // Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol —
2006— Vol. 126. — Р.87–92.
80. Kreitmann, O. Induced corpus luteum dysfunction after aspiration of the
preovulatory follicle in monkeys / O. Kreitmann, W.E. Nixon, G.D. Hodgen //
Fertil Steril — 1981— Vol. 35. — Р. 671–675.
140
81. Lecce, L. Ezrin and EBP50 redistribute apically in rat uterine epithelial cells at
the time of implantation and in response to cell contact / L. Lecce, L.A.
Lindsay, C.R. Murphy // Cell Tissue Res. — 2011. — Vol. 343. — P. 445–453.
82. Lin, L. Expression of human gonadotropin–releasing hormone receptor gene in
the placenta and its functional relationship to human chorionic gonadotropin
secretion / L. Lin, V.J. Roberts, S.S. Yen // J Clin Endocrinol Metab — 1995—
Vol. 80. – Р. 580–585.
83. Luteal estrogen supplementation in stimulated cycles may improve the
pregnancy rate in patients undergoing in vitro fertilization/ intracytoplasmic
sperm injection–embryo transfer / P. Drakakis [et al.] // Gynecological
Endocrinology. – 2007. — Vol. 23. — №11. – Р. 645–52.
84. Luteal phase support for assisted reproduction cycles / Michelle van der
Linden1 [et al.] // Editorial Group: Cochrane Menstrual Disorders and
Subfertility Group Published Online: 5 OCT 2011
Assessed as up–to–date: 25 MAY 2011.
85. Luteal phase support for assisted reproduction cycles. Van der Linden M,
Buckingham K, Farquhar C, Kremer JA, Metwally M. Cochrane Database Syst
Rev 2015; CD009154.
86. Luteal phase support with decapeptyl improves pregnancy outcomes in
intracytoplasmic sperm injection with higher basal follicle–stimulating
hormone or lower mature oocytes / Hsiao–Fan Kung [et al.] // Journal of the
Chinese Medical Association. – 2014. — Vol. 77. – Р. 524–530.
87. Luteal phase support with estrogen in addition to progesterone in patients with
poor response to gonadotropins undergoing IVF / M. Erdem [et al.] // Gynecol
Endocrinol. — 2014. — Vol. 30. — №5. – Р. 363—6.
88. Luteal phase support with GnRH–a improves implantation and pregnancy rates
in IVF cycles with endometrium of [less–than or equal to]7 mm on day of egg
retrieval / H. Qublan [et al.] // Human Fertility — 2008— Vol. 11. — №1. –
Р.43–7.
141
89. Makker, A. Endometrial receptivity: clinical assessment in relation to fertility,
infertility, and antifertility / A. Makker, M.M. Singh // Med Res Rev — 2006—
Vol. 26. — №6. Р. 699—746.
90. Mariee, N. Expression of leukaemia inhibitory factor and interleukin 15 in
endometrium of women with recurrent implantation failure after IVF;
correlation with the number of endometrial natural killer cells / N. Mariee, T.C.
Li, S.M. Laird // Human Reproduction. — 2012. — Vol. 27. — № 7. —
P. 1946–1954.
91. Morphological assessment of endometrial quality in combined GnRH–
agonist/hMG superovulation / C. Bourgain [et al.] // In Abstract Book of the
Society for the Study of Fertility, London, 1988.
92. Nonsupplemented luteal phase characteristics after the administration of
recombinant human chorionic gonadotropin, recombinant luteinizing hormone,
or gonadotropin–releasing hormone (GnRH) agonist to induce final oocyte
maturation in in vitro fertilization patients after ovarian stimulation with
recombinant follicle–stimulating hormone and GnRH antagonist cotreatment
/ N. Beckers [et al.] // J Clin Endocrinol Metab. – 2003. – Vol. 88. – Р. 4186–
4192.
93. Oral estradiol supplementation as luteal support in IVF/ ICSI cycles: a
prospective, randomized controlled study / H. Lin [et al.] // European Journal
of Obstetrics Gynecology and Reproductive Biology — 2013— Vol. 167. – Р.
171–5.
94. Oral progestogen versus intramuscular progesterone for luteal support after
assisted reproductive technology treatment: a prospective randomized study
/ A. Iwase [et al.] // Arch Gynecol Obstet – 2008. – Vol. 277– Р. 319‐324.
95. Outcome of pregnancies after inadvertent exposure to
GnRH agonist in early pregnancy / P. Fatima [et al.] // Mymensingh Med J. –
2011. – Vol. 20– № 2. – Р. 303– 7.
96. Ovarian hyperstimulation syndrome: pathophysiology and prevention / C.O.
Nastri [et al.] // J Assist Reprod Genet – 2010. – Vol. 27. Р – 121‐128.
142
97. Ovarian hyperstimulation syndrome: pathophysiology, staging, prediction and
prevention / C.O. Nastri [et al.] // Ultrasound Obstet Gynecol– 2015. – Vol.
45– Р. 377‐3.
98. Ovarian stimulation with GnRH agonist, but not GnRH antagonist, partially
restores the expression of endometrial integrin beta3 and leukaemia–inhibitory
factor and improves uterine receptivity in mice / H.C. Ruan, X.M. Zhu,Q. Luo
et al. // Human Reproduction. – 2006. – Vol. 21. № 10. – P. 2521–2529.
99. Papanikolaou E.G. Achievement of pregnancy three times in the same patient
during luteal GnRH agonist administration / E.G. Papanikolaou // Reprod
Biomed Online — 2005— Vol. 10. – Р. 347—349.
100. Paulson R.J. Embryo implantation after human in vitro fertilization:
importance of endometrial receptivity / R.J. Paulson, M.V. Sauer, R.A. Lobo //
Fertil Steril – 1990 — Vol. 53. — Р. 870–874.
101. Penzias AS. Luteal phase support / Penzias A.S. // Fertil Steril – 2002 —
Vol. 77. – Р. 318–323.
102. Pirard, C. GnRH agonist as novel luteal support: results of a randomized,
parallel group, feasibility study using intranasal administration of buserelin / C.
Pirard, J. Donnez, E. Loumaye // Hum Reprod — 2005— Vol. 20. – Р. 1798–
1804.
103. Polymorphisms in gonadotropin and gonadotropin receptor genes as markers
of ovarian reserve and response in in vitro fertilization / A. La Marca [et al.] //
Fertil. Steril. – 2013. – Vol. 99, № 4. – P. 970– 978 e971.
104. Preconception folic acid use modulates estradiol and follicular responses to
ovarian stimulation / J. M. Twigt [et al.] // J. Clin. Endocrinol. Metab. – 2011. –
Vol. 96, № 2. – P. E322– 329.
105. Quantitative gonadotropin—releasing hormone gene expression and
immunohistochemical localization in human endometrium throughout the
menstrual cycle / F. Raga [et al.] // Biol Reprod – 1998 — Vol. 59. – Р. 661—
669.
143
106. Razieh, D. Beneficial effect of luteal–phase gonadotropin–releasing
hormone agonist administration on implantation rate after intracytoplasmic
sperm injection / Razieh DF, Maryam AR, Nasim T // Taiwan J Obstet Gynecol
– 2009— Vol. 48. – Р. 245–248.
107. Reprod Biol Endocrinol.Administration of single–dose GnRH agonist in the
luteal phase in ICSI cycles: a meta–analysis / Oliveira J.B. // — 2010 Sep
8;8:107. doi: 10.1186/1477–7827–8–107.Department of Gynecology and
Obstetrics, Botucatu Medical School São Paulo State University–UNESP Sao
Paulo, Brazil. [email protected]
108. Reproductive biology and IVF: ovarian stimulation and endometrial
receptivity / P. Devroey [et al.] // Trends Endocrinol Metab. — 2004 — Vol.
15. – Р. 84–90.
109. Rosenberg, S. The luteal phase defect: the relative frequency of, and
encouraging response to, treatment with vaginal progesterone
/ S.M. Rosenberg, A.A. Luciano, D.H. Riddick // Fertil Steril – 1980. — Vol.
34. – Р. 17–20.
110. Rosenbluth, E. M. Evolving role of assisted reproductive technologies
/ E. M. Rosenbluth // Clin. Obstet. Gynecol. – 2011. – Vol. 54, № 4. – P. 734–
745.
111. Salamonsen, L. Cytokines and chemokines during human embryo
implantation: roles in implantation and early placentation / L.A. Salamonsen,
N.J. Hannan, E. Dimitriadis // Semin Reprod Med – 2007 — Vol. 25. № 6. – Р.
437—444.
112. Sedative and hypnotic effects of oral administration of micronized
progesterone may be mediated through its metabolites / E. Arafat [et al.] // Am
J. Obster Ginecol.– 1988.— Vol. 159. – P. 1203–1210.
113. Seshagiri, P. The secretion of gonadotrophin–releasing hormone by peri–
implantation embryos of the rhesus monkey: comparison with the secretion of
chorionic gonadotrophin / P.B. Seshagiri, E. Terasawa, J.P. Hearn // Hum
Reprod. – 1994. — Vol. 9. – Р. 1300–1307.
144
114. Sexual absorption of vaginal progesterone: a randomized control trial / K.S.
Merriam [et al.] // Int J Endocrinol 2015; 2015: 685281.
115. Single–dose GnRH agonist administration in the luteal phase of GnRH
antagonist cycles: a prospective randomized study / A. Isik [et al.] // Reprod
Biomed Online – 2009 — Vol. 19. – Р. 472–477.
116. Skarin, G. Failure to induce early abortion by huge doses of a superactive
LHRH agonist in women / G. Skarin, S.J. Nillius, L. Wide // Contraception –
1982. — Vol. 26. — Р. 457—463.
117. Smitz, J. The luteal phase and early pregnancy after combined GnRH–
agonist/HMG treatment for superovulation in IVF or GIFT / J. Smitz, P.
Devroey, M. Camus // Hum Reprod – 1988. — Vol. 3. – Р. 585–590.
118. Soares, S R. Etiology of OHSS and use of dopamine agonists / S. R. Soares
// Fertil. Steril. – 2012. – Vol. 97 (3). – P. 0015– 0282.
119. Stocco, C. The molecular control of corpus luteum formation, function, and
regression. / C. Stocco, C. Telleria, G. Gibori // Endocr. Rev. – 2007. – Vol. 28.
– P. 117–149.
120. Subcutaneous progesterone versus vaginal progesterone gel for luteal phase
support in in vitro fertilization: a noninferiority randomized controlled study
/ G. Lockwood [et al.] // Fertil Steril – 2014 – №101– Р. – 112‐119.
121. Suppression of corpus luteum function by the gonadotropin–releasing
hormone antagonist Nal–Glu: effect of the dose and timing of human chorionic
gonadotropin administration / S. Dubourdieu [et al.] // Fertil Steril. — 1991—
Vol. 56. – Р. 440–445.
122. Suppression of serum levels of luteinizing hormone by short– and long–loop
negative feedback in ovariectomized women / A. Miyake [et al.] //
J Endocrinol – 1979 — Vol. 80. – Р. 353–356.
123. Tan, H.H. Perinatal outcome of pregnancies after inadvertent exposure to
gonadotrophin– releasing hormone analogue / H.H. Tan HH, C.T. Yeong, K.E.
Loh // Aust N Z J Obstet Gynaecol. – 2006. – Vol. 46 – № 4. – Р. 336– 40.
145
124. Tavaniotou, A. Effect of human chorionic gonadotropin on luteal luteinizing
hormone concentrations in natural cycles / A. Tavaniotou, P. Devroey // Fertil
Steril – 2003. — Vol. 80. – Р. 654–655.
125. Tawfeek, M. Assessment of leukemia inhibitory factor and glycoprotein 130
expression in endometrium and uterine flushing: a possible diagnostic tool for
impaired fertility / M.A. Tawfeek, M. Eid, A.M. Hasan // BMC Womens
Health. — 2012. — Vol. 20. — № 12. — P. 10.
126. Tesarik, J. Enhancement of embryo developmental potential by a single
administration of GnRH agonist at the time of implantation // J. Tesarik, A.
Hazout, C. Mendoza // Hum Reprod – 2004. — Vol. 19. – Р. 1176–1180.
127. Thau, R.B. Luteinizing hormone–releasing hormone (LHRH) and its
analogs for contraception in women: a review / R.B. Thau // Contraception –
1984. — Vol. 29. – Р. 143–162.
128. The addition of gonadotrophin releasing hormone agonist to routine luteal
phase support in intracytoplasmic sperm injection and embryo transfer cycles: a
randomized clinical trial / Y.G. Aynaoglu // European Journal of Obstetrics &
Gynecology and Reproductive Biology. – 2014. — Vol. 182. – Р. 66–70.
129. The effect of luteal phase vaginal estradiol supplementation on the success
of in vitro fertilization treatment: a prospective randomized study / L. Engmann
[et al.] // Fertility and Sterility. —2008 — Vol. 89. — №3.— Р. 554–61.
130. The human endometrium as a fertility determining factor / T. Strowitzki //
Hum Reprod Update – 2006. — Vol. 12. – № 5. – Р. 617—630.
131. The Istanbul consensus workshop on embryo assessment: proceedings of an
expert meeting // Hum. Reprod. – 2011. – Vol. 26, № 6. – P. 1270–1283.
132. The role of gonadotropin–releasing hormone (GnRH) and its receptor in
development of porcine preimplantation embryos derived from in vitro
fertilization / D.H. Nam [et al.] // Theriogenology — 2005, — Vol. 63. Р.
190–201.
146
133. The role of gonadotropin–releasing hormone in murine preimplantation
embryonic development / F. Raga [et al.] // Endocrinology – 1999 — Vol. 140.
— Р. 3705–3712.
134. The significance of the human corpus luteum in pregnancy maintenance / A.
Csapo [et al.] // Preliminary studies Am J Obstet Gynecol. — 1972— Vol. 112.
– Р. 1061–1067.
135. Vaginal gel versus intramuscular progesterone for luteal phase
supplementation: a prospective randomized trial / L. Dal Prato [et al.] //
Reproductive BioMedicine Online. – 2008 — Vol. 16. — №3— Р. 361–7.
136. Vaisbuch, E. Progesterone support in IVF: is evidence‐based medicine
translated to clinical practice? A worldwide web‐based survey. / E. Vaisbuch,
M. Leong, Z. Shoham // Reprod Biomed Online – 2012. – Vol. 25 – Р. 139‐145.
137. Veysman, B. Pneumonitis and eosinophilia after in vitro fertilization
treatment / B. Veysman, I. Vlahos, L. Oshva // Ann. Emerg. Med. – 2006. —
Vol. 47. – Р. 472–475.
138. Vitielle, D. HOX Genes in Implantation / D. Vitielle, P. H. Kodaman //
Seminars in reproductive medicine. – 2007. – Vol. 25. – P. 431—436.
139. World Health Organization reference values for human semen characteristics
/ T. G. Cooper [et al.] // Hum. Reprod. Update. – 2010. – Vol. 16, № 3. – P.
231–245.