funktionelle charakterisierung des typ-iii-effektors
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Funktionelle Charakterisierung des Typ-III-Effektors XopB aus Xanthomonas campestris pv. vesicatoria
Der Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat.
vorgelegt von
Johannes Priller
aus Nürnberg
Als Dissertation genehmigt von der Naturwissenschaftlichen Fakultät der
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Tag der mündlichen Prüfung: 20.11.2015
Vorsitzender des Promotionsorgans: Prof. Dr. Jörn Wilms
Gutachter: Prof. Dr. Uwe Sonnewald
Prof. Dr. Benedikt Kost
Teile dieser Arbeit sind in folgender Publikation enthalten:
Sonnewald S, Priller JPR, Schuster J, Glickmann E, Hajirezaei MR, Siebig S, Mudgett
MB, Sonnewald U (2012) Regulation of Cell Wall-Bound Invertase in Pepper Leaves by
Xanthomonas campestris pv. vesicatoria Type Three Effectors. PLoS One 7: e51763
i
1. Zusammenfassung/ Summary ..................................................................................... 1
1.1. Zusammenfassung ............................................................................................................. 1
1.2. Summary ........................................................................................................................... 2
2. Einleitung .................................................................................................................... 4
2.1. Die Phytopathogenen Xanthomonaden und Pseudomonaden ........................................... 4
2.1.1. Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv) als Auslöser der bakteriellen
Fleckenkrankheit bei Tomaten-‐ und Paprikapflanzen ..................................................................... 5
2.1.2. Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (Pst DC3000) als Auslöser der bakteriellen
Tüpfelschwärze bei Tomaten-‐ und Arabidopsispflanzen ................................................................ 7
2.2. Das Immunsystem von Pflanzen ........................................................................................ 8
2.2.1. Die Nicht-‐Wirts-‐Resistenz .................................................................................................. 8
2.2.1.1. Präformierte Abwehr der Pflanzen ................................................................................. 9
2.2.1.2. PAMP-‐vermittelte Immunität ......................................................................................... 9
2.2.1.3. Aktivierung der NADPH-‐Oxidase auf Proteinebene ................................................................ 11 2.2.1.4. Genregulation über MAP-‐ und CDP-‐Kinasen ........................................................................... 12
2.3. Effektor-‐vermittelte Immunität ....................................................................................... 12
2.4. Die Phytohormone der Pathogenabwehr ......................................................................... 14
2.5. Suppression der pflanzlichen Immunantwort durch bakterielle Effektoren ...................... 15
2.5.1. Typ-‐III-‐Sekretionssystem Gram-‐negativer Bakterien ....................................................... 15
2.5.2. Typ-‐III-‐Effektoren ............................................................................................................. 16
2.5.3. Zielprozesse der T3Es ....................................................................................................... 17
2.5.3.1. PRRs und assoziierte Kinasen ........................................................................................ 17
2.5.3.2. MAP-‐Kinasen ................................................................................................................. 18
2.5.3.3. Transkription der Wirtszelle .......................................................................................... 19
2.5.3.4. Vesikeltransport ............................................................................................................ 19
2.6. Umprogrammierung des Wirtsmetabolismus durch Pathogene ....................................... 20
2.7. Der Typ-‐III-‐Effektor XopB ................................................................................................. 23
2.8. Vorarbeiten und Zielsetzung dieser Arbeit ....................................................................... 24
3. Material und Methoden ............................................................................................. 25
3.1. Materialien ..................................................................................................................... 25
3.1.1. Chemikalien, Enzyme und Verbrauchsmaterialien .......................................................... 25
3.1.2. Antibiotika ........................................................................................................................ 25
3.1.3. Vektoren ......................................................................................................................... 25
ii
3.1.4. Oligonukleotide und Sequenzierungen ........................................................................ 26
3.1.5. Antikörper ...................................................................................................................... 29
3.1.6. Bakterienstämme ........................................................................................................... 29
3.1.7. Hefestämme ................................................................................................................... 30
3.1.8. Pflanzen .......................................................................................................................... 30
3.2. Arbeiten mit Pflanzen ...................................................................................................... 31
3.2.1. Anzucht von Pflanzen ...................................................................................................... 31
3.2.2. Infektionen von Pflanzen mit Bakterien ....................................................................... 32
3.2.3. Transiente Transformation von Pflanzen ..................................................................... 32
3.2.4. Stabile Transformation von Pflanzen ........................................................................... 33
3.3. Mikrobiologische Methoden ......................................................................................... 33
3.3.1. Anzucht von Bakterien .................................................................................................. 33
3.3.2. Komplementation von Xcv-‐Deletionsmutanten .......................................................... 33
3.3.3. Anzucht von Hefe ........................................................................................................... 34
3.4. Molekularbiologische Methoden .................................................................................. 34
3.4.1. Molekularbiologische Standardmethoden ...................................................................... 34
3.4.2. Kolonie-‐PCR für Xcv ....................................................................................................... 34
3.4.3. Transformation von Bakterien ...................................................................................... 35
3.4.4. Transformation von Hefe .............................................................................................. 35
3.4.5. Hefe-‐Zwei-‐Hybrid-‐cDNA-‐Durchmusterung ................................................................... 35
3.4.6. Direkte Interaktionsstudien in Hefe ............................................................................. 36
3.4.7. Isolierung von genomischer DNA aus Arabidopsis und Southern-‐Blot ...................... 37
3.4.8. Genome Walker-‐Verfahren ........................................................................................... 37
3.4.9. Isolierung von Gesamt-‐RNA aus Pflanzen und Northern-‐Blot .................................... 37
3.4.10. DNAse-‐Verdau und cDNA-‐Synthese ........................................................................... 38
3.4.11. Quantitative Echtzeit-‐PCR (qPCR) .............................................................................. 38
3.4.12. Ortsgerichtete Mutagenese ........................................................................................ 38
3.5. Biochemische Methoden ............................................................................................... 39
3.5.1. Expression und Reinigung von 6xHIS-‐XopB aus E. coli für die Antikörperproduktion
......................................................................................................................................... 39
3.5.2. Koimmunpräzipitation mittels GFP-‐Trap ...................................................................... 39
3.5.3. Western-‐Blot Analyse .................................................................................................... 40
3.5.4. Western-‐Blot Stripping .................................................................................................. 40
iii
3.5.5. Subzelluläre Fraktionierungen ...................................................................................... 40
3.5.6. Isolierung von Proteinen aus apoplastischer Flüssigkeit ............................................ 41
3.5.7. Bestimmung der Salizylsäure-‐ und Camalexin-‐Gehalte von Pflanzen ........................ 42
3.5.8. HRP-‐gekoppelter ROS-‐Nachweis ................................................................................... 42
3.5.9. Messung der cytosolischen Calciumkonzentration ..................................................... 42
3.5.10. Bestimmung der cw-‐Inv Aktivität ............................................................................... 43
3.6. Histologische Färbungen und Mikroskopie ................................................................... 43
3.6.1. Anilinblau-‐Färbung von Kallose .................................................................................... 43
3.6.2. Nachweis von ROS mittels DAB-‐Färbung ..................................................................... 44
3.6.3. Konfokale laser-‐scanning Mikroskopie ........................................................................ 44
4. Ergebnisse .................................................................................................................. 45
4.1. Einfluss von XopB auf die Zellwand-‐gebundene Invertase (cw-‐Inv) .................................. 45
4.1.1. Überprüfung und Komplementation der xopB-‐Deletion in Xcv ....................................... 46
4.1.2. Herstellung eines XopB-‐spezifischen Antikörpers ............................................................ 52
4.1.3. Überprüfung der xopB-‐Komplementanten in planta ....................................................... 54
4.1.4. Einfluss von XopB auf die Aktivität der cw-‐Inv in transgenen Tabakpflanzen ................. 55
4.1.5. Induktion der cw-‐Inv durch proteinogene PAMPs ........................................................... 57
4.1.6. XopB zeigt keine Inhibierung der pflanzlichen Sekretion ................................................. 58
4.2. Untersuchung von Abwehrantworten in transgenen Arabidopsis thaliana-‐Pflanzen mit
induzierbarer Expression des T3E xopB aus Xcv .......................................................................... 61
4.2.1. Identifizierung homozygoter A. thaliana EtOH::xopB-‐Linien ........................................... 62
4.2.2. Expressionskinetik von xopB nach Ethanolinduktion ....................................................... 64
4.2.3. Globale Expressionsanalyse von transgenen A. thaliana EtOH::xopB Linien ................... 65
4.2.4. XopB interferiert mit dem Calciumeinstrom und der ROS-‐Produktion nach flg22-‐
Stimulation .................................................................................................................................... 66
4.2.5. Einfluss von XopB auf die Expression flg22-‐induzierter Gene .......................................... 69
4.2.6. XopB supprimiert die Einlagerung von Kallose ................................................................ 72
4.2.7. Die Expression von XopB fördert die Virulenz von Pst in A. thaliana .............................. 73
4.2.8. XopB verändert die Expression SA-‐abhängiger Gene und die SA-‐Akkumulation in A.
thaliana ......................................................................................................................................... 75
4.2.9. XopB führt zu einer verminderten Camalexin-‐Akkumulation in einer inkompatiblen
Interaktion ..................................................................................................................................... 76
iv
4.3. Veränderungen der Virulenz der Xcv xopB-‐Deletionsmutante in der kompatiblen
Interaktion mit Paprikapflanzen ................................................................................................ 78
4.3.1. Die Deletion von xopB verändert nicht das bakterielle Wachstum von Xcv in Paprika,
aber die Entwicklung der Krankheitssymptome ............................................................................ 78
4.3.2. Die Deletion von xopB beeinflusst die Entwicklung von Krankheitssymptomen und
vermindert die SA-‐Antwort ........................................................................................................... 79
4.3.3. Einfluss der xopB-‐Deletion auf die Akkumulation von ROS in Paprika ............................. 82
4.3.4. CaPO2 und CaCwInv sind ROS-‐abhängige Gene .............................................................. 84
4.4. Subzellulär Lokalisierung von XopB in planta ................................................................... 85
4.4.1. Subzelluläre Lokalisierung von GFP-‐markiertem XopB in N. benthamiana und S.
lycopersicum .................................................................................................................................. 86
4.4.2. Subzelluläre Fraktionierung von XopB in N. benthamiana .............................................. 87
4.4.3. Solubilisierung von cmyc-‐markiertem XopB .................................................................... 89
4.4.4. XopB lokalisiert in N. benthamiana an der Plasmamembran und in frühen Endosomen 90
4.4.5. XopB beeinflusst Größe und Bewegung von ARA7-‐positiven Strukturen ........................ 93
4.5. Identifizierung eines pflanzlichen Interaktionspartners von XopB .................................... 95
4.5.1. Das XopB-‐Köder-‐Konstrukt für eine Hefe-‐Zwei-‐Hybrid-‐cDNA-‐Durchmusterung ............. 95
4.5.2. Durchmusterung von Bibliotheken aus N. tabacum-‐ und A. thaliana-‐cDNA mit XopB als
Köder-‐Protein ................................................................................................................................ 97
4.5.3. Nachweis der Interaktion von XopB mit NtIP1 ................................................................ 98
4.5.4. Homologe von NtIP1 sind in Pflanzen konserviert ......................................................... 101
4.5.4.1. Homologe von NtIP1 in Solanaceae und Arabidopsis ........................................................... 103
4.5.5. Interaktion der NtIP1-‐Familie mit XopB in Hefe ............................................................ 105
4.6. Charakterisierung des XopB-‐interagierenden Proteins IP1 ............................................. 106
4.6.1. Subzelluläre Lokalisierung von GFP-‐markiertem NtIP1, NtIP1(G2A) und NtIP1(G2A/C36A)
in N. benthamiana ....................................................................................................................... 106
4.6.2. XopB verändert die subzelluläre Lokalisierung von NtIP1 ............................................. 110
4.6.3. In planta Interaktion von XopB mit NtIP1 in N. benthamiana ....................................... 112
4.6.3.1. Nachweis der NtIP1-‐XopB-‐Interaktion mittels BIFC .............................................................. 112 4.6.3.2. Koimmunpräzipitation von NtIP1 und XopB .......................................................................... 115
4.6.4. CaIP1 in Wechselwirkung mit Bakterien ........................................................................ 118
4.6.4.1. Transkriptionelle Modulation von CaIP1 durch Xcv .............................................................. 118 4.6.4.2. CaIP1 wird über ROS und Zucker reguliert ............................................................................ 119
4.6.5. NtIP1 ist ein positiver Regulator der cw-‐Inv .................................................................. 120
v
4.6.6. Generierung von transgenen A. thaliana Pflanzen mit konstitutiver Expression von
AtIP1-‐HA ...................................................................................................................................... 122
4.7. Identifizierung und Charakterisierung weiterer Zielprozesse von XopB und NtIP1 ......... 124
4.7.1. Durchmusterung von cDNA-‐Bibliotheken aus N. tabacum und A. thaliana mit NtIP1 als
Köderprotein ............................................................................................................................... 124
4.7.2. Die PH-‐RhoGAP-‐Familie ................................................................................................. 128
4.7.3. NtIP1 interagiert mit dem C-‐Terminus von NtRhoGAP .................................................. 132
4.7.4. Interaktionsstudien von AtIP1 mit AtRhoGAPs .............................................................. 134
4.7.5. Untersuchungen zur Interaktion von AtRhoGAPs mit AtROPs ....................................... 135
4.7.6. Sichtung einer N. tabacum cDNA-‐Bibliothek mit NtRhoGAPΔPH als Köder .................. 137
4.7.7. NtRhoGAP-‐eGFP zeigt eine duale subzelluläre Lokalisierung ........................................ 141
5. Diskussion ................................................................................................................ 145
5.1. XopB supprimiert die Zellwand-‐gebundene Invertase .................................................... 145
5.2. XopB unterdrückt Abwehrantworten in Arabidopsis und Paprika .................................. 148
5.3. XopB interagiert mit einem myristoylierten Wirtsprotein unbekannter Funktion an frühen
Endosomen ............................................................................................................................. 154
5.4. NtIP1 interagiert mit GTPase aktivierenden Proteinen (RhoGAPs) ................................. 156
5.5. Endozytose als möglicher Zielprozess von XopB ............................................................. 158
5.6. Ausblick ......................................................................................................................... 165
6. Abkürzungsverzeichnis ............................................................................................. 166
7. Literaturverzeichnis ................................................................................................. 167
8. Anhang ........................................................................................................................ I
8.1. Sequenz des xopB-‐Deletionslocus in Xcv ΔxopB ................................................................. I
8.2. Potentieller Promotor von xopB ........................................................................................ II
8.3. Sequenzvergleich der IP1-‐Proteine aus Arabidopsis, Tabak, Paprika und Tomate ............. III
8.4. Publikationsliste und Konferenzbeiträge ......................................................................... IV
Zusammenfassung/ Summary
1
1. Zusammenfassung/ Summary
1.1. Zusammenfassung Die Gram-negativen, hemi-biotrophen Bakterien Xanthomonas campestris pv. vesicatoria
(Xcv) und Pseudomonas syringae pv. tomato (Pst) lösen auf ihren Wirtspflanzen die
bakterielle Fleckenkrankheit bzw. Tüpfelschwärze aus. Dabei handelt es sich um eine
kompatible Wirt-Pathogen-Interaktion, da sich Xcv und Pst im Laufe der Evolution an ihren
Wirt angepasst haben. Daher sind sie in der Lage die Immunantworten der Wirtspflanzen zu
unterdrücken und ihre eigene Vermehrung zu fördern.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Typ-III-Effektor (T3E) XopB aus Xcv funktionell
charakterisiert. Es handelt sich um einen Phytopathogen-spezifischen Effektor mit HopD1
und AvrPphD als nächste Verwandte Effektoren aus Pseudomonas syringae. Die Deletion
von xopB in Xcv resultierte in einer erhöhten Aktivität der Zellwand-gebundenen Invertase
(cw-Inv) von Paprikapflanzen, einer erhöhten Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies
(ROS) und von Salizylsäure (SA: salicylic acid) sowie in einer verzögerten Entwicklung von
Krankheitssymptomen. Jedoch war das in planta-Wachstum von Xcv nach der Deletion von
xopB unverändert.
Eine Expression von XopB in Arabidopsis führte dagegen zu einem erhöhten bakteriellen
Wachstum von virulenten Pst-Bakterien. Untersuchungen von frühen
Signaltransduktionsprozessen in Tabak und Arabidopsis ergaben, dass XopB den PAMP-
stimulierten Calciumeinstrom in die Pflanzenzelle verändert und die ROS- und SA-
Produktion supprimiert. Konsistent zu diesen Ergebnissen wurden Calcium-, ROS- und SA-
regulierte Abwehrgene durch XopB moduliert, nicht jedoch MAPK-abhängige.
Über eine Hefe-Zwei-Hybrid-cDNA-Durchmusterung konnte ein Interaktionspartnernetzwerk
identifiziert werden, das einen Hinweis auf die Funktion von XopB lieferte. XopB interagiert in
Hefe mit einem pflanzlichen, myristoylierten Protein unbekannter Funktion (IP1:
Interaktionspartner 1). Für NtIP1 aus Tabak konnte die Interaktion in Hefe und in planta
gezeigt werden, jedoch interagierte in Hefe das Arabidopsis-Homolog AtIP1 nicht mit XopB.
Mit weiteren Hefe-Zwei-Hybrid-cDNA-Durchmusterungen konnten jeweils zwei GTPase-
aktivierende Proteine (RhoGAPs) aus Arabidopsis und Tabak gefunden werden, deren
genaue Funktionen jedoch ebenfalls ungeklärt ist. In einer letzten Durchmusterung mit
NtRhoGAP7 als Köder wurde eine Reihe von möglichen Zielproteinen von NtRhoGAP7
gefunden. Ein vielversprechender Kandidat ist das gefundene Clathrin-
Zusammenfassung/ Summary
2
Assemblierungsprotein, da es am häufigsten in der Durchmusterung auftrat. Zudem konnte
in N. benthamiana exprimiertes XopB-eGFP in frühen Endosomen lokalisiert werden. Da für
das Clathrin-Assemblierungsprotein eine Funktion in der Biogenese von Endosomen
angenommen wird und XopB Größe und Bewegung der frühen Endosomen verändert, greift
XopB wahrscheinlich in die Endozytose der Wirtszelle ein. Die Endozytose ist eine wichtige
Komponente der pflanzlichen Immunantwort und so könnte eine Manipulation dieses
zellbiologischen Prozesses einen Vorteil für Xcv darstellen.
1.2. Summary The Gram-negative bacteria Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv) and
Pseudomonas syringae pv. tomato are the causal agents of the bacterial spot disease and
speck disease, respectively. Over the course of evolution, Xcv and Pst have adapted to their
hosts resulting in a compatible host-pathogen-interaction indicated by a successful
suppression of the plant immunity and promotion of their own propagation.
In this work the type-III-effector (T3E) XopB from Xcv was characterized functionally. XopB is
a pathogen-specific effector with its closest relatives HopD1 and AvrPphD from
Pseudomonas syringae. The deletion of xopB from the Xcv genome resulted in an elevated
activity of the cell wall-bound invertase (cw-Inv) of pepper plants, elevated production of
reactive oxygen species (ROS) and salicylic acid (SA) and in delayed development of
disease symptoms. However, the in planta growth of Xcv was not altered after the deletion of
xopB.
In contrast, XopB expression in Arabidopsis promoted the in planta growth of virulent Pst-
bacteria. Analyses of early signal transduction processes in tobacco and Arabidopsis
revealed, that XopB alters the PAMP-triggered calcium influx and the production of ROS and
SA. Consistent with this calcium-, ROS-and SA-dependent but not MAPK-dependent
defence genes were modulated by XopB.
Using yeast two hybrid (Y2H) screenings an interaction partner network of XopB was
identified. In yeast XopB interacts with a plant myristoylated protein of unknown function
(IP1: interaction partner 1). The Interaction between XopB and NtIP1 from tobacco could be
shown in yeast and in planta, whereas the Arabidopsis homologue AtIP1 did not interact with
XopB in yeast. Further Y2H studies uncovered two uncharacterized RhoGTPase activating
proteins (RhoGAPs) from Arabidopsis and tobacco each. With a final Y2H screening with
NtRhoGAP7 as bait a couple of target protein of NtRhoGAP7 were identified. A promising
candidate was a clathrin-assembly protein, since it was found most frequently. Furthermore,
transiently expressed XopB-eGFP in N. benthamiana was localized to early endosomes.
Zusammenfassung/ Summary
3
Because it is assumed that the clathrin-assembly protein is involved in endosome biogenesis
and because XopB alteres size and movement of early endosomes, it is likely that XopB
interferes with host endocytosis. Endocytosis is a central component of plant immunity and
therefore Xcv could benefit from interfering with this cellular process.
Einleitung
4
2. Einleitung
Pflanzen sind einer Vielzahl von biotischen und abiotischen Stressfaktoren ausgesetzt, auf
die sie in adäquater Weise reagieren müssen. Bedeutende abiotischen Umwelteinflüsse sind
Hitze, Kälte, Trockenheit und versalzte Böden. Zu den biotischen Faktoren zählt man
Infektionen mit Bakterien, Pilze, Oomyceten, Insekten und Viren, auch wenn letzteren
wichtige Kennzeichen des Lebens, wie z.B. ein eigener Stoffwechsel, fehlen. Da Pflanzen
eine sessile Lebensweise haben, stellen all diese Stressfaktoren für Pflanzen eine große
Herausforderung dar, insbesondere wenn sie in Kombination auftreten (Prasch and
Sonnewald, 2014). Die Interaktion mit biotischen Faktoren kann aber auch für beide Seiten
große Vorteile mit sich bringen. Beispiele dafür sind die Symbiosen mit Bakterien oder
Mykorrhizapilzen. Daneben gibt es aber eine Vielzahl schädlicher Phytopathogene, die
ökologische und ökonomische Schäden verursachen. Pflanzen sind in der Lage durch ein
ausgefeiltes System aus Rezeptoren an ihrer Zelloberfläche zwischen Freund und Feind zu
unterscheiden und lassen entsprechend eine Symbiose zu oder leiten Abwehrantworten ein
(Petutsching et al., 2014). Angepasste Phytopathogene können diese Abwehrantworten
überlisten. Dabei führen die Pathogene verschiedene Lebensstile. Nekrotrophe Pathogene
zerstören die Zellen ihres Wirtes und beziehen dann ihre Nährstoffe aus dem abgestorbenen
Zellmaterial. Anders gehen die biotrophen Pathogene vor, die infiziertes Gewebe zwar für
ihre Zwecke ausbeuten, dieses aber nicht absterben lassen. Hemi-biotrophe Pathogene
zeichnen sich hingegen durch eine anfängliche biotrophe Lebensphase aus, die nach einer
gewissen Zeit in eine nekrotrophe Phase umschlägt, was zum Absterben des infizierten
Gewebes oder der ganzen Pflanze führt (Glazebrook, 2005).
2.1. Die Phytopathogenen Xanthomonaden und Pseudomonaden Die Gattung Xanthomonas, als Namensgeber der Xanthomonaden, beinhaltet eine Vielzahl
von Xanthomonas-Arten. Die Gram-negativen, stäbchenförmigen Bakterien sind polar
begeißelt und ausschließlich phytopathogen mit hemi-biotrophen Lebensstil. Die
Xanthomonas-Arten haben ein außergewöhnlich breites Wirtsspektrum und lösen auf
Pflanzen verschiedenster Gattungen Krankheitssymptome aus. In einer großen
Übersichtsstudie vereinigten Leyns et al. (1984) Literaturdaten zu Xanthomonas und
Ergebnisse eigener Infektionsexperimente und beschrieben, dass insgesamt 124
einkeimblättrige und 268 zweikeimblättrige Pflanzenarten von Xanthomonas-Bakterien
Einleitung
5
infiziert werden können (Leyns et al., 1984). Im Gegensatz zu der großen Anzahl von etwa
400 Pflanzenarten, die von der Gattung Xanthomonas befallen werden, zeigte sich bereits in
frühen Studien, dass die Xanthomonas-Stämme einzeln betrachtet ein sehr enges
Wirtsspektrum haben, d.h. nur auf bestimmten Pflanzenarten oder sogar Kultivaren virulent
waren und auf anderen nicht. Lange Zeit diente diese hohe Wirtsspezifität als Grundlage für
die Nomenklatur und die Identifizierung von Xanthomonas-Arten und –Pathovaren (Leyns et
al., 1984). Zu den Wirtspflanzen gehören neben vielen Wildpflanzen die Kulturpflanzen Reis,
Kassava und Weizen als wichtigste betroffene Stärkelieferanten sowie Zitrusbäume,
Bananen, Kohl, Bohnen, Tomaten und Paprika als ökonomisch bedeutsame Kulturpflanzen
(Leyns et al., 1984). Basierend auf DNA-Sequenz-Analysen umfasst die Gattung
Xanthomonas aus heutiger Sicht 27 Arten, die wiederum in zahlreiche Pathovare unterteilt
wird (Ryan et al., 2011). Dabei stellt ein Pathovar eine pathogene Xanthomonas-Art dar, die
ein spezifisches Wirtsspektrum besitzt oder sogar nur bestimmte Gewebe der Pflanze
infiziert (Ryan et al., 2011). Beispielsweise befällt X. oryzae pv. oryzae nur das Leitgewebe
von Reispflanzen und X. oryzae pv. oryzicola nur das Parenchym von Reisblättern. Die
klassische Nomenklatur basierend auf Wirts- und/ oder Gewebsspezifitäten hat somit auch
noch heute trotz der wachsenden Zahl sequenzierter Xanthomonas-Genome eine große
Bedeutung.
Im Gegensatz zu den vielen Xanthomonas-Arten gibt es unter den Pseudomonaden nur die
zwei Arten Pseudomonas syringae und Pseudomonas savastanoi, die in Bezug auf
Pflanzenkrankheiten eine Rolle spielen (Mansfield et al., 2012). Jedoch gibt es allein von
Pseudomonas syringae 29 Pathovare, die zusammengenommen so wie Xanthomonas eine
Vielzahl von Kulturpflanzen befallen. So befallen z.B. P. syringae pv. tomato und P. syringae
pv. phaseolicola Tomaten- bzw. Bohnenpflanzen.
2.1.1. Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv) als Auslöser der
bakteriellen Fleckenkrankheit bei Tomaten- und Paprikapflanzen
Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv), nach neuer Klassifikation X. euvesicatoria
genannt, löst auf Tomaten- und Paprikapflanzen die bakterielle Fleckenkrankheit aus (Abb.
1). Xcv dringt über natürliche Öffnungen wie Stomata oder Hydatoden oder über
Verwundungen in das Blatt ein und besiedelt dort den Interzellularraum (Apoplast). In der
Regel sind Tomaten- und Paprikapflanzen für Xcv suszeptibel und es folgt eine Vermehrung
der Bakterien im Apoplasten. Bakterien und Pflanze gehen dabei eine sogenannte
kompatible Interaktion ein. Krankheitssymptome wie wässrige Läsionen, die sich später zu
Einleitung
6
Nekrosen entwickeln, sind die Folge. Obwohl sich Xcv nicht über das Gefäßsystem der
Pflanze ausbreitet kann, können die Infektionen sehr heftig ausfallen und die ganze Pflanze
einschließlich der Früchte betreffen. Begünstigt wird das Bakterienwachstum durch feucht-
warmes Wetter und durch Regen können Bakterien von infizierten zu nicht-infizierten
Blättern oder Pflanzen weiter übertragen werden (Mansfield et al., 2012).
In frühen Arbeiten mit Xcv konnten in drei gegen Xcv resistente Paprika-Kultivaren drei
unabhängige Resistenzgene identifiziert werden, die mit Bs1, Bs2 und Bs3 (Bs: bacterial
spot) bezeichnet wurden (Minsavage et al., 1990). Das Vorhandensein eines dieser drei
Resistenzgene in Paprika genügte, um aus einer zuvor kompatiblen Interaktion eine
inkompatible zu machen, wodurch sich Xcv nicht weiter vermehren konnte. Die
Inkompatibilität hing mit dem Vorhandensein der entsprechenden Avirulenzgene avrBs1,
avrBs2 und avrBs3 in Xcv zusammen. Minsavage et al. (1990) legten somit einen wichtigen
Grundstein für das Verständnis der zugrundeliegenden genetischen Basis der Xcv-Paprika-
Interaktion.
Abb. 1: Bakterielle Fleckenkrankheit auf Blättern und Früchten von Paprika (Capsicum annuum, links) und Tomate (Solanum lycopersicum, rechts) ausgelöst durch Xanthomonas ssp. Die Aufnahmen von Paprika und Tomate stammen von der Cornell University, Ithaca, USA (http://vegetablemdonline.ppath.cornell.edu/factsheets/Pepper_BactSpot.htm) bzw. von der European and Mediterranean Plant Protection Organization (EPPO, www.eppo.int).
Einleitung
7
2.1.2. Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (Pst DC3000) als Auslöser
der bakteriellen Tüpfelschwärze bei Tomaten- und Arabidopsispflanzen
Nur durch Zufall wurde Pseudomonas syringae pv. tomato als phytopathogenes Bakterium
für genetische Untersuchungen ausgewählt. Aus einer großen Pseudomonas syringae
Stammsammlung konnten nur vier Pst-Stämme gefunden werden, die sich mit Plasmid-DNA
transformieren ließen. Die Transformationsrate war aber nur vom Stamm DC52 halbwegs
akzeptabel (Dr. Cuppels vom Agriculture Research Centre in London, Ontario, Canada: „The
fourth strain, DC52, was not too bad,...“). Dr. Cupples erzeugte daher von DC52 eine
Rifampicin-resistente Variante, wodurch Pst DC3000 entstand (Xin and He, 2013). Mit einer
Tn5-Transposonmutagenese von Pst DC3000 und anschließender Infektion von
Tomatenpflanzen wurden erste Versuche unternommen Virulenzgene von Pst DC3000 zu
identifizieren (Cuppels, 1986). Im Jahre 1991 wurde die Arabidopsis-Pst DC3000-Interaktion
zum ersten mal als kompatible Interaktion beschrieben (Whalen et al., 1991). In dieser Arbeit
wurde zudem der erste bakterielle Avirulenz-Locus eines avirulenten Pst-Stammes
identifiziert. Nach der Transformation von Pst DC3000 mit diesem Avirulenz-Locus verlor
dieser Stamm seine Virulenz für Arabidopsis und es lag damit eine inkompatible Interaktion
vor. Somit stand ein vielversprechendes Wirt-Pathogen-System zur Verfügung, da
Arabidopsis in Bezug auf Anzucht, Generationszeit und Genetik einen optimalen
Modellorganismus darstellt und ebenso wie Pst genetisch manipulierbar ist.
Abb. 2: Bakterielle Tüpfelschwärze auf Blättern und Früchten von Tomate (Solanum lycopersicum, links bzw. Mitte) sowie auf Arabidopsis-Blättern (Arabidopsis thaliana, rechts). Die Aufnahmen stammten von folgenden Quellen (von links nach rechts): http://www.apsnet.org/publications/apsnetfeatures/Pages/FunctionalGenomicsAbstracts2002.aspx, http://vegetablemdonline.ppath.cornell.edu/PhotoPages/Tomatoes/Tom_BactDiseases/Tom_BactFS5.htm und http://www.pseudomonas-syringae.org/pst_ab_DC3000.htm.
Einleitung
8
2.2. Das Immunsystem von Pflanzen Pflanzen besitzen ähnlich wie Vertebraten ein angeborenes Immunsystem (Asai et al.,
2002). Im Gegensatz zu den Vertebraten, die zusätzlich über ein adaptives Immunsystem
verfügen, was im Wesentlichen auf der Produktion Pathogen-spezifischer Antikörper beruht,
müssen Pflanzen allein mit dem angeborenen Immunsystem auskommen. Dennoch können
Pflanzen die meisten Pathogene erfolgreich abwehren. Die Hauptaufgabe des pflanzlichen
Immunsystems ist es dabei zwischen „selbst“ und „nicht-selbst“ zu unterscheiden
(Nürnberger et al., 2004). Pflanzen sind dazu mit bestimmten Rezeptoren an ihrer
Zelloberfläche ausgestattet, die es ihnen ermöglichen z.B. Bakterien anhand konservierter
Strukturen, den sogenannten PAMPs (pathogen-associated molecular patterns), zu
erkennen und daraufhin eine Immunantwort gegen die Eindringlinge einzuleiten (Jones and
Dangl, 2006). Nicht angepasste Bakterien werden so erfolgreich abgewehrt und man spricht
in diesem Falle von einer PAMP-vermittelten Immunität (PTI: PAMP-triggered immunity).
Genau in diesen Prozess greifen bestimmte Bakterien ein, indem sie über ein Typ-III-
Sekretionssystem (T3SS) ca. 30 Typ-III-Effektoren (T3Es) in die Wirtszelle einschleusen mit
dem Ziel die Aktivierung der Immunantwort auf molekularer Ebene zu unterbinden. Man
spricht in diesem Falle von der Effektor-vermittelten Suzeptibilität (ETS: effector-triggered
susceptibility), da die T3Es dafür sorgen den Wirt gegenüber dem Angreifer suszeptibel zu
machen (Jones and Dangl, 2006). Bestimmte Kultivare einer ansonsten suszeptiblen
Pflanzenart können jedoch Resistenzgene (R-Gene) tragen, die die T3Es im Inneren der
Pflanzenzelle erkennen und darauf hin eine Zelltodreaktion, die hypersensitive Reaktion
(HR), einleiten (Jones and Dangl, 2006). In diesem Falle der sogenannten Effektor-
vermittelten Immunität (ETI: effector-triggered immunity) muss die Pflanze durch den
eingeleiteten Zelltod zwar einen Verlust von lebenden Zellen hinnehmen, kann jedoch dem
Angreifer seine Lebensgrundlage entziehen und ihn so daran hindern sich weiter
auszubreiten.
2.2.1. Die Nicht-Wirts-Resistenz
Ist eine gesamte Pflanzenspezies gegenüber allen Isolaten eines Pathogens resistent, so
spricht man von Nicht-Wirts-Resistenz. Das Pathogen ist in diesem Falle an die
Pflanzenspezies nicht angepasst, kann aber in anderen Pflanzenspezies Krankheit auslösen
(Senthil-Kumar and Mysore, 2013). Mit dem Begriff Nicht-Wirts-Resistenz wird eine Vielzahl
von pflanzlichen Abwehrmechanismen zusammengefasst. Die Nicht-Wirts-Resistenz wird
weiter in Typ-I und Typ-II unterteilt. Mündet die Nicht-Wirts-Resistenz in einer HR wird sie als
Typ-II-Nicht-Wirts-Resistenz bezeichnet. Verläuft die Interaktion ohne HR spricht man
Einleitung
9
dagegen von Typ-I-Nicht-Wirts-Resistenz (Oh et al., 2006). Die beiden wichtigsten
Bestandteile der Nicht-Wirts-Resistenz sind die Präformierte Abwehr, d.h.
Abwehrkomponenten, die bereits vor der Infektion vorhanden sind, und die PAMP-triggered
immunity (PTI), die erst nach der Wahrnehmung des Pathogens durch die Pflanze aktiviert
wird.
2.2.1.1. Präformierte Abwehr der Pflanzen
Die erste Hürde, die von phytopathogenen Bakterien überwunden werden muss, stellt die
präformierte Abwehr dar. Dazu zählen mechanische Barrieren und chemische Abwehrstoffe
der Pflanzen. Eine dicht verzahnte Epidermis mit starken Zellwänden, die zusätzlich durch
eine Wachsschicht geschützt ist, verhindert das Eindringen der Bakterien in den
Interzellularraum (Apoplast). Nur über Stomata, Hydatoden oder Verwundungen ist es
Bakterien möglich, den für sie auf Grund der potentiell vorfügbaren Nährstoffe attraktiven
Apoplasten zu erreichen. Gelingt es dem Eindringling diese ersten physikalischen
Hindernisse zu überwinden kommen die konstitutiv produzierten chemische Abwehrstoffe,
die Phytoanticipine, antimikrobiell wirksame Sekundärmetabolite, zum Einsatz.
Beispielsweise hemmen die Phytoanticipine Fragarin der Erdbeere (Fragaria ananassa) oder
die Glukosinolate der Ackerschmalwand das Bakterienwachstum im Apoplasten (Senthil-
Kumar and Mysore, 2013).
2.2.1.2. PAMP-vermittelte Immunität
Für die Aktivierung der PAMP-vermittelten Immunität (PTI: PAMP-triggered Immunity)
werden Pathogene anhand ihrer PAMPs (pathogen associated molecular patterns) von
Rezeptoren der Pflanze erkannt. Diese Rezeptoren an der Plasmamembran werden als
PRRs (pattern recognition receptor) bezeichnet. Am besten sind dabei zwei PRRs aus
Arabidopsis untersucht. Der FLS2-Rezeptor (FLAGELLIN SENSING 2) erkennt ein
konserviertes Epitop aus 22 Aminosäuren des bakteriellen Flagellins (flg22) (Felix et al.,
1999; Gómez-Gómez and Boller, 2000). In ähnlicher Art und Weise wird ein aus 18
Aminosäuren bestehendes Epitop des bakteriellen Elongationsfaktors EF-Tu (elf18) von EFR
(ELONGATION FACTOR TU-Rezeptor) erkannt (Zipfel et al., 2006). Sowohl FLS2 als auch
EFR sind Rezeptorkinasen und gehören zu der Familie der LRR-Rezeptoren (LRR: leucin
rich repeat). Diese zeichnen sich durch eine extrazelluläre LRR-Domäne am N-Terminus
aus, welche für die PAMP-Bindung zuständig ist, durch eine Transmembrandomäne, die für
die Verankerung in der Plasmamembran verantwortlich ist und durch eine intrazelluläre
Serin-/ Threonin-Kinase-Domäne am C-Terminus, die die Signalweiterleitung vermittelt.
Neben flg22 und elf18 gibt es viele weitere PAMPs von Bakterien wie Lipopolysaccharide
(LPS), Kälteschockproteine (CSP: cold shock protein) und Harpin sowie PAMPs von Pilzen
Einleitung
10
wie Chitinfragmente und β-Glukan-Reste (Nürnberger et al., 2004). Interessanterweise ist die
Perzeption von flg22 in Pflanzen hoch konserviert und ist für entfernt verwandte Familien wie
Solanaceae (z.B. Tomate) und Brassicaceae (z.B. Arabidopsis) beschrieben (Nürnberger et
al., 2004). Dagegen scheint EF-Tu nur von Brassicaceae erkannt zu werden (Zipfel et al.,
2006). Kürzlich wurde der ebenfalls auf Brassicaceae beschränkte, bisher unbekannte LPS-
Rezeptor (SD1-29, AT1G61380) von A. thaliana identifiziert (Ranf et al., 2015).
Die Bindung der Liganden flg22 und elf18 an ihre jeweiligen Rezeptoren FLS2 bzw. EFR
bewirkt, dass beide Rezeptoren mit der regulatorischen Rezeptor-Transmembran-Kinase
BAK1 (BRI1 ASSOCIATED KINASE 1) ein Heterodimer ausbilden, wodurch es
wahrscheinlich bereits zu einer Phosphorylierung der Rezeptoren und von BAK1 kommt (Lu
et al., 2010). FLS2, EFR und BAK1 interagieren weiterhin mit der Rezeptor-ähnlichen
zytoplasmatischen Kinase BIK1 (BOTRYTIS-INDUCED KINASE 1) und dessen Homologe
PBS1, PBL1 und PBL2 (Lu et al., 2010; Robatzek and Wirthmueller, 2013). Die genannten
zytoplasmatischen Kinasen werden dann von dem aktiviertem BAK1 phosphoryliert, wobei
diese wiederum den FLS2-/ EFR-BAK1 Rezeptor-Komplex transphosphorylieren. Nach der
vollständigen Phosphorylierung dissoziiert BIK1 vom FLS2-/EFR-BAK1-Komplex und
aktiviert Abwehrprozesse. Wenige Minuten nach der PAMP-Erkennung kommt es zu einer
Erhöhung der zytosolischen Calciumkonzentration ([Ca2+]cyt), zur Produktion reaktiver
Sauerstoffspezies (ROS), einer Alkalinisierung des Apoplasten und zur Aktivierung von
Mitogen-aktivierter Proteinkinasen (MAPKs) sowie Calcium-abhängiger Proteinkinasen
(CDPKs) (Felix et al., 1999; Chinchilla et al., 2007; Heese et al., 2007; Boudsocq et al.,
2010). Innerhalb von Minuten werden dadurch Transkriptionsfaktoren aktiviert und PR-Gene
(PR: pathogenesis related) induziert. Später kommt es zur Akkumulation von
Phytohormonen und Phytoalexinen, d. h. Sekundärmetabolite, die wie die Phytoanticipine
antimikrobielle Wirkung haben, aber erst nach einer Infektion produziert werden. (Tena et al.,
2011). Es ist eine ganze Reihe von Phytoalexinen aus diversen Pflanzengattungen bekannt,
wie z.B. Camalexin aus Arabidopsis oder Capsidiol aus Paprika und Tabak (Ahuja et al.,
2012). Darüberhinaus sind aber auch Hydroxyprolin-reiche Glykoproteine und Phenole als
chemische Komponenten der Abwehr zu nennen (Senthil-Kumar and Mysore, 2013). Als
physikalische Barrieren werden bei einer Infektion die Stomata geschlossen und Zellwände
durch Kallose, Lignin oder Suberin verstärkt, um das Eindringen von weiteren Bakterien in
den Apoplasten bzw. die Translokation von T3Es zu verhindern (Senthil-Kumar and Mysore,
2013).
Eine konstitutive Aktivierung der PTI hätte für die Pflanze negative Folgen und führt z.B. zu
einem defizitären Wurzelwachstum (Gómez-Gómez and Boller, 2000). Daher wird FLS2
Einleitung
11
nach der flg22-Perzeption deaktiviert. Durch die KAPP (kinase-associated protein
phosphatase) und durch die U-Box E3-Ligasen PUB12 und 13 wird FLS2 dephosphoryliert
bzw. über das Proteasom abgebaut und somit inaktiviert (Gómez-Gómez et al., 2001; Lu et
al., 2011).
2.2.1.3. Aktivierung der NADPH-Oxidase auf Proteinebene
Bereits vor der Entdeckung der Rezeptoren FLS2 und EFR in Arabidopsis war aus Arbeiten
mit Petersilien-Zellkulturen bekannt, dass nach PAMP-Stimulation Wasserstoff- und Calcium-
Ionen vom Apoplasten in die Zelle einströmen und Kalium- und Chlorid-Ionen aus der Zelle
ausströmen, was zu einer Alkalinisierung des Apoplasten führt (Nürnberger et al., 1994;
Blume et al., 2000). Diese Ionenströme finden in den ersten Minuten nach der PAMP-
Perzeption statt und sind für die Produktion von ROS und Phytoalexinen essentiell (Blume et
al., 2000). Für die membranständige NADPH-Oxidase RBOHD (RESPIRATORY BURST
HOMOLOGUE ISOFORM D) aus Arabidopsis, die für die flg22-stimulierte ROS-Produktion
verantwortlich ist, ist bekannt, dass sie durch Calcium reguliert wird. Dabei binden Calcium-
Ionen an den zytosolischen N-Terminus der RBOHD und tragen zur Konformationsänderung
und damit zur Aktivierung bei (Ogasawara et al., 2008). Durch den Calciumeinstrom werden
auch CDPKs aktiviert, die den N-Terminus von RBOHD phosphorylieren und dadurch
aktivieren (Boudsocq et al., 2010; Dubiella et al., 2013; Gao et al., 2013). Kürzlich wurde
zudem ein weiterer Calcium-unabhängiger Weg der RBOHD-Aktivierung beschrieben, in
dem aktiviertes BIK1 nach flg22-Stimulation RBOHD über Phosphorylierung aktiviert (Kadota
et al., 2014; Li et al., 2014). Dieses nach der PAMP-Perzeption zeitlich konzertierte
Einströmen von Calcium gefolgt von der ROS-Produktion erlaubt es der Pflanze innerhalb
von etwa 10 Minuten die ersten Abwehrantworten einzuleiten. ROS wird im Zusammenhang
mit verschiedenen Zellwand-assoziierten Abwehrprozessen diskutiert wie der
Kalloseeinlagerung, der Quervernetzung von Prolin-reichen Zellwandproteinen, Lignin und
Suberin (Torres, 2010). Daneben könnte ROS aber auch eine direkte toxische Wirkung auf
Pathogene haben (Torres, 2010). Zunehmend wird ROS aber als Signalmolekül angesehen,
da es ROS-abhängige Transkriptionsfaktoren und Abwehrgene reguliert und sogar im
Zusammenspiel mit CDPKs nach Pathogenbefall eine systemische Signalweiterleitung über
die ganze Pflanze vermitteln kann (Torres, 2010; Dubiella et al., 2013). Die zentrale
Bedeutung der RBOHD-vermittelten ROS-Produktion für die Etablierung von
Abwehrantworten wird dadurch deutlich, dass rbohd-Mutanten eine verminderte Einlagerung
von Kallose nach flg22-Behandlung aufzeigen (Zhang et al., 2007).
Einleitung
12
2.2.1.4. Genregulation über MAP- und CDP-Kinasen
Nach PAMP-Perzeption werden MAP-Kinasen FLS2-abhängig phosphoryliert und damit
aktiviert. MAP-Kinasen bilden dabei eine Phosphorylierungskaskade aus und regulieren
letzten Endes Transkriptionsfaktoren, die wiederum die Expression von PR-Genen aktivieren
(Asai et al., 2002; Eulgem and Somssich, 2007; Popescu et al., 2009). Nach Pathogenbefall
spielen dabei die MAP-Kinasen MPK3 und 6 die wichtigste Rolle. MPK3 und 6 werden von
den stromaufwärts gelegenen MAP-Kinase-Kinasen 4 und 5 (MKK4/5) phosphoryliert (Asai
et al., 2002). MPK3 und 6 sind positive Regulatoren da sie für die Aktivierung der
Transkriptionsfaktoren WRKY22 und WRKY29 wichtig sind, die die Transkription von
Abwehrgenen induzieren. Die bereits genannten CDPKs, die nach dem Calciumeinstrom
aktiviert werden und die RBOHD in Arabidopsis direkt phosphorylieren, haben auch eine
genregulatorische Funktion. Als Pendant zu den MAP-Kinasen MPK3 und 6 werden derzeit
die CDPK4/5/6 und 11 als wichtigste Abwehr-assoziierte Kinasen des Calcium-vermittelten
Signalwegs angesehen. Über noch unbekannte Transkriptionsfaktoren regulieren diese
CDPKs Abwehrgene und tragen damit zur Immunantwort bei (Boudsocq et al., 2010).
Boudsocq et al. (2010) konnten zeigen, dass in Arabidopsis MAPKs und CDPKs sowohl
unabhängig als auch synergistisch arbeiten. So konnten einige flg22-responsive Gene
identifiziert werden, die entweder nur über MAPKs oder CDPKs angesprochen werden bzw.
von beiden Signalwegen in synergistischer Art und Weise. Weitere Bestandteile des
komplexen Calcium-Signalweges sind Calcineurin B-like/ CBL interacting protein kinases
(CBL/CIPKs) und Calmoduline (CAMs), die an der Produktion von Phytohormonen und
Phytoalexinen sowie der Regulation von PR-Genen beteiligt sind (Tena et al., 2011).
2.3. Effektor-vermittelte Immunität Die Effektor-vermittelte Immunität (ETI: effector triggered immunity) basiert auf der von H.
Flor 1971 postulierten Gen-für-Gen-Interaktion, die besagt, dass R-Gene der Pflanze zur
Resistenz gegenüber bestimmten Pathogenen verhelfen, sofern letztere das entsprechende
Avirulenzgen besitzen (Flor, 1971). Heute sind viele Beispiele aus phytopathogenen
Bakterien bekannt, die T3Es besitzen, welche von R-Genen bzw. den korrespondierenden
R-Proteinen erkannt werden. Dieses Erkennen löst in der Regel eine HR aus, was zum
Absterben der Wirtszelle führt. R-Gene codieren für NB-LRR Proteine (NB-LRR; nucleotide
binding leucine-rich repeat), die eine hohe Diversität aufzeigen (Collier and Moffett, 2009). R-
Gene lassen sich weiter in die Klassen mit einer N-terminalen TIR-Domäne (TIR: Toll and
Interleukin-1 Receptor) und einer CC-Domäne (CC: Coiled-Coil) unterteilen. TIR-NB-LRRs
und CC-NB-LRRs induzieren die HR über den EDS1- (ENHANCED DISEASE
Einleitung
13
SUSCEPTIBILITY 1) bzw. NDR1- (NON-RACE-SPECIFIC DISEASE RESISTANCE 1)
abhängigen Signalweg (Aarts et al., 1998). In der Regel interagieren R-Proteine nicht direkt
mit einem T3E, sondern indirekt über einen Kofaktor. In der „guard“-Hypothese geht man
davon aus, dass das R-Protein als guard seinen Kofaktor, den guardee überwacht (Jones
and Dangl, 2006). Veränderungen wie der Abbau oder die Modifikation eines Kofaktors
werden dann vom R-Protein wahrgenommen und die Signalwege über EDS1 oder NDR1
aktiviert. So ist zu erklären warum ein einzelnes R-Gen ausreicht, um die Anwesenheit von
unterschiedlichen Effektoren zu erkennen. Ein gut untersuchtes Beispiel ist die Manipulation
des Kofaktors RIN4 aus Arabidopsis. Die Interaktion von RIN4 mit den nicht verwandten
T3Es AvrB und AvrRpm1 aus Pseudomonas syringae führt über einen unbekannten
Mechanismus zur Hyperphosphorylierung von RIN4 (Mackey et al., 2002). Die
Phosphorylierung von RIN4 und nicht die Effektoren selbst werden von dem R-Protein RPM1
detektiert und eine NDR1-abhängige HR wird eingeleitet (Jones and Dangl, 2006). RIN4 wird
von einem dritten Effektor, AvrRpt2, adressiert. Dieser Effektor bewirkt durch dessen
Cysteinproteaseaktivität den Abbau von RIN4. Wieder wird nicht der Effektor selbst, sondern
dessen Manipulation von RIN4 von einem R-Protein, RPS2, wahrgenommen und eine
NDR1-abhängige HR ausgelöst (Mackey et al., 2003; Jones and Dangl, 2006). Eine Art
Weiterentwicklung der guard-Hypothese ist die decoy-Hypothese. Diese beschäftigt sich mit
der Frage, ob die Kofaktoren das tatsächliche Ziel der T3Es darstellen oder eine von der
Pflanze gestellte Falle (decoy) sind. Man nimmt dabei an, dass im Laufe der Evolution
Kofaktoren entstanden sind, die mit T3Es mit Avirulenzfunktion eine starke Interaktion
eingehen können ohne dabei einem Selektionsdruck unterworfen zu sein, diese Interaktion
oder deren Manipulation durch den T3E zu umgehen. Solche decoys stellten dann
Interaktionspartner dar, die nur so „aussehen“ wie Abwehr-assoziierte Zielproteine (van der
Hoorn and Kamoun, 2008). Ein Beispiel ist dabei die Serin/Threonin-Kinase Pto aus Tomate,
die mit den T3Es AvrPto und AvrPtoB interagiert. Pto wird von dem R-Protein Prf überwacht
und in Anwesenheit von AvrPto oder AvrPtoB wird eine HR ausgelöst (Jones and Dangl,
2006). Das eigentliche Ziel dieser Effektoren sind aber PRRs wie z.B. FLS2 aus Arabidopsis
und Tomate, um die PTI zu unterdrücken (Göhre et al., 2008; Xiang et al., 2008; Xiang et al.,
2011). Ein pflanzliches Zielprotein wäre nach der decoy-Hypothese nur dann eine echte
Falle, wenn -in Abwesenheit des dazugehörigen R-Proteins- durch die Manipulation des
decoys weder ein Nachteil für die Pflanze noch ein Vorteil für das Pathogen entstünde. In
diesem Falle hätte das decoy keine Funktion in der eigentlichen Abwehr, sondern wäre
ausschließlich ein Korezeptor für die R-Gen vermittelte HR. Tatsächlich wurde für AvrPto
gezeigt, dass es zur Virulenz von P. syringae weiterhin beiträgt, wenn einer der beiden „HR-
Faktoren“ Pto oder Prf in Tomate fehlen. Dabei macht es keinen Unterschied, ob die AvrPto-
Einleitung
14
vermittelte HR dadurch verhindert wird, dass Pto oder Prf fehlt. Der Beitrag von AvrPto zur
Virulenz ist in pto/Prf und in Pto/prf Tomaten gleich (Chang et al., 2000). Dies deutet darauf
hin, dass Pto nicht das eigentliche Ziel von AvrPto ist, da P. syringae nicht davon profitiert
Pto zu manipulieren. Pto hat demnach, abgesehen von seiner Funktion als Kofaktor, keine
Funktion in der Pathogen-Abwehr (van der Hoorn and Kamoun, 2008).
2.4. Die Phytohormone der Pathogenabwehr Pflanzen reagieren auf biotischen Stress mit der Produktion der Phytohormone Ethylen (ET),
Salizylsäure (SA) und Jasmonsäure (JA). ET und JA sind die entscheidenden Hormone für
die Abwehr von Insekten wohingegen ET und SA für die Abwehr hemi-biotropher Bakterien
entscheidend sind (O’Donnel et al., 2001; Pieterse and Van Loon, 2004). Die Phytohormone
tragen zu der Pathogenabwehr bei, indem sie im infizierten Gewebe die Transkription ET-,
SA- oder JA-abhängiger Abwehrgene aktivieren oder für das Schließen der Stomata sorgen,
um das Eindringen weiterer Pathogene zu verhindern (Pieterse and Van Loon, 2004;
Mersmann et al., 2010). Die Produktion der Phytohormone wird von MAPK- und Calcium-
abhängigen Signalwegen kontrolliert, die durch PAMPs, Verwundungen oder Insektenbefall
stimuliert werden (Tena et al., 2011). So aktivieren in Arabidopsis die MAP-Kinasen MPK3
und 6 die für die ET-Produktion essentiellen 1-Aminocyclopropancarbonsäure-Synthasen
ACS2 und 6 und es kommt nachfolgend zur ET-Akkumulation. CDPK1 wird mit der
Produktion von SA in Verbindung gebracht, jedoch ist der genaue Mechanismus der
Aktivierung noch unbekannt (Coca and San Segundo, 2010). MPK4 ist dagegen ein
negativer Regulator der SA-Produktion, da mpk4 Arabidopsis-Mutanten einen erhöhten SA-
Gehalt aufweisen (Petersen et al., 2000). CDPK3 und 13 sowie bisher unbekannte MAP-
Kinasen sind an der Regulation der JA-Produktion und JA-abhängiger Gene beteiligt (Tena
et al., 2011). Neben dieser lokalen Wirkung ist SA an der Etablierung der SA-abhängigen
Systemischen Resistenz, der SAR (systemic aquired resistance), beteiligt (Sticher et al.,
1997). SAR bedeutet, dass nach einer Infektion auch nicht-infizierte Pflanzenteile erhöhte
SA-Mengen und induzierte Abwehrgene aufzeigen und Pathogen-resistent sind. Zwar ist SA
essentiell für die SAR und SA wird auch durch die Pflanze transportiert, aber es stellt selbst
nicht das entscheidende mobile Signalmolekül für die Signalweiterleitung dar (Pieterse and
Van Loon, 2004). Im Gegensatz dazu wird JA selbst als das mobile Signalmolekül
angesehen, dass eine SAR nach Insektenbefall auslöst (Pieterse and Van Loon, 2004).
Einleitung
15
2.5. Suppression der pflanzlichen Immunantwort durch bakterielle Effektoren
Phytopathogene Bakterien wie z.B. Pseudomonas und Xanthomonas spp. kodieren für
sechs Sekretionssysteme Typ-I bis Typ-VI (im weiteren T1SS bis T6SS), die bis auf das
T5SS alle die innere und äußere Membran der Gram-negativen Bakterien umspannen und
so Proteine direkt aus dem Zellinneren in das extrazelluläre Milieu abgeben oder in eine
Wirtszelle translozieren können (Büttner and Bonas, 2010; Xin and He, 2013). Das T2SS
und T5SS sind zudem vom Tat- und/ oder Sec-Sekretionssystem abhängig, d.h. die
Substrate werden zunächst Tat-/Sec-abhängig über die innere Membran transportiert und
dann über das T2SS oder T5SS in das extrazelluläre Milieu ausgeschleust (Bronstein et al.,
2005; Gerlach and Hensel, 2007). Sowohl T1SS, T2SS als auch T3SS sind für die Virulenz
von Pseudomonas und Xanthomonas wichtig (Büttner and Bonas, 2010; Xin and He, 2013).
Für T1SS und T2SS sind bisher nur wenige Substrate bekannt und der Fokus der Forschung
liegt derzeit auf dem T3SS. Das T3SS ist für die Pathogenität von Xanthomonas und
Pseudomonas essentiell. Über dieses System werden die T3Es direkt in die Wirtszelle
transloziert, wo sie die pflanzliche Immunantwort supprimieren und den Wirtsmetabolismus
umzuprogrammieren.
2.5.1. Typ-III-Sekretionssystem Gram-negativer Bakterien
Für phytopathogene Gram-negative Bakterien ist das T3SS von zentraler Bedeutung. Ein
Verlust des T3SS hat zur Folge, dass pythopathogene Bakterien auf suszeptiblen und
resistenten Pflanzen keine Krankheit bzw. keine R-Gen vermittelte HR mehr auslösen
können (Büttner and Bonas, 2010). Damit ist das T3SS für die Pathogenität essentiell und
Mutanten mit einem gestörten T3SS konnten über das Ausbleiben von Krankheit oder einer
HR leicht identifiziert werden (Büttner and Bonas, 2010). Dies war namensgebend für die
mehr als 20 hrp-Gene (HR and pathogenicity), die das T3SS auf dem bakteriellen
Chromosom kodieren (Büttner and Bonas, 2010). Eine Gruppe der hrp-Gene ist in den
Phytopathogenen Pseudomonas syringae, Erwinia amylovora, Ralstonia solanacearum und
Xanthomonas ssp. und in Pathogenen von Säugern in Bezug auf Genposition und –
Regulation konserviert, weshalb diese auch hrc-Gene (hrp conserved) genannt werden
(Büttner and Bonas, 2002). Die hrc-Gene zeigen eine hohe Ähnlichkeit zu den kodierenden
Genen des Flagellenapparats und man geht daher davon aus, dass das T3SS aus den
Flagellen evolvierte. Diese hrc-Gene kodieren für die Kernkomponenten des T3SS, die in der
inneren und äußeren Bakterienmembran verankert sind (Büttner and Bonas, 2002). Der pilus
stellt den extrazellulären Teil des T3SS dar und durchdringt die Zellwand der Pflanze. Dort
Einleitung
16
steht er in Verbindung mit dem bakteriellen Translokon, das in der Plasmamembran der
Wirtszelle einen tunnelartige Pore ausbildet (Büttner and Bonas, 2010). Nach der
erfolgreichen Assemblierung des T3SS können dann die T3Es aus dem bakteriellen
Zytoplasma durch den pilus und das Translokon in das Zytoplasma der Wirtszelle
transportiert werden. Die meisten T3SS-Gene und T3Es werden erst während der Infektion
einer Pflanze exprimiert. Die transkriptionelle Regulation erfolgt in Xanthomonas dabei über
HrpX, einem AraC-Typ Transkriptionsfaktor, der wiederum von HrpG, einem OmpR-Typ
response regulator, aktiviert wird. HrpX bindet an die PIP-box (PIP; plant inducible promotor)
im Promotorbereich der entsprechenden Gene. HrpG wird wahrscheinlich über eine noch
unbekannte, membranständige Sensorkinase phosphoryliert, die einen ebenfalls nicht genau
bekannten externen Stimulus aus dem Apoplasten der Pflanze als Signal überträgt (Büttner
and Bonas, 2010).
2.5.2. Typ-III-Effektoren
Pseudomonas syringae und Xanthomonas ssp. sekretieren jeweils ca. 30 verschiedene
Effektoren, die als Hops (Hrp outer protein, z.B. HopD1) bzw. Xops (Xanthomonas outer
protein, z.B. XopD) bezeichnet werden oder das Kürzel „avr“ im Namen tragen, wie z.B.
AvrBs3 (Büttner and Bonas, 2010; Xin and He, 2013). Letztere wurden über ihre
Avirulenzfunktion indentifiziert, d.h. über eine bestimmte Gen-für-Gen-Interaktion zwischen
bakteriellem Effektor und pflanzlichen Resistenz-Gen. Das Kürzel „avr“ ist jedoch irreführend,
da es nicht bedeutet, dass avr-Gene keine Virulenzfunktion haben. Es kommt vielmehr auf
die genaue genetische Ausstattung der Pflanze an. So hat z.B. AvrBs3 eine
Avirulenzfunktion wenn ein bestimmtes Paprikakultivar, das das R-Gen Bs3 trägt, infiziert
wird (Bonas et al., 1989). In diesem Falle wird eine HR ausgelöst und das Pathogen ist
avirulent. Fehlt jedoch Bs3, so kann AvrBs3 seine Virulenzfunktion (siehe 2.5.3.3) entfalten
(Marois et al., 2002). Neben der Entdeckung über die Avirulenzfunktion wurden weitere
Effektoren über andere Verfahren ermittelt. Ein Ansatz beruhte darauf ein verkürztes
Avirulenzgen ohne Sekretionssequenz mittels Transposonmutagenese mit ungekannten
Effektoren zu fusionieren (Guttman et al., 2002; Roden et al., 2004). Das Avirulenzgen
fungierte in diesen Studien als Reporter. Ein anderer Ansatz war es bakterielle Gene zu
identifizieren, die erst in planta induziert werden (Noël et al., 2001; Boch et al., 2002),
wodurch z.B. xopB als T3E identifiziert wurde (Noël et al., 2001). Einige bereits bekannte
Effektoren sind stromaufwärts und –abwärts von konservierten Sequenzen flankiert, die über
Polymerase-Ketten-Reaktionen (PCR) mit entsprechenden Oligonukleotiden amplifiziert
werden können (Arnold et al., 2001). Dadurch können unbekannte Effektoren mit
Einleitung
17
konservierten flankierenden Sequenzen identifiziert werden. Bioinformatische Methoden wie
Sequenzvergleiche basierend auf bekannten T3E-Promotoren, kodierenden Sequenzen von
T3Es oder deren Regulatoren führten zur Identifizierung weiterer Effektoren aus P. syringae
(Lindeberg et al., 2006). Zwar haben T3Es kein konserviertes Sekretionsmotiv, aber es
konnte gezeigt werden, dass bestimmte Aminosäuren in den ersten 25
Aminosäurepositionen von T3Es ab- bzw. angereichert sind (Arnold et al., 2009). Diese
Eigenschaft wird ausgenutzt, um neue Effektoren vorherzusagen.
2.5.3. Zielprozesse der T3Es
Nach der erfolgten Translokation der T3Es greifen diese in unterschiedliche Prozesse der
Wirtszelle ein. So interferieren sie mit Signaltransduktionsprozessen wie der MAPK-Kaskade
oder auch mit späten Immunantworten wie der pflanzlichen Sekretion. Im Folgenden sollen
die Funktionen einiger T3Es aus Xanthomonas ssp. und Pseudomonas syringae dargelegt
werden.
2.5.3.1. PRRs und assoziierte Kinasen
Für die T3Es AvrPto und AvrPtoB aus Pst DC3000 wurde gezeigt, dass sie stromaufwärts
einer MAP-Kinase-Kinase Kinase wirken müssen und somit zu einem sehr frühen Zeitpunkt
in die MAP-Kinase-Kaskade eingreifen (He et al., 2006). avrPto- und/ oder avrPtoB-
Deletionsmutanten von Pst DC3000 zeigten in Arabidopsis ein vermindertes bakterielles
Wachstum (He et al., 2006) und die Überexpression von AvrPto in transgenen
Arabidopsispflanzen supprimierte die PTI (Hauck et al., 2003). Später wurde gezeigt, dass
AvrPto mit FLS2 und EFR aus Arabidopsis sowie FLS2 aus Tomate interagiert und deren
Kinaseaktivitäten hemmt, was zum Ausbleiben der Aktivierung der MAPK-Kaskade nach
PAMP-Stimulation führt (Xiang et al., 2008). Eine weitere Studie postulierte, dass AvrPto und
der funktionell redundante Effektor AvrPtoB mit BAK1, dem Korezeptor von FLS2,
interagieren. AvrPto verhindert dabei die Ausbildung des FLS2-BAK1-Komplexes (Shan et
al., 2008). Die Interaktion zwischen AvrPto und BAK1 in Arabidopsis wurde jedoch in einer
unabhängigen Studie wiederlegt, aber die Rezeptoren FLS2 und EFR wurden als primäre
Zielproteine von AvrPto bestätigt (Xiang et al., 2011). Trotz dieser Kontroverse bleibt als
gemeinsamer Nenner, dass AvrPto und AvrPtoB die PTI unterdrücken, indem AvrPto als
Kinaseinhibitor die Aktivierung von FLS2 und EFR verhindert und AvrPtoB über dessen E3-
Ligase-Aktivität die beiden Rezeptoren ubiquitiniert und sie damit für den Abbau über das
Proteasom markiert (Göhre et al., 2008; Xiang et al., 2011).
Einleitung
18
Die stromabwärts von FLS2-BAK1 oder EFR-BAK1 aktivierten zytoplasmatischen Kinasen
BIK1, PBL1 und PBL2 werden von AvrPphB, einem Effektor mit Cysteinprotease-Aktivität,
adressiert (Zhang et al., 2010). Durch den Abbau dieser Abwehr-assoziierten Kinasen durch
AvrPphB wird die PTI von Arabidopsis geschwächt.
Die P. syringae Effektoren AvrPto, AvrPtoB und AvrPphB greifen mit ihrer Funktion als
Kinaseinhibitior, E3-Ligase bzw. Cysteinprotease in die Signaltransduktion ein. Eine vierte
Variante stammt aus dem Arabidopsis-Pathogen Xanthomonas campestris pv. campestris.
Dessen T3E AvrAC besitzt eine Uridyly-Transferaseaktivität, die es ihm erlaubt ein Uridin-5´-
monophosphatmolekül auf entscheidende Phosphorylierungsstellen der Rezeptor-ähnlichen
Kinasen BIK1 und RIPK (RPM1-INDUCED PROTEIN KINASE) zu übertragen. Damit werden
diese Phosphorylierungsstellen maskiert und die Aktivität der Abwehr-assoziierten Kinasen
BIK1 und RIPK ist eingeschränkt (Feng et al., 2012).
Aus Xcv ist mit XopN ein weiteres Beispiel für einen Effektor bekannt, der eine
Rezeptorkinase an der Plasmamembran von Tomatenzellen als Ziel hat. Ein erster
Anhaltspunkt, dass XopN die PTI von Tomate adressierte, lieferte eine Studie, in der gezeigt
wurde, dass ein Verlust von XopN die Virulenz von Xcv vermindert (Roden et al., 2004).
Später wurden dessen Interaktionspartner TARK1, eine Plasmamembran-ständige atypische
Rezeptor-ähnliche Kinase, und die 14-3-3-Isoform TFT1, einem positiven Regulator der PTI,
gefunden. Die PTI-Suppression durch XopN ist TARK1- und TFT1-abhängig, aber die
biochemische Aktivität von XopN ist noch ungeklärt (Kim et al., 2009; Taylor et al., 2012).
2.5.3.2. MAP-Kinasen
Die nach der PAMP-Perzeption aktivierte MAPK-Kaskade wird ebenfalls von Effektoren
inhibiert. HopAI1, ein konservierter Effektor in Tier- und Pflanzenpathogenen, inaktiviert
MAP-Kinasen, indem es mittels seiner Phosphothreonin Lyase-Aktivität die Phosphorylierung
der Threoninreste von MAP-Kinasen rückgängig macht. Dabei sind MPK3 und MPK6, zwei
entscheidende MAP-Kinasen in der PTI von Pflanzen, die von HopAI1 betroffenen MAP-
Kinasen (Zhang et al., 2007). Die Autoren spekulierten über weitere Interaktionspartner von
HopAI1 und tatsächlich konnte die MAP-Kinase MPK4 als weiteres Ziel identifiziert werden.
Die Kinaseaktivität von MPK4 wird ebenfalls durch HopAI1 reduziert, was zusammen mit der
Manipulation von MPK3 und MPK6 zur Suppression der basalen Abwehr führt (Zhang et al.,
2012). Stromaufwärts von MPK3 und 6 wirkt der Effektor HopF2 indem er die Aktivität von
der MAP-Kinase-Kinase MKK5 manipuliert. Die Manipulation erfolgt dabei über die ADP-
Ribosyltransferase Aktivität von HopF2. MKK5 kann entsprechend MPK3 und 6 nicht mehr
Einleitung
19
phosphorylieren, wodurch nachgeschaltete Prozesse weniger stark aktiviert werden (Li et al.,
2005; Wang et al., 2010).
2.5.3.3. Transkription der Wirtszelle
Eine weitere ADP-Ribosyltransferase aus Pseudomonas syringae ist HopU1, das RNA-
bindende Proteine wie GRP7 (glycine-rich RNA-binding protein 7) ADP-ribosyliert (Fu et al.,
2007). Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass GRP7 mit der FLS2 und EFR mRNA
interagiert und HopU1 diese Interaktion stört. Als Folge wird die Pst-induzierte Akkumulation
des FLS2-Proteins post-transkriptionell supprimiert (Nicaise et al., 2013).
Die Transkription des Wirts selbst wird von den sog. TAL-Effektoren (TAL: transcription
activator like) der Gattung Xanthomonas umprogrammiert. TAL-Effektoren haben einen
modularen Aufbau bestehend aus einer repeat-Domäne, aus einer
Kernlokalisierungssequenz und einer Aktivierungs-Domäne, die eine eukaryotische
Transkriptionsaktivierungsdomäne nachahmt. TAL-Effektoren binden an DNA, wobei die
Sequenzwiederholungen in der repeat-Domäne für die DNA-Sequenzspezifität verantwortlich
sind (Boch et al., 2009). Als gut untersuchter „Prototyp“ gilt dabei der TAL-Effektor AvrBs3. In
einer inkompatiblen Interaktion zwischen Xcv und Paprika induziert das kernlokalisierte
AvrBs3 selbst das nicht-konstitutiv exprimierte Resistenzgen Bs3. AvrBs3 induziert somit
sein korrespondierendes R-Gen und es wird eine HR ausgelöst (Römer et al., 2009). In einer
suszeptiblen Interaktion wird dagegen ein Masterregulator aktiviert, der zu einer für Xcv
förderlichen Hypertrophie der Wirtszellen sorgt (Marois et al., 2002; Kay et al., 2007).
Der Effektor XopD aus Xcv ist wie AvrBs3 im Zellkern lokalisiert und bindet dort über dessen
Helix-Loop-Helix-Motiv an die DNA, besitzt aber keine Aktivierungsdomäne wie TAL-
Effektoren (Kim et al., 2008). Vielmehr interagiert XopD mit dem Ethylen-responsiven
Transkriptionsfaktor SlERF4, der dann von XopD desumoyliert wird. Dadurch wird SlERF4
destabilisiert und die Ethylen-vermittelte Immunantwort der Pflanze ist gestört (Kim et al.,
2013).
2.5.3.4. Vesikeltransport
Mit dem Effektor HopM1 kann Pseudomonas das Wirtsproteasom für seine Zwecke
ausnutzen und die Immunabwehr schwächen. Es konnte gezeigt werden, dass HopM1 mit
dem Abwehr-assoziierten Protein AtMIN7 interagiert und dieses dem Abbau über das
pflanzliche 26S-Proteasom zuführt (Nomura et al., 2006). Interessanterweise wird dieser für
Pseudomonas syringae vorteilhafte HopM1-abhängige Abbau von AtMIN7 während einer
Einleitung
20
ETI unterdrückt (Nomura et al., 2011). HopM1 und AtMIN7 sind beide im TGN/EE (trans-
golgi network/ early endosomes) lokalisiert, was auf eine Funktion im Vesikeltransport
hindeutet. Jüngst wurde ein anderer bereits von Nomura et al. (2006) identifizierter
Interaktionspartner von HopM1 hervorgehoben. Hier wurde gezeigt, dass der HopM1-
Interaktionspartner GRF8/AtMIN10, ein 14-3-3 Protein, für die ROS-Produktion und die
Stomata-assoziierte Abwehr wichtig ist (Lozano-Durán et al., 2014).
Über die Destabilisierung der Mikrotubuli und der 26S Proteasomuntereinheit RPT6 sind die
Effektoren HopZ1a und HopZ4 bzw. XopJ in der Lage die pflanzliche Sekretion und
Zellwand-assoziierte Abwehrreaktionen zu supprimieren (Bartetzko et al., 2009; Lee et al.,
2012; Üstün et al., 2013; Üstün et al., 2014).
2.6. Umprogrammierung des Wirtsmetabolismus durch Pathogene Höhere Pflanzen haben differenzierte Gewebe und Organe, die sich im Hinblick auf die
Assimilatproduktion in zwei Klassen unterteilen lassen. Die photoautotrophen source-
Organe, im Wesentlichen ausgewachsene Blätter, produzieren einen Nettoüberschuss an
Assimilaten wie Zucker und Aminosäuren und transportieren diesen Überschuss an die
heterotrophen sink-Organe weiter, die ihren Energiebedarf nicht selbst decken können. Zu
den sink-Organen zählen Blüten, Früchte, Meristeme, Wurzeln sowie unterirdische Stolone
und Rhizome. Der Assimilattransport findet über das Phloem statt, das zusammen mit dem
wasserführendem Xylem, das Leitgewebe der Pflanzen ausbildet. Die Beladung des
Phloems mit Saccharose kann in den source-Blättern je nach Pflanzenspezies symplastisch
über Plasmodesmata (PDs) oder apoplastisch erfolgen. Bei der symplastischen Beladung
diffundiert die Saccharose passiv von den photosynthetisch aktiven Mesophyllzellen in die
Geleitzellen des Phloems und von dort ebenfalls symplastisch in die Siebelemente (Turgeon,
2010). Pflanzenarten mit apoplastischer Phloembeladung, wie z.B. Arabidopsis, exportieren
die Saccharose hingegen mit Hilfe von H+/Saccharose-Symportern (den SUTs oder SUCs)
und den neu beschriebenen SWEETs (Sugars Will Eventually be Exported Transporters) aus
den Phloemparenchymzellen in den Apoplasten. Dort werden sie von den SUTs in die
Geleitzellen importiert, die wiederum symplastisch mit den Siebelementen in Verbindung
stehen (Sauer and Stolz, 1994; Lalonde et al., 2004; Chen et al., 2012). Dem Massenstrom
folgend wird die Saccharose dann über das Phloem in Richtung sink-Organe transportiert.
Die Phloementladung und Beladung der sink-Zellen erfolgt wieder symplastisch über PDs
oder apoplastisch. Apoplastische Saccharose kann von sink-Zellen über H+/Saccharose-
Importer wieder aufgenommen werden oder wird zunächst von der Zellwand-gebundenen
Invertase (cw-Inv) in Glukose und Fruktose hydrolysiert. Die entstandenen Hexosen werden
Einleitung
21
dann von Hexosetransportern (HXT) in die sink-Zellen transportiert (Biemelt and Sonnewald,
2006).
Pathogene, die ein source-Blatt befallen, müssen nicht nur Strategien besitzen die
präformierte und induzierte Immunabwehr zu unterdrücken, sondern sie müssen nach dem
Eindringen in den Apoplasten mit einem für sie zunächst unwirtlichen Lebensraum
zurechtkommen. Nährstoffe für Pathogene wie die Saccharose diffundieren in source-
Blättern symplastisch über PDs von Mesophyllzelle zu Mesophyllzelle in Richtung
Leitgewebe und sind daher für Pathogene zunächst nicht zugänglich (Senthil-Kumar and
Mysore, 2013). Den Zucker in source-Blättern nicht apoplastisch zu transportieren wird auch
als eine Art von präformierter Abwehr diskutiert, da es die initiale Besiedlung für die
Pathogene erschwert (Senthil-Kumar and Mysore, 2013). Pathogene haben aber Strategien
entwickelt den Wirtsmetabolismus und den Zuckertransport zu ihren Gunsten
umzuprogrammieren.
So werden einige SWEETs aus Arabidopsis durch P. syringae induziert und versorgen so
möglicherweise die Bakterien mit Zucker (Chen et al., 2010). Aus Reis und Kassava ist
bekannt, dass SWEETs von TAL-Effektoren gezielt angeschaltet werden und zur
Suszeptibilität gegenüber Bakterien beitragen (Li et al., 2012; Li et al., 2013; Cohn et al.,
2014). Seit Langem stehen auch die Zellwand-gebundenen Invertasen (cw-Inv) im Fokus der
Wirt-Pathogen-Interaktion. In vielen Studien konnte gezeigt werden, dass nach Infektion von
source-Geweben mit Viren, Pilzen oder Bakterien die cw-Inv-Aktivität ansteigt (Chou et al.,
2000; Herbers et al., 2000; Swarbrick et al., 2006; Essmann et al., 2008; Kocal et al., 2008;
Sonnewald et al., 2012). Infizierte source-Blätter begehen dabei eine sogenannte source-
sink-Konversion, d.h. dass der Wirtsmetabolismus von einem source- zu einem sink-Zustand
umgesteuert wird. Durch die erhöhte cw-Inv-Aktivität wird der Saccharosetransport zum
infizierten Blatt umgeleitet und die dortige Beladung des Phloems mit Saccharose wird
unterbunden (Scharte et al., 2005). Die entstehenden Hexosen Glukose und Fruktose
werden anschließend über koregulierte Hexosetransporter (HXTs) in die Zelle transportiert
(Ehness and Roitsch, 1997; Büttner and Sauer, 2000). Dadurch wird die Photosynthese des
infizierten source-Blattes herunterreguliert und es liegt nun ein sink-Blatt vor (Seo et al.,
2007). Die höhere Verfügbarkeit von Hexosen kann als Energiequelle für die pflanzliche
Abwehr dienen, aber auch für die Ernährung der Pathogene (Bolton, 2009; Proels and
Hückelhoven, 2014). Von einigen Pilzen ist bekannt, dass sie eigene Invertasen und HXTs
während der Infektion exprimieren, aber es ist unklar, ob dies für die Ernährung der Pilze
oder der source-sink-Konversion und damit der Abwehr dient (Proels and Hückelhoven,
2014). Die Verfügbarkeit von Hexosen ist vermutlich nicht limitierend für hemibiotrophe
Einleitung
22
Bakterien, da nach Genstilllegung der cw-Inv das in planta-Wachstum von Xcv in Tomate
nicht vermindert war (Kocal et al., 2008). Stattdessen konnten die Autoren zeigen, dass die
Entwicklung der Krankheitssymptome und die Expression von Abwehrgenen verzögert bzw.
vermindert waren. Durch die Überexpression der cw-Inv in Reis konnte die Resistenz
gegenüber X. oryzae pv. oryzae und Magnaporthe oryzae gesteigert werden. Damit einher
ging eine erhöhte Expression von Abwehrgenen und eine verstärkte Zellwand-assoziierte
Abwehrreaktion, wie die Einlagerung von Kallose, die die Wichtigkeit der cw-Inv in der
Abwehr der Pflanzen aufzeigt (Sun et al., 2014). Tatsächlich führen erhöhte
Glukosekonzentrationen zu einer Repression von Photosynthesegenen und einer Induktion
von Abwehrgenen, wobei das Glukosesignal wahrscheinlich von intrazellulären Hexokinasen
(HXKs) integriert wird (Rolland et al., 2006). Zu den Zucker-regulierten Genen zählt ferner
die cw-Inv, da sie durch Saccharose, Glukose und nicht-metabolisierbare Zucker, aber auch
durch Phytohormone und Abwehr-assoziierte Stimuli wie das PAMP Chitosan und das
DAMP (damage associated molecular pattern) Polygalacturonsäure reguliert wird (Ehness et
al., 1997; Godt and Roitsch, 1997; Sinha et al., 2002; Roitsch et al., 2003). Die cw-Inv ist
somit nicht nur eine wichtige Komponente des Primärstoffwechsels der Pflanze, sondern
steht im Zentrum der Pathogen-stimulierten source-sink-Konversion und damit der
Pathogenabwehr. Die Vorgänge der source-sink-Konversion sind in Abb. 3 schematisch
dargestellt.
Einleitung
23
Abb. 3: Schematische Darstellung der Pathogen-stimulierten source-sink-Konversion (verändert nach Seo et al. 2007). Nach Perzeption des Pathogens im Apoplasten durch Rezeptoren (R) werden die Gene cw-Inv (cell wall-bound invertase), HXT (Hexosetransporter), HXK (Hexosekinase), und PRs (pathogenesis related) heraufreguliert. Durch die erhöhte cw-Inv-Aktivität kommt es zur Akkumulation der Hexosen im Apoplasten und einer Reduktion der Phloembeladung. Durch HXT werden die Hexosen in das Zytosol zurücktransportiert und können verstoffwechselt werden und/ oder HXK-vermittelt die Photosynthese herunterregulieren und PR-Gene heraufregulieren.
2.7. Der Typ-III-Effektor XopB XopB ist ein chromosomal codierter Typ-III-Effektor aus Xcv, der HrpX-abhängig reguliert ist
und für den in vitro gezeigt worden ist, dass er über das T3SS sekretiert wird (Noël et al.,
2001). XopB zeigt eine hohe Homologie zu den Effektoren AvrPphD aus P. syringae pv.
phaseolicola und HopD1 aus P. syringae pv. tomato DC3000. In der Gattung Xanthomonas
gibt es nur in X. vasicola pv. musacearum einen zu XopB homologen Effektor, jedoch ist
dieser nicht als T3E bestätigt (White et al., 2009). XopB gehört daher nicht dem
Kernrepertoire von T3Es an wie beispielsweise XopX, das in mindestens 6 Xanthomonas-
Arten vorhanden ist (White et al., 2009). Der verwandte Effektor HopD1 supprimiert
Immunantworten der ETI in Arabidopsis (Block et al., 2014), jedoch scheint HopD1 auf
Grund von dessen subzellulärer Lokalisierung und dessen Interaktionspartners über einen
anderen Mechanismus zu wirken als XopB. Die biochemische Funktion von XopB, AvrPphD
und HopD1 ist bisher ungeklärt. Eine xopB-Deletionsmutante zeigte zunächst keine
veränderte Virulenz in Paprika, jedoch konnte in einer späteren Studie ein Einfluss auf die
Apoplast
Zytosol
Saccharose
Pathogen
Hexosen
HXT
cw-Inv
Signaltransduktion
Nukleus
cw-Inv HXT HXK PRs
R
PS -
+
+
Saccharose Hexosen
Stoffwechsel
Phloem
X
SUT
X X X X SUT
Stoffwechsel
Signaltransduktion
HXK
Einleitung
24
Entwicklung der Krankheitssymptome gezeigt werden, ohne dass dabei das bakterielle
Wachstum in planta betroffen war (Noël et al., 2001; Schulze et al., 2012). Schulze et al.
(2012) zeigten, dass XopB im Golgiapparat lokalisiert und dort mit der pflanzlichen Sekretion
interferiert. Des Weiteren wurde in dieser Studie gezeigt, dass XopB sowohl einen Einfluss
auf die PTI als auch auf die ETI hat.
2.8. Vorarbeiten und Zielsetzung dieser Arbeit Aus Vorarbeiten der AG Sonnewald war bekannt, dass XopB einen Einfluss auf die cw-Inv-
Aktivität hat. Infektionen von suszeptiblen Paprika-Pflanzen mit einem xopB-Deletionsstamm
resultierten in einem starken Anstieg der mRNA-Menge und Aktivität der cw-Inv. Daher
bestand die Annahme, dass nach einer Infektion XopB die cw-Inv-Aktivität supprimiert und
so möglicherweise Hexose-vermittelte Abwehrreaktionen unterbindet. Da eine konstitutive
Expression von XopB zu Zelltod in Pflanzen führte, wurden in der AG Sonnewald transgene
Arabidopsis und Tabak-Pflanzen erzeugt, die xopB induzierbar exprimieren.
Im Rahmen dieser Arbeit sollten folgende Aspekte behandelt werden:
1. Unterdrückt XopB die cw-Inv-Aktivität durch ein Interferieren mit der pflanzlichen
Sekretion?
2. Interferiert XopB mit Signaltransduktionsprozessen von Pflanzen?
3. In welchem Kompartiment lokalisiert XopB in der Wirtszelle?
4. Mit welchen Wirtsproteinen interagiert XopB, um die Immunantwort und die cw-Inv zu
manipulieren?
Material und Methoden
25
3. Material und Methoden
3.1. Materialien Die nachfolgenden Materialien wurden im Rahmen dieser Arbeit verwendet.
3.1.1. Chemikalien, Enzyme und Verbrauchsmaterialien
Sofern nicht anders angegeben wurden die verwendeten Chemikalien, Enzyme und
Materialien von den Firmen Sigma-Aldrich (St. Louis, USA), Carl Roth GmbH (Karlsruhe),
Thermo Scientific (Waltham, USA), Roche Diagnostics GmbH (Mannheim), Eppendorf
(Hamburg), Greiner Bio-One GmbH (Frickenhausen) und VWR (Darmstadt) bezogen.
Die für die Pflanzenanzucht benötigten Verbrauchsmaterialien stammten von der
Bayerischen Gärtnereigenossenschaft e. G. (Nürnberg). Radioaktive Chemikalien
wurden von der Firma Hartmann Analytic (Braunschweig) bezogen.
3.1.2. Antibiotika
Folgende Antibiotika wurden für die Anzucht von Bakterien oder Pflanzen verwendet.
Bei Verwendung unterschiedlicher Konzentrationen eines Antibiotikums sind die
entsprechenden Medien in Klammern angegeben: Ampicillin (Amp) 166 µg ml-1;
Gentamycin (Gm) 15 µg ml-1; Kanamycin (Km) 50 µg ml-1; Rifampicin (Rif) 100 µg ml-1
(NYG) und 50 µg ml-1 (LB und YEB); Spectinomycin (Spec) 100 µg ml-1; Streptomycin
(Strep) 40 µg ml-1; Gentamycin (Gm) 15 µg ml-1.
3.1.3. Vektoren Tabelle 1: In dieser Arbeit verwendete Vektoren (GW: Gateway-kompatibel)
Vektor Resistenz
(Bakterien) Verwendung Hersteller/ Referenz
pCRblunt KmR Klonierungsvektor Invitrogen (Karlsruhe)
pENTR/D-TOPO KmR Klonierungsvektor Invitrogen (Karlsruhe)
pQE9 AmpR N-terminaler 6xHis-tag, Expressionsvektor E. coli M15/ pREP4 Qiagen, Hilden
Material und Methoden
26
pBinAR KmR binärer Vektor, konstitutive Expression in Pflanzen, KmR auf T-
DNA (Höfgen and Willmitzer, 1990)
pRB-35S-GW-
3xmyc
SpecR
StrepR
binärer Vektor, konstitutive Expression in Pflanzen, Gateway-
kompatibel, KmR auf T-DNA (Bartetzko et al., 2009)
pBBR1MCS-5 GmR konstitutive Expression in Xcv (Kovach et al., 1995)
pK7FWG2.0 SpecR
StrepR
binärer Vektor, konstitutive Expression in Pflanzen, KmR auf T-
DNA (Karimi et al., 2002)
pK7WGF SpecR
StrepR
binärer Vektor, konstitutive Expression in Pflanzen, KmR auf T-
DNA (Karimi et al., 2002)
pGBT9 AmpR N-terminale Fusion mit Gal4-Bindedomäne, Hefe-Zwei-Hybrid-
System Clontech, Mountain View, USA
pGAD424 AmpR N-terminale Fusion mit Gal4-Aktivierungsdomäne, Hefe-Zwei-
Hybrid-System Clontech, Mountain View, USA
pGWB614 SpecR binärer Vektor, konstitutive Expression in Pflanzen, C-
terminaler 3xHA-tag, barR auf T-DNA (Nakamura et al., 2010)
pGWB611 SpecR binärer Vektor, konstitutive Expression in Pflanzen, N-
terminaler tagRFP-tag, barR auf T-DNA (Nakamura et al., 2010)
pRB-35S-GW-
VENUS-N173
SpecR
StrepR Bimolekulare-Fluoreszenz-Komplementation (Üstün et al., 2014)
pRB-35S-
VENUS-C155-GW
SpecR
StrepR Bimolekulare-Fluoreszenz-Komplementation F. Börnke, unveröffentlicht
pRB-35S-GW-
mCherry
SpecR
StrepR
binärer Vektor, konstitutive Expression in Pflanzen, C-
terminaler mCherry-tag, KmR auf T-DNA (Üstün et al., 2013)
3.1.4. Oligonukleotide und Sequenzierungen
Oligonukleotide wurden von der Firma Metabion (Planegg) bezogen. Oligonukleotide für
qPCR wurden mit dem Programm Primer3 plus (http://www.bioinformatics.nl/cgi-
bin/primer3plus/primer3plus.cgi/) oder mit Primer-blast
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) abgeleitet.
Tabelle 2: Verwendete Oligonukleotide. CACC-Überhänge für Gateway-Klonierungen (GW) und Restriktionsschnittstellen sind fett, Kozak-Sequenzen unterstrichen dargestellt.
Nummer Name Sequenz 5´-3´ Gen Verwendung
HP49 M13FP TGTAAAACGACGGCCAGT
AY036109
Kolonie-PCR HP50 M13RP CAGGAAACAGCTATGACC
SS268 5´ xopB -649 bp GCGGATCCTGA AGTACGCTGGCCTTGCGC Komplementation Xcv ΔxopB
SS270 3´ xopB +107 bp GCGGATCCTCGACCGCAGACCCCTAATTC
Caro1 5´ xopB-Deletionsprimer GCGCAGGAGTTTTTTAGC
Überprüfung xopB-Deletion Caro2 3´ xopB-
Deletionsprimer GATCGTGTAAACAACAGC
HP34 xopB_FP_ as1-263 CACCATGAAGGCAGAGCTCACAC
Klonierung N-Terminus XopB HP35 xopB_RP_
as1-263 GGTCGCCACATATAGCAATT
Material und Methoden
27
HP36 xopB_FP_ as261-613 CACCATGGCGACCAAGAAAGAGTTTCAG
Klonierung C-Terminus XopB HP37 xopB_RP_
as261-613 CGGCTCAGGCGCGGGTT
HP66 FP xopB (-ATG) GGATCCAAGGCAGAGCTCACACGAT Klonierung xopB ohne ATG
HP67 RP xopB Stop GTCGACTTACGGCTCAGGCGCGG
HP73 xopB_as1-263_ Y2H_FP GGGATCCGTATGAAGGCAGAGCTCACAC
Klonierung N-Terminus XopB für Hefe-Zwei-Hybrid HP74 xopB_as1-263_
Y2H_RP GGTCGACTCAGGTCGCCACATATAGCAATT
HP92 XopBas77_FP GCGGATCCGTACCGATAACAGTGGGTTAGAA XopB ab as77 für Hefe-Zwei-Hydrid
HP93 XopBas611_RP GCGTCGACTCAAGGCGCGGGTTGGTGCG XopB bis as611 für Hefe-Zwei-Hydrid
HP94 XopBas238_FP GCGGATCCGTTTCATCAATCAGAAACTGAAAG XopB ab as238 für Hefe-Zwei-Hydrid
HP95 XopBas264_FP GCGGATCCGTAAGAAAGAGTTTCAGCTCGG XopB ab as264 für Hefe-Zwei-Hydrid
HP96 XopBas171_RP GCGTCGACTCAGGCGGCGGGCATTAATTG XopB bis as171 für Hefe-Zwei-Hybrid
HP97 XopBas111_RP GCGTCGACTCAAGAAACAAGTCGGCTCGACT XopB bis as111 für Hefe-Zwei-Hybrid
HP98 XopBas1_FP GCGGATCCGTATGAAGGCAGAGCTCACAC XopB ab as1 für Hefe-Zwei-Hybrid
HP137 NtIP1_Y2H_FP GCGGATCCGTATGGGAAGTTTTCAAACCAAAG
SGN-U468159
Klonierung NtIP1 für Hefe-Zwei-Hybrid HP157 NtIP1_
Y2H_RP GCGTCGACTTACAGATGCAAGCTTTTCGAT
HP85 NtIP1_FP CACCGTAACAATGGGAAGTTTTCAAACCAAAG Klonierung NtIP1
HP161 NtIP1_ w/o-Stop_RP CAGATGCAAGCTTTTCGATAAATT
HP91 NtIP1_(G2A)_FP CACCGTAACAATGGCAAGTTTTCAAACCAAAG Ortsgerichtete Mutagenese NtIP1(G2A)
HP260 NtIP1(C36A) FP GAGGTGAATGAAATAATGGCC ATGAGGGAACATGAGAGTCAAGC Ortsgerichtete Mutagenese C36A von NtIP1
HP261 NtIP1(C36A) RP GCTTGACTCTCATGTTCCCTCA TGGCCATTATTTCATTCACCTC
HP238 SlIP1_5´_Y2H GCGGATCCGTATGGGAAGTTTTCAAACCAAGG Soly09g091060.2 Klonierung SlIP1 für Hefe-Zwei-Hybrid
HP239 SlIP1_3´_Y2H GCGTCGACTTACATATGCAAGCTTTTTGAAAG
HP240 SlIP1.1_5´_Y2H GCGGATCCGTATGGGAAGTCTTCAAACAAAAAAT Soly12g097060.1 Klonierung SlIP1.1 für Hefe-Zwei-Hybrid
HP241 SlIP1.1_3´_Y2H GCGTCGACCTAGTTTTTGTAAAAAACTTTAGATATGCT
HP262 AtIP1.1_GW_FP CACCGTAACAATGGGTGGATGCACAAGC AT3G23930 Klonierung AtIP1.1 für Hefe-Zwei-Hybrid
HP263 AtIP1.1_ w/oStopRP TGTACATTCGACACATTTGGTCTT
HP256 AtIP1_5´_Bam GCGGATCCGTAACAATGGGTGGTTCTACAAGCAAG AT4G13540 Klonierung XopB-HA für Col-0 Transformation
HP257 AtIP1_3´HA_Sal GCGTCGACCTAAGCGTAGTCTGGCAC ATCATAAGGGTATTTACACCCGATGAATTTTGTTT
HP205 SlRhoGAP12_5´ CACCGTAACAATGTCTGCTTCACTTGCTGC
NtRhoGAP7
Klonierung NtRhoGAP7-VL
HP206 SlRhoGAP12- GAP_3´ GGATCMATTATTGGCTGCATTAGCAGC Klonierung NtRhoGAP7-PH-GAP und -GAP
HP207 SlRhoGAP12- GAP_5´ CACCGTAACAATGGATTCCTTTGAAGGGTCTTTC Klonierung NtRhoGAP7-ΔPH und -GAP
HP208 SlZIPPER12_5´ CACCGTAACAATGGAGGAGTATGAGAATATTTTCG Klonierung NtRhoGAP7-ZIPPER
HP209 SlRhoGAP12_ wobble_3´ GGATCMATTCCATGGAGGAGATGAAGG Klonierung NtRhoGAP7-VL, -ΔPH und -ZIPPER
HP211 SlRhoGAP12_3´_ Stop TCAATTCCATGGAGGAGATGA Klonierung NtRhoGAP7-VL- Stop
HP254 AT5G12150_ GAP5´_SalI GCGTCGACCTAATTCATGGAGGGATCAGC
AT5G12150 Klonierung AtRhoGAP150ΔPH für Hefe-Zwei-Hybrid HP255 AT5G12150_
STOP_SalI GCGTCGACCTAATTCCATGGTGGAGAAGAG
HP222 AT5G19390_ GAP5´_FP CACCGTAACAATGTTCCGTGCTGAAACTAACGAG
AT5G19390 Klonierung AtRhoGAP390ΔPH für Hefe-Zwei-Hybrid HP223 AT5G19390_
FL_RP TTAGTTCCAAGGTGGAGATGAT
HP226 AT4G13540_FL_FP CACCGTAACAATGGGTGGTTCTACAAGCAAG AT4G13540 Klonierung AtIP1 für Hefe-Zwei-Hybrid
HP227 AT4G13540_ FL_RP TTATTTACACCCGATGAATTTTG
HP175 AtRhoGAP_ consensus_FP CTGGGGAAGAGGCAACGG AT5G19390/
AT5G12150 Hefe-Kolonie-PCR HP176 AtRhoGAP_
consensus_RP ATCTCCTCAAGCTCGCCCT
HP177 NtRhoGAP_ZIPPER_ consensus_FP GCAACGGCAGCATCATTATG NtRhoGAP7/
NtRhoGAP12 Hefe-Kolonie-PCR HP178 NtRhoGAP_ZIPPER_
consensus_RP CTTAAGCTTGTCTCTCGGAG
HP179 NtRhoGAP_GAP_ consensus_FP TGCATCTGAAAATCGGATGAC NtRhoGAP7/
NtRhoGAP12 Hefe-Kolonie-PCR HP180 NtRhoGAP_GAP_
consensus_RP CCTTCATATCCAGATTTTCATC
HP228 AtARA7 FP GW CACCATGGCTGCAGCTGGAAACAAG AT4G19640 Klonierung Marker frühe Endosomen
Material und Methoden
28
HP229 AtARA7 RP CTAAGCACAACAAGATGAGCTC
HP248 CaRbohD_FP_ qPCR TGCCAACCACCACCTAATGG
CA03g30650 pPCR HP249 CaRbohD_RP_
qPCR AACACTCTCGGGAAATCAGGG
HP183 qPCR CaIP1_3' CCTTTCCTTCTTCCATTCTG CA03g02830 qPCR
HP184 qPCR CaIP1_5' GTGCATGAGGGAACATGAAA
HP200 AtrbohD_5' TGATTCCAACGGCCTCTTAC At5g47910 qPCR
HP201 AtrbohD_3' GTTATTCCGGCGAGCTAATG
HP202 AtOxi1_5' TCTTCCGCTTCACCAGTTTC At3g25250 qPCR
HP203 AtOxi1_3' CACGGCCAATGTAGATGATG
HP216 AtPR3_FP CACGAGGAAGAAGGAGGTCG At3g12500 qPCR
HP217 AtPR3_RP TGTAGCCCATCCACCTGTAGT
HP218 AtPR1_FP CGAACACGTGCAATGGAGTT At2g14610 qPCR
HP219 AtPR1_RP TTGGCACATCCGAGTCTCAC
SS293 TUB4_5´ AGGGAAACGAAGACAGCAAG At5g44340 qPCR
SS294 TUB4_3´ GCTCGCTAATCCTACCTTTGG
SS295 PHI1_5´ TTGGTTTAGACGGGATGGTG At1g35140 qPCR
SS296 PHI1_3´ ACTCCAGTACAAGCCGATCC
SS297 NHL10_5´ TTCCTGTCCGTAACCCAAAC At2g35980 qPCR
SS298 NHL10_3´ CCCTCGTAGTAGGCATGAGC
SS352 CaEF1a-2_5’ CCCTCAGACAAGCCACTCC CA11g17910 qPCR
SS353 CaEF1a-2_3’ ACACGACCAACAGGCACAG
SS354 CaPO2_5’ AGAAACGGATCTCCCTGGTC CA05g05190 qPCR
SS355 CaPO2_3’ AAGCAACCATGTCCCTTGTG
SUE164 CaPR1b1/SENU4_FP GGCATCTCGAGCACAAAACT CA09g03220 qPCR
SUE165 CaPR1b1/SENU4_RP GCGCCAGACCACTTGAGTAT
SS423 CaCwInv_5' GGTGGTGGAAAGTTTTGGTG CA10g16710 qPCR
SS424 CaCwInv_3' GTGATTGCCTCCTTAGCATTG
HP181 AtAct1-5 AGGGAAACGAAGACAGCAAG At2g37620 RT-PCR, Aktin-Kontrolle
HP182 AtAct1-3’ GCTCGCTAATCCTACCTTTGG
HP30 cDNA xopB FP GCATTTGGCCCAAGCGCTT AY036109 RT-PCR, xopB-Expression
HP31 cDNA xopB RP GGGTGGAATGCCAGAGGC
HP83 Ubifor tabak ATGCAGATYTTTGTGAAGAC RT-PCR, Ubiquitin-Kontrolle
HP84 Ubirev tabak ACCACCACGRAGACGGAG
HP99 GSP1 Genome Walker CGATTTCGGAACCACCATCAAACAGGA Genome Walker primer
für A. thaliana EtOH::xopB Linien HP100 GSP2 Genome Walker CAATCAGCTGTTGCCCGTCTCACTGGT
HP105 YUC5 FP CTAAGCAACTGAAATGCATC AT5G43890 Insertionslocus EtOH::xopB Linie 12
HP106 YUC5 RP CTACTGATTCTTGCATGGCTG
HP107 igenomic- 10-10-11 FP CGATCTATACTAACATTTGCCT
Insertionslocus EtOH::xopB Linie 10 HP108 igenomic-
10-10-11 RP GAACTAATATATGTGAGACAAGT
HP115 LBb1.3 ATTTTGCCGATTTCGGAAC “left border” Primer
Sequenzierungen wurden von der Firma GATC Biotech AG (Konstanz) durchgeführt.
Gereinigte oder subklonierte PCR-Fragmente wurden nach den Vorgaben der Firma
GATC Biotech AG für den Versand vorbereitet.
Material und Methoden
29
3.1.5. Antikörper Tabelle 3: Im Rahmen dieser Arbeit verwendete Antikörper für Western-Blot Analysen
Primär-Antikörper Verdünnung Hersteller
anti-GFP-Antikörper (Maus, monoklonal) 1:1000 Roche, Mannheim
anti-c-myc-Meerrettichperoxidase-Antikörper (Maus,
monoklonal) 1:3000 Roche, Mannheim
anti-HA-Meerrettichperoxidase-Antikörper (Maus, monoklanal) 1:500 – 1:1000 Roche, Mannheim
anti-XopB-Antikörper (Kanninchen, polyklonal) 1:1000 diese Arbeit
anti-H+-ATPase-Antikörper aus Kaninchen (polyklonal) 1:1000 Agrisera, Vännäs, Schweden
anti-NtSPP2-Antikörper aus Kaninchen (polyklonal) 1:1000 (Chen et al., 2005)
anti-BiP2-Antikörper aus Kaninchen (polyklonal) 1:2000 Agrisera, Vännäs, Schweden
anti-Arf1-Antikörper aus Kanninchen (polyklonal) 1:1000 Agrisera, Vännäs, Schweden
Sekundär-Antikörper
Kanninchen anti-Maus-Meerrettichperoxidase-Antikörper (IgG,
polyklonal) 1:10000
Thermo Scientific, Waltham,
USA
Ziege anti-Kanninchen-Meerrettichperoxidase-Antikörper (IgG,
polyklonal) 1:20000
Thermo Fisher Scientific,
Waltham, USA
3.1.6. Bakterienstämme
Folgende Stämme von Escherichia coli (E. coli), Agrobacterium tumefaciens (A.
tumefaciens), Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv) und Pseudomonas
syringae pv. tomato (Pst) wurden im Rahmen dieser Arbeit für Klonierungen,
Proteinüberexpressionen oder Infektionen von Pflanzen verwendet.
Tabelle 4: Verwendete Bakterienstämme
Bakterienstamm Genotyp Hersteller/ Referenz
E. coli XL1-Blue recA1 endA1 gyr96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F´proAB lacIq
ZΔM15 Tn10 (TetR)] (Bullock et al., 1987)
E. coli TOP10 F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80lacZΔM15 Δ lacX74 recA1
araD139 Δ(araleu)7697 galU galK rpsL (StrR) endA1 nupG Invitrogen (Karlsruhe)
E. coli M15
pREP4 F- Φ80ΔlacM15 thi lac- mtl- recA+ KmR Qiagen, Hilden
E. coli KC8 hsdR leuB600 trpC9830 pyrF::Tn5 hisB463 lac∆X74 strA galUK Clontech, Mountain View, USA
A. tumefaciens
C58C1 RifR, pGV2260 (AmpR) als Helferplasmid (Deblaere et al., 1985)
Xcv 85-10 Wildtyp, RifR (Bonas et al., 1989)
Xcv 85-10
pBBR (LV) Wildtyp mit pBBR1MCS-5 Leervektor, RifR, GmR (Sonnewald et al., 2012)
Material und Methoden
30
Xcv 85-10 ΔxopB xopB-Deletionsmutante, RifR (Noël et al., 2001)
Xcv 85-10 ΔxopB
pBBR (LV) xopB-Deletionsmutante mit pBBR1MCS-5 Leervektor, RifR, GmR (Sonnewald et al., 2012)
Xcv 85-10 ΔxopB
pBBR:xopB(+)
xopB-Komplementante mit genomischen 2.6 kb Fragment mit
xopB-ORF unter lacZ- und xopB-Promotor, RifR, GmR (Sonnewald et al., 2012)
Xcv 85-10 ΔxopB
pBBR:xopB(-)
xopB Komplementante mit genomischen 2.6 kb Fragment mit
xopB-ORF unter xopB-Promotor, RifR, GmR (Sonnewald et al., 2012)
Xcv 85-10
ΔhrpB1 hrpB1-Deletionsmutante, RifR (Rossier et al., 2000)
Xcv 85-10
ΔhrpB1
pBBR (LV)
hrpB1-Deletionsmutante mit pBBR1MCS-5 Leervektor, RifR, GmR (Sonnewald et al., 2012)
Pst DC3000 Wildtyp, virulent, RifR M. B. Mudgett, Standford
University, USA
Pst DC3000
pVSP61 (LV) virulenter Pst DC3000 mit pVSP61 Leervektor, RifR, KmR (Ritter and Dangl, 1996)
Pst DC3000
pVSP61:avrRpm1 avirulenter Pst DC3000 mit pVSP61:avrRpm1, RifR, KmR (Ritter and Dangl, 1996)
Pst ΔTLR1 hrcC-Deletionsmutante, T3SS-defizient, RifR (Boch et al., 2002)
3.1.7. Hefestämme
Folgende Hefestämme (Saccharomyces cerevisiae) wurden im Rahmen dieser Arbeit
verwendet:
Tabelle 5: Verwendete Hefestämme
Hefestamm Genotyp Hersteller/ Referenz
Y187 MATα, ura3-52, his3-200, ade2-101, trp1-901, leu2-3, 112, gal4∆, met−,
gal80∆, URA::GAL1UAS-GAL1TATA-lacZ, MEL1 (Harper et al., 1993)
AH109
MATa, trp1-901, leu2-3, 112, ura3-52, his3-200, gal4∆, gal80∆,
LYS2::GAL1UAS-GAL1TATA-HIS3, GAL2UAS-GAL2TATA-ADE2,
URA3::MEL1UAS-MEL1TATA-lacZ, MEL1
(James et al., 1996)
Y190
MATa, ura3-52, his3-200, ade2-101, lys2-801, trp1-901, leu2-3, 112,
gal4∆, gal80∆, cyhr 2, LYS2::GAL1UAS-HIS3TATA-HIS3, URA3::GAL1UAS -
GAL1TATA-lacZ
(Flick and Johnston, 1990;
Harper et al., 1993)
3.1.8. Pflanzen
Im Rahmen dieser Arbeit wurde mit Arabidopsis thaliana (A. thaliana, Ackerschmalwand),
Capsicum annuum (C. annuum, Paprika), Solanum lycopersicum (S. lycopersicum, Tomate),
Material und Methoden
31
Nicotiana benthamiana (N. benthamiana, Tabak) und Nicotiana tabacum (N. tabacum,
Tabak) gearbeitet.
Tabelle 6: Verwendete Pflanzenarten, -linien und -mutanten
Bezeichnung Beschreibung Referenz
A. thaliana Col-0 Wildtyp AG S. Sonnewald
A. thaliana EtOH::xopB
Linie 10-10-11-2
Ethanol-induzierbare Expression von xopB,
homozygote T4-Generation, KmR
AG S. Sonnewald, diese
Arbeit
A. thaliana EtOH::xopB
Linie 12-4-7
Ethanol-induzierbare Expression von xopB,
homozygote T3-Generation, KmR
AG S. Sonnewald, diese
Arbeit
A. thaliana fls2 T-DNA Insertionsmutante von FLS2, flg22-insensitiv SAIL_691_C04
C. annuum ECW
(Early Cal Wonder) Wildtyp, suszeptibel für Xcv 85-10 AG S. Sonnewald
S. lycopersicum VF36 Wildtyp M. B. Mudgett, Stanford
University, Stanford, USA
N. benthamiana Wildtyp AG S. Sonnewald
N. benthamiana
35S::secGFP konstitutive Expression von secGFP, KmR (Bartetzko et al., 2009)
N. tabacum (SNN) Wildtyp AG S. Sonnewald
N. tabacum ME1-10 PFBPase::GUS, KmR (Sonnewald et al., 2012)
N. tabacum EtOH::xopB
Linie 22-2 Ethanol-induzierbare Expression von xopB, KmR (Sonnewald et al., 2012)
N. tabacum EtOH::xopB
Linie 71-1 Ethanol-induzierbare Expression von xopB, KmR (Sonnewald et al., 2012)
3.2. Arbeiten mit Pflanzen
3.2.1. Anzucht von Pflanzen
A. thaliana-Pflanzen wurden entweder direkt auf Erde oder nach dem Gas-Sterilisieren
auf MS-Platten mit 2% Saccharose (Murashige and Skoog, 1962) ausgebracht und
anschließend 48 h bei 4°C im Dunkeln vernalisiert. Für die Gassterilisation wurden 50 ml
einer 12%igen NaOCl-Lösung in einem Exsikkator vorgelegt und für die
Chlorgasdarstellung mit 2 ml 32%iger HCl angesäuert und 16 h inkubiert.
Die Anzucht erfolgte anschließend im Kurztag mit 8 h Licht bei 22°C und 16 h Dunkelheit
bei 20 °C in Phytotrons (CLF, Wertingen). Nach dem Pikieren wurden die Pflanzen
Material und Methoden
32
weiter im Kurztag in GroBanks (Plant Master PGR 3045, CLF, Wertingen) mit 100 µmol
quanta m-2 s-1 Licht und 60% relative Luftfeuchtigkeit kultiviert.
Paprikapflanzen (C. annuum ECW) und Tabakpflanzen (N. benthamiana und N.
tabacum) wurden im Gewächshaus tags bei 26°C bzw. 25°C mit 16 h Zusatzbeleuchtung
von 150-200 µmol quanta m-2 s-1 mit 60% relative Luftfeuchtigkeit und nachts bei 22°C
kultiviert. Transgene N. tabacum-Linien wurden auf Kanamycin-haltigem MS-Medium
(Tabak) ausgebracht, vernalisiert und anschließend in einem Lichtraum unter einem 16
h Licht/ 8 h Dunkelrhythmus bei 21°C, 50% Luftfeuchtigkeit sowie einer Belichtung von
ca. 150 µmol quanta m-2 s-1 zum Keimen gebracht.
3.2.2. Infektionen von Pflanzen mit Bakterien
Für A. thaliana-Infektionen wurden Pst-Stämme aus sterilen DMSO-Kulturen auf NYG-
Agar-Platten mit entsprechenden Antibiotika ausgestrichen und 2 Tage bei 28°C
kultiviert. Pst wurde weiter in üN-Vorkulturen und anschließend in üN-Hauptkulturen
kultiviert. Die Bakterien wurden durch Zentrifugation bei 4000 Upm für 15 min bei 4°C
pelletiert, mit sterilem 10 mM MgCl2 gewaschen, erneut zentrifugiert und in sterilem 10
mM MgCl2 resuspendiert. Anschließend wurde die gewünschte optische Dichte bei 600
nm (oD600) eingestellt. Diese Suspension wurde von der Blattunterseite her mit einer
nadellosen Einwegspritze infiltriert. Als Kontrolle wurde 10 mM MgCl2 infiltriert. Eine
oD600 von 0,2 entspricht bei Pst 1*108 cfu/ml.
Infektionen von C. annuum oder N. tabacum mit Xcv wurden wie in Sonnewald et al.
(2012) beschrieben durchgeführt. Eine oD600 von 1,0 entspricht bei Xcv 1*109 cfu/ml.
3.2.3. Transiente Transformation von Pflanzen
Agrobakterien (A. tumefaciens C58C1), transformiert mit entsprechenden binären
Konstrukten, wurden in YEB-Medium, versetzt mit 10 mM MES pH 5,6 und 20 µM
Acetosyringon (gelöst in DMSO), mit geeigneten Antibiotika kultiviert. Die Bakterien
wurden wie für Pst beschrieben (siehe 3.2.2) pelletiert und sofern nicht anders
angegeben mit Infiltrationspuffer (10 mM MgCl2, 10 mM MES pH 5,6 und 100 µM
Acetosyringon) auf eine oD600 0,1 eingestellt. N. benthamiana und S. lycopersicum VF36
wurden mit der Agrobakterien-Suspension von der Blattunterseite her im Gewächshaus
infiltriert.
Material und Methoden
33
3.2.4. Stabile Transformation von Pflanzen
A. thaliana Col-0 Wildtyp wurde nach dem floral dipping-Verfahren transformiert (Clough
and Bent, 1998). T1-Samen wurden gassterilisiert und auf MS-Platten mit
entsprechendem Antibiotikum selektiert.
3.3. Mikrobiologische Methoden Im Rahmen dieser Arbeit wurden die nachfolgenden mikrobiologischen Methoden
angewendet.
3.3.1. Anzucht von Bakterien
E. coli XL1-Blue, TOP10 und M15 wurden in LB-Medium unter Schütteln (200 Upm) bzw.
auf LB-Agar-Platten bei 37°C kultiviert.
E. coli KC8-Zellen wurden für die Transformation mit Hefe-DNA aus Hefe-Zwei-Hybrid-
cDNA-Durchmusterungen verwendet und für die Separierung von Köder- und Beute-
Plasmiden auf M9-Medium über die Auxotrophiemarker TRP1 oder LEU2 selektiert.
P. syringae und X. campestris wurden in NYG-Medium unter Schütteln (200 Upm) bzw.
auf NYG-Agar-Platten bei 28°C bzw. 30°C angezogen.
A. tumefaciens wurde in YEB-Medium unter Schütteln (200 Upm) bzw. auf YEB-Agar-
Platten bei 28°C angezogen.
3.3.2. Komplementation von Xcv-Deletionsmutanten
Für das Einbringen von Plasmiden in Xcv wurden triparentale Konjugationen
durchgeführt. Dazu wurden die drei Bakterienstämme E. coli XL1-Blue (Donor), ein Xcv-
Stamm (Rezipient) und E. coli K12 HB101 pRK 2013 (Helfer) benötigt. E. coli XL-1 Blue
wurde mit dem gewünschten pBBR1MCS-5-Plasmid transformiert. Der Rezipient wurde
2 Tage auf NYGRif-Platten und die E. coli-Stämme auf LB-Platten (versetzt mit Km und
Gm für Helfer bzw. Donor) üN bei 37 °C angezogen. Von jedem Stamm wurde ein 5 x 10
mm Rasen steril abgenommen und in jeweils 500 µl NYG-Medium ohne Antibiotika
resuspendiert. Die drei erzeugten Suspensionen wurden in folgendem Verhältnis
Material und Methoden
34
gemischt: 50 µl Rezipient, 10 µl Donor und 10 µl Helfer. Von dieser Mischung wurden 50
µl auf eine NYG-Platte ohne Antibiotikum getropft und der Tropfen steril getrocknet.
Nach 24 h bei 28°C wurde der entstandene Bakterienrasen abgenommen und in 500 µl
NYGRif, Gm-Medium resuspendiert. Die Bakterien wurden in einer Tischzentrifuge 30 s
pelletiert und in 100 µl NYGRif, Gm-Medium aufgenommen. Zweimal 50 µl wurden auf
NYGRif, Gm-Platten ausplattiert und 2 bis 3 Tage bei 28°C inkubiert. Einzelkolonien
wurden in 3 ml NYGRif, Gm-Medium üN bei 28°C kultiviert und am nächsten Tag in
frisches NYG-Medium überimpft und erneut üN kultiviert. Die Identität des Rezipienten
und das Vorhandensein des Plasmids wurden mittels Kolonie-PCR mit der
vorbehandelten Flüssigkultur (siehe 3.4.2) als Matrize überprüft.
3.3.3. Anzucht von Hefe
Die Hefestämme (Saccharomyces cerevisiae) Y187, AH109 und Y190 wurden auf
YPAD-Vollmedium oder SCAD-Selektionsmedium bei 30°C angezogen.
Für SCAD-Selektionsmedium wurde die entsprechende Aminosäure, die als
Auxotrophiemarker dienen sollte, weggelassen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde mit den
Auxotrophiemarkern TRP1, LEU2 und HIS3 gearbeitet.
3.4. Molekularbiologische Methoden
3.4.1. Molekularbiologische Standardmethoden
Standardmethoden wie PCR, Restriktionsverdau, Ligation und Agarosegel-
Elektrophorese wurden nach (Sambrook and Russell, 2001) durchgeführt.
Molekularbiologische Kits zur Aufreinigung von Plasmid-DNA und PCR-Fragmenten
wurden von der Firma Qiagen (Hilden) bezogen und nach Herstellerangaben verwendet.
GATEWAY-Klonierungen wurden mit dem pENTR/D-TOPO-Kit und dem LR-Clonase II-
Kit von Invitrogen (Karlsruhe) nach Herstellerangaben durchgeführt.
3.4.2. Kolonie-PCR für Xcv
Der zu überprüfende Xcv-Klon wurde in NYG-Flüssigmedium mit entsprechenden
Antibiotika üN angezogen. 500 µl Kultur wurden 8 min bei 8000 Upm in einer
Tischzentrifuge bei RT zentrifugiert und das Bakterienpellet in 200 µl sterilem 1 mM
MgCl2 resuspendiert. Diese Suspension wurde 8 min bei 95°C inkubiert und erneut wie
Material und Methoden
35
oben zentrifugiert. 1 bis 2 µl des Überstandes dienten als Matrize für eine PCR mit
genspezifischen Oligonukleotiden.
3.4.3. Transformation von Bakterien
Die Transformation von chemisch- oder elektrokompetenten E. coli-Zellen wurde nach
Standardmethoden durchgeführt (Sambrook and Russell, 2001).
Thermokompetente A. tumefaciens-Zellen wurden wie bei Höfgen und Willmitzer (1990)
transformiert.
3.4.4. Transformation von Hefe
Die Transformation von Hefe wurde wie bereits publiziert durchgeführt (Schiestl and
Gietz, 1989; Gietz et al., 1992).
3.4.5. Hefe-Zwei-Hybrid-cDNA-Durchmusterung
Für das Auffinden von potentiellen Interaktionspartnern wurde die kodierende Sequenz
des Köderproteins in den Vektor pGBT9 kloniert und in den Hefe-Stamm Y187
transformiert. Der transformierte Stamm wurde anschließend in 5 ml SCAD-trp-Medium
üN bei 30°C unter Schütteln inkubiert. 150 ml SCAD-trp-Medium wurden mit 1 ml
Vorkultur angeimpft und erneut üN inkubiert. Beim erreichen einer oD600 von 0,5 bis 1,0
wurden 100 oD-Einheiten der Hauptkultur für 5 min bei 4000 Upm pelletiert. AH109-
Hefe-Zellen, die eine A. thaliana- (Fan et al., 1997) oder N. tacacum-cDNA-Bibliothek
(Börnke, 2005) enthielten, wurden aufgetaut und in 20 ml YPAD überführt. Nach der
Inkubation der AH109-Zellen in einem 30°C-Wasserbad wurden diese auf das Y187-
Hefepellet gegeben und resuspendiert. Die gemischten Hefe-Stämme wurden wie oben
pelletiert, der Überstand bis auf einen geringen Rest verworfen und in diesem Rest
wieder resuspendiert. Die Suspension wurde auf 5 YPAD-Platten verteilt und für 5 h bei
30°C inkubiert. Die Zellen wurden anschließend mit je 2 mal 3 ml YPAD-Flüssigmedium
von den Platten gespült und vereinigt. Nach dem Pelletieren wurden die Zellen in 15 ml
sterilem Wasser aufgenommen. Je 1 ml Suspension wurde auf insgesamt 7 große
SCAD-leu-trp-his + 4 mM 3-Aminotriazol (3-AT) plattiert. 3-AT ist ein kompetitiver
Inhibitor des HIS3-Genproduktes und verhindert so das Wachstum falsch-positiver Klone
auf -his-Medium.
Material und Methoden
36
Die Paarungseffizienz wurde mittels serieller Verdünnungen bestimmt. Dazu wurden die
10-2 bis 10-4 Verdünnungsstufen auf SCAD-leu-trp Platten ausplattiert und bei 30°C
inkubiert. Die gewachsenen Einzelkolonien wurden gezählt und die Paarungseffizienz
berechnet.
Gewachsene Hefekolonien wurden von den großen SCAD-Platten auf kleine SCAD-leu-
trp-his-Platten (einmal mit und einmal ohne GeneScreen-Membran, NEN, Boston, USA)
überstrichen und bei 30°C inkubiert. Klone, die positives Wachstum auf SCAD-leu-trp-
his-Medium und nach dem LacZ-Test mit der GeneScreen-Membran eine Blaufärbung
zeigten, wurden für weitere Analysen verwendet. Für den LacZ-Test wurde Whatman-
Papier mit LacZ-Puffer [Z-Puffer (60 mM Na2HPO4, 40 mM NaH2PO4, 10 mM KCl, 1 mM
MgSO4, pH 7,0) mit 0,064% X-Gal (w/v; gelöst DMSO) und 0,26% β-Mercaptoethanol
(v/v)] benetzt und in eine leere Petrischale gegeben. Die GeneScreen-Membran mit den
Hefe-Zellen wurde in fl. N2 durchgefroren, sofort auf das getränkte Whatman-Papier
gelegt und bei 30°C inkubiert. Hefe-Klone, die nach 8 h bis 24 h eine Blaufärbung
zeigten wurden von der SCAD-leu-trp-his-Rückstellplatte für die Extraktion der Beute-
Plasmide angeimpft.
3.4.6. Direkte Interaktionsstudien in Hefe
Isolierte Beute-Plasmide aus cDNA-Durchmusterungen, klonierte bekannte
Interaktionspartner oder einzelne Genabschnitte von Interesse wurden in direkten
Interaktionsstudien in Hefe getestet. Dazu wurde der Hefe-Stamm Y190 mit den
entsprechenden pGBT9- und pGAD424-Klonen kotransformiert und auf SCAD-leu-trp-
Medium für 2 Tage bei 30°C inkubiert. Zur Zellvermehrung wurden mehrere Klone
einzeln auf frisches Medium überstrichen und erneut üN inkubiert. Danach wurden je
drei Einzelkolonieausstriche in sterilem Wasser resuspendiert und mit einer sterilen
Stempelvorrichtung auf eine SCAD-leu-trp-Platte und zwei SCAD-leu-trp-his-Platten +
25 mM (!) 3-AT (einmal mit und einmal ohne GeneScreen-Membran) transferiert. Nach 2
bis 3 Tagen bei 30°C wurde das Hefewachstum dokumentiert und der LacZ-Test (siehe
3.4.5) durchgeführt. Wachstum auf SCAD-leu-trp-his-Platten und ein positiver LacZ-Test
zeigen eine Interaktion zwischen Beute- und Köderprotein an.
Material und Methoden
37
3.4.7. Isolierung von genomischer DNA aus Arabidopsis und Southern-Blot
Unter fl. N2 wurden etwa 5 g Blattmaterial gemörsert und mit 15 ml DNA-
Extraktionspuffer (500 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl pH 8.0, 50 mM EDTA, 10 mM β-
Mercaptoethanol) gemischt. Das Homogenisat wurde in ein 50 ml Reaktionsgefäß
überführt und 1 ml 20% SDS zugeben und gemischt. Nach einer Inkubation bei 65°C für
10 min, wurden 5 ml 5 M Kaliumacetat zugegeben, der Ansatz gemischt und 30 min auf
Eis inkubiert. Zelltrümmer wurden 30 min bei 4000 Upm und 4°C pelletiert und der
erhaltene Überstand durch Miracloth (Calbiochem) filtriert. Die genomische DNA wurde
durch Zugabe von 10 ml Isopropanol und einer Inkubation bei -20 °C für 20 min gefällt.
Die DNA wurde bei 10000 Upm und 4°C pelletiert und anschließend bei RT getrocknet.
Das Pellet wurde in 700 µl TE-50-Puffer (50 mM Tris-HCl pH 8.0 und 10 mM EDTA)
gelöst. Nach Zugabe von 75 µl 3 M Natriumacetat wurde für 15 min bei 13000 Upm
zentrifugiert. Der Überstand wurde mit 500 µl Isopropanol versetzt und 5 min bei RT
inkubiert. Die genomische DNA wurde durch 10 minütige Zentrifugation bei 13000 Upm
pelletiert und nach dem Trocknen bei RT in 200 µl TE-Puffer (10 mM Tris-HCl pH 8,0
und 1 mM EDTA) gelöst. Der Restriktionsverdau der genomischen DNA und das
Southern-Blot-Verfahren wurde nach (Boldt et al., 2001) durchgeführt.
3.4.8. Genome Walker-Verfahren
Für die Bestimmung des Insertionsortes der T-DNA des EtOH::xopB-Plasmids in den
Linien A. thaliana 10-10-11-2 (T4-Generation) und 12-4-7 (T3-Generation) wurde das
Genome Walker-Verfahren nach dem Protokoll des GenomeWalkerTM Universal Kit
(Clontech, Mountain View, USA) angewendet.
3.4.9. Isolierung von Gesamt-RNA aus Pflanzen und Northern-Blot
Gesamt-RNA aus Pflanzen wurde nach der Methode von (Logemann et al., 1987) isoliert
und die RNA-Konzentration und -Reinheit an einem ND-1000 Spectrophotometer
(NanoDrop Technologies) bestimmt. 20 – 30 µg RNA wurden nach einem
Denaturierungsschritt in einem 1,5%igen Formaldehyd-haltigen Agarosegel aufgetrennt
und durch Kapillartransfer üN auf eine Nylon-Membran (GeneScreen, NEN, Boston,
USA) übertragen. Nach Vernetzung der RNA mit der Membran mittels UV-Licht, wurde
die Membran zur Prähybridisierung 2 h in Church-Puffer bei 65 °C inkubiert (Church and
Gilbert, 1984). Für die Detektion der nachzuweisenden mRNA wurden entsprechende
DNA-Fragmente mit 40 µCi [α32P]dCTP mittels High Prime Mix (Roche, Mannheim) nach
Material und Methoden
38
Herstellerangaben radioaktiv markiert. Die Sonde wurde 2 min bei 95°C denaturiert, zur
Membran mit frischem Church-Puffer gegeben und üN bei 65°C inkubiert. Am nächsten
Tag wurde der Puffer verworfen und die Membran mit 6-fach SSC/ 0,1% SDS
gewaschen. Ggf. wurde auch SSC-Puffer höherer Stringenz verwendet. Die Membran
wurde anschließend eingeschweißt und mit einem Röntgenfilm bedeckt. Nach 2 bis 3
Tagen bei -80°C wurde der Film entwickelt.
3.4.10. DNAse-Verdau und cDNA-Synthese
2,5 bis 10 µg präparierte Gesamt-RNA wurde mit DNAse I (Fermentas, Thermo Fisher)
nach Herstellerangaben von genomischer DNA befreit. Die cDNA wurde mit der
RevertAidTM H Minus M-MuLV Reverse Transkriptase (Fermentas, Thermo Fisher) und
Oligo(dT)30 Oligonukleotiden nach Herstellerangaben synthetisiert.
3.4.11. Quantitative Echtzeit-PCR (qPCR)
Zur quantitativen Bestimmung von mRNA-Mengen wurde eine qPCR mit einem Mx3000
qPCR System (Agilent, Waldbronn) unter Verwendung des Brilliant II SYBR Green
QPCR Master Mix (Agilent) nach Herstellerangaben durchgeführt. Genspezifische
qPCR-Oligonukleotide wurden mit dem Mx3000P System auf Effizienz und Spezifität
getestet. Als Matrize diente hierfür eine cDNA-Verdünnungsreihe (1:5, 1:25, 1:125 und
1:625) aus vereinigten cDNA-Proben (z.B. mock+ flg22-Behandlung). Folgender
Temperaturzyklus wurde verwendet: 10 min 95°C, 40 Zyklen: 15 sec 95°C, 30 sec 60°C
und 15 sec 72°C, Gradient: 55°C bis 95°C für das Erstellen der Schmelzkurve des PCR-
Produktes. Die relative Genexpression wurde mit der Analysesoftware MxPro v4.10 von
Agilent oder mit exportierten Ct-Werten in Excel nach folgender Formel verwendet:
relative Expression = 2ΔCt mit ΔCt = Ctnorm - CtGOI. Die Genexpressionen wurden für
Arabidopsis auf Tubulin 4 und für Paprika auf CaEF1α normalisiert.
3.4.12. Ortsgerichtete Mutagenese
Zur Erzeugung von Punktmutationen wurde nach dem Protokoll des QuikChange II XL
Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent, Waldbronn) gearbeitet. Es wurden hierfür HPLC-
gereinigte Oligonukleotide bestellt.
Material und Methoden
39
3.5. Biochemische Methoden
3.5.1. Expression und Reinigung von 6xHIS-XopB aus E. coli für die
Antikörperproduktion
Die Expression und Reinigung von 6xHis-XopB ist in Sonnewald et al. (2012)
beschrieben. Für die Antikörperproduktion wurde das Antigen (1,43 mg 6xHis-XopB in
Elutionspuffer (25 mM Tris-HCl, 192 mM Glycin und 0,1% SDS, pH 8,2)) an die Firma
Biogenes (Berlin) geschickt. Dort erfolgte eine Immunisierung zweier Kaninchen nach
dem „Komplett und Einfach“-Protokoll von Biogenes. Das Serum der zweiten Blutung
wurde für die in Sonnewald et al. (2012) beschriebene Affinitätsaufreinigung XopB-
spezifischer Antikörper verwendet.
3.5.2. Koimmunpräzipitation mittels GFP-Trap
Die Ko-IP mittels magnetischer GFP-Trap beads (GFP-Trap_M, Chromotek GmbH, Planegg
Martinsried) wurde wie in Schwessinger et al. (2011) beschrieben mit leichten Modifikationen
durchgeführt.
Von transient transformierten N. benthamiana-Pflanzen wurde 1 g Blattmaterial in fl. N2
gemörsert. Ca. 30 µl Blattmaterial wurden mit 10 µl 4-fach Lämmli-Puffer (Laemmli, 1970)
vermengt (RE: Rohextrakt). Das gefrorene Blattpulver wurde anschließend mit 2 ml
Extraktionspuffer [50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 10% (v/v) Glycerin, 10 mM DTT,
10 mM EDTA, 1-fach Complete Proteaseinhibitor, EDTA-frei, 1% NP40] und eine
Spatelspitze PVPP (Polyvinylpolypyrrolidon) versetzt und das Homogenisat anschließend für
15 min bei 12000 Upm und 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und
dessen Proteinkonzentration nach Bradford auf 2 mg ml-1 eingestellt (Bradford, 1976). Von
diesem Extrakt wurde 30 µl als „Input“-Probe entnommen und mit 10 µl 4-fach Lämmli-
Puffer versetzt. Dann wurden 1,5 ml Extrakt auf 20 µl nach Herstellerangaben vorbereitete
GFP-Trap beads gegeben und für 4 Stunden bei 4 °C bei 10 Upm auf einem Überkopfroller
inkubiert. Anschließend wurden vom Überstand 30 µl zu 10 µl 4-fach Lämmli-Puffer
gegeben („non-bound“-Probe), der restliche Überstand wurde verworfen und die Matrix
fünfmal mit je 100 µl Waschpuffer (50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,6) mit 0,5% NP 40
gewaschen. Die gebundenen Proteine wurden mit 40 µl 2-fach Lämmli-Puffer für 10 min bei
70 °C eluiert und zusammen mit den zurückgestellten Proben mittels Western-Blot
analysiert.
Material und Methoden
40
3.5.3. Western-Blot Analyse
Blattscheiben wurden mit Hilfe eines vorgekühlten Rotor-Stator-Homogenisators
(Heidolph, Schwabach) pulverisiert. Für Gesamtprotein-Extraktionen wurden pro 0.5 cm2
50 µl 2-fach Lämmli-Puffer (Laemmli, 1970) zugegeben und 10 min bei 95°C inkubiert.
Ein 10 – 20 µl Aliquot wurde für die Elektrophorese mit 12,5%igen (v/v) SDS-
Polyacrylamidgelen eingesetzt. Die Proteine wurden mit Hilfe einer Fastblot B44
Apparatur (Biometra GmbH, Göttingen) auf eine Nitrozellulose-Membran (Porablot,
Macherey-Nagel, Düren) übertragen. Nach dem Transfer wurde die Membran kurz in
TBST (20 mM Tris, 500 mM NaCl und 0,1% Tween-20) gewaschen und anschließend in
TBST/ 5% Magermilch (w/v) für 1 h bei RT unter Schütteln blockiert. Die Membran
wurde mit Primär-Antikörpern für mind. 1 h bei RT inkubiert. Nach dreimaligem Waschen
mit TBST wurde ein entsprechender Meerrettichperoxidase-gekoppelter Sekundär-
Antiköper für 1 h bei RT eingesetzt. Nach erneutem dreimaligem Waschen wurde die
ECL-Reaktion (Thermo Scientific, Bonn) nach Herstellerangaben durchgeführt und
spezifische Signale mittels Röntgenfilmen detektiert. Bei Meerrettichperoxidase-
gekoppelten Primär-Antikörpern entfiel die Inkubation mit dem Sekundär-Antikörper.
3.5.4. Western-Blot Stripping
Für das Entfernen von Antikörpern wurde die Nitrozellulose-Membran (6 x 9 cm) in 25 ml
50°C warmen 2x stacking-Puffer (25 mM Tris-HCl pH 6,8, 2% SDS) für 5 min inkubiert.
Nach Zugabe von 253 µl β-Mercaptoethanol wurde die Membran für weitere 15 min
geschüttelt. Die Membran wurde mind. dreimal für jeweils 5 min mit mQ-Wasser
gewaschen. Die Membran konnte dann erneut blockiert und mit neuen Antikörpern
inkubiert werden.
3.5.5. Subzelluläre Fraktionierungen
Um die subzelluläre Lokalisierung von Proteinen zu bestimmen wurden
Gesamtproteinextrakte in lösliche und mikrosomale Fraktionen getrennt. 1 g
Blattmaterial wurde in fl. N2 schockgefroren und im Mörser pulverisiert. Nach Zugabe
von eiskaltem Puffer (20 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 1 mM
DDT, 1-fach Roche Complete Protease-Inhibitor, EDTA-frei) wurde die Suspension bei
4000 Upm für 10 min bei 4°C zentrifugiert. Vom Überstand (Gesamtproteinextrakt oder
LSS: low speed supernatant) wurden 200 µl entnommen und für die Western Blot-
Analyse mit 67 µl 4-fach Lämmli-Puffer versetzt. Der LSS wurde anschließend bei
Material und Methoden
41
100000 g für 1 h bei 4 °C zentrifugiert. Vom Überstand (lösliche Fraktion oder USS: ultra
speed supernatant) wurden wieder 200 µl entnommen und mit 67 µl 4-fach Lämmli-
Puffer versetzt. Das Pellet (Mikrosomale Fraktion) wurde in 500 µl 4-fach Lämmli-Puffer
resuspendiert. Alle Proben wurden anschließend einer Western Blot-Analyse
unterzogen. Als Kontrollen für die Trennung der Fraktionen dienten die Antikörper anti-
NtSPP2 (lösliche Fraktion) und anti-H+-ATPase (Membranfraktion).
Für die Trennung der mikrosomalen Fraktion in Plasmamembran- und
Endomembranfraktionen wurde eine Zwei-Phasen-Trennung nach Larsson et al. (1994)
durchgeführt. Als Kontrollen dienten hierbei die Antikörper anti-H+-ATPase
(Membranfraktion), anti-Arf1 (Golgi), anti-BiP2 (Endoplasmatisches Retikulum) und anti-
V-ATPase (Vakuole).
3.5.6. Isolierung von Proteinen aus apoplastischer Flüssigkeit
Zur Extraktion der apoplastischen Flüssigkeit (AF) aus N. benthamiana-Blättern wurden
die Mittelrippen entfernt und die Blatthälften in Leitungswasser mit wenigen Tropfen
Triton X-100 gewaschen. Nach dem Trockentupfen wurden die Blatthälften mit einem
Kaliumphosphatpuffer (50 mM KPi, pH 7,0, 150 mM NaCl und 100 µg ml-1 Pefabloc)
Vakuum-infiltriert. Nach dem Trockentupfen der Blatthälften wurde mit einem Korkbohrer
(4 mm Ø) Blattmaterial für den Gesamtzellextrakt entnommen. Die Blatthälften wurden
dann mit der Schnittfläche nach unten in Alufolie eingerollt und in 50 ml
Reaktionsgefäße mit angeschnittener Spitze gegeben. Mit geeigneten
Zentrifugenbechern wurde die AF mit 1400 Upm bei 4°C für 8 min aus den Blatthälften
gewonnen.
Anschließend wurde zur AF 1/3-Volumen 100%ige Trichloressigsäure (TCA) gegeben
und auf Eis für 15 min inkubiert. Die gefällten Proteine wurden bei 14000 Upm bei 4 °C
für 15 min pelletiert und der Überstand verworfen. Das Pellet wurde mind. zweimal mit
jeweils 300 µl Aceton gewaschen und bei 14000 Upm bei 4 °C für 7 min zentrifugiert. Mit
angefeuchtetem pH-Papier wurde der pH-Wert des Aceton-Überstands überprüft und
ggf. ein weiteres Mal mit Aceton gewaschen. Die Aceton-Überstände wurden verworfen
und die Proteinpellets in der Speed-vac für 5 min getrocknet. Die Pellets wurden in 20 µl
2-fach Lämmli-Puffer aufgenommen und für die Western Blot-Analyse vorbereitet.
Material und Methoden
42
3.5.7. Bestimmung der Salizylsäure- und Camalexin-Gehalte von Pflanzen
Von infizierten Paprika- oder Arabidopsis-Pflanzen wurden jeweils zwei Blattscheiben (4
mm Ø) in ein 1.5 ml Eppendorf-Gefäß überführt, in fl. N2 schockgefroren und bis zur
Probenaufbereitung bei -80 °C gelagert. Die Extraktion und Analyse von freier SA,
glykosylierter SA und von Camalexin (nur bei Arabidopsis) wurde nach Engelsdorf et al.
2013 durchgeführt.
3.5.8. HRP-gekoppelter ROS-Nachweis
Blattscheiben (Korkbohrer, 2 mm Ø) von fünf Wochen alten Arabidopsis-Pflanzen
wurden in eine 96-Loch Mikrotiterplatte, in der pro Loch 200 µl 0,2%iger EtOH/ ddH2O
vorgelegt wurden, transferiert und bei 22°C üN im Dunkeln inkubiert. Die 0,2%ige EtOH-
Lösung wurde entfernt und durch 195 µl luminol assay solution (0,2 mM Luminol, 0,01
mg ml-1 Meerrettichperoxidase Typ VI und 5 µl 200 mM NaPi pH 8,0) ersetzt. Luminol
wurde als 1 mM Stammlösung angesetzt (1,77 mg Luminol in 1 ml 10 mM NaOH mit
Ultraschall gelöst und mit 9 ml ddH2O verdünnt). Die Meerrettichperoxidase wurde als 1
mg ml-1 Stammlösung in ddH2O angesetzt. Zur Hintergrundmessung wurde die Platte 5
min lang in einem Luminometer (Mithras LB 940, Berthold, Bad Wildbad) mit 1 sec
Integration pro Loch vermessen. Nach der raschen manuellen Zugabe von 1 µM flg22
(mit Hilfe einer multistepper-Pipette) wurde die Lumineszenz für 45 min mit 1 sec
Integration pro Loch gemessen. Für jeden Pflanzengenotyp wurde der Hintergrund
berechnet und von den Messwerten nach flg22-Zugabe abgezogen.
3.5.9. Messung der cytosolischen Calciumkonzentration
Apo-Aequorin, XopB und der silencing suppressor p19 wurden in N. benthamiana A.
tumefaciens-vermittelt transient überexprimiert. A. tumefaciens C58C1-Zellen wurden
dazu mit pART27:Aequorin, pBinAR:xopB, pBinAR Leervektor oder pBin:p19
transformiert. Transformierte Klone wurden wie in 3.2.3 vorbereitet und auf eine oD600
von 1,5 eingestellt. A. tumefaciens pART27:Aequorin, pBinAR:xopB und pBin:p19 sowie
pART27:Aequorin, pBinAR Leervektor und pBin:p19 wurden 1:1:1 gemischt und
infiltriert. Vierundzwanzig Stunden später wurden Blattschieben (2 mm Ø) mit einem
Korkbohrer entnommen und in eine 96-Loch Mikrotiterplatte mit 80 µl VE-Wasser/ 10 µM
Coelenterazin (Stammlösung: 1mM natives Coelenterazin in MeOH, Synchem Felsberg)
pro Loch transferiert und für 4 h bei 22°C im Dunkeln inkubiert. Für die Messung der
Material und Methoden
43
Hintergrundsignale wurde pro Bedingung eine Blattscheibe ohne Coelenterazin
inkubiert.
Die Lumineszenz wurde „Loch nach Loch“ mit einem Luminometer (Mithras LB 940,
Berthold, Bad Wildbad) gemessen. Nach 3 min Messung mit einer Integrationszeit von
10 sec wurden 20 µl einer 5-fach konzentrierten flg22-Lösung (f.c. 1 µM) automatisch
injiziert und weitere 30 min gemessen. Zur Normalisierung wurde verbliebenes Aequorin
mit einer automatischen Injektion von 0,5 Volumen 2 M CaCl2/ 50% EtOH „entladen“ und
7 min gemessen. Die relative Lumineszenz wurde berechnet und nach Rentel et al.
(2004a) in zytosolische Calciumkonzentrationen umgerechnet.
3.5.10. Bestimmung der cw-Inv Aktivität
Blattscheiben (2 mal 0,5 cm2) wurden in fl. N2 schockgefroren und mit einem Rotor-
Stator-Homogenisator (Heidolph, Schwabach) pulverisiert. Nach Zugabe von eiskaltem
Enzymextraktionspuffer (50 mM Tris-HCl, pH 6,8, 5 mM MgCl2, 5 mM DTT, 1 mM EDTA,
1 mM EGTA, 15% (v/v) Glycerin und 0,1 mM Pefabloc) wurde das Homogenisat bei 4°C
und 14000 Upm zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet zweimal
mit Waschpuffer (5 mM Tris-HCl, pH 7,0) gewaschen, zentrifugiert und in 50 mM
Natriumacetat-Puffer, pH 5,2 in Anwesenheit von 0,1 M Saccharose für genau 90 min
bei 37°C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 1 M Tris-HCl, pH 8,0 und
sofortiger Inkubation bei 95°C für 5 min abgestoppt. Die Zellwandfragmente wurden
durch Zentrifugieren pelletiert und die Menge freigewordener Glukose im Überstand
nach (Hajirezaei, 2000) bestimmt.
3.6. Histologische Färbungen und Mikroskopie
3.6.1. Anilinblau-Färbung von Kallose
Ganze behandelte Arabidopsis-Blätter wurden in 96%igem EtOH üN entfärbt und die
Kallose wie in Guo et al. (2009) beschrieben mit Anilinblau angefärbt. Nach dem Färben
wurden die Blätter mit der Blattunterseite nach oben auf einen Objektträger gelegt und
mit 40%igem Glycerin überschichtet. Kallose-Einlagerungen wurden mit einem Leica
DMR Epifluoreszenzmikroskop (Anregung: UV-Lampe; Emmission: DAPI-Filter)
dokumentiert. Dazu wurden pro Probe 6 zufällig ausgewählte Bereiche einer Blattes
mikroskopiert und die Kallose-Einlagerungen pro mm2 bestimmt.
Material und Methoden
44
3.6.2. Nachweis von ROS mittels DAB-Färbung
Blattscheiben (4 cm2) wurden von infizierten Paprika-Pflanzen entnommen und in eine
Lösung aus 1 mg ml-1 3,3´-Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid (DAB, Aplichem, A0596)
pH 3.8, mit 1 M NaOH eingestellt, gegeben. Nach einer Inkubation über 18 h im Dunkeln
wurde die DAB-Lösung durch 96%igen EtOH ersetzt und die Blattscheiben bis zur
vollständigen Entfärbung bei 80°C gekocht. Die entfärbten Blattscheiben wurden mit
40%igem Glycerin auf Objektträgern überschichtet und mit einem Leica DMR
Epifluoreszenzmikroskop im Weitfeld analysiert.
Die Quantifizierung des braunen DAB-Niederschlages wurde nach Rodríguez-Herva et
al. (2012) durchgeführt.
3.6.3. Konfokale laser-scanning Mikroskopie
Nach transienter Expression von fluoreszierenden Proteinen (siehe 3.2.3) wurde zu den
angegebenen Zeitpunkten mit einem Skalpell etwa 3 x 10 mm große Streifen aus den
transformierten Blättern entnommen und mit der Blattunterseite nach oben auf einen mit
doppelseitigem Tesa-Film präpariertem Objektträger gelegt. Anschließend wurde das
Präparat mit Leitungswasser überschichtet und mit einem Deckgläschen abgedeckt.
Das Präparat wurde an einem konfokalem laser scanning Mikroskop (KLSM; Leica TCS
SP5 II von Leica Microsystems, Wetzlar) analysiert. Die nachfolgenden fluoreszierende
Proteine oder Farbstoffe wurden verwendet. Wenn nicht anders angegeben wurden die
in Klammern angegebenen Anreguns- und Emissionswellenlängen in nm verwendet:
eGFP und mGFP4 (488/496-539), VENUS (514/527-561), tagRFP, mRFP, mCherry und
MitoTracker Orange (Invitrogen) (561/571-631), FM4-64-FX (561/720-760) und
Chlorophyll (488/640-740). Ein 65 mW Argonlaser (Voreinstellung: 20% Leistung) wurde
für die Wellenlängen 488 und 514 nm und ein 20 mW DPSS-Laser für die Wellenlänge
561 nm eingesetzt. Für Kolokalisierungsstudien mit eGFP und mCherry, tagRFP oder
mRFP wurden die Farbkanäle sequenziell aufgenommen. Für xyt-Aufnahmen wurde der
fast resonant scanner mit 8000 Hz verwendet. Die Datensätze wurden mit der Leica
Software LAS-AF Lite (Version 2.7.0.9329) analysiert und als .tiff-Datei exportiert. Die
Aufnahmen wurden anschließend mit Adobe Photoshop CS5 bearbeitet und mit dem
Open-Source-Vektorgraphikprogramm Inkscape (https://inkscape.org/de/) arrangiert.
Ergebnisse
45
4. Ergebnisse Um den Typ-III-Effektor XopB aus Xcv funktionell zu charakterisieren, wurden im Rahmen
dieser Arbeit biochemische und molekularbiologische Aspekte der Wirt-Pathogen-Interaktion
untersucht. Zunächst wurde der in der AG Sophia Sonnewald gefundenen Einfluss von XopB
auf die Zellwand-gebundene Invertase (cw-Inv) in verschiedenen Wirt-Pathogen-Systemen
bestätigt. Um neben dem Einfluss auf die cw-Inv weitere XopB-abhängige Veränderungen
der pflanzlichen Abwehr untersuchen zu können, wurde mit transgenen Pflanzen des
Modellorganismus Arabidopsis thaliana gearbeitet, die das Effektorgen xopB unter einem
induzierbaren Promotor tragen. Um schließlich den molekularen Wirkmechanismus von
XopB genauer verstehen zu können, wurde in Hefe-Zwei-Hybrid-Durchmusterungen nach
möglichen pflanzlichen Zielproteinen von XopB gesucht. Mit dem gefunden Kandidaten
wurden subzelluläre Lokalisierungsstudien durchgeführt. Abschließend konnten einige neu
entdeckte, XopB-abhängige Einflüsse auf die Immunantwort von A. thaliana, wie
beispielsweise die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS), auf das eigentliche Wirt-
Pathogen-System Xanthomonas campestris pv. vesicatoria – Capsicum annuum (im
Weiteren Paprika-Xanthomonas) übertragen werden. Darüber hinaus konnte in der Paprika-
Xanthomonas-Interaktion ein Modell entwickelt werden, auf welche Weise XopB die cw-Inv
supprimiert.
4.1. Einfluss von XopB auf die Zellwand-gebundene Invertase (cw-Inv) Die cw-Inv hydrolysiert in sink-Geweben Saccharose in Glukose und Fruktose und ist damit
an der Versorgung dieser Gewebe mit Kohlenhydraten beteiligt. In source-Geweben ist
hingegen nur eine sehr geringe Aktivität der cw-Inv nachweisbar. Es konnte jedoch gezeigt
werden, dass die Aktivität dieses Enzyms in source-Blättern nach Infektion mit Xcv anstieg
(Biemelt & Sonnewald, 2006). Interessanterweise stieg die Aktivität der cw-Inv um ein
vielfaches stärker an, wenn mit einer TTSS-defizienten Xcv-Mutante infiziert wurde (Biemelt
& Sonnewald, 2006). Daher wurde postuliert, dass Typ-III-Effektoren daran beteiligt sind, die
Aktivität der cw-Inv zu supprimieren, um möglicherweise Zucker-vermittelte
Abwehrreaktionen der Pflanze zu unterbinden. Daraus resultierte die Frage, welche der ca.
30 Effektoren an der Regulation der cw-Inv beteiligt sind. In einer Durchmusterung wurden
Paprikapflanzen mit 18 verschiedenen Xcv-Deletionsmutanten infiziert, in denen einzelne
Effektoren gezielt ausgeschaltet wurden, und die Veränderungen der cw-Inv-Aktivität
gemessen. Dabei zeigte sich, dass XopB den größten Anteil an der cw-Inv-Suppression
Ergebnisse
46
hatte und die xopB-Deletionsmutante einen beinahe so starken Effekt erzielte wie die TTSS-
defiziente Xcv-Mutante (ΔhrpB1), die keine Typ-III-Effektoren translozieren kann (Sonnewald
et al. 2012). Weiterhin konnte in dieser Studie gezeigt werden, dass auch die mRNA-Menge
des cw-Inv Gens nach Infektion mit Xcv ΔxopB oder Xcv ΔhrpB1 2 Tage bzw. 1 Tag nach
Infektion stark anstieg. Parallel dazu stieg in beiden Fällen die mRNA-Menge von PRQ an,
einem Abwehrgen, dass in Tabak sowohl durch SA als auch durch die Zucker Saccharose,
Glukose und Fruktose induziert wird (Herbers et al., 1996a; Herbers et al., 1996b).
4.1.1. Überprüfung und Komplementation der xopB-Deletion in Xcv
Um zu bestätigen, dass die erhöhte cw-Inv-Aktivität durch die Deletion von xopB
hervorgerufen wurde, sollte der Xcv ΔxopB-Stamm (Noël et al., 2001) komplementiert
werden. Zuvor wurde der verwendete Xcv ΔxopB-Stamm überprüft.
Aus Verständnisgründen soll die in Noël et al. (2001) beschriebene Deletion von xopB in Xcv
an dieser Stelle kurz erläutert werden. Aus einem Cosmid wurde zunächst ein 6.1 kb großes
EcoRV/BamHI-Fragment, das den ORF von xopB enthielt, subkloniert. Aus dem
resultierenden Plasmid wurden mittels partieller XhoI/SalI-Restriktionshydrolyse 1860 bp
deletiert. Nach Religation der kompatiblen XhoI- und SalI-Enden, war der ORF von xopB bis
auf die ersten 40 Nukleotide deletiert. Zusätzlich wurde auch der Teil der 3´UTR von xopB,
der sich zwischen Stop-Codon und SalI-Schnittstelle befand, deletiert (Abb. 4A und B).
Anschließend wurde das verkürzte Fragment in den suicide-Vektor pOK1 umkloniert und
nach erfolgter triparentaler Konjugation das endogene xopB von Xcv 85-10 deletiert (Noël et
al., 2001). Mit den sogenannten xopB-Deletionsprimern (5´Δ und 3´Δ) wurde die xopB-
Deletion überprüft. In einer Kolonie-PCR mit Xcv Wildtyp (WT) und Xcv ΔxopB als Matrizen
wurde ein 2.1 kb- bzw. 0.24 kb-Fragment erhalten, was die xopB-Deletion bestätigte (Abb.
4C). Zusätzlich wurde das erhaltene PCR-Fragment sequenziert. Bis auf einen
Nukleotidaustausch bestätigte die Sequenzierung die Deletion von xopB (siehe Abschnitt
8.1).
Ergebnisse
47
Abb. 4: Überprüfung des Xcv 85-10 WT-Stammes und der xopB-Deletionsmutante. A.) Schematische Darstellung des xopB-Locus im Genom von Xcv 85-10. Weißer Pfeil: ORF von xopB mit einer Größe von 1842 bp. !xopB: Das in Xcv !xopB durch Restriktionshydrolyse deletierte Fragment. Mit den Deletionsprimern 5´! und 3´! sollte im Xcv WT ein PCR-Fragment mit einer Größe von 2101 bp erhalten werden. V, S, X und B: Relative Positionen der Schnittstellen für EcoRV, SalI, XhoI bzw. BamHI. B.) Schematische Darstellung des xopB-Locus im Genom von Xcv !xopB. Weißes Rechteck: Verbliebene xopB-Sequenz (Nukleotide 1 bis 40 des ORFs von xopB) nach der xopB-Deletion. Mit den Deletionsprimern 5´! und 3´! sollte im Xcv !xopB-Stamm ein PCR-Fragment mit einer Größe von 241 bp erhalten werden. V, S und B: siehe A. X/S: Stelle der Ligation von XhoI mit SalI. C.) Überprüfung der Stämme Xcv 85-10 WT und Xcv !xopB mittels PCR mit den Deletionsprimern 5´! und 3´!. WT und !xopB: Kolonie-PCR mit den Stämmen Xcv 85-10 WT bzw. Xcv !xopB. Als Positivkontrolle wurde genomische DNA von Xcv 85-10 WT (gDNA (WT)) und als Negativkontrolle steriles mQ-Wasser (H2O) eingesetzt. (*): Primerdimere. Zahlen links neben Gelbild: wichtigste Standard-Banden in kb.
Für die Komplementation von xopB wurde nun ein 2,6 kb großes genomisches Fragment das
den ORF von xopB mit 1.8 kb enthielt in den Vektor pBBR1MCS-5 (im Weiteren pBBR)
kloniert, der das Gen von Interesse unter der Kontrolle des LacZ-Promotors exprimiert
(Kovach et al., 1995). Es wurde ein großes genomisches Fragment gewählt, da
Komplementationsversuche, in denen nur der ORF von xopB verwendet wurden, erfolglos
blieben. Im potentiellen Promotorbereich von xopB (649 bp stromaufwärts des xopB-ORFs)
konnte mit dem Promotorvorhersageprogramm „SoftBerry“ (www.softberry.com) eine -10-
und eine -35-Region sowie manuell die in Noël et al. (2003) beschriebene PIP-Box-Sequenz
TTCG-N16-TTCG identiziert werden (siehe 8.2). Somit enthalten die 649 bp stromaufwärts
Ergebnisse
48
von xopB sehr wahrscheinlich den endogenen xopB-Promotor. Das 2.6 kb Fragment wurde
über die BamHI-Schnittstelle relativ zum LacZ-Promotor in beiden Orientierungen mit dem
Vektor ligiert und die daraus resultierenden Konstrukte wurden pBBR:xopB (+) und
pBBR:xopB (-) genannt. Das “(+)”- und das “(-)”-Konstrukt exprimieren xopB somit unter der
Kontrolle des LacZ- und des vorhergesagten xopB-Promotors bzw. nur unter der Kontrolle
des vorhergesagten xopB-Promotors (Sonnewald et al., 2012). Die Orientierungen des xopB-
Fragmentes wurden mittels PCR überprüft. Dazu wurde der Primer „M13RP“ mit dem Primer
„3´ xopB +107 bp“ oder „5´ xopB -649 bp“ kombiniert. Mit pBBR:xopB (+) und pBBR:xopB (-)
als Matrizen wurde in der sich anschließenden PCR nur mit der Primer-Kombination
„M13RP“ + „3´ xopB +107 bp“ bzw. „M13RP“ + „5´ xopB -649 bp“ ein Fragment von etwa 2.6
kb erhalten.
Ergebnisse
49
Abb. 5: Herstellung und Überprüfung der xopB-Komplementationskonstrukte. A.) Schematische Darstellung des ORFs von xopB mit flankierenden Bereichen im Genom von Xcv WT (oben). Mit den Primern „5´xopB -649 bp“ und 3´xopB +107 bp“ wurde ein 2,6 kb großes genomisches Fragment amplifiziert. Über die angefügten BamHI-Schnittstellen wurde dieses Fragment in zwei Orientierungen mit dem BamHI-linearisierten Vektor pBBR1-MCS5 ligiert. Die erhaltenen xopB-Deletionskonstrukte wurden entsprechend pBBR:xopB(+) bzw. pBBR:xopB(-) bezeichnet (Schema Mitte bzw. unten). Zur Überprüfung verwendete Primer sind als Pfeile dargestellt. B.) Mit den unter 1, 2 und 3 angegebenen Primerkombinationen wurde die Orientierung des xopB-Fragmentes in den Konstrukten pBBR:xopB(-) und pBBR:xopB(+) mittels PCR überprüft. Als Matrizen dienten die unter den Gelbildern angegebenen Plasmide bzw. steriles mQ-Wasser als Negativkontrolle. (*): unspezifische PCR-Produkte. Zahlen rechts neben den Gelbildern: errechnete Fragmentgrößen in bp; Zahlen links neben den Gelbildern: Größen der wichtigsten Standard-Banden in kb.
Die Konstrukte pBBR:xopB (+) und pBBR:xopB (-) wurden mittels triparentaler Konjugation in
den überprüften Xcv ΔxopB-Stamm (siehe Abb. 4B und C) eingebracht. Als Kontrollen wurde
der pBBR Leervektor (LV) in die Stämme Xcv WT und Xcv ΔxopB eingebracht. Mittels
Kolonie-PCR wurde anschließend die Aufnahme der Plasmide und der genetische
Ergebnisse
50
Hintergrund der transformierten Stämme überprüft. Mit den xopB-Deletionsprimern „5´Δ“ und
„3´Δ“ wurde der xopB-locus von transformierten Xcv 85-10 WT- und Xcv ΔxopB-Stämmen
überprüft. Mit der Primerkombination „xopB 5´“ und „3´xopB +107 bp“ wurde sowohl der
genomische xopB locus der transformierten Stämme amplifiziert als auch -im Falle der xopB-
Komplementanten- ein Teil der Plasmid-kodierten xopB-Fragmente. Mit der
Primerkombination „M13FP“ und „M13RP“ wurde das Vorhandensein der pBBR
Leervektoren (Fragmentgröße von 230 bp) und der Komplementationsplasmide gezeigt. Alle
zu erwartenden Fragmentgrößen sind in Abb. 6A angegeben. Die erhaltenen PCR-
Fragmente sind in Abb. 6B gezeigt.
Ergebnisse
51
Abb. 6: Überprüfung der Komplementationsstämme. Mittels triparentaler Konjugation wurde in den Xcv WT der pBBR Leervektor (LV) und in den Xcv ΔxopB-Stamm sowohl der pBBR (LV) als auch die beiden Komplementationsplasmide pBBR:xopB(+) und pBBR:xopB(-) eingebracht. A.) Schematische Darstellungen der genomischen loci (oben) und der Komplementationsplasmide (Mitte und unten). Alle Primer (Pfeile) und die resultierden PCR-Fragmentgrößen sind eingezeichnet. B.) Kolonie-PCR auf angegebene Xcv-Stämme (oben) und Kontrollen (unten). gDNA (WT): isolierte genomische DNA von Xcv WT. 1, 2 und 3: verwendete
Ergebnisse
52
Primerkombinationen. Zahlen links neben den Gelbildern: errechnete Fragmentgrößen in bp; Zahlen rechts neben den Gelbildern: Größen der wichtigsten Standard-Banden in kb.
4.1.2. Herstellung eines XopB-spezifischen Antikörpers
Um das XopB-Protein während der Infektionsstudien nachweisen zu können, wurde im
Rahmen dieser Arbeit ein polyklonaler XopB-spezifischer Antikörper (AK) hergestellt. Dazu
wurde xopB ohne das Startcodon in den Vektor pQE9 kloniert, wodurch eine translationale
N-terminale Fusion mit dem 6xHis-Epitop entstand (Abb. 7). Die Expression und
Aufreinigung des 6xHis:XopB-Fusionsproteins ist in Sonnewald et al. (2012) beschrieben.
Abb. 7: Schematische Darstellung des 6xHis:XopB-Konstruktes für die Expression in E. coli M15 pREP4-Zellen. Der ORF von xopB wurde ohne Startcodon in den Vektor pQE9 über die Schnittstellen BamHI und SalI kloniert.
Mit dem gereinigtem 6xHis:XopB Protein wurden zwei Kaninchen immunisiert („Komplett und
Einfach“-Protokoll der Biogenes GmbH, Berlin, siehe 3.5.1). Die Sera der zweiten
Blutentnahme (nach viermaliger Immunisierung mit 6xHis:XopB) wurden mittels Western-Blot
getestet. Dazu wurde in N. benthamiana eine Agrobakterien-vermittelte transiente
Expression des Konstruktes pRB-35S::xopB-3xmyc durchgeführt. Zwei Tage nach
Agroinfiltration wurde aus 0.5 cm2 Blattmaterial mit 50 µl 2-fach Lämmli-Puffer ein
Gesamtproteinextrakt hergestellt. Als Negativkontrolle diente ein Gesamtzellextrakt einer
unbehandelten N. benthamiana-Pflanze. Von beiden Gesamtzellextrakten wurden jeweils 5
µl auf ein 12.5 %iges SDS-Gel aufgetragen. Als Positivkontrolle wurden 50 ng 6xHis:XopB-
Protein aufgetragen, das aus E. coli M15-Zellen isoliert wurde. Mit den von der Biogenes
GmbH gelieferten Sera der Kaninchen #20426 und #20427 konnten zwar die Proteine
XopB:3xmyc und 6xHis:XopB nachgewiesen werden, jedoch waren auch sehr viele
unspezifische Signale in der Western-Blot-Analyse sichtbar (Abb. 8 „vor
Affinitätsaufreinigung“). Um die Hintergrundsignale zu reduzieren, wurde daher eine
Affinitätsaufreinigung der polyklonalen XopB-AKs, wie in Sonnewald et al. (2012)
beschrieben, durchgeführt. Für die Affinitätsaufreinigung wurden jeweils 800 µl Serum
eingesetzt. Die an das Antigen 6xHis:XopB, welches zuvor auf eine Western-Blot-Membran
immobilisiert wurde, gebundenen XopB-AKs wurden mit 5 ml Elutionspuffer abgelöst,
Ergebnisse
53
wodurch ein Verdünnungsfaktor von 6,25 berücksichtigt werden musste. Daher wurde für
den Western-Blot „nach Affinitätsaufreinigung“ der XopB-AK 1:160 statt 1:1000 eingesetzt.
Der aufgereinigte XopB-AK detektierte nun sehr spezifisch XopB:3xmyc und 6xHis:XopB und
es waren keine unspezifischen Signale in der Negativkontrolle sichtbar.
Abb. 8: Western-Blot-Analyse mit XopB-spezifischen Antikörpern vor und nach einer Affinitätsreinigung. Test der Kaninchen-Sera der zweiten Blutentnahme nach viermaliger Immunisierung mit dem Antigen 6xHis:XopB. Die Sera und aufgereinigte XopB-AKs der Kaninchen #20426 und #20427 wurden 1:1000 (vor Affinitätsaufreinigung) bzw. 1:160 („nach Affinitätsaufreinigung“) in 1% Magermilch/TBST verdünnt. 1 und 2: Gesamtzellextrakte aus unbehandelter N. benthamiana-Pflanze bzw. nach transienter Expression von 35S::xopB:3xmyc in N. benthamiana (2 dpi). 3: 50 ng gereinigtes 6xHis:XopB-Protein aus E. coli M15 pREP4-Zellen.
Für weitere Western-Blot-Analysen wurde stets der aufgereinigte polyklonale XopB-AK von
Kaninchen #20427 verwendet, da dieser XopB:3xmyc in planta am besten erkannte. Dieser
erzielte auch bei einer höheren Verdünnung wie 1:1000 in 1% Magermilch/TBST sehr gute
Ergebnisse. Es stand somit ein Antikörper zur Verfügung, der transient exprimiertes XopB in
planta detektiert. Dieser Antikörper wurde im Weiteren auch dazu verwendet, um XopB in
transgenen Pflanzen oder in Infektionsstudien mit Xcv nachzuweisen.
Ergebnisse
54
4.1.3. Überprüfung der xopB-Komplementanten in planta
Die in 4.1.1 beschrieben Komplementanten des Xcv ΔxopB-Stammes wurden in planta
hinsichtlich der cw-Inv-Aktivität getestet. Dazu wurden neben diesen beiden
Komplementationsstämmen der Xcv WT und die ΔxopB-Mutante, die aus Kontrollgründen
beide den pBBR Leervektor enthielten, in suszeptible Paprikapflanzen infiltriert und die cw-
Inv-Aktivität 0, 1, 2 und 3 Tage nach Infektion bestimmt. Als negative Kontrolle wurde 10 mM
MgCl2 infiltriert. Wie zu erwarten, stieg die cw-Inv-Aktivität nach Xcv WT-Infektion an. Der
Anstieg war jedoch sehr viel stärker, wenn mit der ΔxopB-Mutante infiziert wurde (Abb. 9A).
Beide Komplementationsstämme waren in der Lage die cw-Inv-Aktivität sogar unter das
Niveau der Xcv WT-Infektion zu senken, worauf zu schließen ist, dass die Komplementation
des Stammes Xcv ΔxopB in trans erfolgreich war und der vorhergesagte xopB-Promotor im
Falle von pBBR:xopB (-) für eine ausreichende Expression gesorgt hat. Die Akkumulation
des XopB-Proteins wurde über die Dauer der Infektion mit dem in 4.1.2 beschriebenen
XopB-spezifischen Antikörper verfolgt. Sowohl das endogene XopB von Xcv WT als auch
das in trans exprimierte XopB konnten mittels Western-Blot nachgewiesen werden (Abb. 9B).
Die stärkeren Bandenintensitäten der XopB-Signale im Falle der beiden
Komplementationsstämme ist vermutlich darauf zurückzuführen, dass xopB von einem
Plasmid transkribiert wird und in höherer Kopienzahl vorliegt als das chromosomal kodierte
xopB von Xcv WT. Wahrscheinlich ist diese erhöhte XopB-Expression dafür verantwortlich,
dass die cw-Inv-Aktivität unter das Niveau der Xcv WT-Infektion gesenkt wurde.
Abb. 9: XopB supprimiert die Aktivität der Zellwandinvertase (cw-Inv) in suszeptiblen Paprikapflanzen. A.) cw-Inv-Aktivität nach Infiltration von Paprikablättern mit 10 mM MgCl2, Xcv Wildtyp (wt), Xcv ΔxopB und den beiden Komplementanten Xcv ΔxopB +xopB (-) bzw. (+). xopB wurde als genomisches Fragment zusammen mit dessen vorhergesagten Promotor in den Vektor pBBR1MCS5 kloniert, um die xopB-Deletion in trans zu
Ergebnisse
55
komplementieren. (-) und (+) bedeuten, dass das genomische Fragment entgegen bzw. mit dem lacZ-Promotor von pBBR1MCS5 kloniert wurde. Als Kontrollen wurden Xcv wt und Xcv ΔxopB mit dem entsprechenden Leervektor transformiert (LV). 0, 1, 2 und 3 Tage (d) nach Infiltration wurden Blattproben für die cw-Inv-Aktivitätsbestimmung entnommen. Die Werte repräsentieren den Mittelwert aus 4 unabhängigen Proben +/- Standardabweichung. B.) Western-Blot-Analyse zum Nachweis von XopB (65.5 kDa) mit einem XopB-spezifischen Antikörper 0, 1, 2 und 3 Tage nach Infiltration (dpi: days post infection).
4.1.4. Einfluss von XopB auf die Aktivität der cw-Inv in transgenen
Tabakpflanzen
In einem alternativen Ansatz wurde der Einfluss von XopB auf die cw-Inv in Tabak
untersucht, um die Ergebnisse aus der Paprika-Xanthomonas-Interaktion zu bestätigen.
Dazu wurden die von Sonnewald et al. (2012) beschriebenen transgenen Tabakpflanzen (N.
tabacum SNN) verwendet. Diese exprimieren xopB unter der Kontrolle eines Ethanol-
induzierbaren Promotors. Aus verschiedenen Primärtransformanden, die nach
Ethanolinduktion mittels Northern-Blot als positive Linien in der AG Sonnewald identifiziert
werden konnten, wurden die Linien 22-2 und 71-1 für weitere Experimente ausgewählt (Abb.
10A). Diese werden hier im Weiteren als N. tabacum EtOH::xopB #22 bzw. #71 bezeichnet.
Es wurde hier ein induzierbares Expressionssystem gewählt, da aus früheren Studien bereits
bekannt war, dass eine konstitutive Expression von xopB zu starken morphologischen
Veränderungen in Tabak- (N. tabacum) und Tomatenpflanzen (S. lycopersicum) führte und
diese transgenen Pflanzen nicht überlebensfähig waren (Sonnewald et al., 2012). Mit dem
induzierbaren Expressionssystem war es somit möglich xopB über mehrere Tage ohne
morphologische Veränderungen in Tabakpflanzen zu exprimieren (Abb. 10C, obere Reihe).
Das Vorhandensein von XopB nach Induktion der Genexpression durch Ethanol wurde in
den transgenen Pflanzen mit dem XopB-spezifischen Antikörper über 4 Tage mittels
Western-Blot nachgewiesen (Abb. 10B). Nach 7 bis 10 Tagen konnten sichtbare
Veränderungen der Morphologie jüngerer Blätter nachgewiesen werden (Abb. 10C, untere
Reihe). Neben den N. tabacum EtOH::xopB Linien wurden als Kontrolle transgene Pflanzen
verwendet, die die β-Glucuronidase unter der Kontrolle des FBPase-Promotors tragen
(FBPase::GUS Linie ME1-10). Da alle beschriebenen transgenen Pflanzenlinien eine
Kanamycin-Resistenz besaßen, konnten sie parallel auf Kanamycin-haltigem Medium
angezogen werden, um sie später für Experimente im Gewächshaus zu verwenden.
Ergebnisse
56
Abb. 10: Expressionskinetik von xopB in transgenen Tabakpflanzen. A.) Sieben unabhängige transgene Linien (Nummer 22, 26, 37, 44, 64, 71 und 72) und zwei Kontrollpflanzen (N. tabacum SNN Wildtyp (wt)) wurden in einer Northern-Blot-Analyse auf xopB-Expression getestet. Als Ladekontrolle wurde das denaturierende RNA-Gel vor dem RNA-Transfer mit Ethidium-Bromid gefärbt und fotografiert. Mit einer radioaktiv markierten xopB-spezifischen Sonde konnte in allen 7 transgenen Linien xopB-mRNA nachgewiesen werden. Zwei Linien (Nummer 22 und 71) wurden für weitere Experimente verwendet. B.) Für eine Expressionskinetik wurden die Linien 22 (#22) und 71 (#71) sowie eine unabhängige transgene Kontroll-Linie (K; ME1-10: FBPase::GUS) mit 1% Ethanol induziert und 0, 1, 2, 3 und 4 Tage nach Induktion (dpi hier: days post induction) Blattproben für eine Western-Blot-Analyse entnommen. Ab Tag 1 konnte in beiden transgenen Pflanzen XopB (65.5 kDa) als Doppelbande nachgewiesen werden. Eine zweite Bande bei ca. 55 kDa spiegelt ein unspezifisches Signal wider. Als Ladekontrolle wurde die Western-Blot-Membran mit Coomassie gefärbt und der Ausschnitt mit RubisCO gezeigt. C.) Die Expression von XopB führt zu starken phänotypischen Veränderungen in Tabak. Obere Reihe: Keine sichtbaren Veränderungen 2 Tage nach Ethanolinduktion in den Linien #22 und #71. Untere Reihe: Zehn Tage nach Ethanolinduktion sind bei den transgenen Linien starke morphologische Veränderungen der Blätter bis hin zu abgestorbenen meristematischen Geweben erkennbar (Pfeile). (K) ME1-10 Kontrollpflanzen. Die Entwicklung des XopB-spezifischen Phänotyps wurde in mehreren Experimenten in ähnlicher Weise beobachtet.
Die oben beschriebenen Tabakpflanzen wurden mit Xcv wt infiziert und die cw-Inv-Aktivität 0
h, 24 h und 48 h nach Infektion (hpi) bestimmt. Als Kontrolle wurde mit 10 mM MgCl2
infiltriert. In den Kontrollpflanzen (ME1-10) stieg die cw-Inv-Aktivität nach Infektion von etwa
20 (0 hpi) auf 400 µmol m-2 min-1 (48 hpi) an (Abb. 11). Die xopB-exprimierenden Pflanzen
hingegen zeigten keinen derartigen Anstieg der cw-Inv-Aktivität nach Xcv-Infektion. Somit ist
XopB auch in N. tabacum in der Lage die Xcv-stimulierte Erhöhung der cw-Inv-Aktivität zu
supprimieren. Das xopB-Transkript wurde mittels RT-PCR nachgewiesen. Dazu wurde 1 Tag
nach Ethanolinduktion die Gesamt-RNA von den Linien ME1-10, EtOH::xopB #22-2 und
EtOH::xopB #71-1 präpariert. Nach erfolgter cDNA-Synthese wurde mit spezifischen Primern
xopB und Ubiquitin nachgewiesen. Wie erwartet konnte nur in den Linien 22-2 und 71-1 ein
xopB-Fragment nachgewiesen werden (Abb. 11, Bildeinsatz).
Ergebnisse
57
Abb. 11: Transgene Tabakpflanzen (N. tabacum SNN) mit induzierbarer Expression des T3E xopB zeigen keinen durch Xcv ausgelösten Anstieg der cw-Inv. Die transgenen Kontrollpflanzen (ME1-10) und die transgenen EtOH::xopB Tabak-Linien wurden mit 1%igen Ethanol gegossen, um xopB zu induzieren. 24 Stunden (h) später wurden ausgewachsene Blätter mit 10 mM MgCl2 (MgCl2) oder Xcv WT (Xcv) infiltriert und nach 0 h, 24 h und 48 h Blattproben für die cw-Inv-Aktivitätsbestimmung entnommen. Bildeinsatz: RT-PCR zum Nachweis des xopB-Transkripts (xopB) 24 h nach Ethanolinduktion. Als Kontrolle wurde Ubiquitin (ubi) amplifiziert. In einem unabhängigen Experiment wurden vergleichbare Ergebnisse erzielt.
4.1.5. Induktion der cw-Inv durch proteinogene PAMPs
Paprikapflanzen, welche mit der Xcv !hrpB1-Mutante infiziert worden sind, zeigten sowohl
eine erhöhte Transkription als auch eine erhöhte Aktivität der cw-Inv (Biemelt and
Sonnewald, 2006; Sonnewald et al., 2012). Es ist daher naheliegend, dass die cw-Inv durch
ein PAMP induziert wird. Frühere Arbeiten konnten bereits zeigen, dass PAMPs aus Pilzen
wie Chitosan oder eine Elicitorpräparation von Fusarium oxysporum die cw-Inv von Pflanzen
transkriptionell aktivieren können (Ehness et al., 1997; Sinha et al., 2002). Um die Natur der
bakteriellen PAMPs, die an der Induktion der cw-Inv-Aktivität beteiligt sind, genauer zu
charakterisieren, wurden suszeptible Paprikapflanzen mit unbehandelten oder inaktivierten
Bakteriensuspensionen von Xcv wt und Xcv !hrpB1 infiltriert. Als Kontrolle wurde 10 mM
MgCl2 infiltriert. Es zeigte sich zunächst, dass nach der Hitzeinaktivierung von Xcv wt die cw-
Inv-Aktivität in Vergleich zu einer Behandlung mit lebenden Xcv-Zellen deutlich erhöht war,
was darauf hindeutet, dass es ein PAMP gibt, das die cw-Inv induziert und diese Induktion
nur durch lebende Xcv wt-Zellen unterdrückt werden kann (Abb. 12). Vergleichbare cw-Inv-
Aktivitäten wurden sowohl durch den lebenden als auch durch einen hitzebehandelten
!hrpB1-Stamm ausgelöst, was die Beteiligung von Typ-III-Effektoren an der Suppression
Ergebnisse
58
unterstreicht. Interessanterweise kam aber die cw-Inv-Antwort nahezu völlig zum Erliegen,
wenn zusätzlich zur Hitzebehandlung die Bakteriensuspensionen von Xcv wt oder Xcv
ΔhrpB1 mit den Proteasen Trypsin und Proteinase K behandelt wurden. Daraus ist zu
schließen, dass die erhöhte cw-Inv-Aktivität auf ein proteinogenes PAMP von Xcv
zurückzuführen ist und nicht auf extrazelluläre Polysaccharide wie beispielsweise LPS
(Lipopolysaccharide).
Abb. 12: Proteinogene PAMPs stimulieren die cw-Inv-Aktivität von suszeptiblen Paprikapflanzen. Xcv Wildtyp (wt) und ΔhrpB1 wurden lebend oder hitzeinaktiviert (95°C) in Paprikablätter infiltriert. Zusätzlich zu der Hitzeinaktivierung wurden die lysierten Bakterien mit Proteinase K und Trypsin für 2 h bei 60°C behandelt. Nach einer Hitzeinaktivierung der Proteasen wurde das Bakterienlysat pelletiert und auf OD600 1 mit 10 mM MgCl2 eingestellt und infiltriert (Protease). 0, 1, 2, und 3 Tage (d) nach Infiltration wurde die cw-Inv-Aktivität bestimmt. Die Werte repräsentieren den Mittelwert aus 4 unabhängigen Proben +/- Standardabweichung. In einem unabhängigen Experiment konnten vergleichbare Ergebnisse erzielt werden.
4.1.6. XopB zeigt keine Inhibierung der pflanzlichen Sekretion
Eine mögliche Strategie, wie XopB die Aktivität der cw-Inv reduzieren könnte, ist mit der
pflanzlichen Sekretion zu interferieren. Ist diese gestört, können sekretierte Proteine wie die
cw-Inv nicht mehr in den Apoplasten gelangen. Um das zu untersuchen, wurde ein
modifiziertes GFP (secGFP), das mit einem Signalpeptid einer Chitinase aus Arabidopsis
versehen wurde (Batoko et al., 2000), transient in N. benthamiana überexprimiert. Bei
ungehinderter Sekretion wird das secGFP in den Apoplasten sekretiert, wo es wegen des
niedrigen pH Wertes kaum fluoreszieren kann. Bei entsprechend hoher Signalverstärkung
kann dann mittels konfokaler laser scanning Mikroskopie (KLSM) aber eine wenn auch nur
sehr schwache intrazelluläre GFP-Fluoreszenz detektiert werden (Abb. 13, erste Reihe).
Wird die Sekretion in frühen oder späten Schritten gestört, kommt es zu einer Anreicherung
von secGFP im Endomembransystem, in dem GFP stark fluoreszieren kann (Batoko et al.,
Ergebnisse
59
2000; Geelen et al., 2002; Tyrrell et al., 2007). Als Positivkontrolle wurde secGFP mit XopJ
koexprimiert. Für diesen Effektor aus Xcv konnte bereits eine Suppression der Sekretion und
eine damit einhergehende erhöhte GFP-Fluoreszenz im Endomembransystem gezeigt
werden (Bartetzko et al., 2009; Üstün et al., 2014). Als weitere Positivkontrolle diente eine
dominant-negative Variante des Q-SNARE-Proteins AtSYP121 [SNARE: soluble NSF (N-
ethylmaleimide-sensitive factor) attachment protein receptor]. Dieses AtSYP121-Sp2-
Fragment (kurz SP2) genannte Q-SNARE-Protein wurde ohne die C-terminale
Transmembrandomäne kloniert und interferiert dadurch mit einem späten Schritt in der
pflanzlichen Sekretion (Tyrrell et al., 2007). Für beide Positivkontrollen (XopJ und SP2)
konnte eine erhöhte secGFP-Fluoreszenz im Endomembransystem mittels KLSM gezeigt
werden Abb. 13, dritte bzw. vierte Reihe). Nach Koexpression von secGFP mit XopB konnte
jedoch keine erhöhte GFP Fluoreszenz mittels KLSM nachgewiesen werden, woraus zu
schließen ist, dass XopB nicht in der Lage ist die pflanzliche Sekretion zu supprimieren (Abb.
13, zweite Reihe).
Abb. 13: XopB interferiert nicht mit der Sekretion des Markers secGFP. A. tumefaciens C58C1 vermittelte Expression von secGFP zusammen mit XopB, XopJ oder AtSYP121-Sp2 (SP2, Positivkontrolle) in N. benthamiana. Als Kontrolle wurde ein Agrobakterienstamm mit dem korrespondierenden Leervektor (pRB35S-cmyc) koinfiltriert. Agrobakterien mit pRB-35S::secGFP wurden zusammen mit einem 35S::xopB, 35S::xopJ, 35S::SP2 oder dem Leervektor (EV) mit einer OD600 von 0.1 (f.c.) infiltriert. Die Konstrukte secGFP, XopJ und SP2 sind in Bartetzko et al. (2009) beschrieben. Zwei Tage nach Agroinfiltration wurden untere Epidermiszellen
Ergebnisse
60
am KLSM mikroskopiert. Die linke Spalte zeigt die GFP-Fluoreszenz in grün (GFP), die mittlere Spalte die Autofluoreszenz des Chlorophylls in rot (Chl) und die rechte Spalte die Überlagerung beider Kanäle.
Dies wurde in einem alternativen Versuch bestätigt. Dazu wurden stabil transformierte N.
benthamiana-Pflanzen verwendet, die secGFP unter der Kontrolle des 35S-Promotors
exprimieren (Bartetzko et al., 2009). Nach A. tumefaciens-vermittelter transienter Expression
von XopB bzw. SP2 wurden 48 h nach Agroinfiltration die apoplastische Flüssigkeit (AF) aus
den N. benthamiana-Blättern isoliert und in dieser die Akkumulation von secGFP analysiert.
Als Kontrolle wurde die AF von Blättern isoliert, die nicht mit Agrobakterien infiltriert wurden.
Um die transiente Expression von XopB und SP2 (beides translationale, C-terminale
Fusionen mit dem c-myc-Epitop) sowie von secGFP nachzuweisen, wurde vor der Isolation
der AF Blattmaterial zur Isolation eines Protein-Gesamtzellextraktes (GZE) entnommen. In
der Western-Blot-Analyse mit einem GFP-spezifischen Antikörper zeigte sich, dass auch mit
diesem Ansatz kein negativer Einfluss von XopB auf die Sekretion von secGFP
nachzuweisen ist, da nach Expression von XopB:c-myc in der apoplastischen Flüssigkeit
sogar ein stärkeres secGFP-Signal nachzuweisen war. In der apoplastischen Flüssigkeit der
Positivkontrolle (SP2) konnte hingegen wie erwartet kein sekretiertes GFP nachgewiesen
werden. In der Negativkontrolle (unbehandelte Kontrollpflanzen) war wiederum sekretiertes
GFP in der apoplastischen Flüssigkeit nachweisbar (Abb. 14, „AF“). Der anti-c-myc Western-
Blot zeigte, dass alle Konstrukte exprimiert wurden (Abb. 14, „GZE“). Zudem konnten keine
c-myc-markierten Proteine in den AF-Fraktionen nachgewiesen werden, was beweist, dass
die AF-Fraktionen nicht durch zytosolische Proteine verunreinigt wurden. Daher stellen die
GFP-Signale, die in den AF-Fraktionen detektiert wurden, tatsächlich sekretiertes und nicht
zytosolisches secGFP dar. Dieses Ergebnis lässt vermuten, dass XopB die Suppression der
cw-Inv-Aktivität nicht durch Manipulation der Sekretion verursacht, sondern über einen
anderen Mechanismus wirken muss.
Ergebnisse
61
Abb. 14: Transiente Expression von XopB verringert nicht die Konzentration von sekretiertem GFP in der apoplastischen Flüssigkeit von transgenen secGFP N. benthamiana-Pflanzen. Transgene secGFP N. benthamiana-Pflanzen wurden mit A. tumefaciens C58C1 pRB-35S::xopB:c-myc oder pRB-35S::AtSYP121-Sp2:c-myc infiltriert. Zwei Tage nach Agroinfiltration wurden Blattproben für den Gesamtzellextrakt (GZE) entnommen und anschließend die apoplastische Flüssigkeit aus den infiltrierten und als Kontrolle aus unbehandelten Blättern gewonnen. In einer Western-Blot-Analyse wurden mit anti-cmyc- und anti-GFP-Antikörpern XopB:c-myc und AtSYP121-Sp2:c-myc bzw. secGFP nachgewiesen. Vergleichbare Ergebnisse wurden in zwei weiteren Experimenten erzielt.
4.2. Untersuchung von Abwehrantworten in transgenen Arabidopsis thaliana-Pflanzen mit induzierbarer Expression des T3E xopB aus Xcv
Da wie unter 4.1.6 beschrieben eine Manipulation der pflanzlichen Sekretion durch XopB
nicht für die geringere cw-Inv-Aktivität verantwortlich sein kann und zudem auch ein Einfluss
von XopB auf die mRNA-Menge der cw-Inv besteht (Sonnewald et al., 2012), unterbindet
XopB vermutlich einen durch Xcv stimulierten Signaltransduktionsprozess der Pflanze. Dies
könnte dann zu einer veränderten Genexpression und somit zu einer veränderten Aktiviät
der cw-Inv führen. Da mit A. thaliana ein hervorragend charakterisierter Modellorganismus
zur Verfügung steht, in dem auch Immunantworten bei Wirt-Pathogen-Interaktionen zahlreich
beschrieben sind, wurden in Vorarbeiten der AG Sonnewald transgene A. thaliana Pflanzen
erstellt, die den bakteriellen Effektor XopB in planta exprimieren. Dazu wurden mit Hilfe eines
geeigneten A. tumefaciens-Stammes und dem von Clough und Bent (Clough and Bent,
1998) beschriebenen „floral dipping“-Verfahren Pflanzen generiert, die im Genom eine T-
DNA tragen, welche den bakteriellen Effektor xopB unter Kontrolle eines Ethanol
induzierbaren Promotors beinhaltet. Diese transgenen Linien werden im Folgenden mit A.
thaliana EtOH::xopB abgekürzt.
Ergebnisse
62
4.2.1. Identifizierung homozygoter A. thaliana EtOH::xopB-Linien
Nach erfolgter A. tumefaciens-vermittelter Transformation von A. thaliana Col-0 mit dem in
Abb. 15A schematisch dargestellten Konstrukt wurden in Vorarbeiten der AG Sonnewald 20
Kanamycin-resistente T1 Pflanzen auf Expression von xopB untersucht. Mittels Northern-Blot
konnten neun Pflanzen mit starker xopB Expression identifiziert werden. Um den letalen
Effekt von XopB auf die Pflanzen zu verhindern, wurde die Expression von xopB für die in
Abb. 15B gezeigte Durchmusterung nur in ausgestanzten Blattscheiben induziert. Die Linien
10, 12, 27 und 16 wurden für weitere Analysen von der AG Sonnewald ausgewählt. Von
diesen Linien wurde genomische DNA aus je einer Pflanze der T3- oder T4-Generation
isoliert und mittels Southern-Blot die Anzahl der T-DNA-Insertionen bestimmt.
Nach hydrolytischer Spaltung der genomischen DNA mit dem Restriktionsenzym EcoRI
sollten in der sich anschließenden Southern-Blot-Analyse ein oder mehrere DNA Fragmente
mit einer Mindestgröße von 1,5 kb nachweisbar sein. Wie in Abb. 14C gezeigt, konnten die
Linien 10 und 12 als Transformanden mit einer einzelnen T-DNA-Insertion identifiziert
werden. Die Linien 27 und 16 enthielten mehrere T-DNA-Insertionen.
Abb. 15: Identifizierung von A. thaliana EtOH::xopB Linien mit nur einer T-DNA Insertion. A.) Schematische Darstellung der Expressionskassette der T-DNA „EtOH::xopB“. Das Regulatorprotein des Alkoholdehydrogenase-Promotors (AlcR) steht unter der Kontrolle des 35S-Promotors (35S). xopB steht unter der Kontrolle des Alkoholdehydrogenase-Promotors aus Aspergillus nidulans (AlcA). Die Terminatoren für AlcR und xopB stammen von der Nopalin-Synthase (NOS) aus A. tumefaciens bzw. aus dem Blumenkohlmosaikvirus (35S T). left border: Linke Grenze der T-DNA. Die rechte Grenze und das Kanamycin-Resistenzgen (nptII) sind nicht dargestellt. Die Zahlen unter den Linien geben die Längen der entsprechenden Abschnitte in Basenpaaren an. B.) Northern-Blot-Analyse der Primärtransformaten (T1) von A. thaliana EtOH::xopB. Mit einer radioaktiv markierten Sonde konnten neun transgene Linien (Nummer 10, 11, 12, 16, 23, 25, 26, 27 und 28) mit starker xopB-Expression identifiziert werden. Die Linien 10, 12, 27 und 16 wurden für weitere Analysen ausgewählt. Als Ladekontrolle wurde die Northern-Blot-Membran mit einem radioaktiv markierten Fragment der kleinen Untereinheit der RubisCO (RbcS) hybridisiert. C.) Die genomische DNA von T3- oder T4-Generatioenen der angezeigten Linien wurde in einer
Ergebnisse
63
Southern-Blot-Analyse untersucht, um die Anzahl der T-DNA-Insertionen zu bestimmen. Dazu wurde die isolierte DNA mit EcoRI hydrolytisch gespalten und nach dem DNA-Transfer die Membran mit der in (A.) angezeigten Sonde (32P probe) hybridisiert.
Die Linien 10 und 12 zeigten zudem auf Kanamycin-haltigem Medium nach Aussaat der T2-
Generation das zu erwartende 3:1 Aufspaltungsverhältnis, was darauf hindeutet, dass diese
Linien nur eine einzige T-DNA-Insertion tragen (Tabelle 7).
Tabelle 7: Aufspaltungsverhältnis der A. thaliana EtOH::xopB Linien mit nur einer T-DNA-Insertion. Die Generationen T2 bis T5 bzw. bis T4 der Linien 10 und 12 wurden auf Kanamycin-haltigem MS-Arabidopsis-Medium ausgesät und nach 14 Tagen das Aufspaltungsverhältnis auf Basis der Kanamycin-Resistenz bestimmt. KanR und KanS: Anzahl der Kanamycin-resistenten bzw. -sensitiven Keimlinge.
Aussaat von Linie (EtOH::xopB) KanR KanS KanR:KanS T2 10 43 16 2.69:1 T3 10-10 98 0 1:0 T4 10-10-11 69 0 1:0 T5 10-10-11-2 127 0 1:0 T2 12 103 31 3.3:1 T3 12-4 86 0 1:0 T4 12-4-7 148 0 1:0
Um den genauen Insertionsort der EtOH::xopB T-DNA zu bestimmen wurde das „genome
walker“ Verfahren angewendet. So konnte gezeigt werden, dass die T-DNA der Linie 10 in
einem nicht kodierenden DNA-Abschnitt zwischen einem Pseudogen (AT2G04260) und der
RNAse E (AT2G04270) inserierte, wohingegen die T-DNA der Linie 12 im 3´-Ende des
kodierenden Bereichs des intronlosen Gens YUC5 (AT5G43890) inserierte (Abb. 16). Um
auszuschließen, dass der Insertionsort der T-DNA die Immunantwort der Linie 12
unabhängig von der xopB-Expression beeinflusst, wurden für alle folgenden Experimente
entweder nur die Linie 10 oder beide Linien verwendet.
Ergebnisse
64
Abb. 16: Insertionsorte der T-DNA „EtOH::xopB“ der Linien 10 und 12 im Arabidopsis-Genom. Schematische Darstellung der T-DNA-Insertionen der Linien 10 und 12 im Chromosom 2 (Chr2) bzw. Chromosom 5 (Chr5). Ausgehend von der linken Grenze der T-DNA (LB: left border) wurde ein kurzer Abschnitt des flankierenden Arabidopsis-Genoms im genome walker-Verfahren amplifiziert und anschließend sequenziert (schwarze Peile). Die Zahlen unter den schwarzen Pfeilen geben die Positionen des Sequenzierergebnisses im Arabidopsis-Genom an.
4.2.2. Expressionskinetik von xopB nach Ethanolinduktion
In den homozygoten EtOH::xopB-Linien wurden die Entwicklungen von phänotypischen
Veränderungen nach der Induktion von xopB verfolgt. Dabei zeigten sich vier Tage nach
Induktion erste Chlorosen auf Blättern. Dies war jedoch nur bei kleinen Blättern, die direkt
über der Erde lagen, zu beobachten. Ausgewachsene Blätter zeigten an Tag vier noch keine
derartigen Symptome. Erst nach etwa zwei Wochen (hier gezeigt nach 18 Tagen) führte die
Expression von XopB zum Absterben der transgenen Pflanzen (Abb. 17A).
Mit den homozygoten Linien wurde weiterhin eine Expressionskinetik durchgeführt, um zu
bestimmen wie lange nach einer einmaligen Ethanolgabe das xopB-Transkript und das
XopB-Protein in den Pflanzen nachweisbar ist. Mittels RT-PCR konnte das xopB-Transkript 4
h und 24 h nach Ethanolinduktion nachgewiesen werden, jedoch nicht mehr nach 48 h (Abb.
17B). Die Western-Blot-Analyse mit einem XopB-spezifischen Antikörper zeigte, dass auch
noch 48 h nach Ethanolgabe XopB-Protein vorhaben war (Abb. 17C). XopB wurde im
Western-Blot stets als Doppelbande detektiert. Dies könnte entweder auf Abbau oder auf
eine posttranslationale Modifikation hindeuten.
Ergebnisse
65
Abb. 17: Expressionskinetik von xopB in A. thaliana EtOH::xopB Linie 10 und 12. A) Je drei Pflanzen der transgenen Linien 10 und 12 und des Wildtyps (Col-0) wurden mit je 10 ml 1% Ethanol gegossen. 0 d, 1 d, 2 d, 4 d und 18 d nach der Ethanolgabe wurden die Pflanzen fotografiert. B) Die Expression von xopB wurde mittels RT-PCR 0, 4, 24 und 48 h nach Ethanolgabe analysiert. Als Positivkontrolle diente das Plasmid, das die EtOH::xopB-Expressionskassette trägt. Als Negativkontrollen dienten cDNA (0 h nach Ethanolgabe) und genomische DNA von A. thaliana Col-0 Wildtyp (WT bzw. gDNA) und Wasser (H2O). Als Lade- und Qualitätskontrolle wurde mit intronflankierenden Primern Actin1 (Actin) amplifiziert. C) Die Akkumulation des XopB-Proteins wurde parallel zu (B) in einer Western-Blot-Analyse mit XopB-spezifischen Antikörpern nachgewiesen. Als Ladekontrolle diente mit Amido-Schwarz gefärbtes RubisCO-Protein.
4.2.3. Globale Expressionsanalyse von transgenen A. thaliana EtOH::xopB
Linien
Die phänotypischen Veränderungen, die durch die Expression von xopB in Arabidopsis
hervorgerufen wurden, deuteten darauf hin, dass dieser T3E einen starken Einfluss auf den
pflanzlichen Stoffwechsel hat und eine transkriptionelle und metabolische
Ergebnisse
66
Umprogrammierung hervorruft. Die Umprogrammierung verschiedener Prozesse in der
Pflanze führt dann möglicherweise zum Absterben der induzierten xopB-Linien (Abb. 17A).
Um mehr über die transkriptionellen Umprogrammierungen, die möglicherweise auch
wichtige Prozesse der Pathogenabwehr betreffen, zu erfahren, wurde daher eine globale
Expressionsanalyse (microarray) mit RNA-Proben, die 4 h nach Ethanolgabe entnommen
wurden, durchgeführt. In der AG Sonnewald wurde der Datensatz mit dem Programm
Genespring GSX v12.5 (Agilent Technologies) ausgewertet. Nach der Normalisierung,
stringenter Filterung der Daten und einem ANOVA-Test wurden entities (d.h. 60mer
oligonukleotide, die ein Gen repräsentieren) identifiziert, die in drei EtOH::xopB Linien (Linie
10, 12 und 27) einen signifikanten mindestens 2-fachen Unterschied im Expressionsniveau
verglichen mit Arabidopsis WT aufzeigten. Es wurden 2675 differentiell regulierte entities
gefunden, die basierend auf der Annotation von TAIR9 2172 Gene repräsentierten. Von den
2675 entities waren 2637 entities in allen drei transgenen Linien in die gleiche Richtung
reguliert. Von diesen wiederum waren 1628 entities herauf- und 1009 entities herab-reguliert.
Aufgrund der hohen Anzahl der regulierten entities sollen hier nur die wichtigsten Ergebnisse
der Analyse zusammengefasst werden. Bezüglich der Pathogenabwehr konnte gezeigt
werden, dass die Cytochrom P450 Mono-Oxygenasen CYP79B2 und CYP79B3 nach
Expression von xopB 7- bzw. 10-fach herunter-reguliert waren. Diese Gene sind für die
Biosynthese von Indol-Glykosinolaten, Indol-Essigsäure und dem Phytoalexin Camalexin
essentiell (Glawischnig et al., 2004). Beide Gene werden über den Transkriptionsfaktor
ATR1/MYB34 reguliert (Celenza et al., 2005), welcher nach xopB-Expression ebenfalls stark
herab-reguliert war. Im Gegensatz dazu war der Transkriptionsfaktor WRKY40, der einen
negativen Regulator der Camalexin-Biosynthese darstellt (Pandey et al., 2010), herauf-
reguliert. Viele Gene der Kategorie „Signaltransduktion“, die für RLKs (receptor like kinases),
MAPKs (mitogen activated protein kinases) oder für Gene des Calciumsignalweges
kodieren, waren nach xopB-Expression moduliert. Beispielsweise waren die Calmodulin-
ähnlichen Gene CML28, 30, 37, 40 und 45, die für potentielle Calcium-Sensoren kodieren,
sowie die Ca2+-ATPase ACA12 und die potentiellen Ca2+-Kanäle CNGC16 und 19 (cyclic
nucleotide-gated channel) nach xopB-Expression herauf-reguliert.
4.2.4. XopB interferiert mit dem Calciumeinstrom und der ROS-Produktion
nach flg22-Stimulation
Ausgehend von der globalen Expressionsanalyse der transgenen EtOH::xopB Pflanzen, in
denen verschiedene Prozesse der Calcium-abhängigen Signaltransduktion deutlich
verändert waren, sollte weiter untersucht werden, ob frühe physiologische Antworten nach
Ergebnisse
67
PAMP-Stimulation durch XopB verändert werden. Sehr frühe Immunantworten der
Pflanzenzelle sind die Erhöhung der zytosolischen Calciumkonzentration [Ca2+]cyt und die
ROS-Produktion (Grant and Loake, 2000; Grant et al., 2000). Um zu untersuchen, ob XopB
den Calciumeinstrom nach flg22-Stimulation beeinflusst, wurde der Calcium-Reporter
Aequorin zusammen mit XopB transient in N. benthamiana überexprimiert. Als Kontrolle
diente eine Koinfiltration von Aequorin mit dem entsprechenden Leervektor (pBinAR).
Vierundzwanzig Stunden nach Agroinfiltration wurden Blattscheiben einzeln in eine 96-Loch-
Mikrotiterplatte überführt und zur Rekonstituierung von Apoaequorin mit Coelenterazin für
vier Stunden bei 22 °C inkubiert und anschließend die Veränderung der [Ca2+]cyt nach
Zugabe von flg22 gemessen. Sieben Minuten nach Stimulation mit 1 µM flg22 erreichten die
Blattscheiben der Leervektor-Kontrolle ein Maximum der [Ca2+]cyt. Die Blattscheiben, die
neben Aequorin auch XopB exprimierten, erreichten das Maximum erst 13 Minuten nach
flg22 Stimulation (siehe Abb. 18A). Es konnte also eine Verschiebung, jedoch keine
Verringerung der [Ca2+]cyt festgestellt werden. Die Expression von XopB wurde mittels
Western-Blot nachgewiesen (Abb. 18B).
Ansätze diesen Effekt von XopB auf die [Ca2+]cyt in Arabidopsis zu zeigen blieben erfolglos.
Nach dem Einkreuzen einer homozygoten Aequorin-Reporter Linie (A. thaliana Col-0
35S::Aequorin 34-11) in die homozygoten EtOH::xopB-Linien 10 und 12 konnte das XopB-
Protein mittels Western-Blot nicht mehr detektiert werden, obwohl die entsprechende T-DNA
in isolierter genomischer DNA mittels PCR nachweisbar war (Daten nicht gezeigt). Das
35S::Aequorin-Konstrukt wurde dagegen exprimiert. Dies konnte im Luminometer nach
Rekonstituierung von Blattscheiben mit Coelenterazin und anschließender Behandlung mit
der sogenannten discharge-Lösung (2M CaCl2 in 50% EtOH), was zu einer maximalen
Lumineszenz des gebildeten Aequorin-Proteins führt, gezeigt werden. Es wurden mehrere
unabhängige Kreuzungen durchgeführt, die jedoch stets dazu führten, dass in heterozygoten
T1-Generationen (EtOH::xopB x 35S::Aequorin) zwar Aequorin, jedoch nicht XopB exprimiert
wurde. Dennoch wurden Pflanzen erzeugt, die für beide T-DNA-Konstrukte homozygot
waren. Auch in diesen konnte jedoch kein XopB-Protein nachgewiesen werden.
Möglicherweise kam es durch das Einkreuzen der 35S::Aequorin-Linie zu einer
Genstilllegung von EtOH::xopB.
Da Calciumionen als „second messenger“ sowohl direkt durch Bindung an den N-Terminus
der NADPH-Oxidase D als auch indirekt durch calciumaktivierte CDPKs an der Aktivierung
der NADPH-Oxidase D in Arabidopsis beteiligt sind (Ogasawara et al., 2008; Dubiella et al.,
2013; Gao et al., 2013; Li et al., 2014), sollte untersucht werden, ob XopB die flg22-
induzierte ROS-Produktion inhibiert oder verschiebt. Dazu wurden Blattscheiben von A.
Ergebnisse
68
thaliana Col-0 WT und von den EtOH::xopB Linien 10 und 12 in eine Mikrotiterplatte
überführt und alle mit 0.2 % EtOH behandelt, um xopB in den transgenen Linien zu
induzieren. Am nächsten Tag wurde dann die ROS-Produktion nach flg22-Behandlung in
einem Meerrettich-Peroxidase gekoppelten Test in einem Luminometer bestimmt. Wie
erwartet induzierte die flg22-Behandlung nach ca. 10 Minuten eine starke Akkumulation von
ROS in den Wildtyppflanzen. Die transgenen EtOH::xopB Linien 10 und 12 zeigten hingegen
nur noch 30% bzw. 20% der Wildtyp-Antwort (Abb. 18C).
Abb. 18: XopB supprimiert frühe Abwehrantworten in N. benthamiana und A. thaliana. A.) Die flg22-induzierte Erhöhung der cytosolischen Calciumkonzentration [Ca2+]cyt wurde in N. benthamiana durch A. tumefaciens-vermittelter Expression von Aequorin und XopB bestimmt. A. tumefaciens C58C1 Stämme mit pBinAR:xopB (35S::xopB, grau gepunktete Linie) oder pBinAR Leervektor (LV, schwarze Linie) wurden mit Stämmen mit pART27:Aequorin und p19 koinfiltriert. Vierundzwanzig Stunden später wurden Blattscheiben mit Coelenterazin inkubiert und mit flg22 (Pfeil) behandelt. Die Werte repräsentieren Mittelwerte aus 4 unabhängigen Proben +/- Standardfehler. Statistisch signifikante Unterschiede wurden für zwei Zeitpunkte mittels eines student´s t-test berechnet und sind mit unterschiedlichen Buchstaben angegeben. (p<0,001 für den Zeitpunkt 10 min; p<0,05 für den Zeitpunkt 16 min). Das Experiment wurde zweimal mit vergleichbaren Ergebnissen wiederholt. B.) Vierundzwanzig Stunden nach Agroinfiltration wurde von den in (A.) verwendeten N. benthamiana-Pflanzen Blattmaterial entnommen und in einer Western-Blot-Analyse die Expression von XopB mit einem XopB-spezifischen Antikörper nachgewiesen. (*) markiert ein unspezifisches Signal. Als Ladekontrolle wurde die Amido-Schwarz gefärbte RubisCO gezeigt. C.) Der Einfluss von XopB auf die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS: reactive oxygen species) wurde in transgenen A. thaliana EtOH::xopB Linien gezeigt. Blattscheiben vom
Ergebnisse
69
Arabidopsis WT (Col-0, schwarze Linie) und von EtOH::xopB Linien (EtOH::xopB 10 und EtOH::xopB 12, grau gestrichelte bzw. gepunktete Linie) wurden für 18 h mit 0.2% Ethanol im Dunkeln inkubiert, um die Expression von xopB zu induzieren. Mit einer Meerrettich-Peroxidase gekoppelten Luminol-Reaktion wurde nach manueller Zugabe von flg22 die ROS-Produktion im Luminometer bestimmt. RLU: relative light units. Die Werte repräsentieren Mittelwerte aus 8 unabhängigen Proben +/- Standardfehler. Statistisch signifikante Unterschiede wurden mittels eines student´s t-test berechnet und sind mit unterschiedlichen Buchstaben angegeben. (p<0,0001). Vergleichbare Ergebnisse wurden in mind. zwei weiteren unabhängigen Experimenten erzielt.
4.2.5. Einfluss von XopB auf die Expression flg22-induzierter Gene
Mit dem folgenden Versuch sollte untersucht werden, ob die ROS-Produktion nach xopB-
Expression vermindert war, weil ROS-produzierende Gene schwächer exprimiert waren und
ob die verminderte ROS-Produktion einen Einfluss auf ROS-regulierte Gene hat. Dazu
wurden A. thaliana Col-0 WT, EtOH::xopB Pflanzen und fls2-Mutanten mit H2O oder 1 µM
flg22 infiltriert und nach 30 und 60 min Gesamt-RNA für qPCR-Analysen isoliert. Alle
Pflanzenlinien wurden 18 h vor der Behandlung mit 10 ml 1% Ethanol gegossen, um xopB zu
induzieren. Zunächst wurden die Gene der Peroxidasen AtPRX33, AtPRX34 und der
NADPH-Oxidase AtRBOHD analysiert, da diese Gene an der flg22-stimulierten ROS-
Produktion beteiligt sind (Zhang et al., 2007; O’Brien et al., 2012). Unter Kontrollbedingungen
(Infiltration von H2O) war die basale Expression von AtRBOHD in den xopB-Linien 3- bis 5-
fach niedriger als in den Wildtyppflanzen und die Expression in Wildtyp und fls2-Mutante war
hingegen vergleichbar (Abb. 19). Nach Stimulation mit flg22 war aber der Anstieg der mRNA-
Menge von AtRBOHD zwischen Wildtyppflanzen (2,6-fach) und transgenen Pflanzen (2,2-
fach und 3,9-fach in den Linien 10 bzw. 12) in etwa gleich, und war in der fls2-Mutante kaum
auszumachen (1,3-fach). Das Expressionsmuster von AtPRX33 und AtPRX34 war unter
Kontrollbedingungen mit dem von AtRBOHD vergleichbar (Abb. 19). Die mRNA-Mengen von
AtPRX33 und AtPRX34 waren 3- bis 4-fach bzw. 2- bis 3-fach niedriger in den transgenen
Pflanzen als in den Wildtyppflanzen. Im Gegensatz zu AtRBOHD wurde die Expression der
Peroxidasen in den xopB-Linien durch flg22 kaum erhöht. In den Wildtyppflanzen hingegen
sowie in der fls2-Mutante war der mRNA-Anstieg von AtPRX33 und AtPRX34 mit 1.5- bis 2-
fach vergleichbar. Somit ist dieser geringe Anstieg unabhängig von FLS2 und wird
möglicherweise durch andere Stimuli wie z.B. Mechanostress vermittelt. Es ist somit
festzuhalten, dass XopB offenbar die basale Expression von beiden Peroxidasen und von
AtRBOHD vermindert und zusätzlich den flg22-stimulierten Anstieg von AtRBOHD
unterdrückt. Zusammen könnte diese verminderte Expression dieser ROS-produzierenden
Gene die beobachtete Verminderung der ROS-Produktion zur Folge haben.
Es stellte sich nun die Frage, ob die Verminderung der ROS-Produktion einen Einfluss auf
Gene hat, die durch ROS transkriptionell reguliert werden. Daher wurde das Gen AtOXI1
untersucht, da es nach H2O2-Behandlung transkriptionell aktiviert wird und zudem in der PTI
Ergebnisse
70
eine Rolle spielt (Rentel et al., 2004b). Unter Kontrollbedingungen war die Expression von
AtOXI1 in WT- und transgenen Pflanzen vergleichbar. In der fls2-Mutante war die
Transkriptmenge 3-fach erhöht und wurde auch nicht durch die flg22-Behandlung weiter
erhöht (Abb. 19). In den WT-Pflanzen war die Expression dieses Gens nach flg22-
Behandlung 10-fach erhöht, wohingegen in den xopB-Linien nur das 3- bis 4-fache der
Transkriptmenge gemessen wurde, was mit der verminderten ROS-Produktion in den xopB-
Linien in Übereinstimmung steht.
In einem nächsten Schritt wurden weitere flg22-stimulierte Gene untersucht, die in
Verbindung mit der Pathogenabwehr stehen. Es wurden die Gene AtWRKY22, AtFRK1,
AtNHL10 und AtPHI1 gewählt, da diese MAPK- und/ oder CDPK-abhängig reguliert werden.
AtWRKY22 und AtFRK1 sind MAPK-spezifisch und AtPHI1 ist CDPK-spezifisch reguliert.
AtNHL10 ist hingegen synergistisch über beide Signalwege reguliert (Boudsocq et al, 2010;
Asai et al, 2002). Mit dieser Auswahl konnte nun untersucht werden, ob XopB neben ROS-
auch MAPK- und/ oder CDPK-Signaltransduktionsprozesse supprimiert. Denn es wurde
gezeigt, dass die Aktivierung des MAPK-Signalweges zwar partiell von der Erhöhung der
[Ca2+]cyt abhängt, aber unabhängig von der ROS-Produktion ist (Zhang et al., 2007; Ranf et
al., 2011; Segonzac et al., 2011; Xu et al., 2014).
Der flg22-stimulierte Anstieg der AtFRK1 Expression war zwischen Col-0 WT und
EtOH::xopB Linie 10 vergleichbar und nur etwas höher in der Linie 12 (2-fach gegeüber WT
und Linie 10). Der Anstieg in der fls2-Mutante war vernachlässigbar. Ein vergleichbares
Expressionsmuster konnte für AtWRKY22 gefunden werden. Im Gegensatz dazu wurde der
flg22-stimulierte Anstieg von AtNHL10, der in den Wildtyppflanzen beobachtet wurde, in
beiden xopB-Linien unterdrückt (Abb. 19). Dies wurde ebenfalls von Schulze et al. (2012) mit
einem NHL10-Promotor-Luziferase-Reporter in Arabidopsis-Protoplasten gezeigt. Da die
MAPK-spezifischen Gene AtFRK1 und AtWRKY22 in der vorliegenden Arbeit durch XopB
nicht supprimiert wurden (Abb. 19), wurde angenommen, dass die Suppression von
AtNHL10 durch eine geringere CDPK-Aktivität hervorgerufen werden musste. Tatsächlich
wurde das CDPK-spezifische Gen AtPHI1 in den xopB-Linien im Vergleich zum WT nach
flg22-Behandlung supprimiert (Abb. 19).
Ergebnisse
71
Abb. 19: XopB verändert die Expression von flg22-induzierten Genen. A. thaliana Col-0 Wildtyppflanzen (WT), transgene EtOH::xopB Linien (10 und 12) und die fls2-Mutante wurden mit 1%igem Ethanol gegossen, um xopB zu induzieren. Achtzehn Stunden später wurden ausgewachsene Blätter mit 1 µM flg22 oder deionisiertem Wasser infiltriert und 30 und 60 min später geerntet. Die Gesamt-RNA wurde isoliert und in cDNA umgeschrieben. Die Transkriptmengen der angegebenen Gene wurden mit quantitativer RT-PCR bestimmt und auf Tubulin 4 (AtTUB4) normalisiert. AtPRX33, AtPRX34, AtRBOHD und AtOXI1 wurden 30 min alle übrigen
Ergebnisse
72
Gene 60 min nach Infiltration analysiert. Die Transkriptmengen wurden relativ zu den Expressionsniveaus von wasserbehandelten Wildtyppflanzen, die auf 1 gesetzt wurden, dargestellt. Werte repräsentieren Mittelwerte aus drei unabhängigen biologischen mit je zwei technischen Replikaten +/- Standardfehler (n=3).
4.2.6. XopB supprimiert die Einlagerung von Kallose
Nach Perzeption eines bakteriellen PAMPs wie flg22 reagieren Pflanzenzellen mit der
Einlagerung von Kallose in die Zellwand. Diese ROS-abhängige Abwehrantwort (Zhang et
al., 2007) wird in einer kompatiblen Interaktion von T3Es unterdrückt (Hauck et al., 2003;
Zhang et al., 2007; Bartetzko et al., 2009; Kim et al., 2009). Mit Ethanol behandelte Col-0
Wildtyp- und EtOH::xopB-Pflanzen der Linie 10 wurden mit flg22 und H2O infiltriert und 18 h
später Kallose mit Anilinblau angefärbt. Am Fluoreszenzmikroskop wurde die Anzahl der
Kalloseeinlagerungen bestimmt. Wildtyppflanzen zeigten nach flg22-Stimulation
durchschnittlich 173 Kallose-Einlagerungen pro mm2 Blattfläche. Nach Expression von XopB
konnten jedoch kaum Kalloseeinlagerungen nachgewiesen werden (Abb. 20A und B). Dies
zeigt, dass durch die Anwesenheit von XopB die Kalloseeinlagerung fast vollständig
unterdrückt wurde und XopB somit einen starken Einfluss auf die basale Abwehr von
Pflanzen hat.
Abb. 20: XopB unterdrückt die Einlagerung von Kallose nach flg22-Infiltration. A. thaliana Col-0 Wildtyp- und transgene EtOH::xopB-Pflanzen der Linie 10 wurden mit jeweils 10 ml 1% EtOH gegossen und 18 h später mit 1 µM flg22 oder deionisiertem Wasser behandelt. Nach weiteren 18 h wurde Kallose mit Anilinblau gefärbt und Aufnahmen mit einem Epifluoreszenz-Mikroskop angefertigt. Je eine representative Aufnahme nach dem Anfärben der Kallose. Vier bis sechs zufällig ausgewählte Bereiche eines Blattes wurden aufgenommen und die Anzahl der Kallose-Ablagerungen gezählt. Zahlen unter den Aufnahmen geben den Mittelwert +/- SE von mindestens 25 Einzelwerten an (n≥ 25). Der statistisch signifikante Unterschied zwischen flg22-behandelten Wildtyp- (Col-0) und transgenen Pflanzen (10) wurde mittels student´s test berechnet und ist mit Sternchen gekennzeichnet. (**** p< 0,0001).
Ergebnisse
73
4.2.7. Die Expression von XopB fördert die Virulenz von Pst in A. thaliana
In den vorherigen Experimenten konnte gezeigt werden, dass XopB verschiedene
Abwehrprozesse inhibiert, welche durch das PAMP flg22 aktiviert werden. Daher stellte sich
nun die Frage, ob XopB auch einen Einfluss auf die Interaktion zwischen Arabidopsis und
lebenden Bakterien hat. Es wurden dazu fünf Wochen alte A. thaliana Wildtyppflanzen und
transgene EtOH::xopB-Pflanzen (Linie 10 und 12) mit verschiedenen Bakterienstämmen
infiltriert. Der für A. thaliana Col-0 virulente Bakterienstamm Pst DC3000 kann die
Immunantwort unterdrücken und geht daher eine kompatible Interaktion mit Arabidopsis ein.
Der avirulente Bakterienstamm Pst pVSP61:avrRpm1 löst in A. thaliana Col-0 ETI aus.
Außerdem wurde Pst ΔTLR1 ausgewählt, die als eine T3SS-defiziente Mutante keine T3Es
in die Wirtszelle translozieren kann und somit PTI auslöst.
Die Daten in Abb. 21A zeigen, dass sich Pst DC3000 in den transgenen EtOH::xopB-
Pflanzen deutlich besser vermehren konnte als in Wildtyppflanzen, während das bakterielle
Wachstum von Pst pVSP61:avrRpm1 und von Pst ΔTLR1 durch die Expression von XopB in
planta nicht signifikant verändert wurde (siehe Abb. 21B bzw. C). Somit konnte angenommen
werden, dass die Expression von XopB in der Pflanze zusätzlich zu den durch Pst DC3000
selbst translozierten Effektoren, die Immunantwort von Arabidopsis effektiv unterdrücken
konnte.
Abb. 21: Die Expression von XopB unterstützt das bakterielle Wachstum von virulenten Pst-Bakterien in planta. Vier bis sechs Arabidopsis-Pflanzen der Linien Col-0 WT, EtOH::xopB Linie 10 und EtOH::xopB Linie 12 wurden mit jeweils 10 ml 1% EtOH gegossen. Achtzehn Stunden später wurden diese mit (A) dem virulenten Pst-Stamm Pst DC3000 WT, (B) dem avirulenten Stamm Pst pVSP61:avrRpm1 oder (C) der TTSS-defizienten Mutante Pst ΔTLR1. Der virulente und avirulente Stamm wurden mit einem Titer von 5*105 cfu ml-1 und die TTSS-defiziente Mutante mit 106 cfu ml-1 infiltriert. Die bakteriellen Titer in planta wurden zu den angegebenen Zeitpunkten aus 3 bis 6 biologischen Replikaten bestimmt (A, n=4; B, n=6; C, n=3 mit 3 pools aus 6 Pflanzen). Werte stellen Mittelwerte +/- SE dar. Statistisch signifikante Unterschiede zwischen infizierten Wildtyp- und EtOH::xopB-Pflanzen wurden mittels student´s t-test berechnet und sind mit Sternchen gekennzeichnet (**p<0.01; *p<0.05). Vergleichbare Ergebnisse wurden aus mind. einem weiteren Experiment erzielt.
Ergebnisse
74
Die Unterschiede im bakteriellen Wachstum von virulenten und avirulenten Stämmen
spiegelten sich im Phänotyp der infizierten Pflanzen wider. EtOH::xopB-Pflanzen zeigten 3.5
Tage nach Infektion mit dem virulenten Bakterienstamm Pst DC3000 pVSP61 (LV) deutlich
stärkere Krankheitssymptome als die Wildtyppflanzen. Die infizierten Blätter der transgenen
Linien kollabierten und zeigten stärkere Chlorosen (Abb. 22A). Wildtyp und transgene
Pflanzen, die mit avirulenten Pst DC3000 pVSP61:avrRpm1 Bakterien infiltriert wurden,
zeigten hingegen alle vergleichbare Symptome (Abb. 22B). Die Infektion mit Pst ΔTLR1 rief
erwartungsgemäß keine Krankheitssymptome hervor (Daten nicht gezeigt).
Abb. 22: Die Expression von XopB beschleunigt die Entwicklung von Krankheitssymptomen in A. thaliana während einer kompatiblen Interaktion mit Pst DC3000. Je sechs unabhängige Arabidopsis-Pflanzen der Linien Col-0 WT, EtOH::xopB Linie 10 und EtOH::xopB Linie 12 wurden mit jeweils 10 ml 1% EtOH gegossen. Achtzehn Stunden später wurden diese mit (A) einem virulenten (Pst (LV)) oder (B) einem avirulenten (Pst avrRmp1) Pst-Stamm infiltriert. Sowohl der virulente als auch der avirulente Pst-Stamm wurden mit 10 mM MgCl2 auf einem bakteriellen Titer von 5*105 cfu ml-1 eingestellt. Als mock-Kontrolle diente 10 mM MgCl2. 3,5 Tage nach Infiltration wurden die Phänotypen von abgeschnittenen Blättern dokumentiert. Je ein repräsentatives Blatt ist gezeigt. Die Zahlen unter den Blättern geben das Verhältnis von vergleichbaren Phänotypen zu der Gesamtzahl an behandelten Blätter an.
Die Krankheitssymptome nach Infektion des Stammes Pst DC3000 WT (ohne Leervektor)
(Abb. 23), der für die Titerbestimmung in planta verwendet wurde, waren mit denen von Pst
DC3000 pVSP61 (LV) ausgelösten vergleichbar.
Ergebnisse
75
Abb. 23: Die Expression von XopB beschleunigt die Entwicklung von Krankheitssymptomen in A. thaliana während einer kompatiblen Interaktion mit Pst DC3000 WT. Arabidopsis-Pflanzen der Linien Col-0 WT, EtOH::xopB Linie 10 und EtOH::xopB Linie 12 wurden mit jeweils 10 ml 1% EtOH gegossen. Achtzehn Stunden später wurden diese mit dem virulenten Pst-Stamm Pst DC3000 WT (Pst #185) mit einem bakteriellen Titer von 5*105 cfu ml-1 infiltriert. Als mock-Kontrolle diente 10 mM MgCl2. 3,5 Tage nach Infiltration wurden die Phänotypen von 6 abgeschnittenen Blättern dokumentiert. Je ein repräsentatives Blatt ist gezeigt. Die Zahlen unter den Blättern geben das Verhältnis von vergleichbaren Phänotypen zu der Gesamtzahl der behandelten Blätter an.
4.2.8. XopB verändert die Expression SA-abhängiger Gene und die SA-
Akkumulation in A. thaliana
Auf Grund des deutlich erhöhten bakteriellen Titers von Pst DC3000 in den transgenen
EtOH::xopB-Linien stellte sich die Frage, ob die Expression von Abwehrgenen der Pflanze
durch XopB beeinflusst wurde. Daher wurden die mRNA-Mengen der bekannten
Abwehrgene AtPR1 und AtPR3 mittels qPCR analysiert. Einen Tag nach Infektion (1 dpi) mit
Pst DC3000 betrug die mRNA-Menge von AtPR1 in beiden transgenen Linien nur etwa 10
bis 20% von der in Wildtyppflanzen gemessenen Menge und die von AtPR3 nur etwa 20 bis
40% (Abb. 24B).
Da AtPR1 und AtPR3 SA-abhängige Abwehrgene sind, wurde die Menge des Phytohormons
Salizylsäure (im Weiteren SA: salicylic acid) nach Infektion quantifiziert (Abb. 24A). Vor der
Infektion enthielten Wildtyp- und EtOH::xopB-Pflanzen etwa vergleichbare Mengen an freier
SA (SA – DC3000) und konjugierter SA (SAG – DC3000). Einen Tag nach Infektion (1 dpi)
stieg der Gehalt von freier SA in den Wildtyppflanzen auf etwa 40 ng cm-2 an, in den
Ergebnisse
76
EtOH::xopB-Pflanzen dagegen nur auf etwa 20 ng cm-2. Ein vergleichbarer Trend konnte für
die konjugierte SA gezeigt werden, jedoch waren die Unterschiede zwischen wildtypischen
und transgenen Pflanzen nicht signifikant (Abb. 24A).
Abb. 24: Die Expression von XopB vermindert die Akkumulation von SA und die Expression SA-abhängiger Gene. Vier unabhängige Arabidopsis-Pflanzen der Linien Col-0 WT, EtOH::xopB Linie 10 und EtOH::xopB Linie 12 wurden mit jeweils 10 ml 1% EtOH gegossen. Achtzehn h später wurden diese mit dem virulenten Pst-Stamm Pst DC3000 pVSP61 (EV) mit einer bakteriellen Dichte von 2.5*106 cfu ml-1 infiltriert. A) Gehalte an freier SA (SA – DC3000) und glykosylierter SA (SAG – DC3000) wurden mittels HPLC 0 und 1 dpi quantifiziert. Werte stellen Mittelwerte +/- SE aus 4 biologischen Replikaten dar (n= 4). Statistisch signifikante Unterschiede zwischen infizierten Wildtyp- und EtOH::xopB-Pflanzen wurden mittels student´s t-test berechnet und sind mit Sternchen gekennzeichnet (* p<0.05). Ähnliche Ergebnisse wurden in einem unabhängigen Experiment erzielt. B) Gesamt-RNA wurde 1 dpi isoliert und die mRNA-Mengen von AtPR1 und AtPR3 mittels qPCR bestimmt. Die Werte wurden auf Tubulin 4 (TUB4) normalisiert und relativ zu zu den Werten aus infizierten Col-0 WT-Blättern dargestellt, welche „1“ gesetzt wurden. Werte repräsentieren Mittelwerte +/- SD (n=3).
4.2.9. XopB führt zu einer verminderten Camalexin-Akkumulation in einer
inkompatiblen Interaktion
Wie in 4.2.7 beschrieben, war das bakterielle Wachstum des avirulenten Stammes Pst
pVSP61:avrRpm1 in den transgenen EtOH::xopB-Linen im Vergleich zum Wildtyp nicht
verändert. Dennoch zeigte sich nach Infektion mit diesem avirulenten Stamm, dass die
Gehalte des Phytoalexins Camalexin in den EtOH::xopB-Linien 10 bzw. 12 mit ca. 180 und
Ergebnisse
77
150 ng cm-2 signifikant niedriger waren als im Col-0 WT mit etwa 280 ng cm-2 (Abb. 25,
Camalexin – avrRpm1). Die Biosynthese von Camalexin wird u. a. durch SA reguliert (Zhou
et al., 1998), weshalb auch in dieser Arabidopsis-Pseudomonas-Interaktion die SA-Gehalte
bestimmt wurden. Interessanterweise konnten unter diesen Bedingungen zwar für beide
EtOH::xopB-Linien erniedrigte Gehalte an freier SA bestimmt werden, jedoch waren die
Unterschiede nur in der Linie 12 signifikant reduziert (Abb. 25, SA – avrRpm1). Der Gehalt
an gebundener SA war in beiden transgenen Linien im Vergleich zum Wildtyp tendenziell,
aber nicht signifikant niedriger (Abb. 25, SAG – avrRpm1). Wahrscheinlich tragen die
verringerten SA-Gehalte zu einer niedrigeren Camalexin-Akkumulation bei, aber
möglicherweise supprimiert XopB die Akkumulation von Camalexin zusätzlich durch einen
SA-unabhängigen Weg.
Abb. 25: XopB verändert die Akkumulation von SA und Camalexin in A. thaliana während einer inkompatiblen Interaktion. Je vier A. thaliana Col-0 Wildtyp- und transgene Pflanzen (EtOH::xopB Linien 10 und 12) wurden mit jeweils 10 ml 1% EtOH (v/v) gegossen. Nach 18 h wurden ganze Blätter mit dem avirulenten Stamm Pst DC3000 pVSP61:avrRpm1 mit einer bakteriellen Dichte von 2.5*106 cfu ml-1 infiltriert. Die Gehalte von freier (SA – avrRpm1) und glykosylierter SA (SAG – avrRpm1) sowie von Camalexin (Camalexin – avrRpm1) wurden mittels HPLC an Tag 0 und 1 nach Infektion (dpi: days post infection) bestimmt. Die Werte repräsentieren Mittelwerte +/- SE aus vier biologischen Replikaten. Statistisch signifikante Unterschiede zwischen infizierten Wildtyp- und EtOH::xopB-Pflanzen wurden mittels student´s t-test berechnet und sind mit Sternchen gekennzeichnet (** p<0.01; * p<0.05). ND: Nicht detektierbar.
Ergebnisse
78
4.3. Veränderungen der Virulenz der Xcv xopB-Deletionsmutante in der kompatiblen Interaktion mit Paprikapflanzen
Mit Hilfe der transgenen A. thaliana EtOH::xopB-Linien konnten einige Zielprozesse von
XopB identifiziert werden. In weiteren Versuchen wurde wieder auf das eigentliche Wirt-
Pathogen-System, Paprika-Xanthomonas, zurückgegriffen, um – soweit dies möglich war –
die Ergebnisse aus Abschnitt 4.2 auf Paprika zu übertragen. Dazu wurde mit den bereits
beschriebenen Xcv-Stämmen gearbeitet.
4.3.1. Die Deletion von xopB verändert nicht das bakterielle Wachstum von
Xcv in Paprika, aber die Entwicklung der Krankheitssymptome
Die Deletion von xopB führte wie bereits beschrieben zu einer starken Erhöhung der cw-Inv-
Aktivität von Paprikapflanzen (siehe 4.1). In einem nächsten Schritt wurde untersucht, ob die
Deletion von xopB auch zu einer veränderten Virulenz von Xcv führt. Dazu wurden
suszeptible Paprikapflanzen mit dem Xcv WT (Xcv (LV)), der xopB-Deletionsmutante Xcv
ΔxopB (LV) und einer Komplementationsmutante Xcv ΔxopB +xopB(-) infiziert. Der
Deletions- und der Komplementationsstamm wurden aus Kontrollgründen mit dem pBBR
Leervektor transformiert. Für eine Analyse des bakteriellen Wachstums in planta wurden die
oben beschriebenen Stämme mit einem niedrigen Titer (105 cfu ml-1) in suszeptible
Paprikapflanzen infiltriert. 0, 1, 3, 6 und 9 dpi wurde der bakterielle Titer in den infizierten
Blättern bestimmt. Es zeigte sich, dass die Deletion von xopB keinen starken Einfluss auf
das bakterielle Wachstum in planta hatte. Nur an Tag 3 konnte ein signifikant höherer
bakterieller Titer von Xcv ΔxopB (LV) festgestellt werden. An allen übrigen Tagen wuchs
dieser Stamm in etwa wie Xcv (LV) und Xcv ΔxopB +xopB (-) (Abb. 26).
Ergebnisse
79
Abb. 26: Die Deletion von xopB hat keinen Einfluss auf das bakterielle Wachstum von Xcv in planta. Xcv (LV), Xcv ΔxopB (LV) und Xcv ΔxopB +xopB (-) wurden in Blätter von suszeptiblen Paprikapflanzen mit einer Bakteriendichte von 105 cfu ml-1 infiltriert. Die Anzahl der Bakterien wurde 0, 1, 3, 6 und 9 Tage nach Infektion (dpi: days post infection) bestimmt. Signifikante Unterschiede zwischen Xcv (LV) und Xcv ΔxopB (LV) wurden mit einem student´s t-test ermittelt. (*): p<0.05. Fehlerbalken: Standardabweichung mit n=3.
4.3.2. Die Deletion von xopB beeinflusst die Entwicklung von
Krankheitssymptomen und vermindert die SA-Antwort
Um einen Einfluss von xopB auf die Entwicklung von Krankheitssymptomen zu untersuchen,
wurden suszeptible Paprikapflanzen mit den unter 4.3.1 beschrieben Xcv-Stämmen mit
einem hohen Titer infiltriert. Als Kontrollen wurden zusätzlich die T3SS-defiziente Mutante
Xcv ΔhrpB1 (LV) und 10 mM MgCl2 (mock-Kontrolle) infiltriert. Fünf Tage nach Infektion
wurde festgestellt, dass der Deletionsstamm Xcv ΔxopB (LV) geringere Krankheitssymptome
in Paprikablättern hervorrief als Xcv WT (LV) oder Xcv ΔxopB + xopB (-). Blätter, die mit dem
Xcv Wildtypstamm oder dem Komplementationsstamm infiziert wurden, zeigten zu diesem
Zeitpunkt kollabierte Blattbereiche und wässrige Läsionen. Die Infektion mit dem xopB-
Deletionsstamm hingegen verlief milder und es konnten nach 5 Tagen nur leichte Chlorosen
festgestellt werden. Xcv ΔhrpB1 (LV) verursachte auf Grund der ausgelösten PTI leichte
Chlorosen (Abb. 27A).
Ergebnisse
80
Da die Symptomentwicklung nach der Deletion von xopB verzögert war, sollte weiter
untersucht werden, ob die SA-Akkumulation verändert war. Dazu wurden die Gehalte an
freier und gebundener SA gemessen. Ein Tag nach Infektion (1 dpi) enthielten die Blätter,
die mit dem xopB-Deletionsstamm infiltriert wurden, 3-mal mehr freie SA als Blätter, die mit
Xcv Wildtyp- oder dem Komplementationsstamm Xcv ΔxopB + xopB (-) infiltriert wurden.
Nach 2 und 3 Tagen war dieser Unterschied noch deutlicher. Die Gehalte an gebundener SA
(SAG) waren 2 Tage nach Xcv ΔxopB-Infektion doppelt so hoch wie nach der Infektion mit
dem Xcv Wildtyp- oder dem Komplementationsstamm Xcv ΔxopB + xopB (-) (Abb. 27B).
Parallel dazu war drei Tage nach Infektion (3 dpi) mit dem xopB-Deletionsstamm die
Expression des SA-abhängigen Gens CaPR1b1 sowie des SA- und Hexose-abhängigen
Gens CaPRQ (Herbers et al., 1996a) 9-fach bzw. 5-fach gegenüber Xcv WT-infizierten
Blättern induziert. Blätter, die mit dem Komplementationsstamm infiziert wurden, zeigten eine
vergleichbare Expression dieser beiden Abwehrgene wie nach einer Xcv WT-Infektion (Abb.
27C). Interessanterweise war die mRNA-Menge von CaPRQ nach Infektion mit Xcv ΔhrpB1
(LV) mit einer 20-fachen Induktion am höchsten. Vermutlich war dies auf erhöhte Hexose-
Gehalte zurückzuführen, die dieser Stamm in Paprika hervorruft (Sonnewald et al., 2012).
Ergebnisse
81
Abb. 27: Die Deletion von xopB führt zu einem verzögertem Krankheitsverlauf, erhöhten SA-Gehalten und einer höheren Expression von PR-Genen in Xcv-infizierten Paprika-Blättern. Ausgewachsene Blätter fünf Wochen alter suszeptibler Paprikapflanzen wurden entweder mit Xcv WT (LV), Xcv ΔxopB (LV), einem Komplementationsstamm, der xopB unter der Kontrolle des eigenen Promotors in trans exprimiert, (Xcv ΔxopB + xopB) oder der TTSS-defizienten Mutante Xcv ΔhrpB1 (LV) mit einer bakteriellen Dichte von 109 cfu ml-1 infiltriert. Als Kontrolle wurden Blätter mit 10 mM MgCl2 infiltriert (mock). LV: pBBR1-MCS5 Leervektor. A) Phänotyp 5 Tage nach Infektion (dpi). Nur die unteren Hälften der Blätter wurden infiltriert. Das Experiment wurde mind. zweimal mit vergleichbaren Ergebnissen wiederholt. B) Gehalte von freier und glykosylierter SA (Freie SA bzw. SAG) von infiltrierten Blättern wurden 0, 1, 2 und 3 dpi mittels HPLC bestimmt. Für jeden Xcv-Stamm wurde je ein Blatt von zwei Paprikapflanzen infiltriert. Die Werte repräsentieren den Mittelwert +/- SE (n= 4). Statistisch signifikante Unterschiede zu Xcv WT-infizierten Blättern wurden mittels student´s t-test berechnet und sind mit Sternchen gekennzeichnet. (**** p<0.0001; *** p<0.001; ** p<0.01 und * p<0.05). In einem unabhängigen Experiment wurden vergleichbare Ergebnisse erzielt. C) Gesamt-RNA wurde 3 Tage nach Infektion (dpi) isoliert
Ergebnisse
82
und die Menge an mRNA von CaPR1b1 and CaPRQ mittels qPCR bestimmt. Werte wurden auf CaEF1alpha normalisiert und relativ zu den Werten aus Xcv WT (LV)-infizierten Blättern dargestellt, welche „1“ gesetzt wurden. Die relative Expression von CaPR1b1 in mock-behandelten Blättern war 0.0006 +/-0.0002. Die Werte repräsentieren Mittelwerte +/- SD (n=3).
4.3.3. Einfluss der xopB-Deletion auf die Akkumulation von ROS in Paprika
Im Modellorganismus A. thaliana konnte gezeigt werden, dass XopB die ROS-Produktion
nach Stimulation mit flg22 supprimiert (siehe 4.2.4). Da keine transgenen Paprikapflanzen
zur Verfügung standen bzw. deren Generierung schwierig ist und die transiente
Proteinexpressionen in Paprika nur unzureichend funktioniert, wurde ein anderer
Versuchsaufbau gewählt, um die ROS-Produktion in Paprika zu untersuchen. Nach Infektion
von Paprikablättern mit Xcv WT, dem xopB-Deletionsstamm, dem xopB-
Komplementationsstamm, der hrpB1-Mutante bzw. 10 mM MgCl2 als Kontrolle, wurde die
Bildung von ROS histochemisch mit 3-3´-Diaminobenzidin (DAB) nachgewiesen. DAB fällt in
Gegenwart von ROS als brauner Niederschlag aus. Die Intensität der Braunfärbung in den
Blattproben gibt Aufschluss über die Menge an produzierten ROS. Drei Tage nach Infektion
zeigten die mit Xcv ΔxopB (LV) infiltrierten Blattproben im Vergleich zu allen anderen
Blattproben die intensivste Braunfärbung, was auf eine erhöhte ROS-Produktion
zurückzuführen ist. Blätter, die mit Xcv WT oder dem xopB-Komplementationsstamm
infiltriert wurden, zeigten vergleichbare Braunfärbungen, die aber im Vergleich zu der
Infektion mit dem xopB-Deletionsstamm deutlich schwächer ausfiel. (Abb. 28A). Somit
scheint XopB in der Interaktion zwischen Paprika und Xcv notwendig zu sein, um die
Akkumulation von ROS zu vermindern. Die Intensität des DAB-Niederschlages wurde mit
dem Programm ImageJ, in dem der „DAB-Vektor“ zur Trennung der Farbkanäle gewählt
wurde, quantifiziert (Abb. 28B).
Da die hier gezeigte ROS-Antwort 3 Tage nach Infektion bestimmt wurde und daher nicht
direkt die frühe flg22-stimulierte ROS-Produktion wie in A. thaliana widerspiegelt, wurden
außerdem die mRNA-Mengen von CaPO2 und CaRbohD bestimmt. CaPO2 ist eine
Zellwand-assoziierte Peroxidase und spielt in der Pathogenabwehr von Paprika eine wichtige
Rolle. Ferner wurde sie als ein ROS-produzierendes Enzym identifiziert (Choi et al., 2007).
Parallel zu den erhöhten ROS-Werten war die mRNA-Menge für CaPO2 nach Infektion mit
Xcv ΔxopB (LV) gegenüber der Xcv Wildtyp- und der Komplementationsstamm-Infektion
etwa 3-fach erhöht (Abb. 28C). Hingegen war die mRNA-Menge von CaRbohD, dem
homologen Gen zu AtRbohD aus Arabidopsis, nur etwa 0.5-fach gegenüber der Xcv Wildtyp-
und der Komplementationsstamm-Infektion erhöht. Daher ist es wahrscheinlich, dass 3 Tage
nach Infektion mit Xcv ΔxopB (LV) die erhöhte Expression von CaPO2 mehr ROS in den
Ergebnisse
83
Paprikablättern produzierte. Die Expressionsdaten von CaRbohD legen nahe, dass diese
NADPH-Oxidase zu diesem Zeitpunkt der Infektion (3 dpi) vermutlich weniger stark zur ROS-
Produktion beiträgt. Unterstützt wird diese Hypothese dadurch, dass das Expressionsprofil
von CaPO2 den DAB-Intensitäten aller Proben, also auch denen der mock- und hrpB1-
Kontrollen, folgt (vgl. Abb. 28B und C). Im Gegensatz dazu ist die Expression von CaRbohD
im Vergleich zu allen anderen Proben nach Infektion mit Xcv ΔhrpB1 am höchsten. Die
Infektion mit Xcv ΔhrpB1 verursachte aber nur eine sehr geringe DAB-Intensität (vgl. Abb.
28B und D). Somit ist es – zumindest für diesen Zeitpunkt der Infektion – unwahrscheinlich,
dass eine veränderte Expression von CaRbohD die ROS-Produktion beeinflusste.
Als Kontrolle wurde die Expression der cw-Inv aus Paprika (CaCwInv) bestimmt. Die mRNA-
Menge von CaCwInv war wie die von CaPO2 nach Infektion mit Xcv ΔxopB (LV) deutlich
höher als nach Infektion mit Xcv WT (LV) oder dem xopB-Komplementationsstamm (Abb.
28E). Nach Infiltration mit Xcv ΔhrpB1 (LV) unterschied sich das Expressionsmuster der
CaCwInv von CaPO2, was darauf hindeutet, dass diese beiden Gene teilweise durch
verschiedene Prozesse reguliert werden. Die in etwa gleichstarke Transkriptakkumulation
der CaCwInv nach Infiltration von Xcv WT (LV) und Xcv ΔxopB (LV) bestätigt zudem die
eingangs beschriebene Effektor-vermittelte Suppression der cw-Inv-Expression und -Aktivität
in Paprika.
Abb. 28: Die Deletion von xopB führt zu einer höheren Akkumulation von ROS in Xcv-infizierten Paprika-Blättern. Ausgewachsene Blätter fünf Wochen alter suszeptibler Paprikapflanzen wurden entweder mit Xcv WT (LV), Xcv ΔxopB (LV), einem Komplementationsstamm, der xopB unter der Kontrolle des eigenen Promotors in trans exprimiert, (Xcv ΔxopB + xopB) oder der TTSS-defizienten Mutante Xcv ΔhrpB1 (LV) mit einer bakteriellen Dichte von 109 cfu ml-1 infiltriert. Als Kontrolle wurden Blätter mit 10 mM MgCl2 infiltriert (mock). LV: pBBR1-MCS5 Leervektor. Für jeden Xcv-Stamm wurden jeweils zwei ganze Blätter von zwei Paprikapflanzen infiltriert. Drei
Ergebnisse
84
Tage nach Infiltration wurden in jeweils sechs 4 cm2 große Blattscheiben ROS mittels DAB angefärbt. Nach dem Entfernen des Chlorophylls wurden pro Blattscheibe sechs zufällig ausgewählte Bereiche mikroskopiert. A) Je eine repräsentative Mikroskopieaufnahme ist gezeigt. B) Die Pixel-Intensität der Aufnahmen wurde mittels ImageJ bestimmt. Werte repräsentieren Mittelwerte +/- SE (n= 18) und sind relativ zu dem Wert aus Xcv WT (LV)-infizierten Blättern dargestellt, welcher „1“ gesetzt wurde. Statistisch signifikante Unterschiede zu Xcv WT-infizierten Blättern wurden mittels student´s t-test berechnet und sind mit Sternchen gekennzeichnet. (**** p<0.0001; *** p<0.001). Vergleichbare Ergebnisse wurden in einem unabhängigen Experiment erzielt. C), D) und E) Drei Tage nach Infektion wurde aus den Blättern die Gesamt-RNA isoliert und die mRNA-Menge der Gene CaPO2, CaRbohD bzw. CaCwInv mittels qPCR bestimmt. Werte wurden auf CaEF1alpha normalisiert und relativ zu den Werten aus Xcv WT (LV)-infizierten Blättern dargestellt, welche „1“ gesetzt wurden. Die relative Expression von CaPO2 und CaCwInv in mock-behandelten Blättern betrug 0.003 +/- 0.00072 bzw. 0.01 +/- 0.001. Werte repräsentieren Mittelwerte +/- SD (n= 3).
4.3.4. CaPO2 und CaCwInv sind ROS-abhängige Gene
Da die xopB-Deletion die Expression von CaPO2, CaRbohD und CaCwInv beeinflusste und
gleichzeitig die Produktion von SA und ROS anstieg, wurde in einem nächsten Schritt
untersucht, ob die Transkription von CaPO2, CaRbohD und CaCwInv direkt durch SA oder
ROS reguliert wird. Aufgrund von Literaturdaten bezüglich der Zucker-vermittelten
Expression von Zellwand-gebundenen Invertasen (Roitsch et al., 1995; Godt and Roitsch,
1997) wurde auch der Einfluss der Zucker Saccharose und Glukose auf die Expression der
CaCwInv getestet. Das Phytohormon ABA (Abscisinsäure, ABA: abscisic acid), das in der
Interaktion mit hemi-biotrophen Bakterien wie Xcv eine untergeordnete Rolle spielt, wurde
als Kontrolle mitgeführt. Mit den genannten Substanzen wurde ein „floating“-Experiment
durchgeführt. Dazu wurden Blattscheiben von unbehandelten Paprikablättern in
verschiedenen Lösungen für 18 h im Dunkeln inkubiert. Als Testlösungen dienten 10 mM
H2O2, 100 µM SA, 100 µM ABA, 250 mM Glukose und 250 mM Saccharose. Deionisiertes
Wasser (dH2O) und MeOH:dH2O 1:1000 dienten als Kontrollen für H2O2, Glukose und
Saccharose bzw. für SA und ABA. Anschließend wurde die Gesamt-RNA isoliert und in
cDNA umgeschrieben und mittels qPCR die Expressionsniveaus der Gene CaPO2,
CaRbohD und CaCwInv bestimmt.
CaPO2 und CaCwInv zeigten nach Behandlung mit 10 mM H2O2 eine gegenüber dH2O 8-
fach bzw. 4-fach erhöhte Transkriptmenge (Abb. 29). Die Expression von CaPO2 wurde
durch die Behandlung mit den Phytohormonen SA und ABA hingegen nicht erhöht. Die
Behandlung mit Saccharose führte zu einer 3-fachen Erhöhung der Expression von CaPO2,
wohingegen die Glukosebehandlung zu einer etwa 10-fachen Suppression führte. Die
Expression der CaCwInv wurde durch keine weiteren Substanzen nennenswert verändert.
Die Expression von CaRbohD wurde durch H2O2 nur leicht erhöht (2-fach).
Die Ergebnisse legen nahe, dass CaPO2 und CaCwInv ROS-regulierte Gene sind. Da die
Infektion mit Xcv ΔxopB (LV) in Paprikablättern eine erhöhte ROS-Produktion zur Folge
Ergebnisse
85
hatte, könnte dies zu einer erhöhten Expression von CaPO2 und CaCwInv geführt haben.
Als Kontrolle für die Inkubationen mit SA- und Zuckerlösungen wurde das SA- und
Zuckerregulierte Gen CaPRQ analysiert. Dieses zeigte nach Behandlung mit SA und
Glukose eine etwa 7-fach bzw. 6-fach erhöhte Transkriptmenge. Unerwarteterweise wurde
die Transkriptmenge von CaPRQ aber auch durch ABA etwa 8.5-fach erhöht. Im Gegensatz
zu Herbers et al. (1996b) wurde die Expression CaPRQ in dieser Arbeit nicht durch
Saccharose induziert.
Abb. 29: Transkriptionelle Regulation von CaCwInv, CaRbohD, CaPO2 und CaPRQ vermittelt durch Abwehr-assoziierte externe Stimuli. Blattscheiben von sechs Paprikapflanzen wurden im Dunkeln in 6-Loch Schalen auf 10 mM H2O2, 100 µM SA, 10 µM ABA, 250 mM Saccharose oder 250 mM Glukose für 18 h inkubiert. Deionisiertes Wasser und deionisiertes Wasser versetzt mit Methanol (1:1000) wurden als Kontrollen mitgeführt. Jeweils sechs Blattscheiben wurden vereinigt und aus diesen Gesamt-RNA extrahiert. Mittels qPCR wurden die mRNA-Mengen der angegebenen Gene bestimmt. Werte wurden auf CaEF1alpha normalisiert und relativ zu den Werten von Blattscheiben dargestellt, die mit deionisiertem Wasser inkubiert wurden, welche „1“ gesetzt wurden. Werte repräsentieren Mittelwerte +/- SD (n= 3). Vergleichbare Ergebnisse wurden in einem unabhängigen Experiment erzielt.
4.4. Subzellulär Lokalisierung von XopB in planta Mit Hilfe von subzellulären Lokalisierungsstudien sollte versucht werden, in welchem
Kompartiment der Wirtszelle XopB seine Wirkung ausübt. Für alle folgenden Lokalisierungen
wurden transiente Agrobacterium tumefaciens-vermittelte Überexpressionen in N.
benthamiana durchgeführt (im Weiteren Agroinfiltration). In der Regel wurden die zu
untersuchenden Gene in binäre Vektoren kloniert, die eine translationale Fusion mit den
Fluorophoren eGFP (enhanced green fluorescenct protein, zusammengefasst in (Tsien,
1998)), mCherry (Shaner et al., 2004), mRFP (monomeric red fluorescent protein (Campbell
et al., 2002)) oder tagRFP (ein monomeres RFP (Merzlyak et al., 2007)) ermöglichten. Nach
erfolgter Expression wurden die fluoreszierenden Fusionsproteine dann mit Hilfe eines
konfokalen laser scanning Mikroskops (KLSM) subzellulär in planta lokalisiert.
Ergebnisse
86
4.4.1. Subzelluläre Lokalisierung von GFP-markiertem XopB in N. benthamiana
und S. lycopersicum
Um einen ersten Eindruck von der subzellulären Lokalisierung von XopB in planta zu
erhalten, wurde XopB als N- und C-terminale eGFP-Fusion in N. benthamiana
überexprimiert. Dazu dienten die Konstrukte pK7WGF2.0:xopB (kurz eGFP-XopB) und
pK7FWG2.0:xopB (kurz XopB-eGFP). Beide binäre Vektoren besitzen einen 35S-Promotor
und -Terminator aus dem Blumenkohlmosaikvirus, wodurch eine starke Expression in
Pflanzen erzielt wird. Das eGFP-XopB-Konstrukt wurde zusätzlich auch in Tomate (S.
lycopersicum) getestet und zeigte dort vergleichbare Ergebnisse wie in N. benthamiana.
Einen Tag nach Agroinfiltration wurden untere Epidermiszellen am KLSM untersucht. N- und
C-terminale eGFP-Fusionen mit XopB führten zu einer vergleichbaren Lokalisierung, was
darauf hindeutet, dass die GFP-Fusionen keinen negativen Einfluss auf die Lokalisierung
von XopB hatten. Die GFP-Fluoreszenz konnte vor allem in Hecht´schen Filamenten (hf) und
in Vesikel-ähnlichen Strukturen (v) detektiert werden, was auf eine Lokalisierung im Zytosol
bzw. dem Endomembransystem hindeutete (Abb. 30A). Der Zellkern (nc) war von GFP-
Fluoreszenz umschlossen, was ebenfalls auf eine zytosolische oder aber auch auf eine ER-
Lokalisierung im hindeuten könnte. Da aber im Cortex der Epidermiszellen nie die typischen
ER-Netzstrukturen aufgenommen werden konnten, ist eine partielle zytosolische
Lokalisierung wahrscheinlicher. Eine Lokalisierung an der Plasmamembran (pm) konnte
nicht eindeutig ausgeschlossen werden, da sowohl eGFP-XopB als auch XopB-eGFP
streckenweise eine sehr scharfe, dünne Linie entlang der Zellperipherie aufzeigten. Die
Expression der GFP-Konstrukte zum Zeitpunkt der Mikroskopie wurde im Western-Blot mit
einem anti-GFP Antikörper nachgewiesen. Beide Konstrukte zeigten die erwartete Größe
von etwa 95 kDa (~65 kDa (XopB) + ~30 kDa (eGFP)), wobei das eGFP:XopB-Konstrukt
wahrscheinlich einem Abbauprozess unterlag, wodurch eine zweite Bande mit einem
geringeren Molekulargewicht entstand (Abb. 30B). Freies GFP bei ~30 kDa konnte in keiner
Probe nachgewiesen werden und es konnte somit ausgeschlossen werden, dass der
zytosolische Anteil von eGFP-XopB und XopB-eGFP, der in der Mikroskopie gezeigt wurde,
auf abgebautes Fusionsprotein zurückzuführen war.
Ergebnisse
87
Abb. 30: Subzelluläre Lokalisierung von XopB:eGFP und eGFP:XopB. A) Mittels Agrobakterien-vermittelter Transformation wurden in N. benthamiana eGFP:XopB und XopB:eGFP und in S. lycopersicum eGFP:XopB überexprimiert. Einen Tag nach Agroinfiltration wurden untere Epidermiszellen am KLSM mikroskopiert. Grün: eGFP-Fluoreszenz. Rot: Autofluoreszenz der Chloroplasten. hf: Hecht´sches Filament, v: Vesikel-ähnliche Struktur, pm: Plasmamembran, nc: Nukleus. B) Western-Blot-Analyse der in N. benthamiana überexprimierten Konstrukte. XopB:eGFP und eGFP:XopB wurden mit GFP-spezifischen Antikörpern nachgewiesen.
4.4.2. Subzelluläre Fraktionierung von XopB in N. benthamiana
Um die subzelluläre Lokalisierung von XopB genauer zu untersuchen, wurden die GFP-
Fusionen von XopB und ein C-terminal cmyc-markiertes XopB (35S::xopB-cmyc) in N.
benthamiana überexprimiert, Zellextrakte hergestellt und diese anschließend fraktioniert.
Dazu wurden in einem ersten Schritt die Gesamtproteinextrakte durch langsames
Zentrifugieren von Zelltrümmern befreit. Der erhaltene Überstand (LSS: low speed
supernatant) wurde dann mittels Ultrazentrifugation in eine mikrosomale Fraktion (USP: ultra
speed pellet) und eine lösliche Fraktion (USS: ultra speed supernatant) aufgetrennt. XopB-
cmyc und eGFP-XopB konnten ausschließlich im USP nachgewiesen werden. Nur XopB-
eGFP konnte sowohl im USP als auch in der USS-Fraktion nachgewiesen werden. Dieses
Konstrukt wurde jedoch auch stärker exprimiert als eGFP-XopB, wie in der LSS-Fraktion zu
sehen ist (Abb. 31). Um zu kontrollieren, ob USS und USP sauber getrennt worden sind,
wurden die endogenen Proteine H+-ATPase (Plasmamembranmarker) und die Saccharose-
Phosphat-Phosphatase SPP2 (Zytosolmarker) mit spezifischen Antikörpern nachgewiesen.
SPP2 und H+-ATPase waren wie erwartet nur in den Fraktionen LSS und USS bzw. LSS und
USP vorhanden. Somit ist anzunehmen, dass die Fraktionierung der XopB-Konstrukte nicht
auf Kreuzkontaminationen zurückzuführen ist, sondern die tatsächliche Lokalisierung
repräsentiert.
Ergebnisse
88
Abb. 31: Subzelluläre Fraktionierung von XopB:cmyc, XopB:eGFP und eGFP:XopB. Mittels Agrobakterien-vermittelter Transformation wurden die angegebenen Konstrukte in N. benthamiana transient überexprimiert (35S-Promotor). Zwei Tage nach Agroinfiltration wurde Blattmaterial geerntet und ein Gesamtproteinextrakt hergestellt. Nach dem Abtrennen der Zelltrümmer durch Zentrifugation bei 10´000 g wurde der Überstand (LSS: low speed supernatant) mittels Ultrazentrifugation bei 100´000 g in eine lösliche Fraktion (USS: ultra speed supernatant) und eine mikrosomale Fraktion (USP: ultra speed pellet) getrennt. Die XopB-Konstrukte wurden mit cmyc- bzw. GFP-spezifischen Antikörpern in den einzelnen Fraktionen nachgewiesen. Die Trennung in USS und USP wurde mit anti-SPP2- bzw. anti-H+-ATPase-Antikörpern nachgewiesen.
Die oben beschriebene mikrosomale Fraktion (USP) enthält die Plasmamembran und alle
Endomembranen wie z.B. das ER. Mit einem wässrigen Zweiphasen-System aus Dextran
T500 und PEG 3350 kann die Plasmamembran von den übrigen Endomembranen
abgetrennt werden (Larsson et al., 1994). Für dieses Vorhaben wurden transgene N.
tabacum-Pflanzen verwendet, die xopB unter einem Ethanol-induzierbaren Promotor tragen
(im Weiteren N. tabacum EtOH::xopB). Nach Induktion des Transgens mit 1% Ethanol wurde
Battmaterial nach 18 h und 42 h entnommen und zunächst eine mikrosomale Fraktion (USP)
nach Larsson et al. (1994) hergestellt. Diese wurde dann in Plasmamembran- und
Endomembranfraktionen getrennt. Es zeigte sich, dass XopB zu beiden Zeitpunkten nur in
der mikrosomalen Fraktion (USP) und in der Plasmamembranfraktion (PM) vorhanden war
Abb. 32). Um zu überprüfen, ob die Fraktionierung erfolgreich war, wurden endogene
Markerproteine für die Kompartimente Plasmamembran (PM), Endoplasmatisches Retikulum
(ER), Golgi (G) und Vacuole (Vac) nachgewiesen. Dazu wurden spezifische Antikörper
gegen H+-ATPase (PM), BIP2 (ER), Arf-1 (G) und V-ATPase (Vac) verwendet. Alle
endogenen Marker konnten im USP nachgewiesen werden und die Fraktionierung in Endo-
und Plasmamembranen war in Bezug auf den PM- und ER-Marker erfolgreich, da sich die
H+-ATPase und BIP2 in der Plasmamembran- (PM) bzw. Endomembran-Fraktion (EM)
anreicherten. Der Golgi- und der Vacuolen-Marker traten jedoch auch in der PM-Fraktion auf.
Möglicherweise gelangen diese Kompartimente oder Teile davon ebenfalls in diese Fraktion.
Larsson et al. (1994) konnten zwar mit Hilfe von Enzymaktivitätsmessungen zeigen, dass die
Plasmamembran von Endomembranen abgetrennt worden ist, jedoch wurden für die
Ergebnisse
89
Endomembranfraktion nur die Aktivitäten von ER- und Mitochondrien-spezifischen Enzymen
gemessen. Daher bleibt es unklar, ob mit dieser Methode überhaupt Golgi- und
Vacuolenmembranen von Plasmamembranen abgetrennt werden können. Zusammen mit
den Ergebnissen der transienten Überexpression der GFP-markierten XopB-Konstrukte
bleibt festzuhalten, dass XopB bevorzugt an der Plasmamembran und/ oder Vesikel-
ähnlichen Strukturen in planta akkumuliert.
Abb. 32: Subzelluläre Fraktionierung der mikrosomalen Fraktion nach Larsson et al. (1994). Transgene N. tabacum EtOH::xopB-Pflanzen wurden mit 1%igem Ethanol induziert. 18 (links) und 42 (rechts) h nach Ethanolinduktion wurde Blattmaterial geerntet und ein Gesamtproteinextrakt hergestellt. Nach dem Abtrennen der Zelltrümmer durch Zentrifugation bei 10´000 g wurde dieser mittels Ultrazentrifugation bei 100´000 g in eine lösliche Fraktion (USS: ultra speed supernatant) und eine mikrosomale Fraktion (USP: ultra speed pellet) getrennt. Die mikrosomale Fraktion wurde anschließend in eine Plasmamembranfraktion (PM) und eine Endomembranfraktion (EM) getrennt. Exprimiertes XopB-Protein wurde mit einem anti-XopB-Antikörper nachgewiesen. Die Trennung des USP in PM und EM wurde mit anti-H+ATPase- bzw. anti-BIP2-Antikörper nachgewiesen. Representative Proteine für Golgi (G) und Vacuole (Vac) wurden mit anti-Arf1 bzw. anti-V-ATPase nachgewiesen.
4.4.3. Solubilisierung von cmyc-markiertem XopB
Der genaue Mechanismus wie XopB an Membranen und Vesikeln lokalisieren kann war
unklar, da XopB weder ein Myristoylierungsmotiv noch Transmembrandomänen besitzt, wie
dies beispielsweise bei den Effektorproteinen XopJ aus Xanthomonas bzw. SseF aus
Salmonella der Fall ist (Thieme et al., 2007; Üstün et al., 2012). Es sollte daher versucht
werden, ob sich die Löslichkeit von XopB mit Detergenzien erhöhen lässt. In der Tat konnten
die Detergenzien CYMAL-5, FOS-Cholin, DEM und DOM, die häufig für die Solubilisierung
von Membranproteinen verwendet werden, transient in N. benthamiana exprimiertes XopB
komplett von der unlöslichen mikrosomalen Fraktion in die lösliche Fraktion bringen (Abb.
33). Als Kontrolle wurde wieder die endogene H+-ATPase im Western-Blot detektiert. Dieses
integrale Plasmamembranprotein verhielt sich in Bezug auf die Löslichkeit wie XopB und war
Ergebnisse
90
somit ebenfalls im löslichen Überstand. Die Detergenzien CHAPS und OG sind offenbar für
die Solubilisierung von XopB und der H+-ATPase nicht geeignet, da beide Proteine nach
Behandlung mit diesen Detergenzien weder in der löslichen noch der unlöslichen Fraktion
vorhanden waren.
Aus diesem Experiment kann vermutet werden, dass XopB mit einem Membran- oder
Vesikel-assoziierten pflanzlichen Protein interagiert und nach Detergenzbehandlung
zusammen mit diesem unbekannten Interaktionspartner in die lösliche Fraktion gelangt.
Abb. 33: Ansätze zur Solubilisierung von XopB-c-myc durch Detergenzien. Mittels Agrobakterien-vermittelter Transformation wurde XopB-c-myc in N. benthamiana transient überexprimiert (35S-Promotor). Zwei Tage nach Agroinfiltration wurde ein Gesamtproteinextrakt hergestellt. Nach dem Abtrennen der Zelltrümmer durch Zentrifugation bei 10´000 g wurde der Überstand (L: low speed supernatant) aliquotiert und mit den angegebenen Detergenzien (1 bis 6) oder Puffer inkubiert. Anschließend wurden die Ansätze bei 100´000 g in eine lösliche (U: ultraspeed supernatant) und eine unlösliche Fraktion (P: ultra speed pellet) getrennt. Detergenzien: 1: CHAPS; 2: CYMAL-5; 3: FOS-Cholin; 4: DEM (n-Decyl-"-D-maltopyranosid); 5: DOM (n-Dodecyl-"-D-maltopyranosid); 6: OG (n-Octyl-"-D-glucopyranosid). wt: Überstand (L: low speed supernatant) einer unbehandelten Wildtyppflanze. Das XopB-c-myc-Protein wurde mit anti-c-myc-Antikörper nachgewiesen. Die Trennung in die Fraktionen U und P wurde mit dem anti-H+ATPase-Antikörper verfolgt.
4.4.4. XopB lokalisiert in N. benthamiana an der Plasmamembran und in frühen
Endosomen
Um die in Abb. 30 gezeigten Lokalisierungen von XopB genauer zu bestimmen, wurden die
Konstrukte zusammen mit einem Plasmamembranmarker (PM-rk, (Nelson et al., 2007)),
einem Golgimarker (G-rb, (Nelson et al., 2007)) oder einem Marker für frühe Endosomen
(tagRFP-ARA7, (Ueda et al., 2001)) transient in N. benthamiana koexprimiert. Zwei Tage
nach Agroinfiltration wurde am KLSM untersucht mit welchem Kompartiment-Marker XopB
kolokalisierte. Die bereits in Abb. 30 gezeigten Vesikel-ähnlichen Strukturen von XopB-eGFP
und eGFP-XopB konnten als frühe Endosomen identifiziert werden, da XopB-eGFP mit
tagRFP-ARA7 kolokalisierte. Dabei konnten kleinere Endosomen von 1-2 !m Durchmesser
detektiert werden, aber auch größere Strukturen mit den Ausmaßen 3x10 !m (Abb. 34, erste
und zweite Reihe). Neben diesen Endosomen konnten jedoch auch Bereiche ausgemacht
werden, in denen GFP-markiertes XopB als dünne, scharfe Linie entlang der Zellperipherie
vorlag. Dieses typische Erscheinungsbild deutete auf eine Lokalisierung von XopB an der
Plasmamembran hin. Dies konnte mittels Koexpression des Plasmamembranmarkers PM-rk
Ergebnisse
91
bestätigt werden (Abb. 34, vierte Reihe). Zusätzlich wurde durch Zugabe von Sorbitol eine
Plasmolyse durchgeführt, wodurch sich die Plasmamembran von der Zellwand ablöst und
sich ins Zellinnere zurückzieht. Damit konnte gezeigt werden, dass sich das mit dem PM-
Marker kolokalisierte eGFP-XopB als scharfe Linie ins Zellinnere zurückzieht (Abb. 34, fünfte
Reihe, 700 mM Sorbitol). Neben diesen eindeutigen PM-Bereichen konnten aber auch Linien
im GFP-Kanal ausgemacht werden, die keine oder nur eine sehr schwache Fluoreszenz des
PM-Markers zeigten. Dies sind entweder Plasmamembranabschnitte, die unzureichend
markiert sind oder stellen Endomembranen und Hetch´sche Filamente dar. Schulze et al.
(2012) konnten für XopB-eGFP eine Kolokalisierung mit dem Golgimarker G-rk (Nelson et
al., 2007) zeigen. Im Rahmen dieser Arbeit konnte dies jedoch nicht bestätigt werden. Es
wurde hier der Marker G-rb aus der „Nebenführ“-Kollektion verwendet (Nelson et al., 2007),
der gegenüber G-rk ein Basta-Resistenzgen statt eines Kanamycin-Resistenzgens auf der T-
DNA trägt. Die Aufnahmen dieser Koexpression wurden 1 und 2 Tage nach Agroinfiltration
am KLSM durchgeführt. Golgi- und XopB-Vesikel befanden sich zwar in räumlicher Nähe,
aber es konnte zu keinem Zeitpunkt eine Kolokalisierung von XopB-eGFP mit dem
Golgimarker G-rb gezeigt werden (Abb. 34, Reihe 6). Als Kontrolle wurde der Golgimarker
mit freiem GFP koexprimiert.
Ergebnisse
92
Abb. 34: XopB kolokalisiert mit der Plasmamembran und frühen Endosomen. Mittels Agrobakterien-vermittelter Transformation wurde XopB-eGFP und eGFP-XopB in N. benthamiana transient überexprimiert (35S-Promotor). Als Marker für die Kompartimente „frühes Endosom“, „Plasmamembran“ und „Golgi“ wurden, wie angegeben, die Fusionsproteine tagRFP-ARA7, AtPIP2A-mCherry (PM-rk) bzw. GmMan49-mCherry (G-rb) koexprimiert. Als silencing suppressor wurde p19 koexprimiert. Zwei Tage nach Agroinfiltration wurden untere Epidermiszellen am KLSM mikroskopiert. Für die Kolokalisierungsstudien mit dem Golgi-Marker wurden 1 und 2 Tage nach Agroinfiltration (dpi) Aufnahmen angefertigt. Für eine Plasmolyse wurde ein Blattpräparat für 30 min mit 700 mM Sorbitol inkubiert. Chl: Chloroplasten. freeGFP: lösliches GFP.
Ergebnisse
93
4.4.5. XopB beeinflusst Größe und Bewegung von ARA7-positiven Strukturen
Bei den ersten Kolokalisierungsstudien mit dem Endosomenmarker ARA7 entstand der
Eindruck, dass die Größe vieler ARA7-positiver Vesikel nach XopB-Expression im Vergleich
zu den von Kotzer et al. (2004) publizierten Vesikelgrößen verändert war. Daher wurde in
einem unabhängigen Experiment besonders auf Größe und Bewegung der ARA7-Vesikel
geachtet. Dazu wurde tagRFP-ARA7 zusammen mit nicht-markiertem XopB oder dem
korrespondierenden Leervektor (pBinAR) in N. benthamiana exprimiert. Zwei Tage nach
Agroinfiltration wurden untere Epidermiszellen als sog. z-Stapel aufgenommen, um die
Größe möglichst vieler ARA7-Vesikel zu überprüfen, und Zeitaufnahmen über 16 Sekunden
angefertigt, um die Bewegung der ARA7-Vesikel zu verfolgen.
Frühe Endosomen, die mit ARA7 markiert werden, sind als mobile Strukturen beschrieben
worden (Ueda et al., 2001). Es sollte mit Hilfe der Zeitaufnahmen gezeigt werden, ob sich die
XopB-abhängige Vergrößerung der frühen Endosomen auf deren Bewegung in der Zelle
auswirkt. In einem Zeitraum von 16 Sekunden legten die frühen Endosomen unter
Kontrollbedingungen (tagRFP-ARA7 + pBinAR (LV)) eine Distanz von etwa 10 µm innerhalb
der Zelle zurück, und verließen dann in der Regel die Fokusebene. Dies wurde in einer
Maximalprojektion über die Zeit (t-Maximalprojektion, 16 sec) gezeigt, in der die Bewegung
der ARA7-Vesikel als Spur nachzuverfolgen ist (Abb. 35A). Diese beschriebene Bewegung
kommt nach Koexpression von XopB zum Erliegen (Abb. 35B). Dieser Effekt traf sowohl für
stark vergrößerte ARA7-Vesikel zu als auch für Vesikel, die noch relativ nah an der
Vesikelgröße der Kontrollbedingung lagen (Abb. 35B, rechter Pfeil bzw. linker Pfeil).
In der z-Maximalprojektion konnte weiterhin eine XopB-abhängige Abnahme der kleinen
ARA7-Vesikel nachgewiesen werden. Zudem war auffällig, dass nach Koexpression von
XopB die Epidermiszellen insgesamt weniger ARA7-Vesikel enthielten und die verbleibenden
deutlich vergrößert waren (Abb. 35C).
Ergebnisse
94
Abb. 35: XopB beeinflusst die Bewegung und die Größe von tagRFP-ARA7-positiven Strukturen. Mittels Agrobakterien-vermittelter Transformation wurden tagRFP-ARA7, XopB und p19 in N. benthamiana transient überexprimiert (35S-Promotor). Als Kontrolle zu der XopB-Expression wurde der korrespondierende Leervektor pBinAR Leervektor (LV) verwendet. Zwei Tage nach Agroinfiltration wurden untere Epidermiszellen am KLSM mikroskopiert. A) Zeitaufnahme über 16 sec von ARA7-positiven Vesikeln unter Kontrollbedingungen. Kasten: t-Maximalprojektion über die Zeit mit t= 16 sec. Pfeile markieren zwei ARA7-positive Vesikel. B) Zeitaufnahme über 16 sec von ARA7-positiven Vesikeln bei Koexpression von XopB. Kasten: t-Maximalprojektion über die Zeit mit t= 16 sec. Pfeile markieren zwei ARA7-positive Vesikel. C) Representative z-Maximalprojektionen gesamter Epidermiszellen. Links: tagRFP-ARA7 unter Kontrollbedingungen. Rechts: Koexpression von tagRFP-ARA7 und XopB. a: kleine ARA7-positive Vesikel, b: Nukleus, c: vergrößerte ARA7-positive Strukturen nach Expression von XopB.
Ergebnisse
95
4.5. Identifizierung eines pflanzlichen Interaktionspartners von XopB Da XopB offensichtlich in der Lage ist verschiedene Immunantworten zu verändern, sollte
nun herausgefunden werden, mit welchem pflanzlichen Wirtsprotein dieser Effektor
wechselwirkt. Dies sollte Erkenntnisse liefern wie XopB Abwehrprozesse der Pflanze
manipuliert. Zum Auffinden eines Interaktionspartners wurde das Hefe-Zwei-Hydrid-System
angewendet.
4.5.1. Das XopB-Köder-Konstrukt für eine Hefe-Zwei-Hybrid-cDNA-
Durchmusterung
Aus Vorarbeiten der AG Börnke (LS Biochemie, Erlangen) war bereits bekannt, dass Hefe-
Zwei-Hybrid-cDNA-Durchmusterungen mit einem XopB-Volllängenkonstrukt nur
unspezifische Interaktionspartner liefert. Daher wurde in dieser Arbeit nur der N-Terminus
von XopB, d.h. die Aminosäuren 1 bis 263, mit der Bindedomäne von GAL4 translational
fusioniert (Abb. 36). Anschließend wurden N. tabacum- und A. thaliana-cDNA-Bibliotheken
durchmustert.
Abb. 36: Schematische Darstellung des XopB-Konstruktes für die Hefe-Zwei-Hybrid-cDNA-Durchmusterung. Es wurde der N-Terminus (Aminosäuren 1 bis 263) von XopB translational mit der Bindedomäne von GAL4 fusioniert. Das XopB-Fragment wurde dazu in den Vektor pGBT9 über die Schnittstellen BamHI und SalI kloniert.
Den N-Terminus von XopB als Köder für eine Hefe-Zwei-Hybrid-cDNA-Durchmusterung
einzusetzen war auch deswegen vielversprechend, da die subzelluläre Fraktionierung von
XopBas1-263:eGFP nach transienter Expression in N. benthamiana zeigte, dass dieses
Konstrukt im Gegensatz zum XopB-Volllängen-Konstrukt sehr gut löslich ist. Dennoch
verbleibt ein Teil dieses verkürzten XopB-Konstruktes so wie das XopB-Volllängen-Konstrukt
in der mikrosomalen Fraktion (Abb. 37, rechts; vgl. Abb. 31 für XopB Volllänge).
Der mit eGFP fusionierte C-Terminus von XopB, d.h. die Aminosäuren 261 bis 613,
exprimierte im Vergleich zum N-Terminus deutlich schwächer und konnte nicht in der
mikrosomalen Fraktion nachgewiesen werden (Abb. 37, links).
Ergebnisse
96
Abb. 37: Subzelluläre Fraktionierung von XopB-C-eGFP (as261-613) und XopB-N-eGFP (as1-263). Mittels A. tumefaciens-vermittelter Transformation wurden die angegebenen Konstrukte in N. benthamiana transient überexprimiert (35S-Promotor). Zwei Tage nach Agroinfiltration wurde Blattmaterial geerntet und ein Gesamtproteinextrakt hergestellt. Nach dem Abtrennen der Zelltrümmer durch Zentrifugation bei 10´000 g wurde der Überstand (LSS: low speed supernatant) mittels Ultrazentrifugation bei 100´000 g in eine lösliche Fraktion (USS: ultra speed supernatant) und eine mikrosomale Fraktion (USP: ultra speed pellet) getrennt. Die verkürzten XopB-Konstrukte wurden mit GFP-spezifischen Antikörpern in den einzelnen Fraktionen nachgewiesen. Die Trennung in USS und USP wurde mit anti-SPP2- bzw. anti-H+-ATPase-Antikörpern nachgewiesen.
Die Erkenntnisse aus der Fraktionierung konnten am KLSM nachvollzogen werden. XopB-N-
eGFP lokalisierte an der Plasmamembran und im Zytosol. Das XopB-C-eGFP-Konstrukt
exprimierte auch hier nur schwach und war nur im Zytosol nachweisbar. Die neben der
Plasmamembran- für XopB typische Vesikel-Lokalisierung ging jedoch im Falle von XopB-N-
eGFP verloren (siehe Abb. 38A). Des Weiteren konnte festgestellt werden, dass nur das
Volllängen-Konstrukt von XopB, jedoch nicht der N- und C-Terminus alleine, eine
Zelltodreaktion in N. benthamiana auslöste (siehe Abb. 38B).
Aufgrund der PM-Lokalisierung von XopB-N-eGFP wurde angenommen, dass der N-
Terminus von XopB immer noch mit potentiellen Interaktionspartnern interagieren kann.
Gleichzeitig besitzt dieses XopB-Fragment aufgrund der guten Löslichkeit eine für das Hefe-
Zwei-Hybrid-Verfahren unabdingbare Eigenschaft, da in diesem Verfahren die
Interaktionspartner in den Zellkern von Hefe gelangen müssen.
Ergebnisse
97
Abb. 38: Subzelluläre Lokalisierung und Phänotypentwicklung von N- und C-terminal verkürzte XopB-eGFP-Fusionen. C-terminale eGFP-Fusionen mit XopB (as1-613, XopB-eGFP), dem N-Terminus von XopB (as1-263, XopB-N-eGFP), dem C-Terminus von XopB (as261-613, XopB-C-eGFP) sowie freies GFP (mGFP4) wurden A. tumefaciens-vermittelt in N. benthamiana überexprimiert. A) In unabhängigen Experimenten wurden untere Epidermiszellen 2 Tage nach Agroinfiltration am KLSM mikroskopiert. GFP-Fluoreszenz: grün; Autofluoreszenz des Chorophylls: blau oder grau. Größenmaßstab: 7,5 µm. B) Phänotypentwicklung 5 Tage nach Agroinfiltration. Gestrichelte Kreise zeigen die Punktinfiltrationen der entsprechenden Konstrukte an.
4.5.2. Durchmusterung von Bibliotheken aus N. tabacum- und A. thaliana-
cDNA mit XopB als Köder-Protein
Der Hefestamm Y187 (Mat α) wurde mit dem in 4.5.1 beschriebenen XopB-Konstrukt (Abb.
36) transformiert. Dieser wurde dann in zwei Durchmusterungen mit dem Hefestamm AH109
(Mat a), der entweder eine N. tabacum- oder eine A. thaliana-cDNA-Bibliothek enthielt,
gepaart. Im Falle der cDNA-Bibliothek aus N. tabacum wurdem 52.2 x106 Hefe-
Transformanden und im Falle der cDNA-Bibliothek aus A. thaliana wurden 25.7 x106 Hefe-
Transformanden durchmustert. Aus der A. thaliana-cDNA-Bibliothek konnte jedoch kein
positiver Interaktionspartner erhalten werden. Die Durchmusterung der cDNA-Bibliothek aus
N. tabacum lieferte hingegen insgesamt 13 Klone, die auf dem Selektivmedium SCAD-leu-
Ergebnisse
98
trp-his wuchsen. Diese Anzahl reduzierte sich im weiteren Verlauf auf 5 Klone, da einige
Hefeklone entweder nach dem Überstreichen auf frisches SCAD-leu-trp-his Medium nicht
mehr weiterwuchsen oder keine Hefe-DNA isoliert werden konnte. Unter den 5 verbliebenen
war nur ein Klon im LacZ-Test positiv. Dieser potentielle Interaktionspartner wurde NtIP1
genannt (für NICOTIANA TABACUM INTERAKTIONSPARTNER 1). Aus diesem und den übrigen 4
Hefeklonen wurden die Beute-Plasmide isoliert und sequenziert. Eine blastx-Analyse ergab
die in Tabelle 8 aufgeführten Treffer. NtIP1 (XP_009605710.1) stellt ein Protein mit
unbekannter Funktion dar, wurde aber interessanterweise in einem Proteom-Ansatz mit der
Immunantwort von Pflanzen in Verbindung gebracht (Boisson et al., 2003). Bei den übrigen 4
Klonen handelte es sich je zweimal um einen zu VOZ1 aus Arabidopsis nah verwandten
Transkriptionsfaktor (VOZ1-ähnlich) bzw. um ein zu UBQ6 aus Arabidopsis nah verwandtes
Ubiquitin (Ubiquitin-40S ribosomales Protein S27a-ähnlich). VOZ1 und UBQ6 wurden als
unspezifische Interaktionspartner eingruppiert, da beide im LacZ-Test negativ waren. VOZ1
trat zudem bereits sehr häufig in Durchmusterungen mit verschiedenen Köderkonstrukten in
der AG F. Börnke auf und ist daher als unspezifischer Treffer bekannt.
Tabelle 8: Identifizierung potentieller Interaktionspartner von BD-XopBas1-263. Nur Klon 1 konnte als HIS3- und eindeutig LacZ-positiv identifiziert werden. Nach der Sequenzierung der Kandidaten wurde mit einer blastx-Analyse die Identität der potentiellen Interaktionspartner bestimmt. Zusätzlich wurde jeweils das Protein aus A. thaliana mit der höchsten Homologie angegeben.
lfd. Nr.
Klon blastx-Treffer Accession E-Wert A. thaliana Homolog
1 1
Vorhergesagtes nicht charakterisiertes Protein
LOC104100232
[Nicotiana tomentosiformis] (im Weiteren NtIP1) XP_009605710.1 5 e-95 At4G13540
2 2a
Vorhergesagtes Ubiquitin-40S ribosomales Protein
S27a-ähnlich
[Citrus sinensis] XP_006488031.1 6 e-89 AT2G47110/ UBQ6
3 2b
Vorhergesagtes Ubiquitin-40S ribosomales Protein
S27a-ähnlich
[Citrus sinensis] XP_006488031.1 6 e-89 AT2G47110/ UBQ6
4 8 Vorhergesagter Transkriptionsfaktor VOZ1-ähnlich
[Nicotiana sylvestris] XP_009776508.1 1 e-134 AT1G28520/ VOZ1
5 13 Vorhergesagter Transkriptionsfaktor VOZ1-ähnlich
[Nicotiana sylvestris] XP_009776508.1 2 e-176 AT1G28520/ VOZ1
4.5.3. Nachweis der Interaktion von XopB mit NtIP1
Die Interaktion zwischen NtIP1 und XopB wurde in einer direkten Interaktion in Hefezellen
überprüft. Hierzu wurde das durch Sequenzierung und Restriktionsanalyse überprüfte
Beuteplasmid AD-NtIP1 mit dem Köderplasmid BD-XopBas1-263 in den Hefe-Stamm Y190
Ergebnisse
99
transformiert. Als Positivkontrolle diente die Interaktion von SV40 mit p53 und als
Negativkontrolle wurde der Y190-Stamm mit dem Köderplasmid und dem
korrespondierenden Leervektor pGAD424 kotransformiert. Durch Stempeln der erhaltenen
Transformanden auf SCAD-leu-trp- und SCAD-leu-trp-his-Medium konnte die Interaktion
zwischen NtIP1 und XopBas1-263 bestätigt werden. Dieser Transformand zeigte wie die
Positivkontrolle auf SCAD-leu-trp-his-Medium Wachstum und zudem im LacZ-filter lift assay
eine blaue Färbung. Die Negativkontrolle zeigte auf SCAD-leu-trp-his kein Wachstum und
keine Blaufärbung (Abb. 39).
Abb. 39: Direkte Interaktion von BD-XopBas1-263 und AD-NtIP1. Jeweils ein Konstrukt mit einer GAL4-Bindedomäne (BD) bzw. –Aktivierungsdomäne (AD) wurde in S. cerevisiae Y190 kotransformiert. Transformanden, die beide Konstrukte enthielten, wuchsen auf SCAD-leu-trp und wurden zum Vermehren auf frisches Medium überstrichen. Pro Transformationsansatz wurden je drei Transformanden auf SCAD-leu-trp (-LT), SCAD-leu-trp-his (-LTH) und für den lacZ-Test auf SCAD-leu-trp-his mit GeenScreen-Membran mit einer Stempelvorrichtung transferiert. Nach 2 bzw. 3 Tagen bei 30°C wurde das Wachstum auf den SCAD-Platten dokumentiert und der LacZ-filter lift assay durchgeführt. LV: pGAD424 Leervektor. Der N-Terminus von XopB (XopBas1-263) interagiert mit NtIP1, was durch das Wachstum auf SCAD-leu-trp-his und den positiven lacZ-Test zu erkennen war. Je ein repräsentativer Transformand ist gezeigt.
Um herauszufinden mit welchem Bereich von XopB NtIP1 genau interagiert, wurden weitere
XopB-Deletionskonstrukte getestet. Es wurden dazu weitere C-terminale Verkürzungen
vorgenommen, wodurch und die Konstrukte XopBas1-111 und as1-171 erhalten wurden.
Zudem wurde das N-terminal verkürzte Konstrukt XopBas264-613 und die N- und C-terminal
verkürzten Konstrukte XopBas77-611 und XopBas238-611 erstellt. Diese wurden mit der
GAL4-Bindedomäne (BD) translational fusioniert, indem sie über die angefügten
Schnittstellen BamHI und SalI in den Vektor pGBT9 kloniert wurden. Anschließend wurden
die BD-Konstrukte jeweils zusammen mit dem AD-NtIP1-Konstrukt in den Hefe-Stamm Y190
transformiert. Es zeigte sich, dass nur das Konstrukt BD-XopBas1-263 mit NtIP1 in Hefe
interagieren kann (Abb. 40A). Sobald der C-Terminus dieses Konstruktes weiter verkürzt
wird (BD-XopBas1-171 und BD-XopBas1-111) findet in Hefe keine Interaktion mehr statt. In
einem unabhängigen Experiment wurde daher noch das Konstrukt BD-XopBas77-263, in
Ergebnisse
100
dem der als unstrukturiert vorhergesagte Bereich as1-76 deletiert wurde, mit einbezogen.
Dieser Teil von XopB interagierte ebenfalls mit NtIP1 (Abb. 40B). Somit kann
geschlussfolgert werden, dass die Aminosäuren 77 bis 263 von XopB für eine Bindung
zwischen XopB und NtIP1 ausreichend sind. Unerwarteter Weise interagierte jedoch das
Konstrukt XopBas77-611, in dem zusätzlich zu dem unstrukturiertem N-Terminus auch ein
kurzer unstrukturierter Bereich am C-Terminus deletiert wurde, nicht mit NtIP1.
Möglicherweise ist in diesem Konstrukt der Interaktionsbereich für NtIP1 in Hefe nicht
zugänglich.
Dass das Konstrukt XopBas77-611 per se in Hefe funktional ist, konnte mit einer cDNA-
Durchmusterung gezeigt werden. Hier wurde in der Arabidopsis-cDNA-Bibliothek (CD4-30)
der Transkriptionsfaktor NTL9 (At4g35580) gefunden, der später auch als Interaktionspartner
von HopD1, dem homologen Effektor von XopB aus P. syringae, beschrieben worden ist
(Block et al., 2014). NTL9 ist über eine Transmembrandomäne am ER von N. benthamiana
gebunden. Block et al. (2014) konnten zudem zeigen, dass HopD1 am ER lokalisierte und
dort mit NTL9 interagierte. Beides wurde auch für XopB untersucht. Es konnte jedoch weder
eine Kolokalisierung von XopB-mCherry und eGFP:NTL9 noch eine Interaktion dieser beiden
Proteine basierend auf split-YFP-Konstrukten in planta nachgewiesen werden (Daten nicht
gezeigt). Daher wurde die Interaktion mit NTL9 nicht weiter verfolgt und weitere
Untersuchungen nur mit NtIP1 durchgeführt.
Abb. 40: Der N-Terminus von XopB interagiert mit NtIP1. A: Die angegebenen BD-XopB-Konstrukte wurden mit dem AD-NtIP1-Fusionskonstrukt (Klon aus cDNA-Durchmusterung) in direkten Interaktionsstudien in S. cerevisiae Y190 getestet. Ausgehend vom Volllängen XopB-Konstrukt (XopBas1-613) wurden verschiedene N- und/ oder C-terminale Deletionskonstrukte von XopB auf Interaktion getestet. B: Das Konstrukt XopBas1-263 wurde weiter N-terminal verkürzt (XopBas77-263) und mit NtIP1 auf Interaktion in Hefe getestet. Positivkontrolle
Ergebnisse
101
A und B: BD-p53 und AD-SV40. Negativkontrollen A und B: BD-XopBas1-263 und pGAD424 (LV) oder pGBT9 (LV) und AD-NtIP1.
4.5.4. Homologe von NtIP1 sind in Pflanzen konserviert
Mit der translatierten Gensequenz von NtIP1 (Unigene-id von „Sol genomics network“,
http://solgenomics.net/: SGN-U468159) wurde auf dem NCBI-server eine blastp-Analyse
(protein-protein blast (Altschul et al., 1997)) durchgeführt. NtIP1 ist nach dieser Analyse nur
in Pflanzen konserviert. Alle 79 blastp-Treffer wurden als newick-Datei vom NCBI-server
exportiert und als phylogenetischer Stammbaum schematisch dargestellt (Abb. 41). Da bei
NCBI für NtIP1 keine N. tabacum-Sequenz hinterlegt ist, stammten die nächstverwandten
Treffer von den Tabakspezies Nicotiana tomentosiformis und Nicotiana sylvestris. Diese
Arten stellen auf Grund der hohen Sequenzübereinstimmungen vermutlich die Eltern von N.
tabacum dar (Clarkson et al., 2004). Weitere nah verwandte Proteine konnten in den
Solanaceae Tomate (S. lycopersicum) und Kartoffel (Solanum tuberosum) gefunden werden.
Homologe Proteine konnten in anderen Dikotyledonen wie z.B. Wein (Vitis vinifera) und
Ackerschmalwand (Arabidopsis thaliana) und Monokotyledonen wie z.B Banane (Musa
acuminata) und Echte Dattelpalme (Phoenix dactylifera) gefunden werden. Diese wurden
jedoch aus Übersichtlichkeitsgründen nicht alle einzeln im Stammbaum dargestellt.
Abb. 41: Phylogenetischer Stammbaum (unrooted) basierend auf den NCBI blastp-Treffern mit NtIP1 als Matrize. Zur besseren Darstellung wurden einige Arme des Stammbaumes zusammengelegt und die Armlängen angeglichen. Die Anzahl der zusammengelegten Arme ist als leaves angegeben. Die Liste der blastp-Treffer wurde als newick-Datei exportiert und für diese Abbildung mit dem online-Programm „PhyloWidget“ (Jordan and Piel, 2008) visualisiert.
Der phylogenetische Stammbaum ließ erkennen, dass es zu NtIP1 9 nah verwandte Proteine
gibt, die mit diesem zusammen eine Gruppe bildeten (im Weiteren NtIP1-Gruppe). Mit Hilfe
Ergebnisse
102
einer blastx-Analyse wurden die Amiosäureidentitäten und die E-Werte für diese Gruppe
ermittelt (Tabelle 9). Als Matrize für diese Analyse diente die Gensequenz von NtIP1. Die
Aminosäureidentitäten reichten von 63 bis 100% und stammen von homologen Genen aus
Tabak, Tomate und Kartoffel.
Tabelle 9: Aminosäureidentitäten in [%] und E-Werte der blastx-Analyse mit NtIP1 als Matrize. Die 9 ersten Treffer der blastx-Analyse des NCBI-servers sind dargestellt. Ntom: N. tomentosiformis; Nsyl: N. sylvestris: Sl: S. lycopersicum; St: S. tuberosum.
Gen AS-Identiät [%] E-Wert
Ntom_LOC104100232 100 8e-116
Nsyl_LOC104232632 isoform X1 84 6e-106
Nsyl_ LOC104232632 isoform X2 84 1e-104
Sl_LOC101265866 76 5e-80
Sl_LOC101267009 63 3e-57
Ntom_LOC104121204 65 7e-55
Nsyl_stress responsive protein NST1-like 63 2e-53
St_gelsolin-related protein of 125kDa-like 74 3e-50
St_LOC102594551 65 2e-36
Ein Vergleich der Proteinsequenzen dieser NtIP1-Gruppe zeigte ein konserviertes Glycin an
der zweiten Aminosäureposition bei 9 von 10 Sequenzen (Abb. 42). Dies ist die typische
Position für eine N-terminale Myristoylierung (N-Myristoylierung). Mit den online-Programm
Myristoylator (Bologna et al., 2004) konnten diese 9 Proteine tatsächlich als myristoylierte
Proteine vorhergesagt werden. Demnach wird NtIP1 möglicherweise posttranslational durch
eine N-Myristoylierung modifiziert. Mit dem online-Programm „CSS Palm 4.0“ (Ren et al.,
2008) wurden von diesen myristoylierten Proteinen NtIP1, Ntom_LOC104100232,
Nsyl_LOC104232632 Isoform X1 und X2, Sl_LOC101265866, Sl_LOC101267009 und
St_gelosin-related protein als palmitoylierte Proteine vorhergesagt. Die Palmitoylierung
wurde für das semi-konservierte Cystein an Position 36, bzw. Position 37 bei
Sl_LOC101267009, vorhergesagt.
Ergebnisse
103
Abb. 42: Aminosäuresequenzanalyse der zu NtIP1 nächstverwandten Proteine. Die 9 nächstverwandten Proteine zu NtIP1 wurden miteinander verglichen (Geneious protein aligment) und das konservierte bzw. semikonservierte Glycin und Cystein mit einem Pfeil gekennzeichent. Nt: N. tabacum; Ntom: N. tomentosiformis; Nsyl: N. sylvestris: Sl: S. lycopersicum; St: S. tuberosum.
Ein Schema, in dem die Positionen der posttranslationalen Modifikationen bei NtIP1
dargestellt sind, ist in Abb. 43 dargestellt.
Abb. 43: Schema der vorhergesagten N-Myristoylierung und Palmitoylierung an Aminosäureposition 2 bzw. 36 von NtIP1. Die Vorhersagen der posttranslationalen Modifikationen wurden mit den Programmen „Myristoylator“ und „CSS Palm 4.0“ durchgeführt.
4.5.4.1. Homologe von NtIP1 in Solanaceae und Arabidopsis
Da Xcv für Tomaten- (S. lycopersicum) und Paprika-Pflanzen (C. annuum) ein Pathogen
darstellt und im Rahmen dieser Arbeit auch mit den Modellorganismen N. benthamiana und
A. thaliana gearbeitet wurde, um die Funktion von XopB aufzuklären, wurde gezielt für diese
Organismen nach den homologen Gen- und Proteinsequenzen von NtIP1 gesucht. Ziel war
es, einige homologe Gene von NtIP1 zu klonieren, um sie später auf Interaktion mit XopB in
Hefe zu testen. Mittels blastn-Analysen (nucleotide-nucleotide blast) basierend auf den
Ergebnisse
104
NCBI- und den „Sol genomics network“-Datenbanken konnten zunächst ein bis zwei
homologe Gene in N. tabacum, N. benthamiana, S. lycopersicum, C. annuum und A. thaliana
gefunden werden. Von N. tabacum konnte in einer unabhängigen cDNA-Durchmusterung
das zweite homologe Gen von NtIP1 identifiziert werden, welches NtIP1.1 genannt wurde
(siehe 4.7.6). Basierend auf den Aminosäureidentitäten der translatierten Sequenzen wurden
die homologen Gene zu NtIP1 und NtIP1.1 immer als IP1 bzw. IP1.1 benannt. Die
Abkürzungen der Spezies wurden entsprechend vorangestellt (Tabelle 10).
Tabelle 10: Die NtIP1-Genfamilie. Übersicht über die homologen Gene von NtIP1 in den Pflanzenspezies N. tabacum, N. benthamiana, S. lycopersicum, C. annuum und A. thaliana. Gene ID: Gen-Identifikationsnummern von Solgenomics oder TAIR. Name: Im Weiteren verwendete Nomenklatur.
Name Gene ID Spezies
NtIP1 SGN-U468159 N. tabacum
NtIP1.1 SGN-U424570
NbIP1 NbS00001933g0015.1 N. benthamiana
NbIP1.1 NbS00021142g0006.1
SlIP1 Soly09g091060.2 S. lycopersicum
SlIP1.1 Soly12g097060.1
CaIP1 CA03g02830 C. annuum
CaIP1.1 CA12g19910
AtIP1 AT4G13540 A. thaliana
AtIP1.1 AT3G23930
Ein phylogenetischer Stammbaum und ein Vergleich der Sequenzen zur Bestimmung der
Aminosäureidentitäten sind in (Abb. 44 A bzw. B) dargestellt. Der Sequenzvergleich zeigte,
dass alle Proteine mit Ausnahme von CaIP1.1 ein konserviertes Glycin an Position 2
besitzen (siehe Abschnitt 8.3), welches vom online-Programm „Myristoylator“ als N-
Myristoylierungsmotiv vorhergesagt wurde.
Ergebnisse
105
Abb. 44: Phylogenetischer Stammbaum und Aminosäureidentitäten der NtIP1-Familie. A.) Die Proteinsequenzen der homologen Proteine aus Tabak (Nt und Nb), Tomate (Sl), Paprika (Ca) und Arabidopsis (At) wurden mit dem Programm Geneious (neighbour joining tree) verglichen und als phylogenetischer Stammbaum dargestellt. B.) Vergleich der Sequenzen aus (A) zur Bestimmung der Aminosäureidentitäten in %.
4.5.5. Interaktion der NtIP1-Familie mit XopB in Hefe
Da anfänglich nicht alle Gensequenzen zur Verfügung standen, konnten nur von Tomate und
Arabidopsis jeweils beide Gene der IP1-Familie kloniert werden. Es stand somit die
komplette Genfamilie aus Tabak (N. tabacum), Tomate und Arabidopsis zur Verfügung und
konnte auf Interaktion mit dem N-Terminus von XopB in Hefe getestet werden. Aus Tabak
interagierten sowohl NtIP1 als auch NtIP1.1. Aus Tomate interagierte SlIP1 mit XopB. Im
Gegesatz dazu zeigten SlIP1.1 sowie AtIP1 und AtIP1.1 in Hefe keine Interaktion mit XopB
(Abb. 45).
Ergebnisse
106
Abb. 45: Direkte Interaktion der NtIP1-Homologen aus Tabak (Nt), Tomate (Sl) und Arabidopsis (At). Bis auf NtIP1 wurden die angegebenen IP1- und IP1.1-Gene in den Vektor pGAD424 kloniert und zusammen mit dem BD-XopBas1-263-Konstrukt in den Hefestamm Y190 kotransformiert. Der NtIP1-Klon stammte aus der cDNA-Durchmusterung. Die Transformanden wurden auf den Selektivmedien SCAD-leu-trp (-LT) und SCAD-leu-trp-his (-LTH) transferiert. Der lacZ-filter lift assay wurde auf einer Genescreenmembran auf SCAD-leu-trp-his-Medium durchgeführt. Positivkontrolle: BD-p53 und AD-SV40; Negativkontrolle: BD-XopBas1-263 und pGAD424 (LV).
4.6. Charakterisierung des XopB-interagierenden Proteins IP1 In anschließenden Schritten wurde NtIP1 aus Tabak in planta lokalisiert und die Interaktion
mit XopB bestätigt. In Paprika wurden transkriptionelle Veränderungen des homologen Gens
CaIP1 während der Xcv-Interaktion untersucht.
4.6.1. Subzelluläre Lokalisierung von GFP-markiertem NtIP1, NtIP1(G2A) und
NtIP1(G2A/C36A) in N. benthamiana
NtIP1 wurde translational mit eGFP fusioniert und in N. benthamiana transient exprimiert.
Zwei Tage nach Agroinfiltration war NtIP1-eGFP als feine Vesikel entlang der Zellperipherie
und im Zellcortex nachweisbar (Abb. 46, erste und zweite Reihe). Es wurde zunächst die
potentielle Myristoylierungs- (Glycin Position 2) und in einem zweiten Schritt die potentielle
Palmitoylierungsstelle (Cystein Position 36) zu Alanin mutiert, wodurch die Klone NtIP1(G2A)
und NtIP1(G2A/C36A) erhalten wurden. Beide Mutanten von NtIP1 wurden mit eGFP
translational fusioniert und in N. benthamiana lokalisiert. Es wurde erwartet, dass diese
Mutanten wegen der fehlenden Myristinsäure- und Palmitinsäurereste löslich sind und daher
Ergebnisse
107
im Zytosol vorliegen. Das Gegenteil trat jedoch ein. Zwar konnte ein gewisser Teil der
Fluoreszenz auch in Hecht´schen Filamenten detektiert werden, was auf eine zytosolische
Lokalisierung hindeutet, jedoch akkumulierte der Großteil von NtIP1(G2A)-eGFP und
NtIP1(G2A/C36A)-eGFP als Aggregate in der Zelle (Abb. 46, dritte und vierte Reihe).
Meistens waren es drei bis fünf sehr große Aggregate pro Zelle, die eine sehr starke GFP-
Fluoreszenz aufzeigten. Möglicherweise werden die NtIP1-Mutanten nicht richtig gefaltet
oder es kommt zur Aggregatbildung, weil NtIP1 nicht mehr an seinen eigentlichen Zielort
gelangen kann. Die Fehllokalisierungen der NtIP1-Mutanten untermauern die Ergebnisse der
Vorhersageprogramme und NtIP1 wird offenbar posttranslational durch Myristoylierung und
wahrscheinlich zusätzlich durch Palmitoylierung modifiziert.
Abb. 46: Subzelluläre Lokalisierung von NtIP1-eGFP und dessen Mutanten. Mittels Gateway cloning wurde der ORF von NtIP1 mit eGFP fusioniert. Mit dem verwendeten binären Vektor pK7FWG2.0 wird das NtIP1:eGFP-Konstrukt unter dem 35S-Promotor in Pflanzen exprimiert. Mittels ortsgerichteter Mutagenese wurden die Mutanten NtIP1(G2A) und NtIP1(G2A/C36A) erzeugt und ebenfalls mit eGFP fusioniert. Die Abbildungen zeigen
Ergebnisse
108
A. tumefaciens-vermittelte transiente Überexpressionen in N. benthamiana 2 Tage nach Agroinfiltration. Als silencing suppressor wurde p19 koexprimiert. Am KLSM wurden untere Epidermiszellen mikroskopiert und sowohl z-Stapel für Maximalprojektionen als auch Nahaufnahmen des Zellcortex (für NtIP1:eGFP) angefertigt. GFP: Fluoreszenzkanal für GFP; Chl: Autofluoreszenz von Chlorophyll.
In einem folgenden Schritt sollte die Identität der NtIP1-Vesikel bestimmt werden. NtIP1-
eGFP wurde zu diesem Zweck mit den Markern tagRFP-ARA7 (frühe Endosomen), ARA6-
mRFP (späte Endosomen), G-rb (Golgi) und px-rk (Peroxisomen) koexprimiert bzw.
Mitochondrien mit dem Farbstoff „Mitotracker Orange“ angefärbt. Es konnte jedoch für keine
der genannten Kompartimente eine Kolokalisierung mit NtIP1-eGFP festgestellt werden
(Abb. 47).
Ergebnisse
109
Abb. 47: Ansätze zur subzellulären Lokalisierung von NtIP1:eGFP mit verschiedenen Kompartiment-Markern. NtIP1:eGFP wurde zusammen mit den angegebenen Markern und p19 in N. benthamiana exprimiert. Zwei Tage nach Agroinfiltration wurden untere Epidermiszellen am KLSM mikroskopiert. GFP: Fluoreszenzkanal für GFP; Rote Fluorophore: Fluoreszenzkanal für tagRFP, mRFP, mCherry und Mitotracker Orange. Chl: Autofluoreszenz von Chlorophyll. Von den Aufnahmen mit tagRFP:ARA6 und ARA7:mRFP wurden zusätzlich 5-
Ergebnisse
110
fach Vergrößerungen dargestellt (Kasten). Mitotracker Orange (Invitrogen) wurde nach Herstellerangaben gelöst und 1 h vor den Aufnahmen infiltriert.
Mit dem Farbstoff FM4-64 konnte gezeigt werden, dass die NtIP1-eGFP-Vesikel von der
Plasmamembran stammen. NtIP1-eGFP exprimierende Epidermiszellen wurden vor dem
Mikroskopieren mit dem Farbstoff FM4-64 inkubiert. Der Farbstoff lagert sich zunächst in die
Plasmamembran ein und wird anschließend endozytiert. NtIP1-eGFP kolokalisierte mit FM4-
64 an der Plasmamembran und an einigen Stellen konnte sogar beobachtet werden, wie der
Farbstoff zusammen mit NtIP1-eGFP endozytiert wird (Abb. 48, Pfeile). Möglicherweise ist
NtIP1-eGFP an einem sehr frühen Schritt der Endosomen-Biogenese beteiligt und
kolokalisierte deswegen nicht mit den Markern ARA7 und ARA6.
Abb. 48: NtIP1-eGFP kolokalisiert mit der PM und FM4-64-positiven Vesikeln. Die Aufnahme zeigt eine transiente A. tumefaciens-vermittelte Überexpression von NtIP1-eGFP in N. benthamiana. Als silencing suppressor wurde p19 koexprimiert. Zwei Tage nach Agroinfiltration wurden untere Epidermiszellen am KLSM mikroskopiert. Blattproben wurden 30 min vor der Aufnahme mit 1-fach FM4-64-FX (Life Technologies, als 10-fach stock nach Herstellerangaben angesetzt) im Dunkeln inkubiert. GFP: Fluoreszenzkanal für GFP; FM4-64: Fluoreszenzkanal für FM4-64-FX. Pfeile markieren Vesikel-ähnliche Strukturen an der Plasmamembran.
4.6.2. XopB verändert die subzelluläre Lokalisierung von NtIP1
Da NtIP1 eine andere Lokalisation als XopB zeigte, stellte sich an diesem Punkt die Frage,
ob und in welchem Kompartiment NtIP1 mit XopB kolokalisiert. Dazu wurde NtIP1-eGFP
zusammen mit XopB-mCherry transient in N. benthamiana überexprimiert. Die
Ergebnisse
111
Fusionsproteine kolokalisierten in Vesikel-ähnlichen Strukturen und im Zytosol (Abb. 49,
erste und zweite Reihe). Zur Darstellung der Vesikel wurde hier eine Ebene des Zellcortexes
einer Epidermiszelle gezeigt. Die Größe der Vesikel ist mit der aus den Kolokalisierungen
von XopB-eGFP und tagRFP-ARA7 vergleichbar. Die zytosolische Lokalisierung von NtIP1-
eGFP ist offenbar XopB-abhängig, da bei der Überexpression von NtIP1-eGFP allein keine
Lokalisierung von NtIP1-eGFP in den Zelllobi nachgewiesen werden konnte (vergleiche Abb.
46, erste Reihe).
Die Neigung der G2A-Mutante von NtIP1-eGFP Aggregate auszubilden, konnte durch
Koexpression von XopB-mCherry nicht verhindert werden und es konnte auch keine
Fluoreszenz von XopB-mCherry in diesen NtIP1-eGFP-Aggregaten festgestellt werden
(siehe Abb. 49, dritte und vierte Reihe). Somit ist die Myristoylierung von NtIP1-eGFP für die
Kolokalisierung und wahrscheinlich auch für die Interaktion mit XopB in planta notwendig.
Abb. 49: Kolokalisierungsstudien von NtIP1-eGFP bzw. NtIP1(G2A) mit XopB-mCherry. Die Aufnahmen zeigen transiente A. tumefaciens-vermittelte Überexpressionen der angegebenen Konstrukte in N. benthamiana. Als silencing suppressor wurde p19 koexprimiert. Zwei Tage nach Agroinfiltration wurden untere Epidermiszellen am KLSM mikroskopiert. XopB wurde mittels Gateway cloning in den Vektor pRB35S-GW-mCherry eingebracht.
Ergebnisse
112
Im Falle von NtIP1(G2A):eGFP wurde der GFP-Kanal einmal mit 942 V und einmal mit nur 544 V verstärkt, um die Struktur der stark fluoreszierenden NtIP1(G2A)-Aggregate realistisch darstellen zu können. GFP: Fluoreszenzkanal für GFP; mCherry: Fluoreszenzkanal für mCherry; Chl: Autofluoreszenz von Chlorophyll.
4.6.3. In planta Interaktion von XopB mit NtIP1 in N. benthamiana
Bisher wurde die Interaktion zwischen NtIP1 und XopB nur in Hefe gezeigt. In diesem
System interagiert nur der N-Terminus von XopB (AS 1-263) mit NtIP1 (Abb. 40). In einem
nächsten Schritt sollte in planta gezeigt werden, dass das XopB-Volllängenprotein mit NtIP1
interagiert. Dazu wurden die Methoden BIFC (bimolecular fluorescence complementation)
und Koimmunpräzipitation gewählt. Im BIFC-Verfahren wurden die zwei Interaktionspartner
XopB und NtIP1 mit je einer Hälfte des gelb fluoreszierenden Proteins VENUS (eine
Punktmutation von YFP: yellow fluorescent protein (Nagai et al., 2002)) translational
fusioniert. Nach erfolgter transienter Expression in N. benthamiana wurde das
komplementierte VENUS-Protein mit Hilfe des KLSM analysiert. Für die
Koimmunpräzipitation wurde eGFP-markiertes XopB zusammen mit HA-markiertem NtIP1
transient in N. benthamiana überexprimiert. Mittels GFP-bindender magnetischer beads
wurde dann untersucht, ob XopB mit NtIP1 in einem Komplex vorliegt.
4.6.3.1. Nachweis der NtIP1-XopB-Interaktion mittels BIFC
Die BIFC-Konstrukte NtIP1-VENUS-N und VENUS-C-XopB wurden transient in N.
benthamiana koexprimiert. Es kam zu einer bimolekularen Fluoreszenz-Komplementation
und die VENUS-Fluoreszenz konnte in Vesikel-ähnlichen Strukturen detektiert werden (Abb.
50A). Neben den Vesikeln mit einer Größe von ca. 1-2 µm konnten auch größere Strukturen
von ca. 5 x 10 µm detektiert werden (siehe Abb. 50A „v“ bzw. „*“). Dieses Muster erinnerte
stark an die Koexpression von XopB-eGFP mit dem Marker für frühe Endosomen tagRFP-
ARA7. Auch dort konnte diese Verteilung zwischen kleineren Vesikeln und deutlich größeren
Strukturen erkannt werden (Abb. 34, erste und zweite Reihe). Dieser Befund stellte einen
ersten Hinweis dar, dass XopB und NtIP1 in frühen Endosomen kolokalisierten. Die VENUS-
Fusionsproteine des BIFC-Experimentes wurden in einer Western-Blot-Analyse mit HA- und
cmyc-spezifischen Antikörpern nachgewiesen (Abb. 50B).
Ergebnisse
113
Abb. 50: Bimolekulare Fluoreszenz Komplementation (BIFC) mit XopB und NtIP1. A: Die Aufnahmen zeigen transiente A. tumefaciens-vermittelte Überexpressionen der angegebenen Konstrukte in N. benthamiana. Als silencing suppressor wurde p19 koexprimiert. Zwei Tage nach Agroinfiltration wurden untere Epidermiszellen am KLSM mikroskopiert. Für alle Proben wurde die VENUS-Fluoreszenz (gelb) und die Autofluoreszenz der Chloroplasten (rot) mit vergleichbarer Verstärkung aufgenommen. Postivkontrolle: VENUS-N-FBPase und VENUS-C-FBPase; Negativkontrolle: NtIP1-VENUS-N und pRB35S-VENUS-C (LV). v: Vesikel-ähnliche Struktur an der Zellperipherie; *: typische große Struktur von ca. 5 x 10 !m. B: Western-Blot-Analyse zu den in (A) gezeigten Aufnahmen. Alle VENUS-N-Konstrukte tragen einem 3xmyc-tag und alle VENUS-C-Konstrukte einen HA-tag. Die Fusionskonstrukte wurden entsprechend mit einem anti-cmyc-Peroxidase- bzw. einem anti-HA-Peroxidase-gekoppelten Antikörper nachgewiesen. Als Ladekontrolle diente die Amido-Schwarz gefärbte RubisCO-Bande.
Die BIFC-Konstrukte wurden daraufhin mit dem Endosomen-Marker tagRFP-ARA7
koexprimiert. Abb. 51 zeigt, dass die Vesikel aus NtIP1-VENUS-N und VENUS-C-XopB mit
dem Endosomenmarker tagRFP-ARA7 kolokalisieren. Da VENUS und tagRFP teilweise
überlappende Emissionsspektren haben, wurde VENUS mit einem kleineren
Detektionsfenster aufgenommen, um ein „Durchbluten“ von tagRFP in den VENUS-Kanal zu
vermeiden. Dadurch war die VENUS-Fluoreszenz etwas schwächer als im BIFC-Experiment
ohne tagRFP-ARA7, in dem die volle VENUS-Fluoreszenz aufgenommen wurde. Nach
Koexpression von XopB, NtIP1 und ARA7 konnten kleinere und größere Vesikel an der
Zellperipherie (siehe Abb. 51, a bzw. b), aber auch größere Vesikel weiter im Zellinneren
Ergebnisse
114
(siehe Abb. 51, c) nachgewiesen werden. Somit ist das frühe Endosom sehr wahrscheinlich
das Kompartiment, in dem XopB und NtIP1 interagieren.
Abb. 51: NtIP1 und XopB interagieren in frühen Endosomen. Die angegebenen VENUS-Konstrukte wurden transient in N. benthamiana exprimiert. Als Marker für frühe Endosomen wurde tagRFP:ARA7 koexprimiert. Zwei Tage nach Agroinfiltration wurden untere Epidermiszellen am KLSM mikroskopiert. NtIP1 und XopB interagieren in kleinen (a) und großen (b) ARA7-positiven Strukturen an der Zellperipherie (A). Große ARA7-positive Strukturen waren auch im Zellinneren nachweisbar (B, c). Einstellungen für BIFC (VENUS) kombiniert mit tagRFP: tagRFP: 561 (Ex), 571-631 (Em) nm; VENUS: 514 (Ex), 527-550 (Em) nm, Chl: 514 (Ex), 640-740 nm.
Für XopB konnte bereits gezeigt werden, dass es die Größe und die Bewegung von ARA7-
markierten Vesikeln verändert. Wird NtIP1-eGFP alleine exprimiert, bewegen sich die NtIP1-
eGFP-Vesikel im Zytoplasmastrom von N. benthamiana-Epidermiszellen (Abb. 52A). Werden
NtIP1-VENUS-N und VENUS-C-XopB hingegen koexprimiert, konnte keine
Vesikelbewegung mehr detektiert werden (Abb. 52B). Das bedeutet, dass XopB NtIP1 an
frühe Endosomen rekrutiert und dort dessen Bewegung unterbindet. Durch welchen
Mechanismus XopB dies vermitteln kann, bedarf jedoch weiterer Untersuchungen.
Ergebnisse
115
Abb. 52: Untersuchungen zur Bewegung von NtIP1 im Zytoplasmastrom von Epidermiszellen. Die Aufnahmen zeigen transiente A. tumefaciens-vermittelte Überexpressionen der angegebenen Konstrukte in N. benthamiana. Als silencing suppressor wurde p19 koexprimiert. Zwei Tage nach Agroinfiltration wurden untere Epidermiszellen am KLSM mikroskopiert. A: Zeitaufnahme über 16 Sekunden, die die Bewegung von NtIP1-eGFP im Zytoplasmastrom zeigt. Pfeil: Markierung eines sich bewegenden NtIP1-Vesikels. B: Zeitaufnahme über 16 Sekunden des BIFC-Experimentes mit XopB und NtIP1. Die Vesikel in denen XopB und NtIP1 interagieren sind in ihrer Bewegung beeinträchtigt. Pfeil: Ein repräsentatives Vesikel ist markiert. Als Orientierungshilfe für A und B wurde eine gestrichelte Linie eingezogen.
4.6.3.2. Koimmunpräzipitation von NtIP1 und XopB
Mit einem unabhängigen Experiment sollte die in planta Interaktion von XopB und NtIP1
bestätigt werden. Dazu wurden die Konstrukte NtIP1-HA und NtIP1(G2A)-HA hergestellt und
deren Expression in N. benthamiana geprüft. Die Expressionskinetik über drei Tage zeigte,
dass 24 Stunden nach Agroinfiltration NtIP1-HA und NtIP1(G2A)-HA im Gesamtzellextrakt
nachweisbar waren und die Proteinakkumulation über 3 Tage konstant blieb (siehe Abb. 53).
Ergebnisse
116
Abb. 53: Expressionskinetik von NtIP1-HA und NtIP1(G2A)-HA in N. benthamiana. Die Konstrukte wurden A. tumefaciens-vermittelt in N. benthamiana zusammen mit p19 als silencing suppressor transient überexprimiert (verwendeter binärer Vektor pGWB614). 0, 1, 2 und 3 Tage nach Agroinfiltration (dpi) wurden Blattproben entnommen. NtIP1-HA und NtIP1(G2A)-HA wurden mittels eines anti-HA-Peroxidase-gekoppelten Antikörpers nachgewiesen.
Für eine Ko-IP wurden diese Konstrukte mit eGFP-XopB, XopB-eGFP oder freiem GFP in N.
benthamiana koexprimiert. Zwei Tage nach Agroinfiltration wurde ein Gesamtzellextrakt
angefertigt. Durch Zentrifugation wurden die Zelltrümmer vom löslichen Überstand (input)
abgetrennt. Mit magnetischen anti-GFP beads wurde mit diesem input eine Ko-IP
durchgeführt und von allen Fraktionen Proben für einen Western-Blot entnommen. Freies
GFP sowie die beiden XopB/GFP-Fusionsproteine konnten im input mit einem anti-GFP-
Antikörper nachgewiesen werden (siehe Abb. 54, I, Anti-GFP). Im Eluat der Ko-IP konnten
wie erwartet alle GFP-Konstrukte nachgewiesen werden, wobei auffiel, dass eGFP-XopB im
Vergleich zu XopB-eGFP zu verstärktem Proteinabbau neigte (siehe Abb. 54, E, Anti-GFP).
Dennoch konnten mit beiden XopB/eGFP-Fusionsproteinen NtIP1-HA koimmunpräzipitiert
werden (siehe Abb. 54, E, Anti-HA). Dadurch wurde die in Hefe und BIFC-Experimenten
gezeigte Interaktion von XopB und NtIP1 bestätigt. In diesem Ko-IP-Experiment und allen
Wiederholungen fiel auf, dass NtIP1-HA bei Koexpression mit freiem GFP nie im input
nachweisbar war (siehe Abb. 54, I, Anti-HA). Bereits die KLSM-Daten legten nahe, dass
nicht nur die Lokalisierung von NtIP1, sondern auch dessen „Löslichkeit“ XopB-abhängig ist
(siehe z.B. Abb. 46 und Abb. 49).
Es wurde daher auch eine Ko-IP mit der G2A-Mutante von NtIP1 durchgeführt und zusätzlich
auch die unlöslichen Proteinfraktionen im Western-Blot analysiert. Es zeichnete sich ein
vergleichbares Bild wie bei den Ko-IPs mit dem wildtypischen NtIP1-HA ab. Beide
XopB/eGFP-Fusionsproteine vermochten NtIP1(G2A)-HA zu binden, da sowohl die eGFP-
Konstrukte als auch NtIP1(G2A)-HA im Eluat nachweisbar waren (Abb. 55, E, Anti-GFP bzw.
Anti-HA). Die G2A-Mutante von NtIP1 konnte bei Koexpression von eGFP-XopB oder XopB-
eGFP im Gesamtzellextrakt (RE), im Pellet (P) und im input (I) – hier jedoch nur bei XopB-
eGFP – nachgewiesen werden. Das Fehlen von NtIP1(G2A)-HA im input nach Koexpression
von eGFP-XopB ist vermutlich auf die geringere Stabilität dieses GFP-Fusionsproteins
Ergebnisse
117
zurückzuführen. NtIP1(G2A)-HA konnte nach Koexpression mit freiem GFP wie erwartet nur
im Gesamtzellextrakt und im Pellet nachgewiesen werden und erneut nicht im input. Die
XopB/eGFP-Fusionsproteine vermochten demnach sowohl NtIP1-HA als auch NtIP1(G2A)-
HA zumindest zu einem gewissen Anteil zu solubilisieren, wobei das stabilere XopB-eGFP-
Konstrukt dies effektiver bewerkstelligen konnte als eGFP-XopB.
Abb. 54: Koimmunpräzipitation von XopB und NtIP1. XopB-eGFP, eGFP-XopB oder freies GFP wurde zusammen mit NtIP1-HA und p19 als silencing suppressor A. tumefaciens-vermittelt in N. benthamiana überexprimiert. Zwei Tage nach Agroinfiltration wurde Blattmaterial geerntet und ein Rohextrakt hergestellt. Nach dem Entfernen der Zelltrümme (I: input) wurde mit diesem eine Ko-IP mit magnetischen GFP-beads durchgeführt. NB: non-bound; nicht gebundene Proteine nach Inkubation mit GFP-beads. E: Eluat. Freies GFP sowie GFP-Fusionsproteine und NtIP1-HA wurden mit GFP- bzw. HA-spezifischen Antikörpern in der Western-Blot-Analyse nachgewiesen.
Ergebnisse
118
Abb. 55: Koimmunpräzipitation von XopB und der Mutante NtIP1(G2A). XopB-eGFP, eGFP-XopB oder freies GFP wurde zusammen mit NtIP1(G2A)-HA und p19 als silencing suppressor A. tumefaciens-vermittelt in N. benthamiana überexprimiert. Zwei Tage nach Agroinfiltration wurde Blattmaterial geerntet und ein Rohextrakt (RE) hergestellt. Nach dem Entfernen der Zelltrümme (P: Pellet) wurde mit dem löslichen Überstand (I: input) eine Ko-IP mit magnetischen GFP-beads durchgeführt. NB: non-bound; nicht gebundene Proteine nach Inkubation mit GFP-beads. E: Eluat. Freies GFP sowie GFP-Fusionsproteine und NtIP1(G2A)-HA wurden mit GFP- bzw. HA-spezifischen Antikörpern in der Western-Blot-Analyse nachgewiesen.
4.6.4. CaIP1 in Wechselwirkung mit Bakterien
Für NtIP1 aus Tabak konnte die Interaktion mit XopB mit Hefe-Zwei-Hybrid-Interaktionen,
BIFC und Koimmunpräzipitation gezeigt werden. Diese Experimente konnten mit CaIP1 aus
Paprika nicht durchgeführt werden, da CaIP1 im Rahmen dieser Arbeit nicht kloniert werden
konnte. Es gelang aber durch einen Sequenzvergleich von homologen IP1-Genen aus
Tabak, Tomate und Kartoffel Oligonukleotide abzuleiten, die in konservierten Bereichen
paarten. Mit diesen konnte ein Teil-Fragment von CaIP1 kloniert und sequenziert werden. Mit
dieser Sequenz war es nun möglich spezifische Oligonukleotide abzuleiten, um mögliche
Veränderungen des Expressionsniveaus von CaIP1 nach Infektion mit Xcv zu untersuchen.
4.6.4.1. Transkriptionelle Modulation von CaIP1 durch Xcv
Um die Expression von CaIP1 zu untersuchen, wurden Blätter suszeptibler Paprika-Pflanzen
mit den Bakterienstämmen Xcv WT (Xcv (LV)), der xopB-Deletionsmutante Xcv ΔxopB (LV),
der Komplementationsmutante Xcv ΔxopB +xopB(-) und der TTSS-defizienten Mutante Xcv
ΔhrpB1 sowie 10mM MgCl2 als mock-Kontrolle infiltriert. In der sich anschließenden qPCR-
Analyse zeigte sich, dass CaIP1 3 Tage nach Infiltration (dpi) drastisch herabreguliert wird,
sobald Paprika-Blätter mit einem Xcv-Stamm infiltriert werden. Unter mock-Bedingungen war
Ergebnisse
119
das Expressionsniveau von CaIP1 gegenüber der Xcv WT-Infektion 60-fach erhöht. Nach
Infektion mit Xcv ΔxopB und der Komplementante war die Expression von CaIP1 gegenüber
der WT-Infektion mit 2.30-fach bzw. 0.69-fach nur geringfügig verändert. Die Infektion mit
Xcv ΔhrpB1 resultierte in einer etwa 10-fach erhöhten Expression gegenüber der Infektion
mit Xcv WT (Abb. 56). Im Allgemeinen wird CaIP1 also nach Xcv-Infektionen herabreguliert
wird und es lässt sich vermuten, dass dies PAMP-vermittelt geschieht. Möglicherweise
spielen jedoch translozierte Effektoren ebenfalls eine Rolle, da nach Infektionen mit Xcv WT,
der xopB-Deletionsmutante und der xopB-Komplementante die niedrigsten
Expressionsniveaus von CaIP1 festgestellt wurden.
Abb. 56: Expressionsanalyse von CaIP1 nach Infektion von Paprika mit Xanthomonas. Ausgewachsene Blätter von fünf Wochen alten suszeptiblen Paprikapflanzen wurden entweder mit Xcv Wildtyp (Xcv (LV)), einem xopB-Deletionsstamm (Xcv ΔxopB (LV)), einem Komplementationsstamm, der xopB unter der Kontrolle des eigenen Promotor in trans exprimiert, (Xcv ΔxopB + xopB) oder der TTSS-defizienten Mutante Xcv ΔhrpB1 (LV) mit einer bakteriellen Dichte von 109 cfu ml-1 infiltriert. Als Kontrolle wurden Blätter mit 10 mM MgCl2 infiltriert (mock). LV: pBBR1-MCS5 Leervektor. Für jeden Xcv-Stamm wurden jeweils zwei ganze Blätter zweier Paprika-Pflanzen infiltriert. Drei Tage nach Infektion wurde aus den Blättern die Gesamt-RNA isoliert und die mRNA Menge von CaIP1 mittels qPCR bestimmt. Die Werte wurden auf CaEF1alpha normalisiert und relativ zu den Werten aus Xcv WT (LV)-infizierten Blättern dargestellt, welche „1“ gesetzt wurden. Niedrige Werte wurden zusätzlich nummerisch im Diagramm dargestellt. Werte repräsentieren Mittelwerte +/- SD (n= 3).
4.6.4.2. CaIP1 wird über ROS und Zucker reguliert
In einem nächsten Schritt wurde die Expression von CaIP1 unter den in 4.3.4 beschriebenen
Bedingungen untersucht. Es zeigte sich, dass CaIP1 durch H2O2 und die Zucker Saccharose
und Glukose 5-fach herab- bzw. jeweils 2.5-fach hochreguliert wurde. Die Phytohormone SA
und ABA hatten hingegen keinen Einfluss auf das Expressionsniveau von CaIP1 (Abb. 57).
Ergebnisse
120
Zusammen mit den Expressionsdaten nach Xcv-Infektionen (4.6.4.1) lässt sich daher
vermuten, dass CaIP1 während einer kompatiblen Interaktion ROS-vermittelt herabreguliert
wird. Möglicherweise spielen aber auch Zucker in der Regulation dieses Gens eine zu H2O2
gegenläufige Rolle. Dies könnte auch erklären, warum CaIP1 nach Infektion mit Xcv ΔxopB
und Xcv ΔhrpB1 weniger stark herabreguliert wurde als nach Infektion mit Xcv WT oder der
xopB-Komplementante. Denn Infektionen mit den Stämmen Xcv ΔxopB und Xcv ΔhrpB1
führten im Vergleich zur Xcv WT-Infektion zu einer erhöhten Expression des Zucker-
regulierten Gens CaPRQ (Abb. 27).
Abb. 57: Transkriptionelle Regulation von CaIP1 wird durch Abwehr-assoziierte externe Stimuli vermittelt. Blattscheiben von sechs Paprika-Pflanzen wurden im Dunkeln in 6-Loch Schalen auf 10 mM H2O2, 100 µM SA, 10 µM ABA, 250 mM Saccharose oder 250 mM Glukose für 18 h inkubiert. Deionisiertes Wasser und deionisiertes Wasser versetzt mit Methanol (1:1000) wurden als Kontrollen mitgeführt. Jeweils sechs Blattscheiben wurden vereinigt und aus diesen Gesamt-RNA extrahiert. Mittels qPCR wurde die mRNA-Menge von CaIP1 bestimmt. Werte wurden auf CaEF1alpha normalisiert und relativ zu den Werten von Blattscheiben dargestellt, die mit deionisiertem Wasser inkubiert wurden, welche „1“ gesetzt wurden. Werte repräsentieren Mittelwerte +/- SD (n= 3). Vergleichbare Ergebnisse wurden in einem unabhängigen Experiment erzielt.
4.6.5. NtIP1 ist ein positiver Regulator der cw-Inv
Um einen möglichen Einfluss von NtIP1 auf die Regulation der cw-Inv zu untersuchen, wurde
NtIP1-HA in N. benthamiana-Blättern A. tumefaciens-vermittelt überexprimiert. Einen Tag
später wurden dieselben Blätter mit Xcv infiltriert, um die cw-Inv-Aktivität zu stimulieren.
Während dieser inkompatiblen Interaktion mit Xcv, nach vorangegangener Agroinfiltration,
erhöhte sich die cw-Inv-Aktivität von etwa 30 auf 100 µmol/ m2 *min und blieb damit deutlich
unter der starken Induktion auf bis zu 400 µmol/ m2 *min nach Infiltration von N. tabacum mit
Xcv (siehe Abb. 11). Dennoch konnte hier nach Überexpression von NtIP1-HA die cw-Inv-
Ergebnisse
121
Aktivität durch Xcv weiter auf etwa 160 µmol/ m2 *min erhöht werden. Alle Blätter die statt mit
Xcv mit MgCl2 infiltriert wurden zeigten anfangs eine niedrigere cw-Inv-Aktivität in Vergleich
zu Xcv-Infiltrierten Blättern, erreichten aber an Tag 4 in etwa das Niveau von 100 µmol/ m2
*min. Möglicherweise stimulierte bereits die Agroinfiltration die cw-Inv und es kam deshalb
über den Verlauf des Experimentes zu einem Anstieg der cw-Inv-Aktivität. Dies wird dadurch
weiter ersichtlich, da die cw-Inv-Aktiviät von einer MgCl2-infiltrierten Kontrolle ohne vorheriger
Agroinfiltration an Tag 0 bei 4,8774 ±0,7906 µmol/ m2 *min lag (nicht in Diagramm
dargestellt). Die Agroinfiltration könnte auch der Grund sein, warum die Induktion der cw-Inv-
Aktivität durch Xcv im allgemeinen niedriger ausfiel als in den vorherigen Experimenten mit
N. tabacum ohne Agroinfiltration (siehe Abb. 8). Die Generierung von transgenen N.
tabacum oder N. benthamiana-Pflanzen mit konstitutiver Expression von NtIP1 wäre für
zukünftige Experimente hilfreich, da dann eine Agroinfiltration nicht mehr nötig wäre.
Abb. 58: Die transiente Überexpression von NtIP1-HA erhöht die Xcv-stimulierte cw-Inv-Aktivität in N. benthamiana. NtIP1-HA und/ oder p19 (durchgezogene bzw. gestrichelte Linien) wurden A. tumefaciens-vermittelt transient in N. benthamiana-Blättern überexprimiert. Einen Tag später wurde Xcv oder MgCl2 (schwarze bzw. graue Linien) infiltriert und die cw-Inv-Aktivität 0, 1, 2, 3 und 4 Tage nach Infektion (dpi) bestimmt. Werte stellen Mittelwerte aus biologischen Replikaten dar (n= 5, ± SD). mock-infiltriertes Blatt (0 dpi): 4,8774 ±0,7906 µmol/ m2 *min (nicht in Diagramm dargestellt). Statistisch signifikante Unterschiede zwischen 35::p19, 35S::NtIP1-HA +Xcv und 35S::p19 +Xcv wurden mittels student´s t-test berechnet und sind mit Sternchen gekennzeichnet. (*** p<0.001 und * p<0.05). Vergleichbare Ergebnisse wurden in einem unabhängigen Experiment erzielt.
Ergebnisse
122
4.6.6. Generierung von transgenen A. thaliana Pflanzen mit konstitutiver
Expression von AtIP1-HA
Da für den AtIP1-locus keine T-DNA-Insertionslinien existieren und ein Versuch AtIP1 mittels
amiRNA stillzulegen erfolglos blieb, wurden transgene Pflanzen hergestellt, die AtIP1
überexprimieren. Mit diesen Pflanzen könnte so der Einfluss der AtIP1-HA-Überexpression
auf die Pst-Arabidopsis-Interaktion untersucht werden. Dazu wurden A. thaliana Col-0
Wildtyppflanzen mit dem in Abb. 59 schematisch dargestellten 35S::AtIP1-HA-Konstrukt
nach dem floral dipping Verfahren transformiert.
Abb. 59: Schematische Darstellung des Überexpressionskonstrukts pBinAR:AtIP1-HA. Über den 5´-Primer wurde an den ORF von AtIP1 eine BamHI-Schnittstelle sowie eine Kozak-Sequenz angefügt und über den 3´-Primer das HA-Epitop, ein Stop-Codon und eine SalI-Schnittstelle.
Aus etwa 1000 gassterilisierten Samen der transformierten T0-Pflanzen konnten 36
Kanamycin-resistente Sämlinge erhalten werden, welche in Erde weiter kultiviert wurden. In
einer Western-Blot-Analyse mit einem HA-spezifischen Antikörper konnten von diesen 36
Primärtransformanden fünf identifiziert werden, die AtIP1-HA exprimierten (Daten nicht
gezeigt). Diese (T1-Linien 2, 5, 24, 35 und 36) und 2 Kanamycin-resistente „nicht-
Exprimierer“ (T1-Linien 1 und 4), die im Western-Blot kein AtIP1-HA-Signal zeigten, sowie
mehrere Wildtyppflanzen wurden zur Samenproduktion weiter kultiviert. Die Western-Blot-
Analyse wurde mit je einem Individuum der T2-Generation wiederholt. Die Nachkommen der
Linien 2, 5, 24, 35 und 36 zeigten wieder ein spezifisches anti-HA-Signal bei etwa 25 kDa
(berechnete Größe von AtIP1-HA: 26 kDa). Die „nicht-Exprimierer“-Linien 1 und 4 sowie der
Col-0 WT zeigten in der Western-Blot-Analyse wie erwartet keine anti-HA-Signale (Abb. 60).
Abb. 60: Expression von AtIP1-HA in transgenen A. thaliana 35S::AtIP1-HA-Pflanzen der T2-Generation. Von den angezeigten Linien wurden aus Blattproben mit 2xLämmli-Puffer Gesamtproteinextrakte erstellt und diese einer Western-Blot-Analyse unterzogen. Mit einem Peroxidase-gekoppelten anti-HA-Antikörper wurden diese Linien auf AtIP1-HA-Expression getestet. Als Ladekontrolle ist die Amido Schwarz-gefärbte RubisCO-Bande auf der Nitrozellulosemembran gezeigt.
Ergebnisse
123
Die Aufspaltungsverhältnisse der T2- und T3-Generationen sind in Tabelle 11 aufgelistet. Die
Linien 35 und 36 zeigten nach Aussaat der T2-Generation in Bezug auf deren Kanamycin-
Resistenz ein 3:1-Aufspaltungsverhältnis und waren in der T3-Generation zu 100%
Kanamycin-resistent (Tabelle 11, fett markiert). Daher tragen diese drei Linien sehr
wahrscheinlich nur eine „35S::AtIP1-HA“-T-DNA-Insertion. Diese beiden Linien waren zudem
bis in die T3-Generation im Western-Blot positiv (siehe unten).
Tabelle 11: Aufspaltungsverhältnisse der transgenen A. thaliana 35S::AtIP1-HA-Linien. KanR:KanS: Verhältnis von Kanamycin-resistenten zu –sinsitiven Sämlingen (n ≥80). Anti-HA WB: Positives (+) bzw. negatives (-) Ergebnis der Western-Blot-Analyse der angezeigten Linien und Generationen.
Aussaat T2-Samen KanR:KanS (T2) Aussaat T3-Samen KanR:KanS (T3) Anti-HA WB (T1/T2/T3)
#1 1:0 #1-1 1:0 -/-/-
#2 3:1 #2-4 7:1 +/+(2-1!)/+
#4 3:1 #4-1 1:0 -/-/-
#5 1:0 #5-6 1:0 +/+/-
#24 3:1 #24-4 8:1 +/+/+
#35 3:1 #35-6 1:0 +/+/+
#36 3:1 #36-5 1:0 +/+/+
Jeweils ein T3-Sämling von allen in Tabelle 11 genannten 35S::AtIP1-HA-Linien sowie eine
Wildtyppflanze wurden zur Samenproduktion weiter kultiviert. Nach etwa 3 Wochen wurden
diese beprobt und erneut eine Western-Blot-Analyse durchgeführt. Die in der T2-Generation
positve Linie 5 war nun nicht mehr positiv. Es standen somit 4 Linien zur Verfügung, die
AtIP1-HA exprimierten und 3 transformierte „Nicht-Exprimierer“ (Abb. 61).
Abb. 61: Überprüfung der Expression von AtIP1-HA in transgenen A. thaliana 35S::AtIP1-HA-Pflanzen der T3-Generation. Von den angezeigten Linien wurden mit 2xLämmli-Puffer Gesamtproteinextrakte erstellt und diese einer Western-Blot-Analyse unterzogen. Mit einem Peroxidase-gekoppelten anti-HA-Antikörper wurden diese Linien auf AtIP1-HA-Expression getestet. Als Ladekontrolle wurde die Amido Schwarz-gefärbte RubisCO-Bande auf der Nitrozellulosemembran gezeigt.
Diese Linien wurden im Rahmen dieser Arbeit jedoch nicht weiter bearbeitet, da in den
bisher durchgeführten Hefe-Zwei-Hybrid-Studien nicht gezeigt werden konnte, dass XopB
mit AtIP1 interagiert.
Ergebnisse
124
4.7. Identifizierung und Charakterisierung weiterer Zielprozesse von XopB und NtIP1
Um die Funktion von NtIP1 und dessen Homologe genauer zu charakterisieren, wurden
pflanzliche Interaktionspartner von NtIP1 identifiziert. In weiteren Untersuchungen konnte so
eine Verbindung von NtIP1 und AtIP1 zu GTPase aktivierenden Proteinen, den sogenannten
RhoGAPs, hergestellt werden.
4.7.1. Durchmusterung von cDNA-Bibliotheken aus N. tabacum und A. thaliana
mit NtIP1 als Köderprotein
Der ORF von NtIP1 wurde in den Vektor pGBT9 kloniert, wodurch eine translationale Fusion
mit der GAL4-Bindedomäne entstand. Mit diesem Konstrukt wurden dann cDNA-Bibliotheken
von N. tabacum und A. thaliana, die mit der Aktivierungsdomäne von GAL4 fusioniert
wurden, durchmustert.
Von jeweils 33 x 106 durchmusterten Hefe-Transformanden der N. tabacum- und A. thaliana-
cDNA-Bibliothek waren etwa 700 bzw. 100 HIS3-positiv. Jeweils 100 Transformanden
wurden für einen lacZ-Test überstrichen. In diesem Test waren jeweils alle 100
Transformanden positiv. Von jeweils 12 dieser positiven Transformanden wurde Plasmid-
DNA isoliert und damit E. coli KC8-Zellen transformiert. Die Beuteplasmide wurden mittels
Selektivmedien vom Köderplasmid getrennt und anschließend präpariert. Nach einer EcoRI-
/XhoI-Restriktionshydrolyse wurde für jedes spezifische Restriktionsmuster ein
repräsentativer Klon sequenziert.
Für N. tabacum wurden 6 Klone (t1, t5, t39, t60, t62 und t80) sequenziert, die alle in der
blastx-Analyse einen Treffer für ein Rho-GTPase aktivierendes Protein (RhoGAP) aus N.
tomentosiformis oder N. sylvestris erzielten. Für A. thaliana wurden 4 repräsentative Klone
(cd1, cd74, cd80 und cd86) sequenziert, die alle ein cDNA-Fragment des RhoGAPs
AT5G12150 enthielten. Die gefundenen RhoGAPs zeichnen sich neben der typischen GAP-
Domäne durch eine PH-Domäne (pleckstrin homology) am N-Terminus und eine Leucin-
Zipper-Domäne am C-Terminus aus. Basierend auf den Sequenzierungen wurden
consensus-Sequenzen erstellt, um für die Tabak- und Arabidopsis-Interaktoren spezifische
Primer abzuleiten. Die meisten Sequenzdaten aus den ersten 12 untersuchten Klonen
enthielten die Leucin-Zipper-Domäne. Es wurden daher Primer für die Tabak- und
Arabidopsis-Interaktoren abgeleitet, die diese Domäne umspannen und ein 260 bp- bzw. 350
bp-Fragment amplifiziere. In einer anschließenden Hefe-Kolonie-PCR konnten mit diesen
Ergebnisse
125
Primern 79 weitere Tabakklone und 64 weitere Arabidopsisklone als „RhoGAP-positiv“
identifiziert werden. Sieben Tabak- und 29 Arabidopsisklone waren in der Hefe-Kolonie-PCR
„RhoGAP-negativ“. Die Beuteplasmide dieser „RhoGAP-negativen“ Klone wurden daraufhin
isoliert, mit EcoRI und XhoI hydrolytisch gespalten und je ein Repräsentant sequenziert. Für
Tabak konnten so die Klone tA11 und tE3 erhalten werden, die für ein nicht charakterisiertes
Protein bzw. erneut für das RhoGAP aus N. tomentosiformis kodierten. Alle potentiellen
Interaktionspartner von NtIP1 aus Tabak sind in Tabelle 12 aufgelistet.
Tabelle 12: Identifizierung potentieller Interaktionspartner von BD-NtIP1 nach der Durchmusterung einer N. tabcum-cDNA-Bibliothek. Die blastx-Treffer wurden nach der NCBI-accession geordnet und zusammengehörige Treffer farblich unterlegt. EcoRI/XhoI: Anzahl der E. coli KC8-Klone mit identischem EcoRI-/XhoI-Restriktionsmuster wie bereits sequenzierte Klone. PCR: Zusätzlich gefundene Klone, die in einer Hefe-Kolonie-PCR als „RhoGAP-positiv“ getestet wurden. $: Summe der Klone, die durch Sequenzierung, Restriktionsmuster oder Hefe-Kolonie-PCR identifiziert wurden. (nb): nicht bestimmt.
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Die 29 „RhoGAP-negativen“ Arabidopsisklone wurden nach demselben Verfahren wie die
„RhoGAP-negativen“ Tabakklone weitergeführt und reduzierten sich letztendlich auf die 5
Klone CD30D5, CD30E9, CD30F6, CD30F8 und CD30H4. Die Klone CD30F6 und CD30F8
enthielten cDNA-Fragmente der RhoGAPs AT5G19390 bzw. AT5G12150. Die übrigen 3
Klone enthielten cDNA-Fragmente verschiedener Gene aus Arabidopsis und sind in Tabelle
13 genauer beschrieben.
Ergebnisse
126
Tabelle 13: Identifizierung potentieller Interaktionspartner von BD-NtIP1 nach der Durchmusterung einer A. thaliana-cDNA-Bibliothek (CD4-30). Die blastx-Treffer wurden nach der NCBI-accession geordnet und zusammengehörige Treffer farblich unterlegt. EcoRI/XhoI: Anzahl der E. coli KC8-Klone mit identischem EcoRI-/XhoI-Restriktionsmuster wie bereits sequenzierte Klone. PCR: Zusätzlich gefundene Klone, die in einer Hefe-Kolonie-PCR als „RhoGAP-positiv“ getestet wurden. Σ: Summe der Klone, die durch Sequenzierung, Restriktionsmuster oder Hefe-Kolonie-PCR identifiziert wurden. (nb): nicht bestimmt.
lfd. Nr. Klon Name blast x-‐Treffer Accession E-‐Wert TAIR EcoRI/XhoI PCR Σ
1 cd1 Rho GTPase aktivierendes Protein mit PH Domäne [Arabidopsis thaliana] NP_196776 0,0 AT5G12150 0
2 cd74 Rho GTPase aktivierendes Protein mit PH Domäne [Arabidopsis thaliana] NP_196776 0,0 AT5G12150 0
3 cd80 Rho GTPase aktivierendes Protein mit PH Domäne [Arabidopsis thaliana] NP_196776 2 e-‐162 AT5G12150 0 64 75
4 cd86 Rho GTPase aktivierendes Protein mit PH Domäne [Arabidopsis thaliana] NP_196776 0,0 AT5G12150 3
5 CD30F8 Rho GTPase aktivierendes Protein mit PH Domäne [Arabidopsis thaliana] NP_196776 5 e-‐162 AT5G12150 3
6 CD30F6 Rho GTPase aktivierendes Protein mit PH Domäne [Arabidopsis thaliana] NP_001031905 0,0 At5G19390 3 (nb) 4
7 CD30H4 nicht charakterisiertes Protein [Arabidopsis thaliana] NP_197174 7 e-‐180 AT5G16720 0 (nb) 1
8 CD30E9 E3 Ubiquitin-‐Ligase-‐BRE1-‐ähnlich 1 [Arabidopsis thaliana] NP_182022 0,0 AT2G44950 1 (nb) 2
9 CD30D5 AUCSIA-‐1 interacting protein [Arabidopsis thaliana] NP_194885 0,0 AT4G31570 0 (nb) 1
Da in beiden cDNA-Durchmusterungen die RhoGAPs als die dominierenden
Interaktionspartner identifiziert wurden, wurden mit dieser Proteingruppe genauere Analysen
durchgeführt. Zunächst wurden die Interaktionen zwischen NtIP1 und je drei ausgewählten
cDNA-Klonen von N. tabacum und A. thaliana in einem unabhängigen Experiment bestätigt.
Dazu wurden jeweils drei Arabidopsis- und Tabakklone ausgewählt, die die verschiedenen
Domänen der RhoGAPs repräsentierten. So wurde z.B. der cDNA-Klon t64 gewählt, da
dieser keine PH- und GAP-Domäne beinhaltete (Abb. 62).
Ergebnisse
127
Abb. 62: Sequenzvergleich von SlRhoGAP12 aus Tomate (A) sowie RhoGAP150 und RhoGAP390 aus Arabidopsis (B bzw. C) mit den Sequenzen aus der Hefe-Zwei-Hybrid-cDNA-Durchmusterung. Je ein repräsentativer cDNA-Klon einer bestimmten Gruppe wurde für direkte Interaktionsstudien ausgewählt.
Nach der Auswahl der Klone wurde das Köderkonstrukt BD-NtIP1 jeweils mit den
Tabakklonen t39, t62 und t64 bzw. mit den Arabidopsisklonen cdF6, cd74 und cd80
kotransformiert. Alle sechs ausgewählten Klone zeigten auf dem SCAD-leu-trp-his-Medium
Wachstum und waren zudem LacZ-positiv (Abb. 63A). Als Positivkontrolle diente wieder die
Interaktion zwischen p53 und SV40, wobei diese etwas schwächer interagierte als üblich,
und als Negativkontrollen NtIP1 und die Klone cd80 und t64 mit ihren korrespondierenden
Leervektoren pGAD424 bzw. pGBT9. Wie zu erwarten, zeigten die Negativkontrollen weder
Wachstum noch eine Blaufärbung im LacZ-Test (Abb. 63B).
Ergebnisse
128
Abb. 63: Direkte Interaktion von NtIP1 mit ausgewählten Arabidopsis- (CD) und Tabak- (t) RhoGAP-cDNA-Fragmenten. A) Die Arabidopsisklone CDF6, CD74 und CD80 sowie die Tabakklone t39, t62 und t64 wurden zusammen mit BD-NtIP1 in den Hefe-Stamm Y190 transformiert und auf geeignete Selektivmedien transferiert. Nach 2 bzw. 3 Tagen bei 30°C wurde das Hefe-Wachstum auf -LT-Platten und -LTH-Platten dokumentiert und ein lacZ-Test durchgeführt. BD: Gal4-Dindedomäne; AD: Gal4-Aktivierungsdomäne; -LT: SCAD-leu-trp-Medium; -LTH: SCAD-leu-trp-his-Medium; lacZ: lacZ filter lift-assay auf SCAD-leu-trp-his-Medium. B) Positivkontrolle: BD-p53 und AD-SV40; Negativkontrollen: BD-NtIP1 und pGAD424 Leervektor, pGBT9 Leervektor und AD-CD80 oder AD-t64.
4.7.2. Die PH-RhoGAP-Familie
Die PH-RhoGAP-Familie besteht in allen hier untersuchten Pflanzenspezies aus drei
Mitgliedern. Die PH-Domäne (pleckstrin homology) ist im Allgemeinen für die Bindung von
Phosphatidylinositol wichtig und trägt damit zur Bindung an Membranen oder an
Membranbereiche bei, die bestimmte Phosphatidylinositole tragen (Brembu et al., 2006). Die
Leucin-Zipper-Domäne vermittelt Protein-Protein-Interaktionen (Causier et al., 2003). Von A.
thaliana, S. lycopersicum, N. tomentosiformis und N. sylvestris konnten mittels blastx-
Analysen jeweils drei PH-RhoGAPs mit den oben beschriebenen Charakteristika gefunden
werden.
Das PH-RhoGAP AtREN1 (ROP1 enhancer 1) aus Arabidopsis wurde bereits genauer
untersucht und es konnte gezeigt werden, dass dieses ein Interaktionspartner von ROP1 aus
Arabidopsis darstellt. ROP1 ist eine kleine GTPase und wird von AtREN1 inaktiviert. Dies
geschieht über die GAP-Domäne (GTPase aktivierendes Protein), die in der Lage ist, die nur
sehr geringe intrinsische GTPase-Aktivität von ROP1 zu erhöhen, wodurch ROP1 von einem
GTP-gebunden Zustand in einen GDP-gebundenen Zustand übergeht (Hwang et al., 2008).
Da ROPs im GTP-gebundenen Zustand in Bezug auf ihre sogenannten Effektoren, also
deren Zielproteine, aktiv und im GDP-Zustand inaktiv sind, spielen die korrespondierenden
Ergebnisse
129
RhoGAPs immer eine inaktivierende Rolle (Nibau et al., 2006). Neben AtREN1 gibt es in
Arabidopsis noch die beiden PH-RhoGAPs AtRhoGAP150 (NCBI: NM_121253; TAIR:
At5G12150) und AtRhoGAP390 (NCBI: NM_180711; TAIR: At5G19390). Diese bilden eine
eigene phylogenetische Gruppe und zeichnen sich gegenüber AtREN1 vorallem durch ein
etwas kürzeres 5´-Ende aus (Hwang et al., 2008).
Von den Arabidopsis-Sequenzen wurde zusammen mit den Sequenzen aus den Solanaceae
ein phylogenetischer Stammbaum erstellt. Tatsächlich bildete sich eine Gruppe aus jeweils
einem PH-RhoGAP der drei Solanaceae-Spezies S. lycopersicum, N. tomentosiformis und
N. sylvestris. Diese Gruppe stand AtREN1 am nächsten und wurde daher zusammen mit
diesem als Klasse I bezeichnet (Abb. 64). Die Solanaceae-Mitglieder wurden daraufhin mit
dem Namenszusatz REN1 versehen. Die beiden übrigen PH-RhoGAPs aus Arabidopsis
bildeten eine eigene Gruppe und wurden als Klasse II bezeichnet. Die übrigen PH-RhoGAPs
aus den Solanaceae bildeten zwei Gruppen, die jeweils eine PH-RhoGAP aus jeder
Pflanzenspezies beinhaltete. Diese beiden Gruppen wurden als Klasse III bzw. IV
bezeichnet. Die Klasse III und IV beinhalten SlRhoGAP7 bzw. SlRhoGAP12 aus Tomate
(Abb. 64).
Abb. 64: Phylogenetischer Stammbaum der PH-RhoGAP-Familie. Die mRNA-Sequenzen der angegebenen Gene wurden mit dem Programm Geneious (neighbour joining tree) miteinander verglichen und als phylogenetischer Stammbaum dargestellt. Basierend auf dem Stammbaum wurden die RhoGAPs in die Klassen I, II, III und IV eingruppiert. At: A. thaliana; Nt: N. tabacum; Nsyl: N. sylvestris; Ntom: N. tomentosiformis; Sl: S. lycopersicum.
Ergebnisse
130
Sofern noch nicht als solche annotiert, wurden die übrigen RhoGAPs aus allen Tabak-
Spezies basierend auf der Tomatennomenklatur als RhoGAP7 bzw. RhoGAP12 bezeichnet
(Tabelle 14).
Tabelle 14: Nomenklatur der PH-RhoGAP-Familie. Kurzname: Die PH-RhoGAPs aus Solanaceae wurden, sofern noch kein Kurzname vorhanden war, mit REN1, RhoGAP7 oder RhoGAP12 abgekürzt. Die Abkürzung AtRhoGAP390 und AtRhoGAP150 basiert auf den TAIR accession-Nummern AT5G19390 bzw. AT5G12150. Nukleotid- und Protein-id: GenBank accessions. At: A. thaliana; Sl: S. lycopersicum; Nsyl: N. sylvestris; Ntom: N. tomentosiformis.
Kurzname Nukleotid-id Protein-id Annotation NCBI/ Solgenomics
AtREN1 NM_118591 NP_194189 Rho GTPase activating protein REN1
SlREN1 XM_010321897 XP_010320199 rho GTPase-activating protein REN1
NsylREN1 XM_009771816 XP_009770118 rho GTPase-activating protein REN1
NtomREN1 XM_009589744 XP_009588039 rho GTPase-activating protein REN1
AtRhoGAP390 NM_180711 NP_851042 Rho GTPase activation protein
AtRhoGAP150 NM_121253 NP_196776 Rho GTPase activation protein with PH domain
SlRhoGAP7 XM_004250845 XP_004250893 rho GTPase-activating protein 7
NtomRhoGAP7 XM_009626628 XP_009624923 rho GTPase-activating protein 7-like
NtRhoGAP7 - - Diese Arbeit
NsylRhoGAP7 XM_009798679 XP_009796981 rho GTPase-activating protein 7-like
SlRhoGAP12 XM_004228455 XP_004228503 rho GTPase-activating protein 7-like
/ Rho GTPase activating protein 12
NtomRhoGAP12 XM_009595100 XP_009593395 rho GTPase-activating protein 7-like
NsylRhoGAP12 XM_009792382 XP_009790684 rho GTPase-activating protein 7-like
NtRhoGAP7, der Interaktionspartner von NtIP1 (siehe 4.7.3), fiel in die Klasse III. Abb. 65
zeigt die Aminosäureidentitäten dieser Familie an.
Ergebnisse
131
Abb. 65: Aminosäure- (AS-) Identitäten der PH-RhoGAP-Familie. Mit dem Programm Geneious wurden die Proteinsequenzen der angegebenen PH-RhoGAPs miteinander verglichen und die AS-Identitäten zueinander in % dargestellt. At: A. thaliana; Nt: N. tabacum; Nsyl: N. sylvestris; Ntom: N. tomentosiformis; Sl: S. lycopersicum.
Ein schematischer Aminosäuresequenzvergleich dieser Familie ist in Abb. 66C gezeigt. Es
ist deutlich zu erkennen, dass alle REN1-Vertreter einen in Vergleich zu den übrigen PH-
RhoGAPs verlängerten N-Terminus haben. Die konservierten Domänen (PH, GAP und
Leucin-ZIPPER) wurden ebenfalls eingezeichnet. Eine Ausnahme in diesem
Sequenzvergleich ist NsylRhoGAP7, da diese Sequenz vor der Leucin-ZIPPER-Domäne
endet. Vermutlich ist dies jedoch auf eine fehlerhafte Assemblierung der mRNA-
Sequenzdaten bei NCBI zurückzuführen, da zwei partielle mRNA Sequenzen gefunden
werden konnten, die genau den fehlenden Teil mit der Leucin-ZIPPER-Domäne ersetzen
(XM_009805863.1 und XM_009805864.1). Somit enthält die NsylRhoGAP7
höchstwahrscheinlich ebenfalls eine Leucin-ZIPPER-Domäne.
Ergebnisse
132
Abb. 66: Aminosäuresequenzvergleich der RhoGAPs mit PH-Domänen aus Arabidopsis, Tabak und Tomate. Erstellt mit Geneious. Schwarz dargestellte sind Aminosäuren, die in allen Sequenzen zu 100% identisch sind. PH und GAP-Domänen nach PROSITE und Lzipper-MIP1 (Leucin-Zipper-Domäne) nach Pfam annotiert. At: A. thaliana; Nt: N. tabacum; Nsyl: N. sylvestris; Ntom: N. tomentosiformis; Sl: S. lycopersicum.
4.7.3. NtIP1 interagiert mit dem C-Terminus von NtRhoGAP
In der NtIP1-Interaktionspartnersuche (siehe 4.7.1) war auffällig, dass keine Volllängenklone
der PH-RhoGAPs aus Tabak und Arabidopsis gefunden wurden, sondern meistens cDNA-
Fragmente, die die Leucin-Zipper-Domäne enthielten oder stromaufwärts von dieser
Domäne lagen, wie im Falle der Tabakklone t62 und tE3. Letztere konnten auf Grund ihrer
Fragmentgrößen mit ca. 2400 bp nicht komplett sequenziert werden und enthielten
höchstwahrscheinlich ebenfalls die Leucin-Zipper-Domäne (Abb. 62A). Es lag daher die
Vermutung nahe, dass NtIP1 mit der Leucin-Zipper-Domäne interagiert. Um diese
Hypothese zu prüfen, wurde NtRhoGAP7 als Volllängenklon sowie dessen einzelne
Domänen kloniert. Zum Zeitpunkt der Arbeiten stand von NtRhoGAP7 keine
Volllängensequenz zur Verfügung. Jedoch konnten mittels eines Sequenzvergleiches
zwischen SlRhoGAP12 aus Tomate (Solyc01g008770) und mehreren unigenes aus Tabak
(N. tabacum) Primer für das 5´- und 3´-Ende abgeleitet werden, um die NtRhoGAP7 zu
amplifizieren. Neben dem Volllängenfragment (NtRhoGAP7-VL) wurden auch cDNA-
Fragmente ohne die PH-Domäne (NtRhoGAP7-ΔPH), bestehend nur aus PH- und GAP-
Domäne (NtRhoGAP7-PH-GAP), bestehend nur aus der GAP-Domäne (NtRhoGAP7-GAP)
und bestehend nur aus der Leucin-Zipper-Domäne und flankierenden Bereichen
(NtRhoGAP7-ZIPPER) amplifiziert.
Ergebnisse
133
Ein Schema zu den Konstrukten ist in Abb. 67A dargestellt. Die NtRhoGAP7-Fragmente
wurden anschließend in den Vektor pGAD424-GW (GW: GATEWAY-kompatibel)
rekombiniert, wodurch eine translationale Fusion mit der Aktivierungsdomäne (AD) von
GAL4 entstand. NtIP1 wurde zu für diese Studien von cDNA amplifiziert und als
Volllängenklon mittels angefügter Schnittstellen für BamHI und SalI in den Vektor pGBT9
kloniert, wodurch eine translationale Fusion mit der Bindedomäne (BD) von GAL4 entstand.
Nach Kotransformation des Hefe-Stammes Y190 mit BD-NtIP1 und je einer AD-NtRhoGAP7-
Variante wurden die erhaltenen Transformanden auf SCAD-leu-trp- und SCAD-leu-trp-his-
Medium (mit und ohne Genescreen-Membran) gestempelt. Es zeigte sich, dass NtIP1 nur
mit Konstrukten interagierte (Wachstum auf SCAD-leu-trp-his und Blaufärbung im LacZ-filter
lift assay), die die Leucin-Zipper-Domäne enthielten (Abb. 67B, NtRhoGAP7-GAP-ZIPPER
und NtRhoGAP7-ZIPPER). Die klonierte GAP-Domäne allein reichte für eine Interaktion
hingegen nicht aus (NtRhoGAP7-GAP). Unerwarteter Weise interagierte NtIP1 aber nicht mit
dem Volllängenklon von NtRhoGAP7, obwohl dieser ebenfalls die Leucin-Zipper-Domäne
enthielt. Möglicherweise stört die PH-Domäne im Hefe-Zwei-Hybrid-System, indem sie das
NtRhoGAP7 an der Plasma- oder einer Endomembran zurückhält und somit das AD-
fusionierte Konstrukt nicht in den Zellkern von Hefe gelangen kann. Unterstützt wird diese
Vermutung dadurch, dass in allen Sequenzen aus der cDNA-Durchmusterung niemals Klone
mit der PH-Domäne gefunden wurden. Als Positivkontrolle wurde wieder die Interaktion
zwischen SV40 und p53 gezeigt. Als Negativkontrollen wurden Hefen mit BD-NtIP1 oder den
AD-NtRhoGAP7-Konstrukten mit ihren korrespondierenden Leervektoren transformiert (Abb.
67B und C).
Ergebnisse
134
Abb. 67: Direkte Interaktion zwischen NtIP1 und NtRhoGAP7 und Domänen von NtRhoGAP7. A) Schematische Darstellung der AD-NtRhoGAP7-Fusionen für die direkte Interaktion mit BD-NtIP1. Neben dem Volllängen- (VL) Konstrukt (AS 1-867) wurden die verkürzten Konstrukte PH-GAP (AS 1-358), GAP (AS 146-358), ZIPPER (AS 366-867) und ΔPH (AS 146-867) erstellt. B) Die in (A) gezeigten Konstrukte wurden zusammen mit BD-NtIP1 in den Hefe-Stamm Y190 transformiert und auf geeignete Selektivmedien transferiert. Nach 2 bzw. 3 Tagen bei 30°C wurde das Hefe-Wachstum auf -LT-Platten und -LTH-Platten dokumentiert und ein lacZ-Test durchgeführt. BD: Gal4-Dindedomäne; AD: Gal4-Aktivierungsdomäne; -LT: SCAD-leu-trp-Medium; -LTH: SCAD-leu-trp-his-Medium; lacZ: lacZ filter lift-assay auf SCAD-leu-trp-his-Medium. Positivkontrolle: BD-p53 und AD-SV40 C) Negativkontrollen: pGBT9 Leervektor (BD-LV) und den in (A) gezeigten AD-NtPHRhoGAP7-Konstrukten; BD-NtIP1 und pGAD424 Leervektor (AD-LV).
4.7.4. Interaktionsstudien von AtIP1 mit AtRhoGAPs
Da in der Arabidopsis cDNA-Durchmusterung mit NtIP1 cDNA-Fragmente von
AtRhoGAP150 und AtRhoGAP390 gefunden wurden (Tabelle 13), sollte überprüft werden,
ob das zu NtIP1 homologe Gen aus Arabidopsis (AtIP1, At4g13540) ebenfalls mit diesen
RhoGAPs interagieren kann. Dazu wurde der ORF von AtIP1 in die Vektoren pGAD424-GW
und pGBT9-GW (GW: GATEWAY-kompatibel) rekombiniert, um eine N-terminale Fusion mit
der GAL4-Aktivierungsdomöne bzw. –Bindedomäne zu erhalten (im Weiteren AD- bzw. BD-
AtIP1). AtRhoGAP150 und AtRhoGAP390 wurden ebenso in diese Vektoren kloniert. Jedoch
wurde bei diesen nicht der gesamte ORF kloniert, sondern eine 5´-verkürzte Sequenz ohne
den für die PH-Domäne kodierenden Bereich. Die PH-Domäne wurde für die Hefe-Studien
weggelassen, da aus den Interaktionsstudien zwischen dem Tabak-Homolog NtIP1 bekannt
Ergebnisse
135
war, dass die PH-Domäne im Hefe-Zwei-Hybridsystem stört. Nach Kotransformation der
entsprechenden Konstrukte konnte gezeigt werde, dass AtIP1 nur mit AtRhoGAP390
interagiert und nicht mit AtRhoGAP150 (Abb. 68A und B).
Abb. 68: Direkte Interaktionsstudie von AtIP1 mit AtRhoGAP150ΔPH oder AtRhoGAP390ΔPH. A.) AtIP1 wurde als BD- und AD-Fusion mit den entsprechenden BD- oder AD-Fusionen von AtRhoGAP150ΔPH und AtRhoGAP390ΔPH in den Hefe-Stamm Y190 transformiert und auf geeignete Selektivmedien transferiert. Nach 2 und 3 Tagen bei 30°C wurde das Hefe-Wachstum auf -LT-Platten und -LTH-Platten dokumentiert bzw. ein lacZ-Test durchgeführt. BD: Gal4-Bindedomäne; AD: Gal4-Aktivierungsdomäne; -LT: SCAD-leu-trp-Medium; -LTH: SCAD-leu-trp-his-Medium; lacZ: lacZ filter lift-assay auf SCAD-leu-trp-his-Medium. Positivkontrolle: BD-p53 und AD-SV40 B.) Negativkontrollen: pGBT9 Leervektor (BD-LV) und AD-AtIP1, AD-AtRhoGAP150ΔPH oder AD- AtRhoGAP390ΔPH; Positivkontrolle: BD-p53 und AD-SV40.
4.7.5. Untersuchungen zur Interaktion von AtRhoGAPs mit AtROPs
Die vorrangegangenen Untersuchungen legten die Vermutung nahe, dass AtIP1 an der
Regulation der RhoGAP390 aus Arabidopsis beteiligt ist. Es stellte sich nun die Frage, ob
und mit welchen ROPs das RhoGAP390 interagiert. Da für einige ROPs aus Arabidopsis
bekannt ist, welche zellulären Prozesse sie regulieren (Nibau et al., 2006), könnte die
Identifizierung des entsprechenden ROPs einen Hinweis auf eine mögliche Funktion von
AtIP1 geben. Daher wurde die RhoGAP390 ohne PH-Domäne in direkten Interaktionstest
gegen eine Arabidopsis-ROP-Kollektion (R. Hückelhoven, TU München, (Hoefle et al.,
2011)) getestet. Die ROP-Kollektion bestand aus den in Hoefle et al. (2011) publizierten
Konstrukten pGBKT7:ROP2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10 und 11 und dem nicht publizierten Konstrukt
pGBKT7:ROP8, womit insgesamt 10 der 11 bekannten ROPs aus Arabidopsis in einem
geeigneten Vektor für Interaktionsstudien in Hefe vorlagen. Unerwarteter Weise interagierte
RhoGAP390 mit keiner der getesteten ROPs in Hefe (Abb. 69A). Als Positivkontrollen wurde
zum einen die Interaktion zwischen p53 und SV40 gezeigt zum anderen die in Hoefle et al.
(2011) publizierte Interaktion zwischen AtRhoGAP1 mit ROP3. Alle Positivkontrollen zeigten
Ergebnisse
136
das erwartete Wachstum auf dem SCAD-leu-trp-his-Medium (-LTH), jedoch konnte nur im
Falle von p53/SV40 eine starke Blaufärbung im lacZ filter-lift assay nachgewiesen werden.
Die Blaufärbung der Interaktion zwischen AtRhoGAP1 und AtROP3 fiel deutlich schwächer
aus. Als Negativkontrollen wurden AtROP3, 6 und 9 mit dem Leervektor pGAD424 getestet.
Wie erwartet zeigte sich hier weder Wachstum auf –LTH noch eine Blaufärbung im lacZ
filter-lift assay (Abb. 69B).
Somit musste davon ausgegangen werden, dass AtRhoGAP390 entweder andere GTPasen,
wie z.B. Rab-GTPasen, reguliert oder mit Vertretern einer anderen Proteinfamilie
wechselwirkt.
Abb. 69: Direkte Interaktionsstudie zwischen ROPs und dem RhoGAP390 aus Arabidopsis. A.) BD-ROP-Fusionen (pGBKT7:AtROP2,3,4,5,6,7,8,9,10 und 11) wurden mit pGAD424:AtRhoGAP390ΔPH in den Hefe-Stamm Y190 transformiert und auf geeignete Selektivmedien transferiert. Nach 2 und 3 Tagen bei 30°C wurde das Hefe-Wachstum auf -LT-Platten bzw. -LTH-Platten dokumentiert und ein lacZ-Test durchgeführt. BD: Gal4-Bindedomäne; AD: Gal4-Aktivierungsdomäne; -LT: SCAD-leu-trp-Medium; -LTH: SCAD-leu-trp-his-Medium; lacZ: lacZ filter lift-assay auf SCAD-leu-trp-his-Medium. B.) Positivkontrollen: BD-p53 und AD-SV40; BD-AtROP3 und AD-AtRhoGAP1 (At5G22400; Negativkontrollen: pGBKT7 Leervektor (BD-LV) und AD-AtRhoGAP390ΔPH; BD-AtROP3, 6 oder 9 und pGAD424 Leervektor (AD-LV).
Ergebnisse
137
4.7.6. Sichtung einer N. tabacum cDNA-Bibliothek mit NtRhoGAPΔPH als
Köder
Da die unter 4.7.5 beschriebenen Interaktionsstudien keinen Hinweis auf eine Beteiligung
der AtRhoGAP390 am ROP-Signalweg ergab, wurde in einer erneuten N. tabacum-cDNA-
Durchmusterung nach möglichen Interaktionspartnern von NtRhoGAP gesucht. Es wurde
hier wieder mit NtRhoGAP7 gearbeitet, da für NtIP1 jedoch nicht für AtIP1 eine Interaktion
mit XopB gezeigt werden konnte. Für die Durchmusterung wurde der NtRhoGAP-Klon ohne
die PH-Domäne gewählt (vgl. 4.7.3). Die Paarungsrate der cDNA-Durchmusterung betrug
19x106 Hefetransformanden. Insgesamt wuchsen auf dem SCAD-leu-trp-his-Medium 84
Hefekolonien, die alle untersucht wurden.
Nach bereits beschriebenen Verfahren (vgl. 4.5.2 und 4.7.1) wurden zunächst einige
repräsentative cDNA-Klone der Durchmusterung, d.h. jeweils ein Klon pro EcoRI/XhoI-
Restriktionsmuster, sequenziert. Die blastx-Analyse der Sequenzen (Tabelle 15) führte
wieder zu NtIP1 (bzw. XP_009605710.1 aus N. tomentosiformis), also jenem Köder, mit
welchem das NtRhoGAP7 ursprünglich gefunden wurde oder zu dessen homologen Protein
NtIP1.1 (bzw. XP_009631441.1 aus N. tomentosiformis). Mit genspezifischen Primern für
NtIP1 und NtIP1.1 konnten 24 bzw. 12 weitere Transformanden in einer Hefe-Kolonie-PCR
identifiziert werden, die cDNA-Fragmente eines der genannten Gene enthielten. Nach
diesem „Aussortieren“ der NtIP1-/NtIP1.1-Transformanden wurden die Beutevektoren der
verbliebenen Transformanden sequenziert. Es konnten so neben NtIP1 einige neue
potentielle Interaktionspartner der NtRhoGAP7 gefunden werden, wie z.B. ein Clathrin-
Assemblierungsprotein, ein beta-Taxilin und ein Beclin-1-ähnliches Protein. Der „Clathrin“-
Klon konnte 5 mal und der „beta-Taxilin“- sowie der „Beclin-1“-Klon konnten jeweils 2 mal
gefunden werden. Ein Protein unbekannter Funktion (XP_009599693.1) konnte sechs Mal
gefunden werden und weitere potentielle Interaktionspartner wie ein „60S ribosomales
Protein“, eine Histon-Lysin-N-Methyltransferase, ein „BTB/POZ-Domäne enthaltendes
Protein“, eine Mannitoldehydrogenase und ein „Mediator der Transkriptions-Untereinheit 36a
der RNA-Polymerase II“ konnten jeweils einmal gefunden werden. Überraschenderweise
wurde aber auch ein RhoGAP (XP_009790689.1 aus N. sylvestris) im Beutevektor gefunden
(Tabelle 15). VOZ1, ein vermutlich unspezifischer Interaktionspartner (siehe 4.5.2), wurde
zwei Mal gefunden.
Ergebnisse
138
Tabelle 15: Identifizierung potentieller Interaktionspartner von BD-NtRhoGAP7ΔPH nach der Durchmusterung einer N. tabacum cDNA-Bibliothek. Die blastx-Treffer wurden nach der accession-Nummer geordnet und zusammengehörige Treffer farblich unterlegt. EcoRI/XhoI: Anzahl der E. coli KC8-Klone mit identischem EcoRI-/XhoI-Restriktionsmuster wie bereits sequenzierte Klone. PCR: Zusätzlich gefundene Klone, die in einer Hefe-Kolonie-PCR positiv auf NtIP1 (XP_009605710.1) oder NtIP1.1 (XP_009631441.1) getestet wurden. Σ: Summe der Klone, die durch Sequenzierung, Restriktionsmuster oder Hefe-Kolonie-PCR identifiziert wurden. (nb): nicht bestimmt.
lfd. Nr. Klon Name blastx-‐Treffer Accession E-‐Wert EcoRI/XhoI PCR Σ
1 IP28_p2134MT Vorhergesagtes putatives Clathrin-‐Assemblierungsprotein At2g25430 [Nicotiana tomentosiformis]
XP_009595075.1 0
2 (nb) 5 2 IP57_p2134MT Vorhergesagtes putatives Clathrin-‐Assemblierungsprotein At2g25430 [Nicotiana tomentosiformis] XP_009595075.1 0
3 IP29_p2134MT Vorhergesagtes putatives Clathrin-‐Assemblierungsprotein At2g25430 [Nicotiana tomentosiformis] XP_009595075.1 5 x e-‐135
4 IP19_p2134MT Vorhergesagtes beta-‐Taxilin Isoform X1 [Nicotiana tomentosiformis]
XP_009597003.1 1 x e-‐162 1 (nb) 2
5 IP27_p2134MT Vorhergesagtes RhoGTPase-‐aktivierendes Protein 7-‐ähnlich Isoform X2 [Nicotiana sylvestris]
XP_009790689.1 0 1 (nb) 3
6 IP71_p2134MT
Vorhergesagtes RhoGTPase-‐aktivierendes Protein 7-‐ähnlich Isoform X2 [Nicotiana sylvestris] XP_009790689.1 0
7 IP18_p2134MT Vorhergesagtes Beclin-‐1-‐ähnliches Protein Isoform X1 [Nicotiana tomentosiformis] XP_009598598.1 0
0 (nb) 2
8 IP53_p2134MT Vorhergesagtes Beclin-‐1-‐ähnliches Protein Isoform X1 [Nicotiana tomentosiformis]
XP_009777829.1 0
9 IP46_p2134MT Vorhergesagtes nicht charakterisiertes Protein LOC104095298 Isoform X1 [Nicotiana tomentosiformis]
XP_009599693.1 0
4 (nb) 6
10 IP3_p2134MT Vorhergesagtes nicht charakterisiertes Protein LOC104095298 Isoform X1 [Nicotiana tomentosiformis] XP_009599693.1 0
11 IP40_p2134MT Vorhergesagtes nicht charakterisiertes Protein LOC104100232 [Nicotiana tomentosiformis] XP_009605710.1 1 x e-‐56
4 24 35
12 IP74_p2134MT Vorhergesagtes nicht charakterisiertes Protein LOC104100232 [Nicotiana tomentosiformis]
XP_009605710.1 1 x e-‐56
13 IP5_p2134MT Vorhergesagtes nicht charakterisiertes Protein LOC104100232 [Nicotiana tomentosiformis] XP_009605710.1 6 x e-‐57
14 IP6_p2134MT Vorhergesagtes nicht charakterisiertes Protein LOC104100232 [Nicotiana tomentosiformis] XP_009605710.1 2 x e-‐86
15 IP10_p2134MT Vorhergesagtes nicht charakterisiertes Protein LOC104100232 [Nicotiana tomentosiformis] XP_009605710.1 2 x e-‐39
16 IP11_p2134MT Vorhergesagtes nicht charakterisiertes Protein LOC104100232 [Nicotiana tomentosiformis]
XP_009605710.1 1 x e-‐109
17 IP12_p2134MT Vorhergesagtes nicht charakterisiertes Protein LOC104100232 [Nicotiana tomentosiformis] XP_009605710.1 3 x e-‐57
18 IP25_p2134MT Vorhergesagtes nicht charakterisiertes Protein LOC104121204 [Nicotiana tomentosiformis] XP_009631441.1 4 x e-‐78
6 12 24
19 IP30_p2134MT Vorhergesagtes nicht charakterisiertes Protein LOC104121204 [Nicotiana tomentosiformis] XP_009631441.1 2 x e-‐79
20 IP32_p2134MT Vorhergesagtes nicht charakterisiertes Protein LOC104121204 [Nicotiana tomentosiformis] XP_009631441.1 9 x e-‐56
21 IP34_p2134MT Vorhergesagtes nicht charakterisiertes Protein LOC104121204 [Nicotiana tomentosiformis] XP_009631441.1 1 x e-‐53
22 IP43_p2134MT Vorhergesagtes nicht charakterisiertes Protein LOC104121204 [Nicotiana tomentosiformis] XP_009631441.1 4 x e-‐82
23 IP1_p2134MT Vorhergesagtes nicht charakterisiertes Protein LOC104121204 [Nicotiana tomentosiformis]
XP_009631441.1 2 x e-‐77
24 IP16_p2134MT Vorhergesagtes 60S ribosomales Protein L5-‐ähnlich [Nicotiana tomentosiformis] XP_009611190.1 0 0 (nb) 1
25 IP60_p2134MT Vorhergesagtes mögliches Histon-‐Lysin-‐N-‐Methyltransferase ATXR3 [Nicotiana tomentosiformis] XP_009624715.1 4 x e-‐28 0 (nb) 1
26 IP70_p2134MT Vorhergesagtes BTB/POZ-‐Domäne enthaltenes Protein At5g66560 [Nicotiana tomentosiformis] XP_009630310.1 0.0 0 (nb) 1
27 IP58_p2134MT Vorhergesagte mögliche Mannitol Dehydrogenase [Nicotiana sylvestris] XP_009764995.1 2 x e-‐111 0 (nb) 1
28 IP56_p2134MT Vorhergesagter Transkriptionsfaktor VOZ1-‐ähnlich [Nicotiana sylvestris]
XP_009776508.1 0 0 (nb) 2
Ergebnisse
139
29 IP55_p2134MT Vorhergesagter Transkriptionsfaktor VOZ1-‐ähnlich [Nicotiana tomentosiformis]
XP_009597399.1 0
30 IP14_p2134MT Vorhergesagter Mediator der RNA-‐Polymerase II Transkriptions-‐Untereinheit 36a-‐ähnlich [Nicotiana sylvestris] XP_009775347.1 1 x e-‐162 1
Ein genauer Blick auf die Sequenzierungsergebnisse der Klone IP27_p2134MT und
IP71_p2134MT (im Weiteren IP27 bzw. IP71) ergab, dass diese nicht mit dem klonierten
NtRhoGAP7 identisch waren, sondern vermutlich das unbekannte homologe RhoGAP aus N.
tabacum darstellten. Die Nukleotidsequenzen von IP27 und IP71 wurden für eine genauere
Analyse in die Aminosäuresequenzen translatiert und in den phylogenetischen Stammbaum
der PH-RhoGAP-Familie mit einbezogen. Wie erwartet fielen die Klone IP27 und IP71 nicht
in die Klasse III, sondern zeigten die höchste Verwandtschaft zu NsylRhoGAP12 aus N.
sylvestris (siehe Abb. 70A). Wieder waren diese RhoGAP-Fragmente keine Volllängenklone,
sondern beinhalteten nur die Leucin-Zipper-Domäne. Ein Sequenzvergleich dieser cDNA-
Klone mit dem nächstverwandten NsylRhoGAP12 ist in Abb. 70B gezeigt. Bis auf eine
fehlende Aminosäure sind IP27 und IP71 mit dem C-Terminus der NsylRhoGAP12 identisch.
Abb. 70: A) Eingruppierung der potentiellen Interaktionspartner IP27_p2134MT und IP71_p2134MT von NtRhoGAP7 in den phylogenetischen Stammbaum der PH-RhoGAP-Familie. Die Sequenzen von IP27 und IP71 aus den Beutevektoren wurden translatiert und in den Stammbaum mit einbezogen. B) Aminosäuresequenzvergleich zwischen der nächstverwandten RhoGAP12 aus N. sylvestris und den beiden Interaktionspartnern IP27_p2134MT und IP71_p2134MT.
Ergebnisse
140
Vermutlich ist NtRhoGAP7 also in der Lage über die Leucin-Zipper-Domäne ein Heterodimer
mit dem nächstverwandten NtRhoGAP12 zu bilden. Da von NtRhoGAP7 (Klasse III) bereits
die ZIPPER-Domäne als BD- und AD-Fusion zur Verfügung stand, wurden diese Konstrukte
in Hefe auf Interaktion mit NtRhoGAP12 und NtRhoGAP7 getestet. Es zeigte sich, dass
NtRhoGAP7 nicht nur Heterodimere mit dem nächstverwandten NtRhoGAP12 ausbilden
kann (siehe IP27: „NtRhoGAP12-ZIPPER“ in Abb. 71A), sondern auch mit sich selbst ein
Homodimer bilden kann (siehe „NtRhoGAP7-ZIPPER“ in Abb. 71B).
Einige zusätzliche repräsentative Klone interessanter, potentieller Interaktionspartner wurden
in einer direkten Hefe-Interaktionsstudie getestet. Das Clathrin-Assemblierungsprotein, das
NtRhoGAP12-ZIPPER, ein Protein unbekannter Funktion XP_009599693.1, das beta-Taxilin,
NtIP1, NtIP1.1 und ein Protein mit einer BTB/POZ-Domäne zeigten eine sehr starke
Interaktion mit NtRhoGAP7-ΔPH. Beclin-1 zeigte eine etwas schwächere Interaktion,
erkennbar an dem verminderten Wachstum auf SCAD-leu-trp-his und der schwächeren
Blaufärbung im LacZ-Test (Abb. 71A).
Abb. 71: Potentielle Interaktionspartner von NtRhoGAP7. A) Direkte Interaktionen zwischen BD-NtRhoGAP7ΔPH und repräsentativen Klonen aus der Durchmusterung mit NtRhoGAPΔPH als Köder. Die angebenen Konstukte wurden in den Hefe-Stamm Y190 transformiert und auf geeignete Selektivmedien transferiert. Nach 2 und 3 Tagen bei 30°C wurde das Hefe-Wachstum auf -LT-Platten und -LTH-Platten dokumentiert bzw. ein lacZ-Test durchgeführt. BD: Gal4-Bindedomäne; AD: Gal4-Aktivierungsdomäne; -LT: SCAD-leu-trp-Medium; -LTH: SCAD-leu-trp-his-Medium; lacZ: lacZ filter lift-assay auf SCAD-leu-trp-his-Medium. B) Die ZIPPER-Domäne von NtRhoGAP7 bildet Homodimere aus. NtRhoGAP7-ZIPPER wurde als BD- und AD-Fusion in den Hefestamm Y190 transformiert und wie in (A) beschrieben die Interaktion nachgewiesen. Positivkontrolle: BD-p53 und AD-SV40; Negativkontrolle: BD-NtRhoGAP7ΔPH und pGAD424 Leervektor (AD-LV).
Ergebnisse
141
Die potentiellen Interaktionspartner „Clathrin-Assemblierungsprotein“, „beta-Taxilin“ und
Beclin-1 stehen in Verbindung mit dem intrazellulären Vesikeltransport, weshalb im
folgenden Abschnitt dieser Prozess in Bezug auf NtRhoGAP7 genauer untersucht wurde.
4.7.7. NtRhoGAP-eGFP zeigt eine duale subzelluläre Lokalisierung
NtRhoGAP7 wurde C-terminal mit eGFP fusioniert und in N. benthamiana transient
überexprimiert. Zwei Tage nach Agroinfiltration konnten in Hecht´schen Filamenten und um
Chloroplasten GFP-Signale detektiert werden Abb. 72A, a bzw. b), was auf eine zytosolische
Lokalisierung von NtRhoGAP7-eGFP hindeutete. Nach Koexpression von XopB veränderte
sich die Lokalisierung jedoch drastisch und NtRhoGAP7 war in Vesikel-ähnlichen Strukturen
detektierbar (siehe Abb. 72A). Die Expression von NtRhoGAP7-eGFP und XopB wurde in
einer Western-Blot-Analyse mit anti-GFP- bzw. anti-XopB-Antikörpern überprüft (siehe Abb.
72B). Der typische durch XopB ausgelöste Zelltod trat 3 Tage nach Agroinfiltration ein (siehe
Abb. 72C). Am Tag der Mikroskopie (2 dpi) konnten aber noch keine Zelltodsymptome
festgestellt werden. Ähnlich wie bei NtIP1-eGFP könnte es sich hier wieder um eine durch
XopB induzierte Veränderung der Lokalisierung von NtRhoGAP7-eGFP handeln.
Abb. 72: XopB-abhängige Lokalisierung von NtRhoGAP7-eGFP. A: Die Aufnahmen zeigen transiente A. tumefaciens-vermittelte Überexpressionen von NtRhoGAP-eGFP (verwendeter binärer Vektor pK7FWG2.0) in N. benthamiana. XopB oder der korrespondierende Leervektor (LV) wurden koexprimiert (verwendeter binärer Vektor pBinAR). Zwei Tage nach Agroinfiltration wurden untere Epidermiszellen am KLSM mikroskopiert. GFP/ Chl: Fluoreszenzkanal für GFP (grün) und Autofluoreszenz von Chlorophylls (rot); Max.: Maximalprojektion z-
Ergebnisse
142
Stapel; a und b: Hecht´sches Filament bzw. umschlossener Chloroplast. B: Western-Blot-Analyse mit GFP- und XopB-spezifischen Antikörpern 2 Tage nach Agroinfiltration. C: XopB-abhängiger Zelltod drei Tage nach Agroinfiltration.
Die Vesikel von NtRhoGAP7-eGFP, die nach XopB-Expression auftraten, bewegten sich
nicht. Um das zu zeigen, wurde eine Zeitaufnahme über 2 min angefertigt. Abb. 73A zeigt die
ersten 16 sec der Aufnahme. Abb. 73B zeigt die t-Maximalprojektion über 2 min und es ist
deutlich zu erkennen, dass die Vesikel statisch sind.
Abb. 73: NtRhoGAP-eGFP-Vesikel zeigen keine Bewegung in der Zelle. A: Die Aufnahmen zeigen eine transiente A. tumefaciens-vermittelte Überexpressionen von NtRhoGAP-eGFP (verwendeter binärer Vektor pK7FWG2.0) in N. benthamiana. XopB wurde koexprimiert (verwendeter binärer Vektor pBinAR). Zwei Tage nach Agroinfiltration wurden untere Epidermiszellen am KLSM mikroskopiert und eine Zeitaufnahme über 2 min angefertigt. A: Acht Einzelaufnahmen der ersten 16 Sekunden (sec) sind gezeigt. B: Maximalprojektion über die Zeit (t) von 2 min. GFP/ Chl: Fluoreszenzkanal für GFP (grün) und Autofluoreszenz von Chlorophylls (rot).
Um zu überprüfen, ob die Vesikel mit ARA7 kolokalisieren, wurde der tagRFP-ARA7-Marker
mit NtRhoGAP7-eGFP zusammen mit unmarkiertem XopB koexprimiert. Es zeigte sich
jedoch, dass der Großteil der NtRhoGAP7-eGFP-Vesikel nicht oder nur teilweise mit
tagRFP-ARA7-Vesikeln kolokalisierte (siehe Abb. 74, b). Nur an einer Stelle direkt an der
Plasmamembran konnte eine eindeutige Kolokalisierung gezeigt werden (siehe Abb. 74, a).
Ergebnisse
143
Abb. 74: XopB-induzierte Vesikel von NtRhoGAP7-eGFP kolokalisieren kaum mit ARA7-positiven Strukturen. Die Aufnahmen zeigen transiente A. tumefaciens-vermittelte Überexpressionen von NtRhoGAP7-eGFP in N. benthamiana. XopB oder der korrespondierende Leervektor (LV) wurden koexprimiert (verwendeter binärer Vektor pBinAR). tagRFP-ARA7 diente als Marker für frühe Endosomen. Zwei Tage nach Agroinfiltration wurden untere Epidermiszellen am KLSM mikroskopiert. Chl: Autofluoreszenz des Chlorophylls (grau); a und b: GFP- und tagRFP-Signale kolokalisieren bzw. sind in räumlicher Nähe.
Da NtRhoGAP7 in Hefe auch mit Beclin-1 interagierte, das an der Regulation der HR und
vermutlich wie dessen homologe aus Hefe und Säugetieren in Pflanzen an der Entstehung
von Lysosomen während der Autophagie beteiligt ist (Liu et al., 2005), wurden in einem
weiteren Experiment NtRhoGAP7-eGFP-exprimierende Blattproben mit dem
Lysosomenmarker DND99 für 1 h bei RT inkubiert. Hier wurde zudem NtIP1-HA
überexprimiert, um zu untersuchen, ob dies die Lokalisierung von NtRhoGAP7 beeinflusst.
NtRhoGAP7-eGFP bildete hier auch in einigen Zellen –wenn auch nicht in jeder- der pBinAR
Leervektorkontrolle Vesikel. Sowohl mit als auch ohne XopB-Expression konnte keine
Kolokalisierung mit dem Lysosomenmarker gezeigt werden. Nun stellte sich die Frage, ob
die einstündige Inkubation mit dem Lysosomenmarker die Vesikelbildung von NtRhoGAP7
förderte. Tatsächlich konnten in Blattproben die sofort nach dem Schneiden mikroskopiert
wurden keine NtRhoGAP7-Vesikel beobachtet werden.
Ergebnisse
144
Abb. 75: Subzellulär Lokalisierung von NtRhoGAP7-eGFP nach kurzer (< 3 min) und einstündiger Inkubation der Blattpräparate bei Zimmertemperatur (RT). NtRhoGAP7-eGFP, NtIP1-HA und p19 wurden zusammen mit XopB (linke Spalte) oder ohne XopB (LV:Leervektor) A. tumefaciens-vermittelt in N. benthamiana überexprimiert. Zwei Tage nach Agroinfiltration wurden Blattstreifen mit einem Skalpell entnommen, mit dem Lysosomenmarker LysoTracker Red DND99 (Life Technologies) für 1h bei RT inkubiert und anschließend mikroskopiert (obere Reihe). Als Kontrolle wurden Blattproben sofort nach dem Präparieren (< 3 min) ohne DND99 mikroskopiert. Gezeigt sind z-Maximalprojektionen der Überlagerungsbilder. Grün: NtRhoGAP7-eGFP, rot: DND99 und grau: Chlorophyll-Autofluoreszenz.
Somit bleibt es hier unklar, ob XopB oder der Verwundungsstress während des Präparierens
der Blattproben zu der Vesikelbildung führte. Daher sind weitere Analysen notwendig, um
den Mechanismus der Lokalisierungsänderung von NtRhoGAP7-eGFP zu verstehen.
Inkuba'on)bei)RT)
<)3)min)
1)h)
NtRhoGAP79eGFP)+)NtIP19HA)
XopB LV
LV XopB
NtRhoGAP79eGFP)+)NtIP19HA)+)DND99)
Diskussion
145
5. Diskussion Von den meisten T3Es ist die genaue Funktion während der Wirt-Pathogen-Interaktion noch
ungeklärt. Die funktionelle Charakterisierung einiger Effektoren konnte jedoch erste Hinweise
darauf geben wie sie zur Virulenz Gram-negativer Bakterien beitragen (Kay and Bonas,
2009; Feng and Zhou, 2012). Frühe Studien legten nahe, dass das T3SS die entscheidende
Komponente für die Pathogenität von Xcv und Pst darstellt. So konnte nachgewiesen
werden, dass Paprikapflanzen nach Infektionen mit Xcv hrp-Mutanten (T3SS-defizient)
Hydroxyprolin-reiche Glykoproteine und Kallose in der Zellwand akkumulieren, zwei wichtige
Abwehrprozesse der Pflanze, die offenbar von T3Es unterdrückt werden (Brown et al.,
1995). Im selben Jahr wurden vergleichbare Ergebnisse in der Interaktion zwischen Salat
(Lactuca sativa) und einer hrp-Mutante von P. syringae veröffentlicht (Bestwick et al., 1995).
Für die Funktionsaufklärung eines T3Es sind zahlreiche Methoden beschrieben, mit denen
der Beitrag einzelner T3Es zur Virulenz oder Avirulenz eines Pathogens untersucht werden
kann (Munkvold and Martin, 2009). Ein klassischer genetischer loss-of-function-Ansatz ist
dabei die Deletion eines einzelnen Effektors im bakteriellen Genom, wobei hier die
funktionelle Redundanz anderer T3Es berücksichtigt werden muss. Demgegenüber stehen
zahlreiche gain-of-function-Methoden wie die transiente, stabile oder induzierbare
Expression ausgewähler T3Es in Pflanzen oder anderen Modellsystemen wie der Hefe oder
Säugerzellkulturen (Munkvold and Martin, 2009; Lee et al., 2012). Beispielsweise konnte mit
Hilfe transgener Arabidopsis-Pflanzen mit induzierbarer AvrPto-Expression gezeigt werden,
dass dieser T3E aus Pst die basale Abwehr supprimiert, was zur Verringerung der
Kalloseeinlagerung und zu einem höherem bakteriellen Wachstum einer T3SS-defizienten
Pst-Mutante in planta führte (Hauck et al., 2003). Weiterführende Studien zeigten dann, dass
dieser T3E die Kinaseaktivität der Rezeptoren FLS2 und EFR hemmt und damit die
Signalweiterleitung nach PAMP-Perzeption unterbindet (Shan et al., 2008; Xiang et al., 2008;
Xiang et al., 2011).
5.1. XopB supprimiert die Zellwand-gebundene Invertase Der Ausgangspunkt für die Arbeiten mit dem T3E XopB war die Erkenntnis, dass Infektionen
von Blättern suszeptibler Paprikapflanzen mit einer Xcv xopB-Deletionsmutante einen
Anstieg der cw-Inv-Aktivität zur Folge hatte. Infektionen mit der T3SS-defizienten Mutante
Xcv ΔhrpB1 resultierte in einer ähnlichen starken Aktivitätssteigerung der cw-Inv, nicht aber
Diskussion
146
die Infektion mit Xcv WT. Die hohe cw-Inv-Aktivität nach Infektion mit der T3SS-defizienten
Mutante Xcv ΔhrpB1 in source-Blättern von Paprika korrelierte mit erhöhten Gehalten von
Saccharose, Glukose und Fruktose, die sehr wahrscheinlich durch die erhöhte Expression
des PR-Gens CaPRQ zur Verstärkung der Zucker-vermittelten Abwehr beitragen
(Sonnewald et al., 2012). Die vergleichbare Erhöhung der cw-Inv-Aktivität nach Infektion mit
Xcv ΔhrpB1 und Xcv ∆xopB lässt darauf schließen, dass XopB eine Schlüsselrolle in der
Suppression der cw-Inv spielt (Sonnewald et al., 2012). Unterstützt wird diese Vermutung
durch die in dieser Arbeit gezeigte gleich starke Erhöhung der mRNA-Menge von CaCwInv
(Ca10g16710) nach Infektion von Paprika mit diesen beiden Xcv-Stämmen (siehe Abb. 28E).
Die über eine Modulation der cw-Inv verstärkte Zucker-vermittelte Abwehr wurde für
zahlreiche Wirt-Pathogen-Interaktionen beschrieben. Sie beschränkt sich dabei nicht nur auf
die Abwehr von hemi-biotrophen Bakterien, sondern spielt auch bei nekrotrophen und
biotrophen Bakterien und Pilzen sowie in der Interaktion mit Viren eine Rolle (Proels and
Hückelhoven, 2014). Der molekulare Mechanismus der Modulation der cw-Inv während einer
Wirt-Pathogen-Interaktion ist jedoch nicht genau bekannt. Eine Betrachtung der Regulation
der cw-Inv in Abwesenheit von Pathogenen liefert jedoch Hinweise darauf, welche
Regulationsmechanismen nach Pathogenbefall von der Pflanze und/ oder vom Pathogen
verändert werden könnten.
In Abwesenheit von Pathogenen unterliegt die cw-Inv einer transkriptionellen und post-
transkriptionellen Regulation. Phylogenetische Analysen ergaben, dass die in dieser Arbeit
untersuchte CaCwInv das Ortholog von Lin6 aus Tomate darstellt. Lin6 und Lin8 sind zwei
von insgesamt vier cw-Inv und werden in source-Blättern schwach exprimiert, wobei in
source-Blättern die Aktivität der cw-Inv sehr gering ist (Fridman and Zamir, 2003; Biemelt
and Sonnewald, 2006; Kocal et al., 2008). Es wird angenommen, dass die cw-Inv-Aktivität im
Apoplasten post-translational durch proteinogene cw-Inv-Inhibitoren auf einem niedrigen
Niveau gehalten wird (Rausch and Greiner, 2004; Huang et al., 2007; Palmer et al., 2015).
Die Beteiligung eines proteinogenen Inhibitors (p17) konnte erstmals in Tabak gezeigt
werden (Weil et al., 1994). In dieser Studie konnte eine maximale p17-abhängige Inhibition
der cw-Inv-Aktivität bei einem pH-Wert von 4,5 erzielt werden, wobei die Inhibition wiederum
durch Saccharose vermindert wurde. Kristallstrukturanalysen eines Proteinkomplexes aus
der cw-Inv INV1 aus Arabidopsis und dem Inhibitor CIF aus Tabak zeigten weiterhin, dass
CIF mit Saccharose um das aktive Zentrum von INV1 konkurriert und die INV1-CIF-
Komplexbildung ein Maximum bei etwa pH 4,5 hat (Hothorn et al., 2010). In Abwesenheit
des Inhibitors stellt pH 4,5 gleichzeitig das pH-Optimum der INV1 dar. Eine Erhöhung des
pH-Wertes auf 5,8 resultierte in der Dissoziation des INV1-CIF-Komplexes und führte zu
Diskussion
147
einer maximalen INV1-Aktivität. Bemerkenswerterweise findet eine vergleichbare
Veränderung des apoplastischen pH-Wertes (von 5,1 auf 5,9) nach der PAMP-Perzeption
von Tomatenzellen statt (Felix et al., 1999). Dies könnte die Dissoziation des Zellwand-
Invertase-Inhibitor-Komplexen nach Pathogenbefall begünstigen. In Arabidopsis wurde
zudem gezeigt, dass eine Pst-vermittelte Erhöhung der mRNA-Menge der CwINV1 von einer
Herabregulierung des cwInv-Inhibitors AtC/VIF2 und einer geringeren cwInv-Inhibitor-
Aktivität in Blattextrakten begleitet wurde (Bonfig et al., 2010). Eine Behandlung mit dem
cwInv-Inhibitor Acarbose, ein Pseudotetrasaccharid, steigerte außerdem die Suszeptibilität
von Arabidopsis gegenüber Pst DC3000, was die Rolle der cw-Inv als positiver Regulator der
Pathogenabwehr in Arabidopsis unterstreicht (Bonfig et al., 2010). Die Genstilllegung des
cw-Inv-Inhibitors INVINH1 in Tomate führte zu einer etwa 1,6-fachen Erhöhung der cw-Inv-
Aktivität ohne dabei die Expression von Lin6 und Lin8 zu beeinflussen (Jin et al., 2009). Dies
erklärt zwar die geringe cw-Inv-Aktivität trotz einer basalen Expression von Lin6 und Lin8 in
source-Blättern, zeigt aber auch, dass die stark erhöhten cw-Inv-Aktivitäten um den Faktor
10 bis 60 nach Infektion von Tomaten- oder Paprika-Blättern mit Xcv WT bzw. der hrpB1-
Mutante (siehe Abb. 9A und Biemelt and Sonnewald, 2006) nicht allein durch die
Dissoziation des Inhibitors von der cw-Inv hervorgerufen werden können. Vielmehr scheint
zumindest in Solanaceae die transkriptionelle Regulation der cw-Inv für die Wirt-Pathogen-
Interaktion entscheidend zu sein. In Arabidopsis akkumuliert das CwINV1-Transkript nach
Pst DC3000-Infektion, aber eine erhöhte cwInv-Aktivität konnte nur histochemisch in situ
nachgewiesen werden, wohingegen mit der - auch in dieser Arbeit angewandten - in vitro-
Messung mit präparierten Zellwandfraktionen keine Veränderung der cw-Inv-Aktivität nach
Pst-Infektion nachgewiesen werden konnte (Bonfig et al., 2006; Bonfig et al., 2010). Die
Induktion von cw-Inv-Genen in photoautotrophen Suspensionskulturen aus Chenopodium
rubrum- (Roter Gänsefuß) und Lycopersicon peruvianum-Zellen (Tomate) konnte durch
Glukose und Saccharose, nicht-metabolisierbare Zucker, aber auch pilzliche PAMPs wie
Chitosan oder einer Elicitor-Präparation von Fusarium oxysporum lycopersici erzielt werden
(Ehness et al., 1997; Sinha et al., 2002). Die cw-Inv wird dabei aber offenbar durch
unterschiedliche Signalwege induziert, da die Glukose-vermittelte Induktion im Gegensatz
zur Chitosan-vermittelten Induktion nicht Kinase-abhängig ist, was durch eine Behandlung
mit dem Kinase-Inhibitor Staurosporin gezeigt wurde (Ehness et al., 1997). Für Tomate,
Paprika und Arabidopsis ist gezeigt worden, dass die Applikation von Chitosan oder der
Elicitor-Präparation von F. oxysporum zur verstärkten ROS-Produktion führt (Lee et al.,
1999; Khokon et al., 2010; Daudi et al., 2012; O’Brien et al., 2012; Mejía-Teniente et al.,
2013). Da in dieser Arbeit die cw-Inv aus Paprika als H2O2-responsives Gen identifiziert
werden konnte (siehe Abb. 57), ist es denkbar, dass diese oben genannten PAMPs die cw-
Diskussion
148
Inv ROS-abhängig induzieren. Dass die Induktion der cw-Inv in Paprika PAMP-vermittelt ist,
legten auch die erhöhte mRNA-Menge und Aktivität der cw-Inv nach Xcv ∆hrpB1-Infektion
nahe (Sonnewald et al., 2012). Aus weiteren Experimenten wurde geschlussfolgert, dass ein
proteinogenes PAMP von Xcv dafür verantwortlich ist (siehe Abb. 12). Somit können
Kohlenhydrate wie Lipopolysaccharide, die in Paprika ebenfalls Abwehrantworten auslösen
(Keshavarzi et al., 2004), als PAMPs für die Induktion der cw-Inv ausgeschlossen werden.
Es ist bisher nicht bekannt welche PAMPs und Rezeptoren die entscheidende Rolle in der
Paprika-Xcv-Interaktion spielen. So ist auch kein homologer FLS2-Rezeptor für Paprika
bekannt.
5.2. XopB unterdrückt Abwehrantworten in Arabidopsis und Paprika Um die von XopB adressierten Abwehrprozesse weiter einzugrenzen, wurden transgene
Arabidopsis-Pflanzen verwendet, die xopB unter einem Ethanol induzierbaren Promotor
exprimieren. Da die konstitutive Expression von xopB über mehrere Tage in verschiedenen
Organismen letal ist (Salomon et al., 2011; Schulze et al., 2012; Sonnewald et al., 2012)
wurde ein induzierbares Expressionssystem gewählt. So war es möglich Abwehrantworten
über einen Zeitraum von bis zu 3 Tagen zu untersuchen, da in diesem Zeitraum XopB keine
sichtbaren Zelltodreaktionen in Arabidopsis auslöste. Schulze et al. (2012) konnten in
Arabidopsis-Protoplasten mit einem Luziferasereporter zeigen, dass die Überexpression von
xopB die flg22-stimulierte Promotoraktivität des Gens AtNHL10 unterbindet. Gleichzeitig war
die Aktivierung des MAPK-Signalwegs durch XopB nicht vermindert, da die für die AtNHL10-
Aktivierung entscheidenden MAP-Kinasen MPK3 und MPK6 nach flg22-Stimulation weiterhin
phosphoryliert wurden (Schulze et al., 2012). Die Autoren zeigten weiterhin, dass XopB die
Sekretion in N. benthamiana stört und postulierten, dass dies zu einer geringeren
Konzentration von FLS2-Rezeptoren in der Plasmamembran und damit zu einer geringeren
Promotoraktivität von AtNHL10 führte. Die von Schulze et al. (2012) gezeigte Akkumulation
des Reporterkonstruktes secGFP im Endomembransystem konnte im Rahmen dieser Arbeit
nicht bestätigt werden (siehe Abb. 13). Zusätzlich wurde auch die Konzentration von secGFP
in der apoplastischen Flüssigkeit untersucht und es konnte ebenfalls keine Blockade der
Sekretion durch XopB nachgewiesen werden (siehe Abb. 14). Zusammen mit den
unveränderten Aktivitäten von MPK3 und MPK6 nach flg22-Stimulation von Arabidopsis-
Protoplasten (Schulze et al., 2012) ist es daher unwahrscheinlich, dass die FLS2-
Konzentration in der Plasmamembran von Arabidopsis oder N. benthamiana durch XopB
reduziert wird. Da AtNHL10 synergistisch von MAPK- und CDPK-Signalwegen
angesprochen wird (Boudsocq et al., 2010), war es naheliegend, den CDPK-Weg genauer
Diskussion
149
zu betrachten. Tatsächlich war der flg22-induzierte Calciumeinstrom nach Überexpression
von XopB in N. benthamiana betroffen (siehe Abb. 18A). Der typische Calcium-peak nach
flg22-Stimulation war in Anwesenheit von XopB um 6 Minuten verzögert, aber nicht
verringert. In der Literatur sind keine Mutanten beschrieben, die eine vergleichbare
Veränderung der Calciumsignatur aufweisen. Zwar zeigten bak1 Arabidopsis-Mutanten einen
verzögerten Calciumeinstrom, aber gleichzeitig auch eine deutliche Verringerung von
[Ca2+]cyt (Ranf et al., 2011). Eine bik1 Mutante hingegen zeigte nur eine Verringerung von
[Ca2+]cyt und keine Verzögerung des Calciumeinstroms (Li et al., 2014). Somit sind BAK1 und
BIK1 wichtig für den flg22-stimulierten Calciumeinstrom, aber es ist auf Grund der
unterschiedlichen Calciumsignaturen unwahrscheinlich, dass XopB diese bzw. die
orthologen Regulatoren in N. benthamiana manipuliert. Ferner sind in der bak1 Mutante die
flg22-stimulierte Promotoraktivität sowohl von AtNHL10 (synergistisch aktiviert durch MAPKs
und CDPKs) als auch von AtFRK1 (MAPK spezifisch) und AtPHI1 (CDPK spezifisch)
supprimiert (Ranf et al., 2011). In Anwesenheit von XopB waren jedoch nur die CDPK-
abhängigen Reportergene AtNHL10 und AtPHI1 supprimiert, nicht aber der MAPK-
spezifische Reporter AtFRK1 (siehe Abb. 19). XopB interferiert offenbar spezifisch mit
Calcium-abhängigen Signaltransduktionsprozessen. Die ROS-Produktion nach flg22-
Behandlung von Arabidopsis war ebenfalls durch XopB deutlich supprimiert (siehe Abb.
18C), was eine drastische Reduktion der ROS-abhängigen Kallose-Einlagerung zur Folge
hatte (siehe Abb. 20). Die verminderte ROS-Produktion wirkte sich auch auf die Expression
des ROS-abhängigen Abwehrgens AtOXI1 aus (siehe Abb. 19), was darauf hindeutet, dass
der ROS-Signalweg supprimiert wurde. Die Kinaseaktivität von AtOXI1 und dessen
Expression konnte experimentell durch exogene H2O2-Gaben erhöht werden und ein Verlust
dieser Kinase führte zudem zur Hypersuszeptibilität von Arabidopsis (Rentel et al., 2004b;
Petersen et al., 2009; Forzani et al., 2011). AtOXI1 aktiviert MPK3 und 6 indirekt über die
Aktivierung von Kinasen der PTI1-Familie (Rentel et al., 2004b; Anthony et al., 2006; Forzani
et al., 2011). Frühere Studien legten eine Verbindung zwischen ROS- und MAPK-
Signalwege nahe, da H2O2-Behandlungen die von MPK3 und 6 stromaufwärtsliegende
MAPKKK ANP1 aus Arabidopsis aktivierten (Kovtun et al., 2000). Neulich wurde jedoch mit
einem genetischen Ansatz gezeigt, dass ROS- und MAPK-Signalwege unabhängig
voneinander agieren (Xu et al., 2014). Es ist somit vorstellbar, dass XopB die ROS-
Produktion supprimiert, aber MAPK-spezifische Reportergene nicht beeinflusst werden.
Pharmakologische Studien zeigten, dass der Calciumeinstrom für die flg22-stimulierte
Aktvierung von MAP Kinasen wichtig ist (Segonzac et al., 2011). XopB scheint somit über
einen Mechanismus zu wirken, der den Calciumeinstrom und die ROS-Produktion verändert
und gleichzeitig nicht die Aktivierung von MAP Kinasen beeinflusst. Die Auswirkungen der
Diskussion
150
durch XopB möglicherweise manipulierten Endozytose auf den Calciumeinstrom und die
ROS-Produktion wird in Abschnitt 5.5 diskutiert.
Da das ROS-produzierende Enzym AtRBOHD von Calcium aktiviert wird (Ogasawara et al.,
2008; Boudsocq et al., 2010; Dubiella et al., 2013; Gao et al., 2013) und ROS wiederum den
Calciumeinstrom verstärkt (Ranf et al., 2011), stellte sich die Frage, ob XopB primär den
Calciumeinstrom oder die ROS-Produktion hemmt. Ranf et al. (2011) konnten zeigen, dass
ein Interferieren mit der ROS-Produktion nicht zu einer Verschiebung des Calciumeinstroms
führte. Vielmehr ergaben deren Messungen mit Aequorin-exprimierenden Arabidopsis-
Keimlingen, dass flg22 einen Doppel-peak auslöst und der zweite peak ROS-abhängig ist.
Somit ist es wahrscheinlicher, dass die XopB-abhängige Verschiebung des
Calciumeinstromes zu einer verminderten ROS-Produktion führte. Die von Ranf et al. (2011)
gezeigte hohe Auflösung des Calciumeinstromes in zwei peaks ist jedoch nur mit Keimlingen
möglich, die in Flüssigmedium angezogen wurden und einen flüssigkeitsgefüllten Apoplasten
haben (persönliche Korrespondenz Dr. Stefanie Ranf, TU München). Da das Einkreuzen
einer Aequorin Reporter-Linie in die EtOH::xopB Arabidopsis-Linien zur Genstilllegung von
xopB führte, konnte im Rahmen dieser Arbeit aber nicht mit Keimlingen gearbeitet werden.
Warum der ROS-peak nach XopB-Expression nicht auch verschoben war, kann an dieser
Stelle nicht beantwortet werden. Möglicherweise muss die Calcium-abhängige Aktivierung
von NADPH-Oxidasen in einer strengen zeitlichen Choreographie ablaufen. Ein verzögerter
Calciumeinstrom hätte dann einen vergleichbaren Effekt auf die ROS-Produktion wie eine
Verminderung von [Ca2+]cyt. Für eine genauere Klärung müssten die ROS-Produktion und der
Calciumeinstrom in der gleichen Modellpflanze gemessen werden. Dazu könnte ein
alternatives Aequorinkonstrukt mit einem Ubiquitin- statt eines 35S-Promotors verwendet
werden oder ROS in N. benthamiana gemessen werden.
Interessanterweise war in die Transkriptmenge von AtRBOHD sowohl in unbehandelten als
auch in flg22-behandelten xopB-exprimierenden Arabidopsis-Linien im Vergleich zu Col-0
Wildtyp reduziert. Des Weiteren war auch die Expression zweier apoplastischen
Peroxidasen, AtPRX33 und AtPRX34, in induzierten H2O-behandelten xopB-Linien
herabreguliert (siehe Abb. 19). Diese Peroxidasen tragen in etwa zu der Hälfte der flg22-
stimulierten ROS-Produktion bei (Daudi et al., 2012; O’Brien et al., 2012). Daher ist es
möglich, dass die reduzierte ROS-Produktion in den xopB-exprimierenden Linien auf Grund
der geringeren Expression von AtRBOHD, AtPRX33 und AtPRX34 zustande kam. Allerdings
kann nicht mit Sicherheit gesagt werden, ob die hier festgestellte geringere Genexpression
von AtRBOHD, AtPRX33 und AtPRX34 auch zu einer geringeren Proteinkonzentration in der
Plasmamembran bzw. dem Apoplasten führte. Kürzlich wurde gezeigt, dass die mRNA-
Diskussion
151
Menge von AtRBOHD sowie AtPRX33 und AtPRX34 positiv durch ROS reguliert wird
(O’Brien et al., 2012). Des Weiteren hängt die Expression dieser Gene von Peroxidase-
produziertem ROS ab. Dies wurde durch pharmakologische Studien gezeigt, in denen die
Behandlung von Arabidopsis-Suspensionskulturen mit dem Peroxidase-Hemmer
Natriumazid die basale Expression von AtRBOHD, AtPRX33 und AtPRX34 reduzierte.
Behandlungen mit dem NADPH-Oxidase-Hemmer DPI veränderten dagegen die basale
Expression dieser drei Gene nicht (O’Brien et al., 2012). Somit hat die basale Peroxidase-
vermittelte ROS-Produktion einen genregulatorischen Effekt auf NADPH-Oxidasen und
Peroxidasen. Darüberhinaus wurde gezeigt, dass NADPH-Oxidasen von ROS aktiviert
werden müssen, was möglicherweise von Peroxidasen als Aktivatoren bewerkstelligt wird
(Torres et al., 2005). Behandlungen der T-DNA-Insertionslinien prx33, prx34 und rbohd mit
flg22 resultierte in allen drei Fällen in einer verringerter Kallose-Einlagerung in Arabidopsis
(Zhang et al., 2007; Daudi et al., 2012), was die ROS-Abhängigkeit dieser Abwehrreaktion
hervorhebt. Dem folgend ist die verringerte Kallose-Einlagerung in der untersuchten xopB-
Linie sehr wahrscheinlich auf die reduzierte ROS-Produktion zurückzuführen.
In der Paprika-Xcv-Interaktion konnte gezeigt werden, dass eine Infektion mit dem xopB-
Deletionsstamm im Vergleich zur Xcv Wildtyp-Infektion zu einer erhöhten ROS-Akkumulation
führte (siehe Abb. 28A und B). Somit fungiert XopB auch in diesem Wirt-Pathogen-System
als ROS-Suppressor. Choi et al. (2007) identifizierten in Paprika die Peroxidase CaPO2, die
für die ROS-Akkumulation nach Befall mit virulenten und avirulenten Xcv-Stämmen
verantwortlich ist. Nach Infektion mit Xcv ΔxopB war die Expression von CaPO2 stark erhöht,
während die Expression des RBOHD Orthologs, CaRbohD, nur leicht erhöht war (siehe Abb.
28 C bzw. D). Die mRNA-Menge von CaCwInv war ebenfalls stark erhöht (siehe Abb. 28E).
So ist es wahrscheinlich, dass die erhöhte ROS-Akkumulation nach Xcv ΔxopB-Infektion
durch eine erhöhte CaPO2-Aktivität hervorgerufen wurde. Von diesen Ergebnissen
ausgehend stellte sich die Frage, ob CaPO2, CaRbohD und CaCwInv ROS-induzierte Gene
sind. Tatsächlich waren diese drei Gene in Paprika-Blattscheiben, die mit H2O2 behandelt
wurden, heraufreguliert (siehe Abb. 29). CaPO2 und CaCwInv waren dabei stark (8-fach bzw.
4-fach) und CaRbohD nur leicht induziert (2-fach). Die XopB-vermittelte Veränderung der
ROS-Produktion beeinflusst daher die Regulation weiterer ROS-abhängiger Gene. Da
transgene Arabidopsis-Pflanzen, die CaPO2 überexprimieren, nach Pathogen-Befall
verstärkt ROS produzieren (Choi et al., 2007) und CaPO2 in Paprika gleichzeitig ROS-
abhängig transkriptionell induziert wird, kann nicht eindeutig gesagt werden, ob durch den
Xcv ΔxopB-Stamm zunächst CaPO2 auf Proteinebene aktiviert wird und anschließend durch
positive Rückkopplung dessen Expression erhöht wird oder ob zunächst ein anderes ROS-
Diskussion
152
produzierendes Enzym, z.B. ein RBOH-Ortholog, aktiviert wird und dadurch CaPO2 induziert
wird.
CaPO2 wird transkriptionell von virulenten und avirulenten Xcv-Stämmen induziert und eine
Virus-induzierte Genstilllegung von CaPO2 führte zur Hypersuszeptibilität gegenüber einem
virulenten Xcv-Stamm (Choi et al., 2007). Somit scheint diese Peroxidase eine vergleichbare
Rolle zu spielen wie die Peroxidasen AtPRX33 und 34 in Arabidopsis, da das bakteriele
Wachstum von Pst DC3000 in AtPRX33/AtPRX34-antisense-Pflanzen gefördert wurde
(Daudi et al., 2012). Ferner förderte die Überexpression von CaPO2 in Arabidopsis-Pflanzen
die ROS-Akkumulation nach Pst DC3000-Infektion und verminderte das bakterielle
Wachstum (Choi et al., 2007). Die mRNA-Menge von PR-Genen war ebenfalls erhöht,
darunter auch das SA-abhängige Gen AtPR1 (Choi et al., 2007). Vergleichbar dazu
akkumulierten Paprika-Blätter nach Infektion mit Xcv ΔxopB im Vergleich zur Xcv Wildtyp-
Infektion mehr SA und mehr Transkript des SA-abhängigen PR-Gens CaPR1b1.
Die Deletion von xopB führte zu einer verzögerten Entwicklung von Krankheitssymptomen in
Paprika (siehe Abb. 27A), obwohl das bakterielle Wachstum in planta nicht verändert war
(siehe Abb. 26). Eine Entkopplung von Phänotyp und bakteriellem Wachstum konnte bereits
in einer Pseudomonas-Tomate-Interaktion gezeigt werden, indem in Pst DC3000 der Effektor
hopPtoN deletiert wurde (López-Solanilla et al., 2004). Die Autoren dieser Studien zeigten,
dass die Infektion von Tomatenblättern mit der hopPtoN-Deletionsmutante zu verstärkten
Krankheitssymptomen führte und gleichzeitig das bakterielle Wachstum unverändert blieb.
Zu XopB funktionell redundante Effektoren könnten im Falle der xopB-Deletion dafür sorgen,
dass das bakterielle Wachstum in planta nicht beeinflusst wird. Tatsächlich konnten Schulze
et al. (2012) zeigen, dass das in planta Wachstum der Doppeldeletionsmutante Xcv ΔxopB
ΔxopS in Paprika vermindert ist, während die Deletion von xopS alleine zu verzögerten
Krankheitssymptomen führte. Des Weiteren unterdrückt eine Überexpression von XopS oder
XopB die flg22- und elf18-stimulierte Induktion von NHL10 in Arabidopsis (Schulze et al.
2012). Ob XopB und XopS jedoch im selben Kompartiment wirken und/ oder ein
gemeinsames Wirtsprotein adressieren, wurde in dieser Studie nicht gezeigt. Es kann daher
nicht ausgeschlossen werden, dass das verminderte Wachstum der Doppelmutante durch
die Manipulation zweier unabhängiger Zielprozesse zustande kam.
Um die Frage zu beantworten, ob XopB die Suszeptibilität von Pflanzen verändert, wurden
die transgenen Arabidopsis xopB-Linien mit Pst DC3000 infiziert. Mit diesem Ansatz konnte
die möglicher funktionelle Redundanz anderer T3Es umgangen werden. Die XopB-
Expression förderte das in planta Wachstum von virulenten Pst DC3000-Bakterien (siehe
Diskussion
153
Abb. 21A) und supprimierte die SA-Akkumulation sowie die Expression von den SA-
abhängigen PR-Genen AtPR1 und AtPR3 (siehe Abb. 24). Des Weiteren war die
Entwicklung der Krankheitssymptome beschleunigt (siehe Abb. 23), was darauf hindeutet,
dass XopB Abwehrantworten während einer Infektion mit Pst DC3000 unterdrückt. Obwohl
XopB typische Antworten der basalen Abwehr wie die Einlagerung von Kallose unterdrückt,
ist die XopB-Expression in Arabidopsis nicht ausreichend das Wachstum des T3SS-
defizienten Stammes Pst ΔTLR1 zu fördern (siehe Abb. 21C). Offenbar ist XopB nur
zusammen mit den T3Es von Pst DC3000 in der Lage die Suszeptibilität von Arabidopsis
weiter zu erhöhen. Das bakterielle Wachstum und die Entwicklung einer HR nach Infektion
des avirulenten Stammes Pst avrRpm1 war in den xopB-Linien nicht beeinflusst (siehe Abb.
21B bzw. Abb. 22B). Im Gegensatz zu HopD1, dem orthologen T3E aus Pst, scheint XopB
somit in Arabidopsis keine Rolle in der R-Gen-vermittelten Abwehr zu spielen. HopD1 ist in
der Lage eine durch AvrRpm1 ausgelöste HR in Arabidopsis zu unterbinden, was zu einem
erhöhten bakteriellen Wachstum von Pst avrRpm1 führte (Block et al., 2014). Dennoch
haben die xopB-Linien 10 und 12, die mit Pst avrRpm1 infiziert wurden, geringere
Camalexingehalte als Col-0 Wildtyp-Pflanzen. Die Akkumulation von freier SA war allerdings
nach Infektion nur in der xopB-Linie 12 signifikant erniedrigt (siehe Abb. 25). Da die
Camalexinproduktion ROS- und SA-abhängig ist (Zhou et al., 1998; Chaouch et al., 2010),
manipuliert XopB die Camalexinproduktion während einer inkompatiblen Interaktion
möglicherweise stärker über den ROS- und weniger stark über den SA-abhängigen Weg, da
ja sonst in beiden xopB-Linien die SA-Gehalte in gleicher Weise erniedrigt gewesen sein
müssten. In einer früheren Studie wurde die Camalexinproduktion zahlreicher Arabidopsis
Ökotypen untersucht und festgestellt, dass geringere Camalexingehalte mit einem erhöhtem
Wachstum des avirulenten Stammes Pst avrRps4 korrelierten (Schuhegger et al., 2007). Ob
diese Ökotypen auch veränderte SA-Gehalte haben, wurde in dieser Studie allerdings nicht
untersucht. Arabidopsis rbohd-Mutanten zeigten zudem eine unveränderte Zelltodreaktion,
obwohl die ROS-Produktion nach Infektion mit Pst avrRpm1 reduziert war (Torres et al.,
2005). Offenbar ist eine verminderte ROS-Produktion nicht ausreichend, um die
Zelltodreaktion zu verhindern, was das unveränderte Wachstum von avirulenten
Pseudomonas-Stämmen in den xopB-Linien erklären könnte (siehe Abb. 21B). In weiteren
Versuchen mit DAB-Färbungen müsste daher untersucht werden, ob das unveränderte in
planta-Wachstum von Pst avrRpm1 mit einer verminderten ROS-Produktion in den xopB-
Linien einhergeht.
Diskussion
154
5.3. XopB interagiert mit einem myristoylierten Wirtsprotein unbekannter Funktion an frühen Endosomen
Über eine Hefe-Zwei-Hybrid-cDNA-Durchmusterung wurde NtIP1 als Interaktionspartner von
XopB gefunden. NtIP1 gehört zu einer kleinen konservierten Genfamilie in Pflanzen
bestehend aus jeweils zwei Mitgliedern. Deren Funktionen sind aber unbekannt. Alle im
Rahmen dieser Arbeit untersuchten Mitglieder kodieren für Proteine, die als myristoyliert
vorhergesagt werden (siehe 4.5.4.1). Viele davon werden zusätzlich als palmitoyliert
horhergesagt (online-Programm „CSS Palm 4.0“ (Ren et al., 2008)). Diese Eigenschaft ist in
Bezug auf die Wirt-Pathogen-Interaktion interessant, da viele myristoylierte Proteine eine
Rolle in der Pathogenabwehr spielen (Boisson et al., 2003; Running, 2014).
Die Myristoylierung ist eine irreversible, ko-translationale Modifikation, bei der die C14:0-
Fettsäure Myristinsäure an den N-Terminus des Glycins an Position 2 kovalent gebunden
wird (Qi et al., 2000). Dies wird in Arabidopsis durch die N-Myristoyltransferase AtNMT1
katalysiert (Qi et al., 2000). Zuvor muss hierfür das Methionin an Position 1 durch eine
Peptidase entfernt werden, damit ein freier N-Terminus am Glycin entstehen kann (Giglione
et al., 2004). Im Gegensatz zur Myristoylierung ist die Palmitoylierung, eine S-Acylierung,
reversibel. Bei dieser wird mittels Palmitoyl-Acyltransferasen (PATs) ein Palmitinsäurerest
kovalent an die Thiolgruppe von Cysteinen gebunden, wodurch ein Thioester entsteht (Resh,
2006). Beide Modifikationen tragen zur Bindung löslicher Proteine an verschiedene
Zellmembranen oder Subdomänen von Membranen bei (Running, 2014).
In Arabidopsis werden mehr als 1,7 % des Proteoms, d.h. >422 Proteine, myristoyliert
(Boisson et al., 2003; Pierre et al., 2007). Säuger und höhere Pflanzen haben zwei
konservierte NMT Homologe, NMT1 und NMT2, wobei in Arabidopsis AtNMT1 für
Entwicklungsprozesse in frühen und späten Stadien und die Golgi-abhängige Sekretion
essentiell ist und NMT2 nur für die Blühinduktion wichtig ist (Pierre et al., 2007; Renna et al.,
2013). Pierre et al. (2007) konnten weiterhin zeigen, dass AtIP1 von AtNMT1 in vitro
myristoyliert wird. Die meisten myristoylierten Proteine mit bekannter Funktion stellen
Kinasen, darunter auch CDPKs, Phosphatasen, GTP-bindende Proteine, NBS-LRRs und
Transkriptionsfaktoren dar (Boisson et al., 2003; Running, 2014). Beispielsweise ist die
Myristoylierung der Calcium-abhängigen Proteinkinase AtCPK1 essentiell für dessen duale
Lokalisierung an Peroxisomen und Lipidkörperchen (Coca and San Segundo, 2010). Die
Überexpression und die Genstilllegung von AtCPK1 steigert bzw. vermindert die Resistenz
von Arabidopsis gegenüber Pilzen und Bakterien. Des Weiteren konnten Coca und San
Segundo (2010) zeigen, dass die Produktion von SA und die Expression SA-abhängiger
Gene AtCPK1-abhängig ist. Zentrale Komponenten der pflanzlichen Immunabwehr von
Diskussion
155
Arabidopsis wie der PRR FLS2, die Kinasen BIK1 und PBL1 sowie R-Proteine (NBS-LRRs)
der Subfamilien RPS5/RPS2 und RPP1 werden myristoyliert und/ oder palmitoyliert (Boisson
et al., 2003; Boyle and Martin, 2015). Die S-Acylierung von FLS2 ist nicht für dessen PM-
Lokalisierung nötig, da FLS2 über eine Transmembrandomäne verfügt. Da S-Acylierte
Proteine, darunter auch FLS2, in Mikrodomänen der PM, den sogenannten detergent-
resistant membranes (DRMs), angereichert sind, geht man aber davon aus, dass in diesen
Mikrodomänen die Interaktion von FLS2 mit weiteren Komponenten der Immunabwehr, z.B.
mit BIK1, stattfindet (Boyle and Martin, 2015). Nach der PAMP-Perzeption finden in diesen
Mikrodomänen somit die ersten Schritte der Signaltransduktion statt und so verwundert es
nicht, dass phytopathogene Bakterien T3Es evolvierten, die an genau dieser Stelle
eingreifen. Um an die Mikrodomänen zu gelangen, nutzen dazu einige T3Es die pflanzliche
Myristoylierung und Palmitoylierung aus. Beispiele für T3Es die eine solche Modifikation
erfahren sind AvrPto, AvrB, AvrC, AvrRpm1, HopF2, AvrPphB, HopO1-1, HopX2 und
HopAF1 aus Pseudomonas und XopJ, XopE1 und XopE2 aus Xanthomonas (Boyle and
Martin, 2015). AvrPto gelangt nach dessen Modifikation durch NMT und PAT vermutlich
auch in diese Mikrodomänen, um dort die Kinasedomäne von FLS2 zu manipulieren. Das zu
AvrPto korrespondierende R-Protein, Pto, besitzt ebenfalls ein Myristoylierungsmotif und
biochemische Untersuchungen belegten diese Modifikation in vivo (De Vries et al., 2006).
Überraschenderweise ist Pto im Gegensatz zu AvrPto im Zytosol lokalisiert und dennoch ist
die Myristoylierung von Pto essentiell für das Auslösen einer HR (De Vries et al., 2006).
Möglicherweise passt das R-Protein Pto den T3E AvrPto auf dessen Weg zur PM ab oder
eine sehr geringe Konzentration von myristoyliertem Pto in der PM ist für das Auslösen der
HR ausreichend (Boyle and Martin, 2015).
Die transiente Überexpression von NtIP1 resultierte in einer dualen Lokalisierung von NtIP1
an der PM und in Vesikel-ähnlichen Strukturen (siehe Abb. 48). Die Vesikel sind
Endosomen, da sie mit dem Farbstoff FM4-64-FX markiert werden konnten, welcher sich
zunächst in der PM einlagert und anschließend endozytiert wird. NtIP1 scheint demnach -
zumindest bei transienter Überexpression - einer konstitutiven Endozytose zu unterliegen.
Die genaue Identität dieser NtIP1-Endosomen konnte aber nicht geklärt werden, da sie
weder mit Markern für frühe noch späte Endosomen kolokalisierten (siehe Abb. 47). Die
frühen Endosomen (repräsentiert durch die Rab GTPase ARA7) stellen aber offenbar den
Ort der Interaktion zwischen XopB und NtIP1 dar (siehe Abb. 51). Ob nun XopB über NtIP1
zunächst an die PM gelangt und anschließend mit diesem endozytiert wird oder ob die duale
Lokalisierung von XopB an der PM und in frühen Endosomen NtIP1-unabhängig ist, kann
nicht mit Sicherheit gesagt werden, da XopB vermutlich auch mit dem IP1-Homolog aus N.
Diskussion
156
benthamiana (NbIP1), dem Organismus, in welchem die Lokalisierungsstudien durchgeführt
wurden, interagiert. Versuche über Virus-induzierte Genstillegung das NbIP1-Transkript zu
reduzieren blieben erfolglos. Mit der Herstellung von anti-sense- oder amiRNA-Pflanzen
könnten weitere Versuche unternommen werden IP1 in Tabak auszuschalten. In diesen
Pflanzenlinien könnte dann die Lokalisierung von XopB ohne IP1-Hintergrund untersucht
werden. Nichtsdestotrotz verändert XopB Größe und Bewegung der frühen Endosomen in N.
benthamiana und möglicherweise führt dies zur Akkumulation von NtIP1-eGFP in diesem
Kompartiment. Eine andere Hypothese ist, dass XopB NtIP1 manipuliert und dies die
Struktur der Endosomen verändert.
5.4. NtIP1 interagiert mit GTPase aktivierenden Proteinen (RhoGAPs) Weitere Hefe-Zwei-Hybrid-Durchmusterungen mit Arabidopsis- und Tabak-cDNA-
Bibliotheken und NtIP1 als Köder lieferten zunächst jeweils zwei RhoGAPs (NtRhoGAP7 und
12 aus Tabak und AtRhoGAP150 und 390 aus Arabidopsis) als potentielle
Interaktionspartner für NtIP1. Mittels direkten Hefe-Interaktionen konnte gezeigt werden,
dass AtIP1 nur mit AtRhoGAP390 und nicht mit AtRhoGAP150 interagierte (siehe Abb. 68).
Aus Tabak konnte nur NtRhoGAP7 kloniert werden, welches aber im direkten
Interaktionstest als Interaktionspartner von NtIP1 bestätigt werden konnte (siehe Abb. 67).
NtIP1 interagiert dabei mit dem C-Terminus von NtRhoGAP7, der eine Leucin-Zipper-
Domäne enthält (siehe Abb. 67). Da diese Domänen Protein-Protein-Interaktionen vermitteln
(Causier et al., 2003), ist es sehr wahrscheinlich, dass NtIP1 direkt mit dieser Domäne
interagiert. Zunächst erschien es naheliegend, dass die gefundenen RhoGAPs Regulatoren
von kleinen GTPasen, den ROPs (Rho-like GTPases from plants), auch RACs genannt,
darstellten. ROPs regulieren eine Vielzahl von Prozessen in der Pflanzenzelle, darunter das
Zytoskelett, die Zellpolarität, die Zellmorphologie, das Pollenschlauchwachstum, das
Wurzelhaarwachstum, die ROS-Produktion, Calciumeinströme sowie Exo- und Endocytose
(Nibau et al., 2006; Craddock et al., 2012; Craddock and Yang, 2012). ROPs regulieren
sogenannte Effektoren der Pflanze wie z.B. die RICs (ROP-interactive CRIB-containing
proteins), die dann beispielsweise das Zytoskelett modulieren. Die Interaktion mit den
Effektoren findet statt, wenn ROPs im GTP-gebundenen Zustand vorliegen. Die Hydrolyse
von GTP zu GDP bewirkt eine Konformationsänderung der ROPs und die Interaktion mit den
Effektoren kommt zum Erliegen (Brembu et al., 2006). Das Überführen der ROPs von einen
GDP- zu einem GTP-gebundenen Zustand und wieder zurück wird über GAPs (GTPase
activating proteins) bzw. GEFs (GDP exchange factors) reguliert. GAPs und GEFs stellen
somit die zentralen molekularen Schalter für die ROPs dar. Darüber hinaus werden ROPs
Diskussion
157
von GDIs (GDP dissociation inhibitors) reguliert. Diese verhindern die Dissoziation von
gebundenen Nukleotiden, die GTP-Hydrolyse, die Interaktion mit GAPs, GEFs und
Effektoren und extrahieren prenylierte ROPs von der Plasmamembran (Brembu et al., 2006).
Zu den Effektoren von ROPs gehören auch NADPH-Oxidasen. So ist OsRAC1 an der
Produktion von ROS in Reis beteiligt (Ono et al., 2001), indem es an den N-Terminus der
NADPH-Oxidase OsRbohB bindet und dessen Aktivität erhöht (Wong et al., 2007).
Die gefundenen Interaktionspartner von NtIP1 gehören einer kleinen Familie der RhoGAPs
an, die aus drei Mitgliedern besteht und sich dadurch auszeichnet, dass deren Mitglieder
neben der typischen GAP-Domäne eine PH-Domäne und eine Leucin-Zipper-Domäne
besitzen (siehe Abschnitt 4.7.2). Neben AtRhoGAP150 und AtRhoGAP390 gehört zu dieser
Familie AtREN1 (ROP1 ENHANCER 1) aus Arabidopsis. AtREN1 reguliert in seiner Funktion
als GTPase aktivierendes Protein AtROP1 (Hwang et al., 2008). Bisher konnte eine Funktion
von AtREN1 und AtROP1 nur für das Pollenschlauchwachstum gezeigt werden. Der Verlust
von AtREN1 sowie die Expression von konstitutiv aktiven AtROP1 (CA-ROP1) erzeugte ein
balooning, also ein extremes Aufblähen, der Pollenschläuche von Arabidopsis (Hwang et al.,
2008). Aufgrund der hohen Sequenzidentitäten zwischen AtREN1 und den beiden anderen
AtRhoGAPs, wurde in Hefe getestet ob letztere möglicherweise auch mit ROPs interagieren.
Dazu wurde AtRhoGAP390 ausgewählt, da nur dieses mit AtIP1 interagierte. Keine der
getesteten ROPs aus Arabidopsis interagierte jedoch mit diesem RhoGAP (siehe Abb. 69).
Da 10 von insgesamt 11 ROPs getestet wurden ist es unwahrscheinlich, dass dieses
RhoGAP an der Regulation von ROPs beteiligt sind. Daher wurde erneut eine Hefe-Zwei-
Hybrid-cDNA-Durchmusterung durchgeführt, um die Funktion dieser RhoGAPs aufzuklären.
Insgesamt konnten 13 verschiedene Interaktionspartner von NtRhoGAP7 identifiziert werden
(siehe Tabelle 15). Als häufigste Interaktionspartner traten wieder NtIP1 (35 von 84
untersuchten Klonen) und das homologe Protein NtIP1.1 (24 von 84 untersuchten Klonen)
auf. Daneben trat jedoch auch der C-Terminus von NtRhoGAP12 als Interaktionspartner von
NtRhoGAP7 auf. Weiterhin kann der C-Terminus von NtRhoGAP7 in Hefe mit sich selbst
interagieren (siehe Abb. 71B). Offenbar ist NtRhoGAP7 in der Lage über den C-Terminus
Hetero- und Homodimere auszubilden sowie mit NtIP1 und NtIP1.1 zu interagieren.
Möglicherweise ist die Dimerisierung für die Funktion der RhoGAPs wichtig und die
Interaktion mit den myristoylierten Proteinen NtIP1 und NtIP1.1 könnte die subzelluläre
Lokalisierung der RhoGAPs verändern oder die Ausbildung von RhoGAP-Dimeren in vivo
verhindern.
Diskussion
158
5.5. Endozytose als möglicher Zielprozess von XopB Als weiterer Interaktionspartner von NtRhoGAP7 konnte das Clathrin-Assemblierungsprotein
XP_009595075.1 identifiziert werden (siehe Tabelle 15). Es ist das Ortholog von At2G25430
aus Arabidopsis und zeigt zu diesem auf Aminosäureebene (blastx-Analyse mit dem NCBI
server, Mai 2015) 61% Identität. At2G25430 gehört einer Gruppe aus acht homologen
Proteinen in Arabidopsis an (At2G25430, At1g05020, At1g03050, At4g02650, At5g35200,
At4g25940, At2g01600 und At1g14910), die eine Funktion als accessory adaptor proteins,
im Weiteren Hilfsproteine, in der frühen Phase der Clathrin-vermittelten Endozytose (CME:
clathrin-mediated endocytosis) haben und zu dem Protein AP180 aus Säugern homolog sind
(Chen et al., 2011).
Das Clathrin-Assemblierungsprotein XP_009595075.1, spielt vermutlich eine vergleichbare
Rolle in der CME wie dessen orthologes Protein At2G25430. Letzteres wurde neulich in
einem Proteom-Ansatz mit der CME in Verbindung gebracht. Neben anderen Hilfsproteinen
mit SH3- (SRC homology), WD40- und EH-Domänen wurde At2G25430 in einer
Aufreinigung von CLC2-GFP (Clathrin Light Chain 2-GFP) nachgewiesen (Heard et al.,
2015). Weitere Clathrinbestandteile wie CHC1 (Clathrin Heavy Chain 1), CHC2 (Clathrin
Heavy Chain 2), CLC1 (Clathrin Light Chain 1) und der Köder CLC2 wurden in dieser Studie
ebenfalls gefunden und unterstreichen die Rolle dieses Hilfsproteins in der frühen Phase der
CME.
Die CME beginnt mit der Bindung des heterotetrameren Adaptorprotein 2 (AP2)-Komplexes
an Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PI(4,5)P2) der Plasmamembranlipide und an den
zytoplasmatischen Teil von PM-ständigen Rezeptoren, sofern dieser ein YXXΦ-
Endozytosemotiv (Y: Tyrosin, X: beliebige Aminosäure und Φ: Aminosäure mit großer,
hydrophober Seitenkette) enthält (McMahon and Boucrot, 2011). Der AP2-Komplex ist - in
Säugetierzellen - bereits vor der PM-Bindung mit Clathrin versehen, welches wiederum aus
CHC (Clathrin Heavy Chain) und CLC (Clathrin Light Chain) zusammengesetzt ist, und es
entstehen nach der Anlagerung an die PM die sogenannten clathrin coated pits (CCPs), d.h.
Invaginationen der PM, an denen sich die Vesikel zur Endozytose ausbilden. Die
Invagination der PM wird durch die Bindung weiterer Clathrin-beladener AP2-Komplexe und
die damit einhergehende Polymerisation des Clathrins vorangetrieben (Baisa et al., 2013).
Während dieser frühen Phase der Endosomenbiogenese sind auch die bereits genannten
Hilfsproteine beteiligt. Von dieser Gruppe ist AP180 das am besten untersuchte Protein in
Säugerzellen (McMahon and Boucrot, 2011). AP180 bindet PI(4,5)P2 über dessen
konservierte ANTH-Domäne (AP180 N-terminal homology), aber auch Clathrin und den AP2-
Diskussion
159
Komplex und man geht davon aus, dass dieses Protein die Größe der Vesikel reguliert (Ford
et al., 2001; Chen et al., 2011; McMahon and Boucrot, 2011). Die orthologen AP180-Protein
aus Arabidopsis enthalten ebenfalls eine ANTH-Domäne und spielen wahrscheinlich in
Pflanzen eine vergleichbare Rolle wie in Säugerzellen (Chen et al., 2011). Über die
Interaktionspartner-Kette XopB → NtIP1 → NtRhoGAP könnte XopB dieses Clathrin-
Assemblierungsprotein selbst oder dessen Lokalisierung modulieren und so Größe und
Bewegung von ARA7-positiven Vesikeln verändern (siehe Abb. 34und Abb. 35). Die
möglichen Auswirkungen einer solchen Modulation auf die Immunantworten der Pflanze sind
in Abb. 76 als Modell dargestellt.
Dass die CME in der Wirt-Pathogen-Interaktion eine Rolle spielt und Pathogene diesen
zellbiologischen Prozess möglicherweise zu Ihren Gunsten manipulieren, legen Studien mit
Gerste und Arabidopsis nahe. Ein GAP aus Gerste, HvARF-GAP der ARF-GAP-Familie
(ARF: ADP ribosylation factor; ADP Ribosylierungsfaktor), konnte als Interaktionspartner des
Effektors BEC4 aus Blumeria graminis identifiziert werden (Schmidt et al., 2014). AGD5, das
Arabidopsis-Ortholog von HvARF-GAP, bindet Clathrin und ist am Vesikeltransport zwischen
TGN und Vakuole beteiligt (Sauer et al., 2013). Dass BEC4 die pflanzliche Abwehr
möglicherweise über ein Eingreifen in diesen Vesikeltransport manipuliert, legen
Infektionsstudien mit Arabidopsis agd5 T-DNA-Insertionslinien nahe. Diese sind gegenüber
dem nicht-angepassten falschen Mehltau (Erysiphe pisi) suszeptibler und gegenüber dem
angepassten echten Mehltau (Hyaloperonospora arabidopsidis) resistenter (Schmidt et al.,
2014).
Nach den frühen Schritten der Endosomenbiogenese tritt eine fortschreitende Clathrin-
Polymerisation ein und es entstehen Clathrin-ummantelte Vesikel (CCVs: clathrin coated
vesicles), die mit Hilfe von großen GTPasen, den Dynaminen, abgeschnürt werden und
anschließend innerhalb von Sekunden ihren Clathrin-Mantel wieder verlieren. Dies ist die
Voraussetzung für eine Fusion der Vesikel mit dem trans-Golgi Netzwerk (TGN) und dem
frühen Endosom (EE: early endosome) (Chen et al., 2011). Dort wird die Ladung sortiert und
entweder zurück zur PM oder für den Abbau weiter Richtung Vakuole transportiert (Chen et
al., 2011). Die CME ist somit auch am post-Golgi Vesikeltransport beteiligt. Dieser Weg
zurück zur PM wird von dem T3E HopM1 aus Pst gestört, indem er mit dem ARF-GEF
AtMIN7 interagiert und dessen Abbau über das Wirtsproteasom einleitet (Nomura et al.,
2006). Proteine unterschiedlicher Natur sind in Arabidopsis als Ladungen der CCVs bekannt.
CME spielt eine zentrale Rolle in der Pflanzenentwicklung und so werden z.B. der Auxin-
Transporter PIN2, die Zellulose-Synthase Untereinheit CESA6 und der Brassinosteroid-
Rezeptor BRI1 AP2-Komplex-abhängig endozytiert (Baisa et al., 2013). Für Clathrin-
Diskussion
160
Mutanten konnte gezeigt werden, dass die polare Verteilung von PIN2 und damit der polare
Auxin-Transport in Wurzeln verloren geht (Kitakura et al., 2011). Für die Abwehr-assoziierten
Rezeptoren FLS2 aus Arabidopsis und LeEix2 aus Tomate wurde ferner gezeigt, dass diese
nach der Perzeption ihres bakteriellen bzw. pilzlichen Liganden endozytiert werden
(Robatzek et al., 2006; Bar and Avni, 2009).
Dass eine ungestörte Endozytose für die Pathogen-Perzeption wichtig ist, zeigen Studien mit
dem Rezeptor LeEix2 aus Tomate. Dieser PM-ständige LRR-Rezeptor ohne
zytoplasmatische Kinase-Domäne, perzipiert die pilzliche Xylanase EIX (EIX: ethylene-
inducing xylanase), wobei dessen zytoplasmatisches YXXΦ-Endozytosemotiv für die LeEix2-
abhängige Signaltransduktion essentiell ist (Ron and Avni, 2004). Nachfolgend konnte der
endozytierte LeEix2-Rezeptor mit dem Endosomenmarker FYVE-DsRed kolokalisiert
werden, der späte Endosomen anfärbt (Bar and Avni, 2009; Beck et al., 2012a).
Behandlungen mit Endozytose-Inhibitoren oder die Expression einer dominant-negativen
Clathrin-Mutante interferierten mit der LeEix2-abhängigen Signaltransduktion (Sharfman et
al., 2011). In dieser Studie wurde gezeigt, dass die Endozytose-Inhibitoren 1-Butanol und
Dynasore, ein Dynamin-Hemmer, nicht nur die Endozytose von LeEix2, sondern auch die
EIX-induzierte ROS-Produktion und damit eine wichtige Abwehrreaktion der Pflanze
supprimieren.
Der ebenfalls gut charakterisierte FLS2-Rezeptor wird in einem konstitutiven
Recyclingprozess endozytiert und wieder zur PM zurücktransportiert. Dieser Weg ist von
GNOM, einem ARF-GEF, abhängig und kann durch Brefeldin A (BFA) in Arabidopsis
inhibiert werden. Die flg22-induzierte Endozytose von FLS2 ist jedoch BFA-insensitiv und
stellt somit einen GNOM-unabhängigen Weg dar (Robatzek et al., 2006; Beck et al., 2012a).
Weitere Studien mit flg22-Behandlungen zeigten, dass endozytiertes FLS2 sequentiell mit
ARA7 und ARA6, den Markern für frühe bzw. späte Endosomen, kolokalisierte und die
Expression einer dominant-negativen Mutante von ARA7 (DN-ARA7) diese Liganden-
induzierte Endozytose von FLS2 verhinderte (Beck et al., 2012b).
Welche Kompartimente sind von einer veränderten Endozytose betroffen?
Die duale Lokalisierung von XopB an der PM und in frühen Endosomen erscheint in
Anbetracht der endozytierten Rezeptoren FLS2 und LeEix2, die ebenfalls an der PM, in
frühen und/ oder späten Endosomen lokalisieren, besonders interessant und deutet darauf
hin, dass XopB die pflanzliche Immunantwort durch ein Eingreifen in die Endozytose und den
Vesikeltransport manipuliert. Unterstützt wird diese Hypothese durch die veränderte Größe
und die verminderte Bewegung der ARA7-positiven Vesikel im Zytoplasmastrom in
Diskussion
161
Anwesenheit von XopB (siehe Abb. 34 und Abb. 35). Eine veränderte Endosomenstruktur
tritt ebenfalls auf, wenn konstitutiv aktive ARA6- und ARA7-Mutanten in Arabidopsis-
Protoplasten exprimiert werden (Ueda et al., 2001). Ueda et al. (2001) zeigten, dass diese
Mutanten in stark vergrößerten, Hohlkugel-förmigen Endomembranstrukturen lokalisierten,
die später als vergrößerte multi-vesikuläre Körper (MVB: multivesicular bodies) identifiziert
wurden (Jia et al., 2013).
Im Falle von XopB konnten keine derartigen ringförmigen Strukturen in den KLSM-Analysen
nachgewiesen werden. XopB wirkt offenbar über einen anderen Mechanismus auf die
Endosomenbiogenese ein. Jia et al. (2013) zeigten weiterhin, dass ein Vakuolen- und ein
MVB-Marker nicht jedoch TGN- (trans golgi network) und cis-Golgi-Marker mit den
vergrößerten ARA7-positiven MVB kolokalisierten und der Golgi-Marker weiterhin die für
Golgi-Stapel typische punktförmige Lokalisierung zeigte. Dies steht im Einklang mit den
Koexpressionsstudien, in denen XopB-eGFP weder mit dem cis-Golgi-Marker Man49-
mCherry (G-rb) kolokalisierte noch dessen Größe und Verteilung veränderte (siehe Abb. 34).
Im Gegensatz dazu kolokalisierte in einer anderen Studie GFP-markiertes XopB mit diesem
Golgi-Marker (Schulze et al., 2012).
Welche Signaltransduktionsprozesse beeinflusst die Endozytose?
Die Endozytose von FLS2 und LeEIX2 scheint nicht nur für deren proteasomalen Abbau und/
oder das Recycling wichtig zu sein, sondern ein Teil des Signaltransduktionsprozesses zu
sein. Tatsächlich reduzierten die Endozytoseinhibitoren Wortmannin (Wm) und Tyrphostin
A23 (TyrA23) nicht nur die Endozytose von FLS2-GFP (Beck et al., 2012b), sondern
vermindern auch die Produktion von ROS nach flg22-Stimulation (Smith et al., 2014b).
Gleichzeitig bleibt jedoch die flg22-abhängige Aktivierung von MPK3 und 6 von Wm und
TyrA23 unangetastet (Smith et al., 2014b). Dies steht im Einklang mit den verminderten
ROS-Produktionen der transgenen EtOH::xopB Arabidopsis-Pflanzen nach flg22-Stimulation
(siehe Abb. 18C) sowie mit den Ergebnissen der qPCR-Analysen in Arabidopsis, in denen
XopB nach flg22-Stimulation einen supprimierenden Einfluss auf das ROS-responsive Gen
AtOXI1, jedoch nicht auf die MAPK-spezifischen Marker AtFRK1 und AtWRKY22 hatte
(siehe Abb. 19). Ein Modell der von XopB beeinflussten Signaltransduktionsprozesse ist in
Abb. 76 dargestellt.
Das Interferieren mit der Endozytose hat somit nur auf bestimmte Teile der flg22-stimulierten
Signaltransduktion eine Auswirkung. Vor Kurzem konnte mit genetischen Studien gezeigt
werden, dass das Dynamin DRP2B aus Arabidopsis, das wie NtRhoGAP7 und 12 eine PH-
Domäne besitzt, an der FLS2-Endozytose beteiligt ist und die drp2b-Mutante suszeptibler
Diskussion
162
gegenüber Pst WT und der T3SS-defizienten Pst-Mutante hrcC- ist (Smith et al., 2014a). Die
genauere Analyse dieser Dynamin-Mutante ergab, dass die Aktivierung der MAP-Kinase-
Kaskade nach flg22-Stimulation unverändert ist. Dagegen waren die ROS-Produktion und
der Calciumeinstrom nach flg22-Stimulation erhöht. Dies zeigt erneut, dass die Aktivierung
der MAPK-Kaskade Endozytose-unabhängig ist, aber eine gestörte Endozytose offenbar die
ROS-Produktion und den Calciumeinstrom beeinflusst. Im Gegensatz zu den Studien mit
den Endozytose-Inhibitoren, die einen negativen Einfluss auf die ROS-Produktion haben
(Smith et al., 2014b), hat das Fehlen des Dynamins DRPB2 einen positiven Effekt auf die
ROS-Produktion und den Calciumeinstrom. Dies zeigt, dass diese Abwehrantworten sowohl
positiv als auch negativ durch die Endozytose reguliert werden. Je nachdem welcher Schritt
der Endozytose betroffen ist, kommt es offenbar zu gegensätzlichen Auswirkungen auf die
ROS-Produktion und den Calciumeinstrom. Nach Pst WT-Infektion akkumulierte weniger SA
in der drp2b-Mutante und das SA-abhängige PR-Gen AtPR1 zeigte nach Pst WT und Pst
hrcC--Infektion sowie nach flg22-Infiltration eine geringere Expression als in Col-0
Wildtyppflanzen (Smith et al., 2014a). Somit sind im Falle der drp2b-Mutante trotz erhöhter
ROS-Produktion und verstärkter Calciumeinströme die SA-abhängigen Prozesse nach
Pathogenbefall entscheidend und führen zu einer erhöhten Suszeptibilität dieser Dynamin-
Mutante gegenüber Pst. Durch welchen molekularen Mechanismus es zu diesen
veränderten Abwehrantworten kommt, liegt derzeit jedoch noch im Dunkeln.
In früheren Studien konnte allerdings die CME mit den Isoformen D der NADPH-Oxidasen
(RbohD) aus Arabidopsis und N. tabacum in Verbindung gebracht werden. Salzstress
induziert in Arabidopsis eine AtRbohD-abhängige ROS-Produktion sowie eine erhöhte
Endozytose des Farbstoffes FM4-64 (Leshem et al., 2007). In den dadurch gebildeten
Endosomen ist eine erhöhte ROS-Konzentration nachweisbar. Diese intrazelluläre ROS-
Produktion wurde durch den Endozytose-Inhibitor Wm unterbunden, was vermuten lässt,
dass AtRbohD nicht nur an der PM, sondern auch intrazellulär ROS produziert. Tatsächlich
konnte in einer neueren Studie gezeigt werden, dass in Arabidopsis GFP-AtRbohD unter
dessen endogenen Promotor nach Salzapplikation endozytiert wird (Hao et al., 2014). Mit
dieser Pflanzenlinie konnte ferner gezeigt werden, dass Salzstress aber auch eine flg22-
Stimulation die Dynamik und die Oligomerisierung von GFP-AtRbohD innerhalb der PM
erhöht. AtRbohD kolokalisiert und kodiffundiert dabei mit Clathrin in der PM, was mit einer
mCherry-AtRbohD x CLC-GFP (clathrin light chain-GFP) Arabidopsis-Linie gezeigt werden
konnte. Des Weiteren war die Dynamik und die Oligomerisierung von GFP-AtRbohD in der
Clathrin-Mutante chc2-1 (clathrin heavy chain 2) reduziert (Hao et al., 2014), was die Rolle
der CME in der Regulation von AtRbohD unterstreicht. Ob die chc2 Mutante jedoch eine
Diskussion
163
veränderte ROS-Produktion nach flg22- oder Salz-Behandlung aufzeigt, wurde bisher nicht
untersucht.
Möglicherweise ist aber auch die ROS-Produktion selbst wichtig für die CME. Behandlungen
von Tabak BY2-Zellen (BY2: bright yellow 2) mit dem pilzlichen Elicitor Cryptogein induzierte
sowohl ROS als auch die Endozytose des Farbstoffes FM4-64 (Leborgne-Castel et al.,
2008). Da NtRbohD-antisense-Tabak-Pflanzen nach Cryptogein-Behandlung eine
verminderte Bildung von CCPs (clathrin coated pits) an der PM zeigten, ist anzunehmen,
dass zumindest in diesem Modellsystem NtRbohD stromaufwärts der CME fungiert
(Leborgne-Castel et al., 2008).
Diskussion
164
Abb. 76: Funktionales (A) und mechanistisches (B) Modell der XopB-abhängigen Suppression pflanzlicher Abwehrprozesse. A: Durch eine Manipulation des PAMP-vermittelten Calciumeinstromes (Ca2+) durch XopB werden die Calcium-abhängigen Proteinkinasen (CDPK) nicht aktiviert und es kommt zu einer verminderten Induktion CDPK-abhängiger Gene wie z.B. PHI1 aus Arabidopsis. Die Calcium- und CDPK-abhängige Aktivierung der NADPH-Oxidase RBOHD ist von der Manipulation des Calciumeinstromes ebenfalls betroffen und es kommt zu einer verminderten ROS-Produktion und damit zu einer verminderten Induktion ROS-regulierter Gene wie z.B. OXI1 aus Arabidopsis. Die Aktivierung von Mitogen-aktivierten Proteinkinasen (MAPK) wird von XopB nicht beeinflusst und es kommt zu einer PAMP-vermittelten Erhöhung der mRNA-Menge von z.B. FRK1 aus Arabidopsis. Pst: Pst DC3000; FLS2: Flagellin-Rezeptor; K: Kinasedomäne von FLS2; PM: Plasmamembran. B: XopB greift in die Clathrin-vermittelte Endozytose ein, indem es entweder NtIP1 oder die Interaktion zwischen NtIP1 und NtRhoGAP7 und/ oder NtRhoGAP12 (GAP7/12) manipuliert bzw. stört. Dadurch könnte die Funktion des Clathrin-Assemblierungsproteins (CAP) beeinträchtigt werden und es kommt zu einer gestörten Endozytose von FLS2 und der NADPH-Oxidase RBOHD. Dies führt zur Beeinträchtigung des PAMP-vermittelten Calciumeinstromes und der ROS-Produktion. Die Aktivierung von MAP-Kinasen bleibt dagegen unbeeinflusst.
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Diskussion
165
5.6. Ausblick Im Rahmen dieser Arbeit konnte NtIP1 als Interaktionspartner von XopB identifiziert werden.
NtIP1 interagiert in Hefe mit dem GTPase aktivierenden Protein NtRhoGAP7, das wiederum
mit sich selbst und mit dessen nächstverwandten Homolog NtRhoGAP12 wechselwirkt.
Demnach bilden diese RhoGAPs möglicherweise in planta Homo- und/ oder Heterodimere
aus. In fortführenden Untersuchungen sollten die in Hefe identifizierten Interaktionspartner
von NtRhoGAP7 in planta mittels BIFC und co-IP bestätigt werden. Als vielversprechende
Kandidaten sind dabei das Clathrin-Assemblierungsprotein XP_009595075.1, Beclin-1 und
das β-Taxilin, anzusehen, da diese Proteine mit dem intrazellulären Vesikeltransport und/
oder mit der Pathogenabwehr in Verbindung stehen.
XopB konnte in dieser Arbeit in frühen Endosomen lokalisiert werden. Da die Größe und die
Bewegung der frühen Endosomen XopB-abhängig verändert wurde, stört XopB
möglicherweise die Clathrin-vermittelte Endozytose. Mit Hilfe des Farbstoffes FM4-64 und
eines FLS2-GFP-Konstruktes könnte geklärt werden, ob die Endozytose im Allgemeinen
bzw. die konstitutive oder Liganden-anhängige FLS2-Endozytose XopB-abhängig verändert
wird.
Die Genstilllegung von IP1 in Arabidopsis, Tomate oder Tabak sowie die Erzeugung stabiler
Überexpressionslinien könnte darüber Aufschluss geben, ob die durch XopB
hervorgerufenen Veränderungen der Pathogenabwehr IP1-abhängig sind oder nicht. Dies ist
besonders für die Ergebnisse aus dem Arabidopsis-Modell wichtig, da XopB in Hefe weder
mit AtIP1 noch AtIP1.1 interagierte. Pst-Infektionen und flg22-Behandlungen der erzeugten
Überexpressionslinien von Arabidopsis (35S::AtIP1-HA) könnten erste Hinweise auf eine
Beteiligungen von AtIP1 an der Pathogenabwehr liefern.
Da die biochemische Aktivität von XopB nach wie vor ungeklärt ist, kann an dieser Stelle
nicht gesagt werden, ob XopB NtIP1 modifiziert. Weitere Untersuchungen sind daher nötig,
um zu klären, ob die hier gezeigte XopB-abhängige Veränderung der NtIP1-Lokalisation
einen Einfluss auf die NtRhoGAP7-Aktvität hat. Ferner könnte mit co-IP-Studien untersucht
werden, ob XopB die Interaktion zwischen NtIP1 und NtRhoGAP7 oder die oben erwähnte
Homo- und Heterodimerbildung der NtRhoGAPs verhindert. Da NtRhoGAP7 auf Grund der
GAP-Domäne sehr wahrscheinlich eine GTPase reguliert, könnte mit einem pull down-assay
und anschließender Proteinidentifizierung über Massenspektrometrie nach weiteren
möglichen Interaktionspartnern wie GTPasen gesucht werden.
Abkürzungsverzeichnis
166
6. Abkürzungsverzeichnis °C Grad Celsius Abb. Abbildung AS/ as Aminosäure(n) bp Basenpaare ca. circa cDNA komplementäre DNA cfu "colony forming units", Kolonien bildende Einheiten cm Zentimeter cv. „cultivar“, Kultivar cw-Inv/ CwInv Zellwand-gebundene Invertase DNA Desoxyribonukleinsäure DNAse Desoxyribonuklease dNTP Desoxyribonukleosidtriphosphat dpi „days post infection“, Tage nach Infektion DTT Dithiothreitol EDTA Ethylendiamintetraessigsäure ER endoplasmatisches Retikulum EtOH
Ex
Em
Ethanol
„excitation wavelength“, Anregungswellenlänge
„emission wavelength“, Emissionswellenlänge
g Gramm oder Erdbeschleunigung GFP grün-fluoreszierendes Protein h
hpi
Stunde(n)
„hours post infection“, Stunden nach Infektion IPTG Isopropyl-b-D-Galaktopyranosid kb Kilobsen kDa Kilodalton L Liter M molar M-MuLV Moloney Murine Leukemia Virus mA Milliampere mCi Millicurie MeOH Methanol mg Milligramm min Minute(n) ml Milliliter mm Millimeter mRNA "messenger RNA", Boten-RNA mW Milliwatt nm nanometer oD600 optische Dichte bei 600 nm ORF "open reading frame", offener Leserahmen PCR "polymerase chain reaction", Polymerase-Kettenreaktion PM Plasmamembran pv. Pathovar RFP rot-fluoreszierendes Protein RT
SD
SE
"room temperature", Zimmertemperatur oder Reverse Transkription
„standard deviation“, Standardabweichung
„standard error“, Standard Fehler
SDS "sodium dodecyl sulfate", Natriumdodecylsulfat sec
ssp.
Sekunden
Subspezies Tris Tri-(Hydroxymethyl)-Aminomethan üN über Nacht Upm Umdrehungen pro Minute v/v Volumen pro Volumen w/v Gewicht pro Volumen X-Gal 5-Brom-4-chlor-3-indoxyl-β-D-galactopyranosid µl Mikroliter µM mikromolar µm Mikrometer
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167
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I
8. Anhang
8.1. Sequenz des xopB-Deletionslocus in Xcv !xopB
Abb. 77: Überprüfung des xopB-Deletionsstammes Xcv !xopB (Stamm #19 der Sammlung LS Biochemie). Mit den grün markierten „Deletionsprimern“ wurde ein 241 bp großes Fragment von genomischer DNA von Xcv !xopB mittels PCR amplifiziert. Das erhaltene Fragment wurde in den Vektor pGEM-t-easy subkloniert und mittels Sequenzierung überprüft. Basierend auf Noël et al. (2001) wurde die xopB-Deletion mit dem Sequenzprogramm Geneious nachkonstruiert (2. Xcv DeltaxopB_insilico) und mit dem Sequenzierergebnis (1. Xcv DeltaxopB_Sequenzierung) verglichen. Bis auf einen Nukleotidaustausch (Position 128: A zu G) waren die Sequenzen identisch. 5´UTR und 3´UTR: 5´- bzw. 3´-untranslated region.
II
8.2. Potentieller Promotor von xopB
Abb. 78: Potentieller Promotor von xopB. In den 649 bp stromaufwärts des ORFs von xopB wurde mit dem Promotorvorhersageprogramm „SoftBerry“ eine -10- und eine -35-Region identifiziert. Die PIP-box (plant-inducible promoter box) wurde manuell mit Hilfe des Sequenzprogrammes Geneious identifiziert.
III
8.3. Sequenzvergleich der IP1-Proteine aus Arabidopsis, Tabak, Paprika und Tomate
Abb. 79: Proteinsequenzvergleich der IPs aus Arabidopsis (At), N. tabacum (Nt), N. benthamiana (Nb), Paprika (Ca) und Tomate (Sl). Die vorhergesagte Myristoylierungsstelle ist mit einem Pfeil gekennzeichnet.
IV
8.4. Publikationsliste und Konferenzbeiträge
PUBLIKATIONEN:
Sonnewald S, Priller JPR, Schuster J, Glickmann E, Hajirezaei MR, Siebig S, Mudgett MB, Sonnewald U (2012) Regulation of Cell Wall-Bound Invertase in Pepper Leaves by Xanthomonas
campestris pv. vesicatoria Type Three Effectors. PLoS One 7: e51763
PRÄSENTATIONEN:
Juli 2014, 6th Annual Retreat, Erlangen School of Molecular Communication, Kloster Banz, Bad
Staffelstein, Germany, Vortrag: „The Xanthomonas campestris pv. vesicatoria type III effector XopB
supports bacterial virulence by interfering with ROS signalling”
Juli 2013, 5th Annual Retreat, Erlangen School of Molecular Communication, Kloster Banz, Bad
Staffelstein, Germany, Vortrag: „Analysis of the Type III effector protein XopB from Xanthomonas
campestris pv. vesicatoria”
Februar 2012, 25. Tagung der Molekularbiologie der Pflanzen, Dabringhausen, Germany, Poster:
„Functional and Structural Characterization of Type III Effector Protein XopB from the Phytopathogenic
Gram-negative Bacterium Xanthomonas campestris pv. vesicatoria”
Oktober 2011, First International SFB 796 Conference: Mechanisms of viral host cell manipulations:
from plants to humans, Bamberg, Germany, Poster: „Functional and Structural Characterization of Type
III Effector Protein XopB from the Phytopathogenic Gram-negative Bacterium Xanthomonas campestris
pv. vesicatoria”
Juli 2011, 3nd Annual Retreat, Erlangen School of Molecular Communication, Kloster Banz, Bad
Staffelstein, Germany, Vortrag und Poster: “Characterization of Type III Effector Protein XopB of
Xanthomonas campestris pv. vesicatoria Regulating Plant Cell Wall-bound Invertase“
Mai 2011, International Meeting "Communication in Plants and their Responses to the Environment",
Halle (Saale), Germany, Poster: „Characterization of Type III Effector Protein XopB of Xanthomonas
campestris pv. vesicatoria Regulating Plant Cell Wall-bound Invertase”
September 2010, 2nd Annual Retreat, Erlangen School of Molecular Communication, Kloster Banz, Bad
Staffelstein, Germany, Vortrag: „Characterization of Xanthomonas campestris pv. vesicatoria Effectors
Regulating Cell Wall-bound Invertase”