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FUNDAMENTOS EN CROMATOGRAFÍA DE GASES Y GASES DE MASAS
Manuel Gayo González
Responsable de Ventas Universidad
Consultor LCMSQQQ&GCQQQ
Universidad Europea de Madrid, 15 Octubre 2010
Introducción a la cromatografía de gases
La cromatografía es un método de separación físico.
En cromatografía de gases, los componentes a separar se distribuyen entre dos fases: una fase estacionaria y una fase móvil .
Los componentes se separan debido a la diferencia de afinidad con la faseestacionaria.
La fase móvil introduce los analitos en la columna y a través del sistema.
Como fáse móvil se utilizan gases inertes (gas portador).
Definición de Cromatografía de gases
Esquema típico de un sistema de GC
Componentes
Gases Sistema para introducción de la muestra Columna Detector Adquisición de datos
Componentes
GasesGas portador:
- transporta la muestra a través del sistema.- Su selección y velocidad influye en la eficiencia y el tiempo de retención.
Gases del detector: Soporte para ciertos detectores, ej. FID.
Componentes
Sistema de introducción de la muestra:Introducción de la muestra en la corriente del gas portador con mínimas variacionesen la corriente de gas.
-Rápido-Reproducible-Sin pérdida de eficacia.-Muestra representativa
Componentes
Columna: Logra la separación de los componentes de la muestra.
Detector:Reconoce y responde a alguna propiedad de los componentes de la muestra a medidaque eluyen de la columna.
Adquisición de datos: Convierte la señal del detector en un cromatograma y permite la determinación manual o automatizada de la identidad y cantidades de los componentesde la muestra.
AIR
CA
RR
IER
GA
S
HY
DR
OG
EN
MOL-SIEVE
TRAPS
FIXED
RESTRICTORS
FLOW
CONTROLLER
INJECTION
PORTREGULATORS
DETECTOR
ELECTROMETER
RECORDER/
INTEGRATOR
COLUMN
Cromatógrafo de gases típico
Consideraciones generales en GC
• Temperatura: Implica un peso molecular límite
CarrierGas Column
Data
System
Heated to VaporizeSample
Heated toKeep Clean
Heated toControl Separation
Integrator
Column
Detector
InjectionPort
• Instrumento presurizado: Las fugas son problemáticas.
Consideraciones generales de los tipos de muestra
Requirimientos de la muestra en cromatografía de gases
•Suficiente Volatilidad: Las macro moléculas generalmente no tienensuficiente volatilidad (no pasan a fase gas en las condiciones instrumentales).
•Libre de residuos: Esta es una extensión del primer requerimiento. Las impurezas no volátiles en la matriz de la muestra puede derivar en contaminación del inyector y columna que degradará rápidamente la cromatografía.
•Estabilidad térmica: Los compuestos de interés no se deben degradarcuando se introducen en el inyector a alta temperatura (por encima de 300°C) o en la columna (por encima de 350°C).
El 10-20% de todos los compuestos son adecuados para análisis por GC
Papel de la muestra
Tipo de gas portador Tipo de inyector de la muestra Tipo de columna Tipo de detector
La muestra determina la configuración del instrumento, es decir:
Tipos de columnas
Longitud (metros)
D.I. (mm)
0.5-10
2-4
5-100
0.53
5-100
0.1-0.25
EMPAQUETADA SERIES 530 NARROW BORE
Empaquetadas Capilares
Tubo abierto
con
recubrimiento
Columnas capilares
Comparación de los tipos de columna
124
56
8
9
10
11&12
7
12
456
9
10117&8
12
Columna empaquetada:
Semi-Capilar
Capilar
5% OV101
sobre 80/100 Chromosorb
30m X 0.53mm X .88
30m X 0.32mm X .25
Muestra para evaluación de columna
Modelo del proceso cromatográfico
B
Separación de compuestos
Flujo
A
C
D
Tiempo de retención
tr: Tiempo de retención. Tiempo que tarda un analito en salir de la columna
tr’: Tiempo de retención relativo. Tiempo que un analito pasa en la fase estacionaria
tm: Tiempo muerto ( se conoce también como tiempo de retención de un compuesto no
retenido). Tiempo que tarda en salir de la columna un compuesto no retenido.
Resolución
• Depende de tres parámetros:
– Factor de Retención (k)
– Selectividad ( )
– Eficacia (N)
• Si los tres son correctos tendremos separación en línea base.
• Los tres parámetros son independientes entre sí y se pueden ajustar.
Factor de retención (k)tr(B)
Soluto A Soluto B
tt‘r(A) = tr(A) – tm
k(A) = t'r(A) / tm
t = tr(B) - tr(A)
Time
Inyección
tr(A)
t’r(B)
t’r(A)
tm
Retention Time of
Unretained
Compound
k es inversamente proporcional a la temperatura de la columna
Selectividad
Inyección
Soluto A Soluto B
TIME > 1.05 son deseables para Columnas Capilares> 1.2 son deseables para Columnas empaquetadas
=t’r(B)
t’r(A)
k(B)
k(A)
=
tm
t’r(B)
t’r(A)
depende de la fase estacionaria
Eficiencia
Inyección
W h
Wb
Número de platos teóricos (N)
Altura equivalente de plato teórico (HETP)
HETP HLc
N
N 16tR
wb
2
5.545tR
wh
2
tm
tr
t’r
Es deseable el mayor valor N posible
t
Wb(1) Wb(2)
RS
t
12
Wb(1) Wb(2)
RS = 1.17 x [ t / (Wh1 + Wh2)]
Wh1Wh2
Resolución (Ecuación gráfica):Función del factor de retención, selectividad y eficiencia.
• La resolución depende de tres factores: k, , & N.
• Todos estos factores son necesarios para conseguir buena separación en línea base.
Factor de retención
(Temperatura)
Selectividad
(fase estacionaria)
Eficiencia
(Lc, Dc,
4
1
1
N
k
kRs
Resolución: Resumen
Simetría de pico
Gases portadores y de soporte del detector
Los gases deben:
o Elegirse considerando el tipo de detector utilizadoo Ser inerteso Secoso Puros
Para la utilización del gas comprimidocon seguridad:
Seguir las normas de seguridad del Dpto. de seguridad de la empresa o
las suministrada por el proveedor local
Los gases portadores más comunes son N2, He, H2.
Gases portadores
Su selección y velocidad influye en la eficiencia y el tiempo de retención.
Curvas de Van Demmter
Tipos de inyectores en GC.
Sistemas de inyección
Permiten introducir la muestra en el cromatógrafo de manerarepetitiva y reproducible. La muestra debe ser representativa y debe inyectarse sin que haya cambios químicos.
Tipos de inyectores:•Split/Splitless - EPC y no EPC•Empaquetadas con purga (Purged Packed) -EPC y no EPC•Refrigeración en columna (Cool on-column) - EPC•Vaporización a temperatura programada PTV y MMI - EPC
Inyector “Split/Splitless” (con/sin división)
Modo “Split” Análisis de comp. principales
Modo “Splitless” Análisis de trazas de comp.
“Split” a pulsos Permite un volúmen de inyección mayor
“Splitless” a pulsos Permite un volúmen de inyección mayor
Diagrama de flujo “Split” (con división): Pre-Inyección
SELLO
(ENTRADA)
(SEPTUM)
SALIDA DE SPLIT
FLUJO TOTAL
COLUMNA
SEPTUM
GAS PORTADOR
ALINEADOR
50 ml/min
2 ml/min
0.6 ml/min
48 ml/min
47.4 ml/min
SALIDA DE PURGA
VALVULA DE PURGA
Diagrama de flujo “Split”: Inyección de muestra
(ENTRADA)
(SEPTUM)
SALIDA DE SPLIT
FLUJO TOTAL
COLUMNA
= GAS PORTADOR
VALVULA DE PURGA
SALIDA DE PURGA
REL. SPLIT = FLUJO EN COLUMNA + SALIDA SPLIT
FLUJO EN COLUMNA
= MOLECULAS DE MUESTRA LÍQUIDA
Diagrama de flujo “split”: Vaporización de la muestra
(ENTRADA)
(SEPTUM)
SALIDA DE SPLIT
FLUJO TOTAL
COLUMNA
= GAS PORTADOR
= MOLECULAS DE MUESTRA
= MOLECULAS DISOLVENTE
SALIDA DE PURGA
VALVULA DE PURGA
La vaporización tiene lugar cuando se
transfiere suficiente energía térmica a la
muestra. Esto puede ocurrir en el gas
portador, pero es más probable durante
el contacto con una superficie sólida,
como el alineador o el medio de mezcla.
Típicamente los inlets se mantienen a temperaturas elevadas (>175°C hasta350°C dependiendo de la temperatura de vaporización de la muestras
Diagrama de flujo “split”: Mezcla Muestra/Gas
(ENTRADA) VALVULA DE PURGA
(SEPTUM) VALVULA DE PURGA
VALVULA DE SPLIT
FLUJO TOTAL
COLUMNA
Para que el concepto de SPLIT RATIO (Relación de Split) sea válido, la muestra (disolvente + analito) debe mezclarse con el gas portador y generar una mezcla homogénea.
Al fondo del puerto de inyección, una pequeña parte de esta mezcla se transferirá a la columna, mientras el exceso de la mezcla salga del cromatógrafo por la Salida de “SPLIT”
= GAS PORTADOR
= MOLECULAS DE MUESTRA
= MOLECULAS DE
DISOLVENTE
Diagrama de flujo en el Splitless•La vávula de purga está cerrada durante la inyección (no hay flujo en la válvula de split)•En un tiempo específico después de la inyección, la válvula de purgase abre para eliminar vapores remanentes en el inlet.
Injection Solvent Effect:Initial oven temperature is maintained below the boiling point of the solvent causing the solvent to condense at the head of the column "swelling" the stationary phase and trapping the analyte.
SOLVENT BOILING POINT INITIAL OVEN TEMP
( ºC) ( C)o
DICHLOROMETHANE
CHLOROFORM
CARBON DISULFIDE
DIETHYL ETHERPENTANEHEXANE
ISO-OCTANE
40
61
46
35
36
69
99
10-30
25-50
10-35
10-25
10-25
40-60
70-90
S
SS
SS S
S S SS
S S
SS
S SS S
S
S
S
S
S
S SS
SS
S
S
S
SS
SS
S S SS
S
SSS
S
S
S
S
S
S
S
S SS
S SS
S
S
SS
S
AA
A AA
A
A
A AAA
A
A
AA
A = ANALYTE
S = SOLVENT
Los liners más utilizados
@Consultar el catálogo de Columnas y Consumibles de Agilent Technologies:
4-mm di 1000-ul volumen
nominal, vidrio
borosilica- to (no tratado),
tapón de lana de vidrio
silanizada
Modos Split y splitless,
especialmente
recomendados para
inyecciones rápidas con el
Inyector Automatico 7673
19251-60540Split/Splitless
Alineadores: No tratados
Configuración
Uso recomendado
HP Ref.Tipo
4-mm di, volúmen
nominal 900 ul, vidrio
borosilicato (desacti-
vado), lana de vidrio
silanizada (desactivada)
Modos Split y splitless.
Puede estar medio
empaquetada.
5062-3587Empaquetada
Alineadores: Desactivados
Lana vidrio grado pesticidas5181-8818
4-mm di, volúmen
nominal 900 ul,
vidrio de borosili-
cato (desactivado)
5181-3316No empaquetada, Modos Split y splitless.
Puede estar medio
empaquetada.
cónica
cónica
http://www.chem.agilent.com/en-US/Search/Library/_layouts/Agilent/PublicationSummary.aspx?whid=57180&liid=56
Expansión de disolventes comunes
Cálculo del volumen de expansión
Solvent Vapor Volume Calculator
http://www.chem.agilent.com/en-US/Support/Downloads/Utilities/Pages/GcPressureFlow.aspx
- Capacidad de programación de temperatura
- Flexibilidad en los volúmenes de inyecciónAnálisis de muestras termolábiles y mínima discriminación en la inyección
para compuestos con alto peso molecular
- Mayor sensibilidad en inyecciones de gran volumen
- Disminuye pasos de preparación de muestraMayor productividad
Nuevo Inyector Multimodo para
muestras con alto contenido en matriz
Inyección cold Splitless 4 µL
Temperatura de la fuente 350⁰ C
Inyección Solvent Vent 5 µL
Temperatura de la fuente 350⁰ C
Inyección Splitlless 250⁰C 3µL
Temperatura de la fuente 280⁰ C
Patrón directo compuesto por 56 compuestos:
17 Hidrocarburos Policíclicos Aromáticos (PAHs)
23 Pesticidas Organoclorados (POCs)
6 Pesticidas Nitrogenados, Triazinas
10 Hidrocarburos Clorados
MMI en la práctica
INTRODUCCION A LA CROMATOGRAFÍA DE GASES MASAS
ACOPLAMIENTO GC/MS
La espectrometría de masas es una técnica analítica muy potente utilizada para: Identificar compuestos desconocidos. Cuantificar compuestos conocidos. “Elucidar la estructura química de las moléculas”.
220 Trampa de Iones
240 Trampa de Iones
Comparación Detectores de Cromatografía de Gases
El Detector Selectivo de
Masas (MSD) es a la vez:
Universal (trabajando con
barridos completos - modo SCAN)
Específico y muy sensible
(trabajando con iones selectivos -
modo SIM)
FPD(S)
NPD(P)
NPD(N)
ECD
FID
TCD
MSD
(SIM) (SCAN)
10-15
fg
10-12
pg
10-9
ng
10-6
µg
10-3
mg
1ppb = 1 pg / µl 1ppm = 1 ng / µl
Proceso de Ionización por Impacto Electrónico (EI)
m/z
C
AAC
AB
ABC+
+
++
+
Abundancia
Señal.
Espectro de Masas
0 10 70 100
eV
Energía de los electrones
#ABC del producto (ABC)
La curva depende
+.
Ionización:
ABC+.
ABC
Molécula Neutra Ión Molecular Excitado
- 2e -+ +e
Fragmentación:
(pérdida de un neutro)
AB.
+ C (reordenamiento)
A+ABC +. +C
+ BC .
etc.
+.AB
+
+ B+AC.
Diagrama de un Espectrómetro de Masas
Fuente de Iones Analizador Detector
de Iones
Sistema de Datos
Espectro de Masas
Sistema en Vacío
Inyector
Introducción de la Muestra:
GC/MS - LC/MS - Directa
Componentes Fuente de Iones
Foco de
electronesLentes de
entrada
Lentes "Draw-Out"
Lentes de
focalización de
iones
"Target"
"Repeler"
Línea de
transferencia de
columna
Filamento
" Magnet"
(imán
colimador)
*-->
Cuadruplo
"Empuja" los electrones hacia
fuente de iones
Target: "Atrae" los electrones ionizantes hacia la fuente
Filamento: Proporciona electrones para la ionización
Foco de electrones:
Magnet: Controla la forma del haz de electrones
ionizantes
Repeller: "Empuja" los iones formados fuera de la fuente
Lentes "Draw-Out": "Arrastra" a los iones fuera de la
fuente
Actua como apertura de entrada
al juego de lentes de focalización
Lentes de focalización
de iones:Focaliza los iones hacia las lentes
de entrada
Lentes de entrada Focaliza los iones hacia el campo
del cuadrupolo
Analizador-Filtro de Masas
AMPLITUD AMPLITUD RF
ELECTRODOS NEGATIVOS
-DC
-
0
+
( + )
FILTR0
MASAS
BAJAS
( -
) F
ILT
RO
MA
SA
S
ALTA
S Los voltajes aplicados en ambos pares de
electrodos son iguales en magnitud pero de
signo opuesto. La magnitud del potencial DC
controla la masa seleccionada
ELECTRODOS POSITIVOS
-
0
+
AMPLITUD RF
AMPLITUD
+DC
FRECUENCIA
RF
2 pares de electrodos Hiperbólicos
("rods") a los que se aplica una
componente de corriente alterna y otra de
continua de igual magnitud pero de signo
opuesto
Barrido de Masas (modo "SCAN") con Cuadrupolo
Para barrer un rango de masas, los potenciales de DC y RF aplicados al cuadrupolo han de ser
variados, para variar las masas que son filtradas. La relación entre los potenciales RF y DC es la
llamada LINEA DE BARRIDO.
La magnitud del potencial DC controla la masa seleccionada,
LINEA DE
BARRIDO
BARRIDO- ELECTRODOS POSITIVOS
+
0
-
AMPLITUD
DC
TRABAJO EN MODO SCAN
AMPLITUD
RF
Amplitud RF/ DF = cte.
Detector de Iones:Electromultiplicador
(-1200V TO -3000V)
+ + ++
SEÑAL
E.M. VOLTS (CDEM)
QUADS
+
+
+
Los multiplicadores son capaces de aumentar la corriente por un factor de 1,000,000 pero el rango
de trabajo típico es de 100,000.
El tamaño de la señal (y ruido) es función del voltaje del EM, cuanto mayor es el voltaje mayor
es la señal.
El EM tiene un tiempo de vida finito. Este tiempo de vida es función de la corriente de salida,
cuanto mayor es ésta, menor es el tiempo de vida del EM.
Espectro de Masas
20 40 60 80 100 120 140 160 180
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Abundance
29
43
55
57
71
85
98 113128 141 159
170
m/z->
Average spectrum of dodecane from EVALDEMO.D
M
<--[C H ] +
+.13
<--[C H ]11
<--[C H ]4
+
+(Base peak)
(Parent)
9
5
6
Dodecano : C12H26 (M=170)
Ión Molecular (M +): pérdida de un electrón
Pico Base: ión más abundante del espectro
Sintonizado con PFTBA
Espectro Perfluorotributylamine (PFTBA)
650
Scan: 10.00 - 650.00 Samples: 16 Thresh: 500117 peaks Base: 69.00 Abundance: 1974784
Mass Abund Rel Abund Iso Mass Iso Abund Iso Ratio
69.00 1974784 100.00 70.00 20344 1.03
219.00 1161216 58.80 219.95 45968 3.96
502.00 56648 2.87 503.00 5690 10.04
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600
0
50
100
131
219
264
69
414 (GCD)502
614
N CF2 - CF2 - CF2 - CF3
..
F3 C - F2C - F2C - F2 C
F3 C - F2C - F2C - F2 C
Metil estearato (C H O ) M = 298
Ión M+1 = 299
Contribución isotópica del carbono:
C19 x 1.1% de C = 20.9%
Contribución isotópica del deuterio:
H38 x 0.015% de D = 0.6%
Los espectros clásicos de EI deben
proporcionar picos isotópicos con relaciones
respecto al ion molecular muy cercanas a los
valores teóricos.
298 299
M
M +1 = 21.5%
+
+
13
¿Qué es un espectro EI clásico?
+38 219
+
Contribución isotópica total = 21.5%
Laboratorio Aplicaciones Agilent-BCN
Ionización Química Positiva (PCI)
Forma iones a partir del “gas reactivo” por bombardeo con electrones.
Los iones del gas reactivo sufren reacciones con moléculas de la muestra produciéndose
iones de la misma.
La ionización química (CI) es mucho más suave que la ionización por impacto
electrónico (EI), por lo que se produce menos fragmentación.
El gas reactivo más común es el metano, que produce iones con prácticamente cualquier
molécula de muestra.
Otros gases reactivos (isobutano, amoniaco) son más selectivos y producen incluso menos
fragmentación.
Presión de la fuente ~ 0.2 Torr.
Es el método más frecuentemente utilizado para determinar pesos moleculares de
compuestos.
Con metano se forma: M+1, M+29; M+41. Muy útil para asegurar M.
Con amoníaco se suele formar el M+1 y el M+18. Es muy selectivo (aminas).
Con isobutano sólo suele obtenerse el M+1.
M + CH CH + [M-H]
M + C H [M-C H ]
M + C H [M-C H ]
¿Qué es un Espectro CI clásico?
Transferencia de Protones+5 4
+
Adición Alquílica
22 5 5
3 5 3 5
++
+ +
Ionización del fenobarbital [M/z-232] empleando CH4 como gas reactante Formación Iones Reactivos
Las moléculas neutras de muestras reaccionan con iones
secundarios del gas reactante para formar aductos
Reacciones Analito-Gas Reactivo
+
CH +e CH +2e
CH +e CH +e +H
+Primaria
Secundaria CH +CH CH +CH
CH +CH C H [29] +H
C H +CH C H [41] + 2H
4 5+
34+
3+
5
+4
4
2 5+5+
3
2 2
2
4-
-4
+3
-
-+4
m/z = M + 1m/z = M + 29m/z = M + 41
233 261
[M+1]
[M+29]+
[M+41]+
273
+
100 pg de BenzofenonaPCI en Modo SCAN
M+1M+29 M+41
La PCI facilita la detección del ión molecular
Ionización Química Negativa (NCI)
“Ionización química negativa por captura electrónica”.
Primero se forma una nube de electrones con poco exceso de energía
(“electrones térmicos”).
Los “electrones térmicos” son capturados por moléculas de muestra.
Es necesario un gas amortiguador (que retira energía de los
electrones/iones). El metano es el más utilizado.
Presión de la fuente ~ 0.4 Torr (mayor que en PCI).
Sólamente ciertos tipos de moléculas son capaces de capturar electrones
térmicos (selectividad).
Extremadamente eficiente para algunas moléculas (sensibilidad).
Los límites de detección son generalmente muy bajos debido a la falta de
respuesta de los contaminantes o de la matriz.
Usado frecuentemente para análisis selectivos y de alta sensibilidad de
compuestos electrofílicos.
Suele proporcionar el M(-).
Beneficios:
Voltaje de Ionización Variable (5-240 eV)
Los voltajes pequeños proporcionan
una menor fragmentación general y
por otro lado incrementan el ion
molecular en relación a la ionización
estándar a 70eV.
Los voltajes pequeños proporcionan
ionización selectiva [ej..: aromáticos
en alcanos].
Los voltajes altos con CI son también
posibles y proporcionan una mayor
sensibilidad.
60 100 140 180 220 260 300 340 380
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
m/z-->
AbundanceScan 619 (7.531 min.): 2.D (-)
394
71
99127
169 210 309337225 253
365
12 eV
C28H58
60 100 140 180 220 260 300 340 380
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
11000
m/z-->
AbundanceScan 617 (7.515 min.): GLUC.D (-)
57
85
113
141 394183168 211 295238 337268 365
70 eV M+
Obtención de información
• El proceso para conseguir el password es el siguiente:
1. Acuda a la página de Agilent. (www.chem.agilent.com)
2. Pinche en el botón de Register
3. Siga los pasos que le indique el navegador
4. Finalmente adquiera su clave de acceso (password)
5. Una vez tenga la clave de acceso:
6. Acuda a www.chem.agilent.com
• Luego:
1. Haga clic en Login
2. Introduzca su nombre y password
3. De nuevo en la pagina inicial entre en Literature Library – Online Literature
4. Una vez en Library introduzca un keyword (por ejemplo: PAH)
5. Introduzca un tipo de publicación (por ejemplo: Application)
6. Rellene el resto de campos si lo considera necesario
7. Haga clic en Search
RESUMEN: Ventajas del acoplamiento GCMS
1971
• Operación robusta
• Identificación y confirmación
• Sensibilidad y Especificidad
• Facilidad de Uso
• Tecnología asequible
5975 GCMS7000B GCMSMS
¡GRACIAS!