Resumo: 07.001

Função renal em modelo de artrite induzida por colágeno

Autores 1MENDES, M. T.

1, Murari-do-Nascimento, S.

1, SILVEIRA, P. F.

1 Farmacologia - IB

Apoio Financeiro: FAPESP, CNPq e CAPES

Resumo Introdução A artrite reumatoide (AR) é uma doença auto-imune, inflamatória, crônica e sistêmica, caracterizada pela inflamação sinovial, levando à destruição progressiva da cartilagem e ossos das articulações. Em certos casos há ocorrência de danos extra-articulares e co-morbidades, tais como disfunção renal, a qual tem sido atribuída a vários fatores, incluindo a terapia com fármacos nefrotóxicos e a presença de hipertensão, aterosclerose, vasculite e amiloidose. Objetivos Avaliar se há efeito renal decorrente da AR em camundongos, independente de intervenção terapêutica. Código de Experimentação Animal 859/11 Código de Experimentação Humana Métodos Camundongos Swiss, adultos, 18-20g, machos, foram submetidos à indução de AR por colágeno tipo 2 em adjuvante (modelo CIA) ou administrados com salina (C). Entre os animais induzidos foram selecionados os artríticos (A). Após 41 dias, procedeu-se a urinálise do tipo 1 e medidas de osmolalidade, proteína total, creatinina, ureia, ácido úrico e atividade de aminopeptidase neutra (APN) no plasma (P) e na urina (U), além de hematócrito, nº e tamanho médio das hemácias (VCM) e hemoglobina no sangue, e estresse oxidativo (GSH/GSSG e MDA) no cortéx (CR) e medula (MR) renal, em conformidade com o protocolo nº 859/11, aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais do Instituto Butantan. As medidas foram expressas como média±EPM e analisadas estatisticamente pelo teste t de Student não pareado (AR versus C) bicaudal (p Resultados Animais A puderam ser distinguidos macroscopicamente de C já no início do desenvolvimento da doença, pela presença de edema grave nas patas traseiras, bem como pela presença de cianose e eritema. Ácido úrico (mg/dL; A-P, n=19: 2,47±0,46; C-P, n=13: 1,86±0,39; A-U, n=4: 7,87±4,87; C-U, n=4: 5,18±2,73) creatinina (mg/dL; A-P, n=17: 2,71±0,24; C-P, n=13: 2,33±0,29; A-U, n=4: 13,67±3,40; C-U, n=4: 16,47±4,09), ureia (mg/dL; A-P, n=19: 50,17±2,60; C-P, n=13: 51,05±2,94; A-U, n=4: 3536±1386; C-U, n=3: 2386±820), APN (pmoles substrato hidrolisado/min/mg proteína; A-P, n=13: 3066,82±59,81; C-P, n=10: 3141,38±44,27; A-U e C-U = 0), estresse oxidativo (µg/mL; GSH/GSSG: A-CX, n=11: 5,6±0,98; C-CX: n=8: 4,65±0.52; A-MR, n=11: 6,42±1,94; C-MR: n=8: 5,07±0,69; nmol/mg proteína; MDA: A-CX, n=15: 4,57±0,60; C-CX, n=8: 4,7±0,78; A-MR, n=15: 3,43±0,46; C-MR, n=8: 2,79±0,42), proteína (mg/mL; A-P, n=19: 8,46±0,56; C-P, n=11: 6,46±1,14), nº hemáceas/mm3 (A, n=11: 7443030±365331; C, n=10: 7217800±311516), VCM (μm; A, n=8: 542,74±16,25; C, n=6: 557,5±7,44) e hemoglobina (g/dL; A, n=9: 0,0527± 0,0031; C, n=7: 0,0539±0,0023) não diferiram entre A e C. Houve proteinúria (mg/mL) (3,45±0,83, n=4) e aumento no hematócrito (47,9±0,62, n=8) em A, comparado a C (respectivamente, 0,63±0,28, n=3 e 44,9±0,83, n=14). Conclusão

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O leve aumento do hematócrito, sem alteração significativa no nº de hemáceas e no VCM, sugere policitemia relativa e secundária, provavelmente resultante de aumento na produção de eritropoietina, o qual é considerado homeostático para impedir o desenvolvimento de anemia em pacientes com AR. A forte proteinúria indica dano glomerular induzido exclusivamente pela doença.

Palavras-chaves: Modelo Animal, Artrite Reumatóide, colágeno tipo 2, Função renal

Resumo: 07.002

Efeitos do veneno de abelha Apis mellifera na função renal de camundongos

Autores 1FREZZATTI, R.

1, SILVEIRA, P. F.

1 Farmacologia - Ibu

Apoio Financeiro: Fapesp, CNPq e CAPES.

Resumo Introdução O envenenamento por picada de abelhas é um problema relevante de saúde pública. Há relato de ocorrência de rabdomiólise e hemólise causados por veneno de abelhas (BV). Por ser bem vascularizado, o rim é um órgão muito vulnerável a envenenamento, mas é pouco conhecida a nefrotoxicidade do BV. Objetivos Contribuir com o conhecimento sobre a disfunção renal decorrente do envenenamento por BV. Código de Experimentação Animal 858/11 Código de Experimentação Humana Métodos Medidas de hematócrito (Ht), osmolalidade (Osm), proteína (Prot), alanina aminopeptidase (AAP), creatinina (Cr), ureia (Ur) e ácido úrico (Au) na urina (U) e plasma (P), e de estresse oxidativo (GSSG/GSH e malonaldeído [MDA]) no córtex (CX) e medula (ME) renal de camundongos Swiss, adultos, 18-20g, machos, submetidos à injeção única, em bolus, de BV (2,5 mg/kg em volume máximo de 50 μL/animal, subcutaneamente, no dorso) (E). Controles (C) foram injetados com o mesmo volume de NaCl 0,9%. Os procedimentos experimentais estão em conformidade com o protocolo 858/11 aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais do Instituto Butantan. Os dados foram expressos como média±EPM e analisados estatisticamente (E versus C) pelo teste t de Student, não-pareado, bicaudal, p Resultados C: Ht=43,5±0,8; GSSG/GSH-CX=4,3±0,3 µg/mL; GSSG/GSH-ME=3,9±0,4 µg/mL; MDA-CX=0,7±0,04 nmol/mg prot.10-6; MDA-ME=0,7±0,02 nmol/mg prot.10-6; Osm-U=880±5 mOsm/kg; Prot-U=1,5±0,02 mg/mL; AAP-U=0; Cr-U=6,8±1,6 mg/dL;

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Ur-U=2111±39 mg/dL; Au-U=4,5±0,6 mg/dL; Osm-P=262±2 mOsm/kg; Prot-P=78±7 mg/mL; AAP-P=277±37 UP/mg prot; Cr-P=0,9±0,1mg/dL; Ur-P=51±5 mg/dL; Au-P=1,7±0,3 mg/dL. Relativamente a C, em E variaram: Osm-U: 772±2 mOsm/kg e MDA-ME=1,1±0,1 nmol/mg prot.10-6, permanecendo inalterados: Ht=43,5±0,4; GSSG/GSH-CX=5,1±0,2 µg/mL; GSSG/GSH-ME=4,8±0,2 µg/mL; MDA-CX=1,1±0,1 nmol/mg prot.10-6; Prot-U=2±0,07 mg/mL; AAP-U=0; Cr-U=8,4±1,5 mg/dL; Ur-U=1472±430 mg/dL; Au-U=4,5±0,2 mg/dL; Osm-P=266±2 mOsm/kg; Prot-P=74±4 mg/mL; AAP-P=215±36 UP/mg proteína; Cr-P=1,1±0,1 mg/dL; Ur-P=50±4 mg/dL; Au-P=1,1±0,2 mg/dL. Conclusão A literatura tem preconizado o estresse oxidativo como fator crítico no desenvolvimento de insuficiência renal aguda em geral, principalmente o aumento de MDA e a diminuição de GSH. A dose de BV, aqui utilizada por via que mimetiza a picada, é próxima da DL50 intravenosa e intraperitoneal (2,8-3,8 mg/kg) do veneno de abelhas europeias e africanizadas e corresponde a 5 vezes aquela que, infundida na veia jugular de ratos, é relatada como causa de redução da taxa de filtração glomerular e fluxo sanguíneo renal, predominantemente cortical. O aumento de MDA, aqui observado na ME de E, sugere dano renal, especialmente nos túbulos, estruturas mais abundantes nessa porção. Esses danos podem ser agravados pela hipo-osmolalidade urinária que acompanha este aumento, sinalizando a tendência de um aumento deletério de eletrólitos no sangue. Tais alterações devem ser relacionadas a uma fase inicial de lesão renal, permitindo inferir que há risco iminente de dano renal no envenenamento por BV, o qual dependerá da suscetibilidade individual e da dose inoculada, ambos fatores ainda imponderáveis nesse envenenamento, assim sugerindo que o emprego preventivo de agentes nefroprotetores pode ser útil nesses acidentes.

Palavras-chaves: Abelha, Apis mellifera, Função Renal, Insuficiência Renal Aguda, Veneno

Resumo: 07.003

FUNÇÃO E MORFOLOGIA RENAL DE RATOS TRATADOS COM ANGIOTENSINA II E/OU LOSARTAN

Autores 1CASARE, F. A. M.

1, OLIVEIRA-SOUZA, M.

1 Departamento Fisiologia e Biofísica - USP

Apoio Financeiro: FAPESP, CAPES e CNPq

Resumo Introdução Estudos demonstram que a produção exacerbada de Angiotensina II (Ang II) contribui para a hipertensão arterial e induz injúria em vários tecidos, incluindo o renal. Outros achados, demonstram que a infusão crônica de Ang II em ratos induz ativação do sistema renina-angiotensina intra-renal com consequentes alterações na função glomerular e tubular. Objetivos Avaliar os efeitos da Ang II e/ou Losartan (antagonista do receptor AT1) na hemodinâmica, função e morfologia renal. Código de Experimentação Animal Sim Código de Experimentação Humana

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Métodos Todos os procedimentos foram aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais do Instituto de Ciências Biomédicas - USP - São Paulo, protocolo n.º139. Ratos Wistar, com idade de 35 dias foram separados em grupos: Sham (cirurgia fictícia), Losartan (Los – 10 mg/kg/dia), tratados com Ang II 288 µg/kg/dia) diluída em salina ou Ang II/Los. A infusão subcutânea de Ang II durante 42 dias foi realizada através de mini bomba osmótica (Alzet- Mod. 2006) implantada no dorso do animal. O Losartan foi administrado por injeções subcutâneas após o 28º dia do implante da mini bomba. A pressão arterial (PA) de todos os animais foi monitorada quinzenalmente, por pletismografia de cauda. Ao final dos tratamentos, os animais foram submetidos aos experimentos de clearance através da canulação da artéria carótida - para a coleta de amostras de sangue, da veia jugular - para a infusão de ácido paraamino-hipúrico (PAH) e inulina, e da bexiga - para a coleta de urina. Após o clearance, os rins foram removidos e fixados para análises morfológicas. O fluxo plasmático renal (FPR) e o ritmo de filtração glomerular (RFG) foram avaliados por determinação das concentrações plasmática e urinária de PAH e inulina respectivamente. Também foram avaliados a fração de filtração (FF) e o fluxo urinário. A analise estatística foi realizada através do programa GraphPad Prism5, e os resultados são expressos em média ± erro padrão de 6 animais para cada grupo, considerando diferentes os valores de *p <0,05. Resultados O tratamento com Ang II induziu aumento da PA, (Sham: 109 ± 5 vs Ang II: 193 ± 7 mmHg*); do FPR (Sham: 23,3 ± 1,5; vs Ang II: 34,2 ± 2,5 ml/min/kg*); do RFG (Sham: 7,2 ± 0,3 vs Ang II: 13,1 ± 1,3, ml/min/kg*); da FF (Sham: 32,1 ± 1,6 vs Ang II: 40,4 ± 2,0 %*) e do fluxo urinário (Sham: 0,15 ± 0,01 vs Ang II: 0,21± 0,02 ml/min/kg*); mas não alterou os parâmetros tubulares, como fração de excreção de Na+, K+ e osmolaridade urinária. Os animais tratados com Losartan não apresentaram alterações quando comparados aos grupos controles, e reduziu significativamente o efeito da Ang II sobre os parâmetros acima analisados. Quanto às alterações morfológicas, a Ang II induziu expansão glomerular (Sham: 7.676 ± 186 vs Ang II: 9.973 ± 319 µm2*); queda na razão da área parede/lúmen da artéria interlobular (Sham: 4,0 ± .0,2 vs Ang II: 1,8 ± 0,1 µm2*), redução da resistência vascular renal (Sham: 2,23 ± 0,02 vs Ang II: 1,49 ± 0,01 UR*), alem de induzir infiltração por macrófagos, aumento da expressão de desmina glomerular e acentuada proteinúria. O Losartan corrigiu todos os efeitos causados pela Ang II nestes parâmetros. Conclusão O tratamento por 42 dias com Ang II induziu, via receptores AT1, hipertensão arterial, lesão na parede das artérias interlobulares, alterações na hemodinâmica renal, injúria glomerular com consequente proteinúria.

Palavras-chaves: Angiotensina II, Função Renal, Losartan, Morfologia Renal

Resumo: 07.004

Glucagon-Like Peptide-1 Functionally Mediates the Interaction between NHE3 and Dipeptidyl Peptidase IV in the Renal Proximal Tubule

Autores 1FARAH, L. S.

1, VALENTINI, V.

2, PESSOA, T. D.

2, MALNIC, G.

1, GIRARDI, A. C. C.

1

Laboratório de genética e cardiologia molecular - InCor, 2 Fisiologia e Biofísica - ICB-USP

Apoio Financeiro: FAPESP

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Resumo Introdução The activity of Na+/H+ exchanger isoform 3 (NHE3) is modified by a series of molecular mechanisms, among which association with other proteins. It has been previously shown that dipeptidyl peptidase IV (DPPIV) physically associates with NHE3 in the apical membrane of the renal proximal tubule (PT). Moreover, studies in vitro and in vivo have revealed that inhibition of the catalytic activity of DPPIV inhibits NHE3 activity. Glucagon-like peptide (GLP-1) is a substrate of DPPIV and exerts natriuretic effects in humans and in experimental animals. Based on these data, we postulated that GLP-1 may be a potential candidate to mediate the functional interaction between NHE3 and DPPIV. Objetivos This study aimed to test the hypothesis that GLP-1 mediates the interaction between NHE3 and DPPIV in the renal proximal tubule. Código de Experimentação Animal Protocol # 1027/07 Código de Experimentação Humana Métodos Renal function was evaluated in male Wistar rats (Protocol # 1027/07) in response to acute intravenous administration of the DPPIV inhibitor sitagliptin (100 mg/kg) in the presence or absence of the antagonist of the GLP-1 receptor (GLP-1R) exendin-9 (100 µg/kg) or in the presence of the agonist of this receptor exendin-4 (µg/kg). The effect of these compounds on NHE3 function was measured as the rate of bicarbonate reabsorption by means of in vivo stationary microperfusion in PT. Resultados We have observed that the diuretic and natriuretic effects of the DPPIV inhibitor were blocked by exendin-9. Conversely, there was no additive effect on urinary flow and urinary sodium excretion when sitagliptin was infused with exendin-4, suggesting that the mechanism by which DPPIV inhibition promotes diuresis and natriuresis is dependent on GLP-1R activation. Moreover, increases in urinary flow and urinary sodium excretion induced by exendin-4 or sitagliptin was accompanied by increased bicarbonaturia, whereas the concomitant administration of sitagliptin and exendin-9 decreased sodium, bicarbonate and water excretion. By the means of stationary microperfusion we found that NHE3-mediated-PT bicarbonate reabsorption was reduced by exendin-4 (1.324 ± 0.168vs.2.001± 0.082nmol/cm2×s, P < 0.001) while it was slightly but not significantly increased by exendin-9 (2.183 ± 0.074 vs.2.001± 0.082nmol/cm2×s). Conclusão Together, our previous findings combined with the results presented in this study allow us to validate the hypothesis that inhibition of the catalytic activity of DPPIV increases the bioavailability of GLP-1, and therefore reduces the activity of NHE3. In summary, we conclude that GLP-1 mediates the functional interaction between DPPIV and NHE3 in the PT.

Palavras-chaves: Renal proximal Tubule, NHE3, Dipeptidyl peptidase IV, Glucagon-like peptide-1, Exendin-4, Exendin-9

Resumo: 07.005

ECSTASY (MDMA) INCREASES BOTH WATER ABSORPTION BY THE KIDNEY AND REACTIVE OXYGEN SPECIES (ROS) IN NORMAL RATS. Effect of N-acetylcysteine on ROS.

Autores 1BRAGANÇA, A. C. D.

2, MOREAU, R. L. M.

1, SEGURO, A. C.

1, SHIMIZU, M. H. M.

1, JESUS,

D. A. 1, MAGALDI, A. J.

1 Nefrologia - HCFMUSP,

2 Toxicologia - FCFUSP

Apoio Financeiro: HCFMUSP,FMUSP,FAPESP,CNPq,ICFTUSP

Resumo Introdução Introduction- 3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA or Ecstasy-Ec) is an amphetamine popularly used as a recreational drug of abuse. Ec also produces hyperthermia, profuse sudoresis, intense thirst, an inappropriate antidiuretic hormone secretion and also a multisystemic toxicity with oxidative stress. The intense thirst induces high ingestion of free water, and together with the increased water absorption produced by vasopressin, an acute hyponatremia is developed, frequently causing death. Objetivos Objective- As the hyponatremia is induced rapidly experiments were carried out to investigate a possible effect of the Ec directly on the water transporter in the rat Inner Medullary Collecting Duct (IMCD), measuring the Aquaporin 2 (AQP2) expression. Oxidative Stress (OS) was studied because it has already been reported that Ec can induce the appearance of ROS, causing renal tissue damage. OS was determined by measuring the thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) and a reduced form of Glutathione (GSH). To try to decrease the OS, the antioxidant inhibitor N-acetylcysteine (NAC)was used. Código de Experimentação Animal CAPPesq 048/10 Código de Experimentação Humana Métodos Methods- AQP2 Group – AQP2 expression - Wistar rats (250g) were maintained on lithium (Li) diet for 5 days to block the Vp action before Ec addition. AQP2 expression was determined by Western Blot techniques in IMCD and measured by densitometric analysis. Ec Group - OS was studied in 6 rats injected i.p. with Ec (10mg/kg), by determining the TBARS

(nmoles/24hs) and the GSH (mol/ml) in the plasma, compared to the control. Ec+NAC Group-OS study in 6 rats previously treated with NAC (added to drinking water- 4.8 mg/L for 5 days) and injected with Ec (Ec+NAC). TBARS and GSH were also determined. Ethic Commission Number-CAPPesq 048/10 Resultados Results- AQP2 Group - The densitometric analysis of the bands from the Western Blot AQP2 expression revealed that Ec was able to increase the water transporter expression decreased by Li therapy (absence of Vp action): control- 100.00±5.08, Li- 68.28±2.39, Li+Ec- 76.40 ± 0.80 % p Conclusão Summary and Conclusion- These results showed that the AQP2 abundance was decreased in the presence of lithium but increased in presence of Li+Ec evidencing a proper effect of this drug to increase IMCD water absorption. The increase of water transporter AQP2 expression in the IMCD, demonstrated that there is another mechanism contributing to the rapid

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hyponatremia that occurs with Ec use. The increase of the TBARS and the decrease of GSH showed an Ec-mediated oxidative stress that was prevented by the previous use of NAC. These results showed that the two effects studied can contribute, at least in part, to a rapid malaise, which in turn can lead to a lethal outcome if not treated correctly and as soon as possible.

Palavras-chaves: aquaporin 2, ecstasy, hyponatremia, oxidative stress, water absorption

Resumo: 07.006

INDUÇÃO DE DRC UTILIZANDO TÉCNICA DE ISQUEMIA E REPERFUSÃO RENAL UNILATERAL EM COELHOS NOVA ZELÂNDIA BRANCO

Autores 1TOGOE, E. B.

1, CURY, J. L.

1, SOUZA, A. S. D.

1, SILVA, I. S.

1 FAMED - PROG PÓS

GRADUAÇAÕ EM SAÚDE E DESENVOLVIMENTO DA REGIÃO CENTRO OESTE - UFMS

Apoio Financeiro:

Resumo Introdução Existem descritos modelos de DRC em ratos e coelhos, utilizando técnica de isquemia renal em conjunto com ressecções 4/5 ou 5/6 do tecido renal, em dois tempos cirúrgicos. Objetivos Estabelecer um modelo de DRC em coelhos Nova Zelândia Branco, utilizando técnica exclusiva de isquemia e reperfusão renal unilateral. Código de Experimentação Animal 280 Código de Experimentação Humana Métodos Aprovação pela Comissão no Uso de Animais UFMS, protocolo nº 280. Foram utilizados 20 coelhos Nova Zelândia Branco, machos, peso de 2,5 a 3 kg, procedentes de criadouro especializado. Durante todo o experimento os animais foram mantidos em gaiolas individuais, com ventilação e temperatura apropriada, cuidados diários de higiene e livre acesso à água e ração comercial. Todos os animais foram submetidos aos seguintes procedimentos: coleta de sangue pré-operatória (1ª coleta) para análise de creatinina e uréia séricas, cirurgia para isquemia e reperfusão renal esquerda, coleta de sangue após 6 semanas pós-operatório (2ª coleta), coleta de sangue (3ª coleta) 11 semanas de pós-operatório (pré-eutanásia). Todas as coletas foram realizadas com administração de: acepromazina (0,05g/Kg) associado à butorfanol (1mg/Kg) por via intramuscular 15 minutos antes do procedimento de punção cardíaca, realizada pelo veterinário responsável técnico. Para o procedimento cirúrgico: anestésico dissociativo (Cloridrato de tiletamina e Cloridrato de Zolazepam) 5mg/Kg por via intramuscular, laparotomia de flanco esquerdo com incisão longitudinal de 5 cm para dissecção

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subcutânea e músculos parietais, localização e clampeamento do pedículo vascular renal por 20 minutos. Após remoção dos clampes e reperfusão renal, foi feita síntese por planos com fio mononylon 4-0. Eutanásia dos animais com dose letal de barbitúrico intravenoso (100mg/kg), seguindo-se da retirada dos rins direito (RD) e esquerdo (RE). O material foi processado e corado com Hematoxilina e Eosina. Análise estatística: variáveis quantitativas expressas em médias e desvios-padrão e comparadas com teste ANOVA (one-way), seguida post hoc de Tukey, com significância estatística p Resultados Dos 20 coelhos estudados, 3 foram a óbito durante a pesquisa e excluídos das análises. As medias e desvio padrão dos níveis de creatinina da 1ª, 2ª e 3ª coleta foram, respectivamente 1,01±0,16, 1,15±0,16, 1,73±0,95 e uréia foram, respectivamente 31±4,53, 39,61±3,63, 32,62±5,79. O aumento da creatinina após a intervenção cirúrgica apresentou significância estatística na 3ª coleta em relação a 1ª e 2ª coleta (p Conclusão A técnica exclusiva de isquemia e reperfusão renal unilateral, sem nefrectomia, em coelhos Nova Zelândia Branco, mostrou efetividade na obtenção de um modelo animal de DRC, pois podemos observar, na histopatologia, lesões renais em ambos os rins e aumentos séricos de uréia e creatinina, que estão de acordo com a evolução da deficiência renal secundária à isquemia e reperfusão renal.

Palavras-chaves: doença renal crônica, isquemia e reperfusão, modelo animal de doença

Resumo: 07.007

CARACTERIZAÇÃO DO SISTEMA ENDOCANABINÓIDE EM CÉLULAS DE TÚBULO PROXIMAL RENAL E SEU PAPEL NA MODULAÇÃO DO TRANSPORTE ATIVO DE SÓDIO.

Autores

1,2SAMPAIO, L. S.

1,2, LIMA, D.

1,2, SAMPAIO, C. L. C.

1,2, TAVEIRA DA SILVA, R.

1,2, VIEYRA,

A. 2, REIS, R. A. M.

1,2, Einicker-Lamas, M

1 Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho IBCCF -

UFRJ, 2 Instututo Nacional de Ciência e Tecnologia em Biologia Estrutural e Bioimagem. - INCT

Apoio Financeiro: Capes, CNPq e FAPERJ

Resumo Introdução O sistema endocanabinóide (SEnd) é formado pelos canabinóides endógenos, pelos receptores canabinóides e por um grupo de enzimas responsáveis pela síntese e degradação dos endocanabinóides (Prostaglandins Other Lipid Mediat. 68-69: 619-631, 2002). O SEnd encontra-se envolvido, principalmente, com a modulação de respostas rápidas, incluindo a regulação da concentração intracelular de íons através da interação com proteínas diversas. Objetivos Identificar receptores canabinóides e avaliar o papel do SEnd sobre o transporte ativo primário de sódio em células de túbulo proximal renal. Código de Experimentação Animal

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Código de Experimentação Humana Métodos Células epiteliais derivadas de túbulo proximal de rim de porco imortalizadas (LLC-PK1), apresentando 90% de confluência foram utilizadas para todos os experimentos. Para avaliar a presença de receptores canabinóides, CB1 e CB2 foram realizadas técnicas de eletroforese, imunodetecção e imunofluorescência. A medida de atividade da Na+-K+ATPase foi obtida através de método colorimétrico e para medida da atividade da Na+ATPase foi utilizado incorporação de [32P]ATP. Foi realizado ensaio de quantificação de AMPc a partir da incorporação de [3H]AMPc. As drogas utilizadas nos experimentos incluiam win 55, 212-2 (WIN), hemopressina (HEM), AM251, PTX e H89. Resultados Através da imunodetecção e imunofluorescência foi possível comprovar a existência de receptores canabinóides nas cultura LLC-PK1, sendo a expressão de CB1 75% maior que a de CB2. Sobre a atividade da Na+-K+ATPase foi visto que a adição do agonista canabinóide WIN (10-7M) é capaz de aumentar a atividade ATPásica, em tempos de incubação de 1 e 30 minutos (ambos aumento de 50%), quando comparado ao controle. Já o tratamento com o agonista inverso, HEM (10-6M) foi capaz de inibir a atividade basal da enzima, quanto utilizado tempo de incubação de 30 minutos (inibição de 30%), e aumentar a atividade ATPásica, quando utilizado o tempo de 1 minuto de tratamento (aumento de 50%). Quando incubada juntamente WIN e HEM, ambos por 30 minutos, a Na+-K+ATPase não apresenta alterações em sua atividade, comparado ao controle. A incubação com o antagonista CB1, AM251 (10-6M) é capaz de inibir a modulação da Na+-K+ATPase, promovida tanto pelo WIN quanto pela HEM apenas quando os agonistas são incubados por 30 minutos. O tratamento de 30 minuutos com HEM revelou a existência da elevação nos níveis de AMPc nas células (aumento de 40% quando comparado ao controle). O tratamento com H89 (10-5M), inibidor de proteína cinase A (PKA), evitou o efeito inibitório da HEM, mas não interferiu na ativação promovida pelo WIN, enquanto que a incubação com PTX (100ng/ml) não afetou nenhum dos padrões de modulação dos canabinóides. WIN e HEM não afetaram a atividade da Na+ATPase. Conclusão O SEnd desempenha importante papel modulatório sobre o aporte de sódio reabsorvido pelo tecido renal, aqui representado pela a modulação da Na+-K+ATPase presente em túbulo proximal. As vias de sinalização envolvendo endocanabinóides em células LLC-PK1 demonstraram a participação do receptor canabinóide clássico (CB1) e no que diz respeito ao efeito modulatório promovido pela HEM sobre a Na+-K+ATPase, a participação de AMPc e de PKA são essenciais. Assim, o SEnd surge como um importante e evidente sistema regulador da função renal, sendo necessários estudos futuros para o amplo entendimento da participação dos canabinóides sobre a fisiologia renal tubular.

Palavras-chaves: endocanabinóide, Na+-K+ATPase , LLC-PK1, Rim

Resumo: 07.008

CHANGES IN RENAL FUNCTION OF MICE EXPOSURE TO MICROCISTIN-LR INTOXICATION.

Autores

1FELTRAN, G. S.

1, MAISSNER, F. F.

1, FONSECA, R. N.

1, SILVA, J. R.

1, MORAES, J. L. C.

2,

DE BARROS, C. M. 3, AZEVEDO, S. M. F. O.

4, SOARES, R. M.

1,3, SOUZA-MENEZES, J.

1

Laboratório Integrado de Bioquimica Hatisaburo Masuda - NUPEM/UFRJ, 2 Laboratório Integrado de

Morfologia - NUPEM/UFRJ, 3 Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho - UFRJ,

4 Xerém - UFRJ

Apoio Financeiro: FAPERJ, CNPq, FUNEMAC and INCTEM.

Resumo Introdução Cyanobacteria are prokaryotic microorganisms, photosynthetic with biochemical and cellular organization like bacteria. Moreover, it has a broad range of genotypic and phenotypic features leading to a wide geographical distribution. Currently, the biggest concern about cyanobacteria bloom is the fact that it is potentially produce toxins that can cause serious physiological damage to mammals and also harm aquatic biota. Objetivos In this study, it was analyzed the changes in renal function of mice exposure to cyanobacteria toxin (microcystin - LR) intoxication. Código de Experimentação Animal MACAE018 Código de Experimentação Humana Métodos C57BL6 mice between 12 to 16 weeks of age (20g-30g) were divided in two groups: control (CTRL, n = 3) and exposure to microcystin-LR (MYCST, N = 4). The mice were intraperitoneally submitted to a dose of 25ug/kg (MCYST25), 35ug/kg (MCYST35) and 45ug/kg (MCYST45) ug/kg of body weight of microcystin-LR in 0.9% NaCl solution. The control group received the vehicle (0.9% NaCl). 24 hours before the euthanasia, the animals were kept in metabolic cages for urine collection. The mice were weighed, sedated and anesthetized with a mixture of ketamine (83mg/kg BW) and xylazine (5mg/kg BW). Under deep anesthesia, blood sampling was performed by cardiac puncture for plasma isolation. Using plasma and urine, the renal function was determined by measuring the GFR and fractional excretion of Na+, K+, Cl-, total protein, glucose and urea. After total laparotomy kidneys were removed and their weights were determined to determine renal index (organ weight / body weight). After this procedure, the left kidney was frozen in liquid nitrogen for future analysis. Statistical analysis was performed using t-TEST. Differences were considered significant when p <0.05. Resultados All mice subject to intraperitoneal injection of 45 µg/kg Body Weight of microcystin-LR died 5h after toxin administration. In MCYST25, it was not observed significantly changes in fractional excretion (FE=%) of Na+, K+, Cl-, and urea (0.202 ± 0.053; 13.740 ± 3.323; 0.148 ± 0.025; and 0.121 ± 0.020, respectively) compared to their respective CTRL (0.265 ± 0.183; 5.303 ± 4.168; 0.146 ± 0.010; 0.115 ± 0.036, respectively). The GFR also did not significantly change in MCYST25 (0.591 ± 0.068) compared to CTRL (0.507 ± 0.056). However, the FE of total protein was higher in MCYST25 (12.220 ± 0.377) compared to CTRL (8.627 ± 0.683). It was not observed significant changes in renal index in both groups. In MCYSCT35, the fractional excretion (FE=%) of glucose, Cl-, and total protein was higher (0.050 ± 0.0096; 0.244 ± 0.014 and 18.560 ± 1.516 respectively) compared to CTRL (0.007 ± 0.0029, 0.146 ± 0.010 and 8.627 ± 0.683 respectively). The GFR was lower in MCYST35 (0.003 ± 0.0001) compared to CTRL (0.005 ± 0.0005).In the FE of urea, K+ and Na+ was not observed significantly changes in MCYST35 (0.118 ± 0.027; 23.000 ± 6.024; 0.186 ± 0.041, respectively) compared to CTRL (0.115 ± 0.036; 5.303 ± 4.168; 0.086 ± 0.003 respectively). The right renal index was higher in MCYST35 (0.008 ± 0.0009) compared CTRL (0.006 ± 0.0001). Conclusão In this work it was observed that only the animals subject to 35 µg/kg BW microcistin-LR intoxication showed lower GFR and higher Cl- and Glucose FE. Both 25 and 35 µg/kg, were able to induce enhancement in total protein FE. The lethal dose

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was observed in mice exposure to a dose of 45 ug/kg BW.

Palavras-chaves: microcystin- LR, lesion, renal function, changes

Resumo: 07.009

O TRATAMENTO INTRACAPSULAR COM LPA RECUPERA A ATIVIDADE DA (Na++K+)ATPase E NÃO DA Na+-ATPase PRESENTES NO CÓRTEX DE RINS DE RATOS WISTAR SUBMETIDOS AO PROCESSO DE ISQUEMIA– REPERFUSÃO RENAL

Autores 1GONSALEZ, S. R.

1, Leal, A. C.

2, Einicker-Lamas, M

1, LARA, L. S.

1 Farmacologia e Química

Medicinal - ICB, 2 Biofísica - IBF

Apoio Financeiro: FAPERJ, CNPq, CAPES-PROBITEC, INCT-INBEB

Resumo Introdução O ácido lisofosfatídico - 1-acyl-2-lyso-sn-glycero-3-phosphate (LPA) é um fosfolipídio endógeno gerado também durante o processo de isquemia e reperfusão (IR)renal, cujos efeitos são mediados por receptores específicos acoplados a proteína G. Recentemente, observamos que o tratamento com LPA intracapsular previne a diminuição da taxa de filtração glomerular medida através da depuração de creatinina e a carga de sódio filtrada, o acúmulo de ureia no plasma. Entretanto, o tratamento não previne a diminuição da fração de excreção renal de sódio. Objetivos Determinar o efeito do tratamento com LPA sobre os transportadores renais de sódio: Sódio,Potássio ATPase (NKA) e sódio,ATPase (NaA), incluindo suas vias de sinalização envolvidas nesse sistema. Código de Experimentação Animal IBCCF087 Código de Experimentação Humana Métodos Ratos Wistar machos adultos (180 a 200g) foram distribuídos em três grupos: (a) falso operados: (n=11); (b) IR: a isquemia foi induzida pela aplicação de um grampo vascular não traumático nos duas artérias renais por 30 min. Em seguida, o grampo foi removido para que a reperfusão ocorresse e a cicatriz fosse fechada (n=11); (c) IR + LPA: durante os 30 min relativos ao processo de isquemia, LPA(1mg por Kg) foi administrado na cápsula renal. Após 30 min, o grampo foi removido e a cicatriz fechada (n=11). Após as 24 horas do processo de reperfusão os animais foram sacrificados. os rins removidos e a região cortical dissecada para realização de ensaios de Western blot e atividade enzimática. As atividades enzimáticas foram realizadas conforme descrito por Lara et al., (2001). Aprovação pelo comitê de ética de uso de animais experimentais da Universidade Federal do Rio de Janeiro (IBCCF087). A análise estatística foi realizada por One-way ANOVA e pós- teste Tukey

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Resultados Durante a I/R, a atividade e a expressão da NKA aumentam cerca de 50 % enquanto a atividade da NaA diminui em 46 %; este efeito pode estar associado a diminuição de 40 % da atividade da proteína cinase C (PKC; p Conclusão Durante a IR, ocorre a diminuição da via de sinalização PLC,PKC que pode estar associada ao aumento da expressão e atividade da NKA. O tratamento com PLA leva a ativação desta via que promove o retorno da NKA ao controle. A maior disponibilidade de receptores LPA1 pode auxiliar neste evento. A NaA é insensível ao tratamento com LPA e independente da via PLC,PKC. Essa enzima pode ser o componente responsável pela diminuição da fração de excreção urinária de sódio.

Palavras-chaves: Ácido lisofosfatídico, Isquemia-reperfusão renal, Na+ ATPases, Proteína cinase C, Receptores de LPA

Resumo: 07.010

Efeito dos produtos finais de glicação avançada (AGEs) sobre a viabilidade celular e a geração de espécies reativas de oxigênio em células tubulares proximais humanas

Autores 1MONTEIRO, M. B.

2, THIEME, K.

1, PASSARELLI, M.

2, MACHADO, U. F.

2, SOUZA, M. O.

1,

CORREA-GIANNELLA, M. L. 1 Endocrinologia - FMUSP,

2 Fisiologia e Biofísica - ICB

Apoio Financeiro: Fapesp

Resumo Introdução O papel dos produtos finais de glicação avançada (AGEs) está bem estabelecido no desenvolvimento das complicações crônicas do diabetes mellitus, inclusive da nefropatia diabética (ND), que é uma das principais causas de doença renal terminal. Além da lesão glomerular, o compartimento tubulointersticial é afetado no desenvolvimento da ND, não somente pela proteinúria como pelos efeitos pró-inflamatórios, profibróticos, pró-oxidantes e angiogênicos da hiperglicemia e dos AGEs. Os mecanismos moleculares pelos quais os AGEs promovem alterações na região tubulointersticial ainda não foram completamente elucidados. Objetivos Avaliar o efeito dos AGEs sobre a viabilidade, a geração de espécies reativas de oxigênio e a ativação de vias de sobrevivência celular e apoptose em células tubulares proximais humanas da linhagem HK-2. Código de Experimentação Animal Código de Experimentação Humana 149940

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Métodos Células HK-2 foram tratadas com albumina controle não glicada (AlbC) ou com albumina glicada in vitro após incubação com glicoaldeído (AlbAGE) por diferentes tempos de exposição. A viabilidade celular foi avaliada pelo ensaio MTT nos tempos de 24, 28 e 72 horas após exposição às concentrações de 20, 50, 100, 500, 1.000, 2.000, 5.000 e 10.000 ug/ml de AlbC e AlbAGE. A produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) foi medida pelo ensaio com carboxi-H2DCFDA em células tratadas com AlbC e AlbAGE nas concentrações de 20 ug/ml, 50 ug/ml e 500 ug/ml por 24 horas. A expressão das proteínas de vias de sobrevivência (Akt e p-Akt), de apoptose (caspase 3) e de resposta ao estresse (p38) foi avaliada por Western blot com anticorpos monoclonais, em extratos proteicos de células tratadas com AlbC e AlbAGE (20, 50, 100 e 500 ug/ml) por 24 horas. Resultados As células tratadas com AlbC e com AlbAGE apresentaram aumento da viabilidade em 48 horas, exceto nas concentrações de 5.000 e 10.000 ug/ml. Após 72 horas, observou-se uma redução da viabilidade para valores semelhantes aos observados em 24 horas de tratamento. No ensaio para avaliação da geração de EROs, notou-se que uma grande proporção de células não tratadas com albumina já apresentava geração de EROs (73,8%; ± 14,2). Além disso, pôde-se observar uma redução tanto maior no número total de células quanto maior a concentração de albumina (glicada e não glicada). A queda tornou-se especialmente acentuada nas concentrações acima de 1.000 ug/ml para os tratamentos com AlbAGE. Não houve diferença estatisticamente significante na geração de EROs em nenhuma das concentrações de albumina (glicada ou não), quando comparadas às células não tratadas com albumina. Não foram observadas diferenças na expressão da proteína p38 (resposta celular ao estresse) e da caspase 3 (pró-apoptótica) nas células tratadas com AlbC ou AlbAGE durante 24 horas em relação às células não tratadas, enquanto houve um aumento da relação p-Akt/Akt (sobrevivência celular) nas células tratadas com AlbAGE nas concentrações de 20 ug/ml e 50 ug/ml. Conclusão A AlbAGE não causou diminuição da viabilidade celular nos tempos de 24, 48 e 72 horas e nem aumento da geração de EROs ou ativação de caspase-3 após 24 horas de exposição, em comparação à albumina não glicada. Experimentos adicionais em tempos mais prolongados serão realizados para avaliar o efeito da cronicidade do estímulo com AGEs sobre as células HK-2.

Palavras-chaves: AGE, Células tubulares, Diabetes, Renal

Resumo: 07.011

O AUMENTO LOCAL DE Na+ NO MEIO EXTRACELULAR MODIFICA A HOMEOSTASIA INTRACELULAR DE Ca2+ POR UM MECANISMO DEPENDENTE DE SERCA EM CÉLULAS DE TÚBULO PROXIMAL RENAL.

Autores 1SOUZA, A. M.

2, FERRÃO, F. M.

2, LOWE, J.

1, CUNHA, V. M. N.

1, LARA, L.S.

1 Farmacologia e

Química Medicinal - ICB, 2 Biofísica - IBCCF

Apoio Financeiro: FAPERJ, CNPq, INCT-INBEEB

Resumo Introdução

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É bem estabelecida a relação entre a ingestão de sal, balanço corporal total de Na + e pressão arterial. No entanto, estudos de balanço de Na + em humanos e em animais experimentais sugerem que o acúmulo de Na + no organismo não é exatamente proporcional a retenção de água necessária para manter a iso-osmolaridade dos fluidos corporais. Desta forma, embora elevações do volume extracelular (VEC) promovam um efeito pressor, o aumento localizado em micro-ambientes extracelulares da concentração de Na + , per se também pode contribuir para a hipertensão e lesões em órgãos alvos, inclusive nos rins. Recentemente, nosso grupo demonstrou que ratos machos Sprague-Dawley submetidos a elevada ingestão de sal apresentam deficiência da função renal associado a lesão no túbulo proximal caracterizando um quadro de necrose tubular aguda. Entretanto, pouco se sabe como o aumento da ingestão de sal ativa vias de sinalização específicas que contribuem para o desenvolvimento e progressão da lesão renal. Objetivos Determinar os mecanismos moleculares ativados pela presença de alta concentração de Na + no meio extracelular de cultura de células derivadas de túbulo proximal de rim de porco (LLC-PK 1 ) que podem estar associados a progressão da necrose tubular aguda. Código de Experimentação Animal Código de Experimentação Humana Métodos As células LLC-PK 1 foram cultivadas em meio DMEM com 10% de soro fetal bovino a 37 o C com 5 % de CO 2 . Para o experimento, as células foram plaqueadas (5×10 5 células) e mantidas por 48 h, até atingirem a confluência. As células foram incubadas com diferentes concentrações de NaCl (de 140 e 170 meq) e a osmolaridade foi mantida a 310 mOsm/Kg com manitol. As células foram retiradas da placa com auxílio de rodinho e homogeneizadas utilizando Potter. A medida da atividade das ATPases transportadoras de Ca 2+ foi realizada segundo o método descrito por Ferrão et al Am J Physiol Renal Physiol. 302: F875-883, 2012). A atividade Ca 2+ -ATPásica total foi calculada pela diferença entre as determinações feitas na presença de 7,5 micromolar de Ca 2+ livre e na sua ausência pela adição de EGTA 2 mM. As atividades das Ca 2+ -ATPase de membrana plasmática (PMCA) e Ca 2+ -ATPase de retículo sarcoendoplasmático (SERCA) foram medidas na presença de tapsigargina 1 micromolar, um inibidor específico da SERCA. Resultados Em alta concentração de Na + (170 meq), a atividade Ca 2+ -ATPásica total é aproximadamente duas vezes superior que na condição controle (140 meq) (18,29±1,01 vs. 8,46±0,63, n=3, p Conclusão Considerando que a SERCA é a enzima responsável por manter o Ca 2+ estocado no retículo endoplasmático, nossos experimentos sugerem que o aumento extracelular da concentração de Na + promove um aumento intracelular de Ca 2+ detectado indiretamente pelo aumento da atividade SERCA. Desta forma, o íon Ca 2+ poderia ser o segundo mensageiro capaz de ativar vias de sinalização envolvidas no dano celular ativado pelo aumento localizado de Na + .

Palavras-chaves: Ca2+-ATPase, LLC-PK1, Necrose tubular, Sódio, Túbulo proximal

Resumo: 07.012

What is the mechanism of microalbuminuria in hypertension: a role for receptor-mediated endocytosis in the kidney proximal tubule?

Autores 1ARRUDA-JUNIOR, D. F.

1, INOUE, B. H.

1, CAMPOS, L. C. G.

1, KRIEGER, J. E.

1, GIRARDI, A.

C. C. 1 Instituto do Coração - USP

Apoio Financeiro: FAPESP and CAPES.

Resumo Introdução Cumulative epidemiological evidences indicate that the presence of microalbuminuria predicts a higher frequency of cardiovascular events, peripheral disease and mortality in essential hypertension. Microalbuminuria may arise from increased glomerular permeability and/or reduced proximal tubular reabsorption of albumin by receptor-mediated endocytosis. Objetivos This study aimed to evaluate the temporal pattern of urinary protein excretion and to test the hypothesis that progression of microalbuminuria is associated with decreased protein expression of critical components of the endocytic apparatus in the renal proximal tubule of spontaneously hypertensive rats (SHR). Código de Experimentação Animal 052/11 Código de Experimentação Humana Métodos Studies were performed in male SHRs and age-matched Wistar rats. Blood pressure (SBP) was measured by tail cuff plethysmography. Rats were individually placed into metabolic cages to assess urine function. Urinary albumin concentration was determined with an ELISA kit specific for rat urine albumin Additionally, albumin was isolated from urine by SDS-PAGE and quantified by densitometry. Immunoblotting analysis was performed to examine the protein abundance of critical components of the apical endocytic machinery in the kidney proximal tubule including megalin, cubilin, the chloride channel ClC-5 and the vacuolar-H+-ATPase B2 subunit. Histological and morphometric analysis were carried out to determine the mean glomerular diameter and volume of glomeruli and Bowman’s capsule. Data are expressed as means ± standard error. Comparisons among groups were made by one-way analysis of variance (ANOVA). Adjustment for multiple comparisons was made with the Bonferroni’s method. Differences were considered significant if P <0.05. Resultados SBP values increased from 6 to 14 weeks of age (110 ± 3 vs. 180 ± 2 mmHg, P 0.001 and 29 ± 3% vs. 14 week-old SHR, P Conclusão Collectively, our study suggests that enhanced urinary protein excretion, especially of albumin, may be due, at least in part, to lower expression of key components of the apical endocytic apparatus in the renal proximal tubule. Finally, one may speculate that dysfunction of the apical endocytic pathway in the renal proximal tubule may contribute to the development of microalbuminuria in essential hypertension.

Palavras-chaves: receptor mediated endocytosis, megalin, cubilin, proximal tubule, ClC-5

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Resumo: 07.013

Efeito agudo do tratamento com alta glicose sobre a atividade do trocador Na+/H+ em células do túbulo distal.

Autores 1PESSOA, J. M. D. C.

1, DAMASCENO, R. D. S.

1, SOUZA, M. O. D.

1 Fisiologia e Biofísica - ICB-

USP

Apoio Financeiro: FAPESP, CAPES, CNPq, ICB-USP

Resumo Introdução Em rins diabéticos, a excreção de glicose e alterações na atividade do trocador Na+/H+, isoformas 1 e 3 (NHE1 e NHE3 ) do túbulo proximal, podem induzir mudanças no comportamento celular. No entanto, o efeito da glicose sobre as células do néfron distal não é bem estabelecido. Objetivos Investigar o efeito do tratamento agudo com glicose (25 mM) sobre a expressão das proteínas transportadoras de glicose e sobre os eventos celulares associados à atividade de NHE-1 e NHE-3 em células Madin-Darby Canine Kidney (MDCK), derivadas do néfron distal. Código de Experimentação Animal Isento Código de Experimentação Humana Isento Métodos A expressão de RNA mensageiro (RNAm) dos cotransportadores Na+/glicose,isoformas 1 e 2 (SGLT1 e SGLT2), foi avaliada por Polymerase Chain Reaction (PCR).A expressão protéica de GLUT2, NHE1, NHE3, Mitogen-activated protein kinase(MAPK/Erk1/2), 90 kDa ribosomal S6 kinase (p90RSK) foi avaliada por Western Blot. A taxa de recuperação do pH intracelular (dpHi/dt) foi avaliada por microscopia de fluorescência utilizando a sonda intracelular 2'-7'-bis(carboxyethyl)-5(6)-carboxyfluorescein(BCECF/AM). A atividade de NHE1 ou NHE3 foi monitorada pelo uso de inibidores específicos: NHE1 (3-methylsulphonyl-4-piperidinobenzoyl, guanidine hydrochloride-HOE694, 50µM)e NHE3(S3226,10 µM). Resultados Por PCR, não foi encontrado RNAm para SGLT1 ou SGLT2 em células MDCK. Contudo, observou-se a expressão da proteína GLUT2 nestas células. O tratamento agudo com glicose 25 mM não alterou a expressão celular total de GLUT2, mas induziu a inserção da proteína na membrana plasmática. Nossos resultados também indicam que após o pulso ácido com NH4Cl, a velocidade de extrusão celular de H+ do controle, durante 7 minutos, foi igual a [0,249 ± 0,023 unidades pH/min (n = 10)]. Glicose (25 mM) aumentou significativamente este parâmetro, o qual foi reduzido por HOE694 e S3226, sugerindo atividade de NHE-1 e NHE-3, respectivamente. A glicose (25 mM) não alterou a expressão de NHE-1, mas

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aumentou a expressão de NHE-3 na membrana plasmática. Os efeitos estimuladores de glicose sobre a velocidade de extrusão celular de H+ e sobre a expressão das frações fosforiladas de Erk1/2 e p90RSK foram reduzidos por PD98059 (inibidor da Mek).Entretanto,PD98059 não alterou o efeito estimulador da glicose sobre a expressão de NHE3, na membrana plasmática. Conclusão Estes resultados sugerem que o tratamento com glicose (25 mM) induziu a translocação de GLUT-2 para a membrana, a fim de aumentar o ganho celular de glicose. Este fato estimulou a atividade de NHE-1 via Mek/Erk1/2/p90RSK e a atividade de NHE-3 através de vias independentes de Mek/Erk1/2.

Palavras-chaves: glicose, GLUT2, Mek/ERK1/2, NHEs, p90

Resumo: 07.014

ESTUDO DO EFEITO DE ESTERÓIDES CARDIOTÔNICOS NO TRANSPORTE IÔNICO E HEMODINÂMICA RENAL

Autores 1GODINHO, A. N.

1, PINTO, F. T. R.

1, LIMA, V. D. S.

1, FONTELES, M. C.

1, NASCIMENTO, N.

R. F. D. 1, LESSA, L. M. A.

1 Instituto Superior de Ciências Biomédicas - UECE

Apoio Financeiro: Capes, CNPq, UECE

Resumo Introdução Esteróides cardiotônicos da adrenal são conhecidos por modular o metabolismo de sódio e água. Estes compostos contribuem para a excreção de sódio sob condições de sobrecarga de sal devido a sua propriedade natriurética, relacionada com a inibição da isoforma α1 da bomba Na+/K+ ATPase (NKA) renal, resultando assim na diminuição da reabsorção de sódio. Dentre este grupo de compostos, destaca-se a bufalina, um bufadienolídeo isolado inicialmente da pele de sapos, e mais recentemente identificado em mamíferos. A isoforma 3 do permutador Na+/H+ (NHE3), principal rota para reabsorção de Na+ em túbulos proximais, depende do gradiente para Na+ gerado pela ação da bomba NKA, da mesma forma que vários outros tipos de transporte acoplado presentes nesta região do nefro. Objetivos Considerando a importância dos efeitos observados em diversos estudos da ação da bufalina sobre a função tubular renal, o presente trabalho teve como objetivo investigar os efeitos da bufalina sobre a atividade do permutador NHE3 no sistema de microperfusão renal. Código de Experimentação Animal 11518128-8/67 Código de Experimentação Humana

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Métodos Para tanto, após aprovação pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal, sob número de protocolo 11518128-8/67, foi utilizado a técnica de microperfusão estacionário in vivo, onde com o auxílio de uma micropipeta dupla, um túbulo proximal foi puncionado. Um ramo foi utilizado para injetar solução de perfusão controle ou a experimental contendo bufalina, e o outro para bloquear as colunas de fluido injetadas no lúmen. Em outro segmento do mesmo túbulo era implantado um microeletrodo de dois ramos assimétricos, preenchido com resina de troca iônica sensível a H+. Esse método permite a medida da secreção de H+ em túbulos proximais, a qual representa uma medida indireta da função do permutador NHE3. Resultados Em nossos resultados preliminares, utilizando a técnica de microperfusão estacionária in vivo, foi observada uma inibição da secreção de hidrogênio no grupo experimental. Em experimentos realizados com bufalina 1µM (n=12) e grupo controle com veículo (n=10), foram obtidos os seguintes resultados, respectivamente: reabsorção de bicarbonato - J[HCO3-] -(nmol.cm-2.s´1) 1,36±0,077 x 2,11±0,16 (p < 0,01); meia vida de acidificação luminal - t1/2 (s) - 5,71±0,36 x 4,23±0,27 (p < 0,01); bicarbonato estacionário - [HCO3-] mM - 8,57±0,59 x 5,21±0,77 (p < 0,01) e - pH - 7,00±0,03 x 6,72±0,08 (p < 0,01). De acordo com nossos dados, podemos observar que, ao comparar o grupo da bufalina com o controle, houve uma tendência a inibição da acidificação tubular. Este efeito está representado pelo aumento da meia vida de acidificação, além da observação que tanto a concentração de bicarbonato como o pH estacionário, respectivamente, são significativamente maiores no grupo perfundido com a bufalina, o que demonstra ainda mais com a inibição do trocador. Conclusão Em conjunto, esses dados suportam a diminuição do fluxo de bicarbonato. Contudo, experimentos objetivando avaliar outras concentrações de bufalina, bem como a inibição específica do trocador NHE3 ainda precisam ser realizados. Além disso, nosso estudo tem como meta investigar as vias de sinalização envolvidas nos efeitos promovidos por bufalina em túbulos renais de rato, dando ênfase aos mecanismos associados à inibição da NKA renal promovida por este agente esteróide.

Palavras-chaves: bufalina, cardiotônicos, microperfusão

Resumo: 07.015

ESTUDO DO SISTEMA RENINA ANGIOTENSINA RENAL EM UM MODELO EXPERIMENTAL DE OBESIDADE

Autores 1MULLER, C. R.

2, YOKOTA, R.

2, LEITE, A. P. O.

1, NEVES, H. K.

1, LOPES, B. K.

1, FONTELES,

M. C. 1, FARAH, V.

1, FIORINO, P.

1 CCBS - UPM,

2 Departamento De Nefrologia - UNIFESP

Apoio Financeiro: Mackpesquisa

Resumo Introdução A obesidade é uma doença multifatorial e complexa conceituada como um acúmulo corporal de tecido adiposo, por um balanço energético positivo, e tem sido associada com disfunção renal. Objetivos

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O objetivo do presente trabalho foi avaliar a contribuição do sistema renina angiotensina nas alterações da função renal observadas em animais submetidos à dieta hiperlipídica desde o desmame (21 dias de idade), durante 8 semanas, no sistema de perfusão renal extracorpórea. Código de Experimentação Animal 077/03/2011 Código de Experimentação Humana Métodos Foram utilizados Ratos Wistar (6 por grupo) machos divididos em grupo dieta padrão (GDP), alimentados com ração comercial, e grupo dieta hiperlipídica (GHL), alimentados com uma dieta hiperlipídica (com adição de 30% de manteiga sem sal). Ao final da 8ª semana de protocolo experimental, a função renal foi avaliada no sistema de perfusão renal (SPR) (solução de Krebs-Henseleit e albumina bovina, 6%). Após anestesia (Pentobarbital 50mg/kg) o rim direito foi retirado cirurgicamente e acoplado ao SPR. O protocolo consistiu de um registro basal de 30 minutos e posterior infusão no SPR de Losartan (10mg/100 ml) e acompanhamento de mais 30 minutos. Os parâmetros analisados foram Resistência Vascular Renal (RVR), Fluxo Urinário (FU), Pressão de Perfusão (PP), Fluxo Plasmático Renal (FPR) e Ritmo de Filtração Glomerular (RFG). O rim contralateral foi coletado para análise da concentração de ECA tecidual através de Western Blot. Resultados Durante o período basal no SPR, o GHL apresentou alterações significativas quando comparado ao GDP, com aumento da RVR (GHL:7.2 ± 0.85 vs GDP:4.83 ± 0.49, mmHg.mL.g-1.min-1) e da PP (GHL: 130±6.7 vs GDP:111.5±2.9, mmHg). Nos primeiros 30 minutos após a injeção do Losartan o GHL apresentou redução na PP (21%), RVR (44%) e aumento do FPR (44%), sem modificações no FU e no RFG quando comparado com seu período basal. A análise por Western Blot demonstrou que os animais do GHL expressaram mais ECA renal(24%) do que os animais GDP. Conclusão Em conjunto, esses resultados sugerem que o consumo de uma dieta hiperlipídica do desmame até a fase adulta modificou a função renal podendo estar associada com o aumento da expressão da ECA intrarenal.

Palavras-chaves: Rim, Obesidade, Sistema Renina Angiotensina

Resumo: 07.016

SOBRECARGA DE SÓDIO PERINATAL ALTERA A PRESSÃO ARTERIAL E FUNÇÃO RENAL DE RATOS: ENALAPRIL PODE REVERTER

Autores 1CABRAL, E. V.

1, VIEIRA-FILHO, L. D.

1, RIBEIRO, V. S.

1, SANT'HELENA, B. R. M.

1, SILVA,

N. E. R. 1, PAIXÃO, A. D. O. D.

1 Fisiologia e Farmacologia - UFPE

Apoio Financeiro: CNPq, CAPES e FACEPE.

Resumo Introdução A sobrecarga de sódio durante o período perinatal aumenta os níveis de colágeno no rim, altera transportadores de sódio e compromete a função renal. Por outro lado, intervenções farmacológicas em períodos precoces da vida podem prevenir tais alterações. Objetivos Investigamos, em ratos Wistar, se uma sobrecarga de sódio durante o período perinatal induz na idade adulta hipertensão, alteração da função renal e dos níveis de marcadores de estresse oxidativo no rim. Adicionalmente, investigamos se um inibidor de enzima conversora, o enalapril, após o desmame, influencia alterações produzidas pela sobrecarga de sódio. Código de Experimentação Animal 23076.055063/2010-03 Código de Experimentação Humana Métodos O protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da UFPE (23076.055063/2010-03). A prole controle (C) foi obtida de mães mantidas com água potável, enquanto a prole salina (S) foi oriunda de mães mantidas com solução NaCl 0,3M, desde 20 dias antes do acasalamento até o desmame. Aos 21 dias de idade, parte da prole C e S recebeu enalapril (E, 100mg/L) por 3 semanas, enquanto outra parte foi mantida apenas com água potável. A partir de então os grupos passaram a ser denominados: C (n=5), S (n=5), CE (n=6) e SE (n=5), de acordo com o tratamento com água potável ou E. Durante o crescimento, os animais foram instalados em gaiolas metabólicas individuais para coleta de urina por 24h. Aos 210 dias de idade, foram anestesiados com pentobarbital sódico (60mg/kg, ip) para avaliação direta da pressão arterial média (PAM), através de um transdutor de pressão conectado a um amplificador ADInstruments, PowerLAb 8/35 antes (níveis basais) e durante infusão contínua de angiotensina II (ANGII, 100ng/kg/min). A filtração glomerular (FG) foi avaliada pelo clearance de creatinina. A proteinúria foi mensurada pelo método Folin fenol. Os níveis de GSH foram mensurados por método colorimétrico e o estresse oxidativo foi avaliado pela mensuração das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS). Para análise estatística utilizamos teste t para dados pareados, (ANOVA) seguida pelo Tukey ou Student-Newman-Keuls, considerando diferença estatística (p <0,05). Resultados A PAM basal apresentou-se semelhante entre os grupos. Em resposta à ANGII, o grupo S não apresentou aumento de PAM, enquanto os demais grupos apresentaram elevação deste parâmetro (C, 25 mmHg; CE, 16 mmHg e SE, 17 mmHg, p < 0,05). O grupo S apresentou FG 36% menor (p < 0,05) do que o grupo C, aos 90 e 120 dias. O tratamento com E não preveniu esta alteração, visto que o grupo SE demonstrou uma redução de 32% (p < 0,05) no mesmo período. O grupo CE apresentou, aos 60, 90 e 120 dias, FG 60%, 32% e 32 % menor, respectivamente (p < 0,05), do que o grupo C. A proteinúria apresentou-se semelhante entre os grupos. Os níveis de GSH no rim apresentaram-se semelhantes entre os grupos, enquanto os níveis de TBARS se apresentaram semelhantes apenas antre os grupos C, S e SE. O grupo CE apresentou níveis de TBARS 33% mais elevados (p < 0,05) do que o grupo C. Conclusão A sobrecarga de sódio durante o período perinatal dessensibilizou a responsividade vascular à ANGII e diminuiu a FG. O tratamento com E recuperou a responsividade à ANGII, mas não preveniu a diminuição de FG. Ademais, o tratamento com E, mesmo durante um período avançado do desenvolvimento, comprometeu a função renal do grupo controle.

Palavras-chaves: Angiotensina II, Enalapril, Função Renal, Pressão Arterial, Sobrecarga de sódio

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Resumo: 07.017

DISFUNÇÃO RENAL NA DOENÇA FALCIFORME – SÉRIE DE 26 PACIENTES DE FORTALEZA, CEARÁ, BRASIL

Autores

1MENESES, G. C.

2, JÚNIOR, G. B. S.

2, VIEIRA, A. P. F.

2, BEM, A. X. C.

2, ALVES, M. P.

1,

MARTINS, A. M. C. 3, LIBÓRIO, A. B.

2, DAHER, E. F.

1 Departamento de Análises Clínicas e

Toxicológicas - UFC, 2 Departamento de Medicina Clínica - UFC,

3 Curso de Medicina, Centro de

Ciências da Saúde - UNIFOR

Apoio Financeiro: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq

Resumo Introdução Alterações renais são uma das principais complicações crônicas na doença falciforme. Objetivos O objetivo deste estudo é investigar a ocorrência de alterações renais em pacientes com doença falciforme. Código de Experimentação Animal Código de Experimentação Humana 088.08.10 Métodos Foi realizado estudo prospectivo com 26 pacientes portadores de doença falciforme atendidos no ambulatório de Hematologia do Hospital Universitário Walter Cantídio da UFC, em Fortaleza, Ceará, cujo Comitê de Ética e Pesquisa avaliou e aprovou o protocolo do estudo sob número:088.08.10. Foi realizado o teste de concentração urinária pela razão entre a osmolaridade urinária e plasmática (U/Posm) após 12h de jejum e restrição hídrica. Foi colhida uma amostra basal (T0) e outra 4h após administração de DDAVP (desmopressina) 20mcg (T4). Valores anormais de U/Posm foram considerados quando abaixo de 2,8. O Teste de acidificação urinária foi realizado pela medida do pH urinário antes (T0) e após (T4) sobrecarga ácida com solução de cloreto de cálcio (CaCl2) a 2mEq/Kg (OSTER et al., Nephron. 14: 281–289, 1975). A acidose metabólica foi documentada pela diminuição de bicarbonato no soro > 3 mmol/L e pH 5,3 após a sobrecarga ácida. Foram ainda calculados os valores da fração de excreção de sódio (FENa), transporte de água livre de solutos (TcH2O) e gradiente transtubular de potássio (TTKG). O grupo da doença falciforme foi comparado ao grupo controle, composto de 15 voluntários sadios. A comparação do grupo caso-controle em relação às variáveis categorizadas foi realizada mediante o Teste Exato, de Fisher. Resultados A idade e o gênero dos pacientes eram similares ao do grupo controle. O déficit de acidificação urinária foi observado em 10 pacientes (38,4%). A osmolalidade foi significantemente menor nos pacientes (355±60 vs. 818±202mOsm/kg, p=0.0001,

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após administração do DDAVP e 12 h de privação hídrica), caracterizando defeitos na concentração urinária que foram encontrados em todos os pacientes (100%). A FENa foi maior entre os pacientes com doença falciforme (0.75±0.3 vs. 0.55±0.2%, p=0.02). O TTKG também foi maior nos pacientes (5.5±2.5 vs. 3.0±1.5, p=0.001), e o TcH2O foi menor (0.22±0.3 vs. 1.1±0.3L/dia, p=0.0001). Conclusão A doença falciforme é associada a importantes alterações da função renal, sobretudo alterações tubulares. As principais anormalidades encontradas foram defeitos na concentração urinária e incompleta acidificação tubular distal. Houve também um aumento no transporte de potássio e diminuição da reabsorção de água, evidenciando uma possível disfunção tubular distal.

Palavras-chaves: Anemia, Doença renal, Alterações tubulares

Resumo: 07.018

BAPTA e TAPSIGARGINA INIBEM O EFEITO BIFÁSICO DA ANGIOTENSINA-(1-7) SOBRE O TROCADOR Na+/H+ (ISOFORMA NHE3) NO TÚBULO PROXIMAL CORTICAL IN VIVO.

Autores 1CASTELO-BRANCO, R. C.

2, DELLOVA, D. C. A. L.

1, MELLO-AIRES, M.

1 FISIOLOGIA E

BIOFÍSICA - USP, 2 Medicina Veterinária - USP

Apoio Financeiro: CNPq e FAPESP

Resumo Introdução A angiotensina-(1-7) [Ang-(1-7)] é um heptapéptido membro do Sistema Renina-Angiotensina, vasodilatador e antagonista da angiotensina II (Ang II) na vasculatura. É conhecido que a Ang II regula o trocador Na+/H+ do epitélio tubular renal, com importante ação na regulação do pH e volume intra e extracelular. Entretanto, o papel da Ang-(1-7) na função renal ainda não é bem compreendido. Objetivos Determinar a ação da Ang-(1-7) sobre o trocador Na+/H+ e a concentração citosólica de cálcio ([Ca2+]i) em túbulos renais proximais, in vivo. Código de Experimentação Animal n 102 fls. 132, livro 02 Código de Experimentação Humana Métodos A ação direta de Ang-(1-7) no fluxo reabsortivo tubular de bicarbonato (JHCO3-), via Na+/H+, foi avaliada por

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microperfusão estacionária do túbulo proximal médio (S2) de rim de rato in vivo, utilizando o microeletrodo sensível ao íon H+. A (Ca2+)i foi monitorada fluorimétricamente em túbulos proximais isolados, por meio do probe sensivél a cálcio FURA-2-AM (5 mM, por 15 min). Resultados A Ang-(1-7; 10-12 e 10-9 M) perfundida na luz tubular causa diminuição significativa (P Conclusão O uso de BAPTA ou tapsigargina sugere uma correlação dos efeitos da Ang (1-7) na [Ca2+]i e no JHCO3-. Assim, a interação dos efeitos opostos dose-dependentes da ANG II e Ang-(1-7) na [Ca2+]i e no JHCO3- pode representar um importante mecanismo de regulação fisiológica do pH e volume intra e extracelular.

Palavras-chaves: ANGIOTENSINA-(1-7), NHE3, TÚBULO PROXIMAL RENAL, [Ca2+]i

Resumo: 07.019

Papel do metabolismo da glicose na atividade do trocador Na+/H+ isoforma 3 (NHE3) no túbulo proximal: geração de ATP e via glicolítica

Autores 1PESSOA, T. D.

3, CARRARO-LACROIX, L.

2, GIRARDI, A. C. C.

1, MALNIC, G.

1 Fisiologia e

Biofisica - USP, 2 Cardiologia - InCor,

3 Fisiologia - UFPR

Apoio Financeiro: FAPESP e CNPq

Resumo Introdução Em experimentos recentes realizados em nosso laboratório, observamos que NHE3 é estimulado pela perfusão de solução de glicose 5mM (GLI5) comparado à perfusão de uma solução sem glicose (CTRL), de galactose ou de seu análogo não metabolizável (α-MG). Estes dados indicam que, de alguma forma, o metabolismo da glicose está envolvido no efeito estimulatório produzido pela GLI5 sobre o permutador. Objetivos Determinar a via metabólica para o efeito estimulatório da glicose 5mM na atividade do NHE3 Código de Experimentação Animal 144/06 Código de Experimentação Humana Métodos

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Com o intuito de verificar os efeitos do metabolismo da glicose sobre NHE3, ratos Wistar, machos, pesando entre 200g e 280g foram submetidos à técnica de microperfusão estacionária “in vivo” (de acordo com projeto submetido e aprovado pelo o comitê de ética, processo número: 144/06). Através desta técnica mediu-se o fluxo de reabsorção de HCO3- (JHCO3-) frente à perfusão de uma solução CTRL ou uma solução contendo iso-Leucina (10mM), que foi utilizada como uma fonte de ATP independente da glicose. Os túbulos também foram perfundidos com solução CTRL ou GLI5 adicionada de um inibidor da hexoquinase (2-metil-D-glicose, 2-DG, 10mM) na presença ou não de iso-Leucina 10mM, a fim de identificar se o metabolismo da glicose é o responsável pelo efeito estimulatório produzido pela GLI5. Resultados A perfusão de iso-leucina não foi capaz de estimular o JHCO3-, ao contrário da perfusão de GLI5, indicando que a produção de ATP não é o mecanismo pelo qual a GLI5 promove o aumento da atividade do NHE3. A adição do inibidor da hexoquinase, 2-DG, aboliu completamente o efeito estimulatório da GLI5 e produziu um efeito inibitório adicional quando adicionada à solução CTRL ou GLU5 (JHCO3- de 1,289±0,054 nmol/cm2/s para CTRL + 2-DG vs 1,903±0,083 nmol/cm2/s para CTRL sozinho P Conclusão Nossos resultados mostram que GLI5 estimula o NHE3 através do metabolismo glicolítico. A observação de que a adição de 2-DG à solução CTRL promove um efeito inibitório que é abolido pela adição de iso-Leucina indica que, além do metabolismo glicolítico, a manutenção da concentração intracelular de ATP é necessária para a atividade normal do NHE3. Sendo assim, nossos dados mostram uma íntima relação entre a atividade do NHE3 e o metabolismo da glicose, seja pela produção de intermediários da via glicolítica seja pela formação de ATP.

Palavras-chaves: NHE3, Glicose, Glicólise, ATP, Metabolismo

Resumo: 07.020

Tratamento materno com lipopolissacarídeo em ratos induz elevação do estresse oxidativo placentário e dos níveis pressóricos na prole adulta

Autores

1BARROS, N. G.

1, FARIAS, J. S.

1, LIMA-FILHO, M. M.

1, CABRAL, E. V.

1, SANT'HELENA, B.

R. M. 1, RIBEIRO, V. S.

1, VIEIRA-FILHO, L. D.

1, PAIXÃO, A. D. O.

1 Departamento de Fisiologia

e Farmacologia - UFPE

Apoio Financeiro: CAPES, CNPQ, FACEPE

Resumo Introdução Distúrbios durante a vida intrauterina comprometem o desenvolvimento fetal e podem levar a hipertensão na idade adulta. Altos níveis de estresse oxidativo na placenta, e, por conseguinte no rim fetal, podem ser responsáveis pela programação da hipertensão. Os níveis de estresse oxidativo placentário podem ter correlação com a angiogênese neste órgão. Objetivos Neste estudo, investigamos se a inflamação materna, induzida por lipolissacarídeo (LPS), afeta o estresse oxidativo e a expressão de marcadores de angiogênese na placenta, bem como, se induz alterações nos níveis pressóricos e volume

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plasmático na prole adulta. Além disso, avaliamos o efeito do tratamento materno com α-tocoferol sobre esses parâmetros. Código de Experimentação Animal 23076.015422/2012-43 Código de Experimentação Humana Métodos O protocolo experimental aqui descrito foi aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da Universidade Federal de Pernambuco (processo nº 23076.015422/2012-43). Ratas Wistar (n=8 por grupo) foram submetidas ao tratamento com veículo ou LPS (500 mg/kg de peso corpóreo, via subcutânea) nos dias 13, 15, 17 e 19 da gestação, acompanhado ou não pelo tratamento diário com α-tocoferol (350 mg/kg de peso corpóreo, via gavagem). Parte das mães de cada grupo (n=5) foi eutanasiada no 20º dia de gestação, para avaliação do estresse oxidativo e expressão de marcadores de angiogênese na placenta. Outra parte das mães (n=3 por grupo) teve a gestação a termo e a prole (n=8 - 15) foi submetida ao acompanhamento dos níveis pressóricos e avaliação do estresse oxidativo renal e volume plasmático aos 150 dias de vida. Resultados O grupo tratado com LPS apresentou, no 20º dia de gestação, diminuição (17%, P 100%, P Conclusão Estes achados demonstram: (i) que processos inflamatórios maternos podem prejudicar o desenvolvimento fetal e induzir elevação dos níveis pressóricos da prole na idade adulta; (ii) que o estresse oxidativo pode ser um importante fator para programação dessas alterações, uma vez que o tratamento materno com α-tocoferol impediu a diminuição do peso fetal e o desenvolvimento de hipertensão na prole adulta.

Palavras-chaves: Alfa-tocoferol, Estresse oxidativo, Função renal, Pressão arterial, Programação intra-uterina

Resumo: 07.021

CLC-5, CFTR, MEGALIN AND CUBILIN EXPRESSIONS ARE DECREASED IN THE KIDNEY OF EARLY-STAGE DIABETIC RATS

Autores

1,2FIGUEIRA, M. F.

1, CASTIGLIONE, R.

1, JUDICE, M.

1, BARBOSA, C.

1, ORNELLAS, F.

2,

FELTRAN, G. 1, MORALES, M.

2, MENEZES, J. D. S.

1 Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho -

UFRJ, 2 Núcleo em Ecologia e Desenvolvimento Sócio-Ambiental de Macaé - UFRJ/Macae

Apoio Financeiro: FAPERJ, CNPq, CAPES

Resumo Introdução

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Proteinuria is one of the main characteristic of diabetic nephropathy. ClC-5, CFTR, TNR-CFTR, Megalin and Cubilin are important proteins involved in the mechanism of endocytosis of low molecular weight proteins in the kidney proximal tubule. Objetivos In the present study, we investigated the renal function, the protein excretion profile, the ClC-5, TNR-CFTR and CFTR protein expression and the ClC-5, Megalin and Cubilin mRNA expression in rats subjected to type 1 diabetes. Código de Experimentação Animal IBCCF 074 Código de Experimentação Humana Métodos This study was approved by the Ethics Committee of Animal Use in the Health Sciences Center of UFRJ (CEUA-CCS, IBCCF 074). 8 weeks-old male Wistar rats (170-210 g) were divided into control (CTRL; minimal n=4) and diabetic (DM; minimal n=4) groups. Diabetes was induced intraperitoneally by a single injection of streptozotocin (45 mg/Kg). The presence and maintenance of hyperglycemia was monitored in blood tail using a glucometer. Urine samples (24h urine) were collected 4 (CTRL, DM) weeks after diabetes induction and the rats were sacrificed. Glomerular filtration rate (GFR) and protein excretion was determined. Urine samples were dialyzed against water using dialyze bags (cut off 10000) and then lyophilized. Protein concentration was determined by Bradford assay. Proteins were submitted to standard SDS-PAGE loading equal amounts of protein per lane (30ug) using 10% SDS-polyacrylamide gel. The proteins in the gels were stained by comassie blue and analyzed by the program Image J. Then the expression of ClC-5, CFTR and TNR-CFTR in kidney of diabetic rats and controls were analyzed by Western Blot and the mRNA expression of ClC-5, Megalin and Cubilin were analyzed by RT-PCR. Statistical analysis was performed by unpaired Student’s t-test using GraphPad Prism 4.0 software. Differences were considered significant when p <0.05. Resultados DM showed higher blood glucose (mg/dL) (357±31, p Conclusão The GFR and the protein clearance were higher in DM group. Diabetic Wistar male rats showed a different pattern in the urinary proteins of low molecular weight and a lower expression of ClC-5, CFTR, TNR-CFTR Megalin and Cubilin compared to controls rats. Therefore, this reduction in the expression of these proteins may be a factor involved in the genesis of the changing in protein profile of low molecular weight observed in the urine of diabetic animals.

Palavras-chaves: Diabetic nephropathy, Proteinuria, Glomerular filtration rate, Endocytosis, proximal tubule

Resumo: 07.022

SOBRECARGA DE ALFA-TOCOFEROL DURANTE O PERÍODO PRÉ-NATAL PODE REPERCUTIR SOBRE A FUNÇÃO RENAL NA IDADE ADULTA

Autores 1RIBEIRO, V.S.

1, VIEIRA-FILHO, L. D.

1, CABRAL, E. V.

1, SANT`HELENA, B. M.

1, PAIXÃO,

A. D. O. 1, PAIXÃO, A. D. O.

1 Departamento de Fisiologia e Farmacologia - UFPE

Apoio Financeiro: CAPES, CNPq e PROCAD NF-2009.

Resumo Introdução A suplementação de alfa-tocoferol pode induzir alterações nos padrões de sinalização intracelular e afetar o número de néfrons. Objetivos Neste trabalho, investigamos se a sobrecarga materna de alfa-tocoferol, durante a prenhez, repercute sobre a pressão arterial e função renal da prole na idade adulta, bem como, através da utilização de um agente mimético da superóxido dismutase, o tempol (T), buscamos elucidar a natureza da ação do alfa-tocoferol: ação anti-oxidante versus ação genômica. Código de Experimentação Animal 23076.000346/2012-71 Código de Experimentação Humana Métodos O protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da UFPE sob n° 23076.000346/2012-71. Foram utilizados ratos machos da linhagem Wistar provenientes de mães tratadas durante a gestação com veiculo, o grupo controle (grupo CV) ou tratadas, por gavagem, com sobrecargas de alfa-tocoferol, nas doses de 0,5g/kg/dia (grupo 0,5g) ou 1g/kg/dia (grupo 1g) e alfa ou com T na dose de 0,03/kg/dia, dissolvido na água de beber (grupo CV+T) e associado ao alfa-tocoferol (grupo 0,5g+T). 8 animais de cada grupo foram sacrificados no dia do nascimento para avaliação de indicadores do estresse oxidativo no fígado, através da detecção de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e níveis de glutationa reduzida (GSH). Enquanto cerca de 16 animais em cada grupo atingiram a idade adulta para avaliação de parâmetros gerais em gaiola metabólica, incluindo clearance de creatinina e proteinúria, avaliação de indicadores de estresse oxidativo no rim e avaliação da pressão arterial sistólica (PAS), pelo método de pletismografia. As diferenças estatísticas entre os grupos foram avaliadas através de ANOVA seguida pelo Student-Newman-Keuls. Diferenças foram consideradas significantes quando P <0,05. Resultados No dia do nascimento foram observados os seguintes dados: semelhança de peso entre os grupos, 37% de redução (P < 0,05) nos níveis de TBARS hepático no grupo 0,5g e aumento de 65% (P < 0,05) nos níveis de TBARS hepático no grupo 1g, embora os níveis de GSH tenham se apresentado 224% maiores (P Conclusão A sobrecarga de alfa-tocoferol, nas duas doses utilizadas, produziu elevação da pressão arterial sistólica na prole adulta. A ação do alfa-tocoferol parece ser de natureza genômica, tendo em vista que o tempol, de natura puramente anti-oxidante, não aumentou a pressão arterial e ainda preveniu a elevação deste parâmetro no grupo tratado com alfa-tocoferol.

Palavras-chaves: Alfa-tocoferol, Função renal, Pressão arterial

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Resumo: 07.023

Mecanismos moleculares renais envolvidos no estabelecimento da hipertensão induzida pela desnutrição intrauterina em ratos

Autores

1VIEIRA-FILHO, L. D.

1, CABRAL, E. V.

1, FARIAS, J. S.

2, SILVA, P. A.

2, VIEYRA, A.

1,

PAIXÃO, A. D. O. 1 Departamento de Fisiologia e Farmacologia - UFPE,

2 Instituto de Biofísica

Carlos Chagas Filho - UFRJ

Apoio Financeiro: CAPES, CNPQ, FACEPE, FAPERJ

Resumo Introdução Desnutrição materna durante a gestação pode induzir hipertensão na prole adulta, correlacionada em parte, com elevado estresse oxidativo placentário. Na prole, alterações do transporte renal de sódio precedem a elevação da pressão arterial induzida por desnutrição intrauterina. No entanto, as vias moleculares relacionadas ainda não são claras. Objetivos Neste trabalho, avaliamos se a elevação da pressão arterial induzida pela desnutrição intrauterina é precedida por alterações na atividade da Na + -ATPase resistente à ouabaína e sua via de regulação dependente de angiotensina II (Ang II), bem como, se o tratamento materno com alfa-tocoferol durante a lactação previne essas alterações. Avaliamos ainda a expressão renal de Ang II, NADPH oxidase e a infiltração de macrófagos durante a fase estabelecida da elevação dos níveis pressóricos. Código de Experimentação Animal 23076.012671/2008-09 Código de Experimentação Humana Métodos O presente protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da UFPE (nº 23076.012671/2008-09). Os grupos experimentais foram obtidos de mães submetidas à dieta padrão (n=14) ou multicarenciada (n=14) durante a gestação, que receberam ou não tratamento com alfa-tocoferol durante a lactação (n=7 por subgrupo). Aos 30 e 60 dias de vida, a prole (n=8-16 por grupo experimental) sofreu eutanásia e coleta do tecido renal para avaliação da atividade da Na + -ATPase em membranas do túbulo proximal. Após o acompanhamento dos níveis pressóricos até os 150 dias de vida, outra parte dos animais (n=7-14) foi submetida a avaliação do volume plasmático, bem como a avaliação da expressão renal de Ang II e NADPH oxidase e a infiltração de macrófagos. Resultados A elevação (10%, P in utero apresentou maior (17%, P + -ATPase em membrana do túbulo proximal. Aos 30 dias de vida, em paralelo as alterações na atividade da Na + -ATPase, foi observado diminuição (70%, P 200%, P 2 para angiotensina II estava diminuída (40%, P phox (subunidade regulatória da NADPH oxidase) e maior (>100%, P <0,05). Conclusão

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Estes dados demonstram que: (i) alterações na via de sinalização do túbulo proximal e na modulação da produção de espécies reativas do oxigênio no rim estão envolvidas no desenvolvimento da hipertensão induzida pela desnutrição intrauterina; (ii) a preservação do equilíbrio do status oxidativo no ambiente perinatal é fundamental para manutenção da homeostase da pressão arterial.

Palavras-chaves: Angiotensina II, Estresse oxidativo renal, Hipertensão, Programação intrauterina, Transporte proximal de sódio

Resumo: 07.024

ROLE OF ESTROGEN AND PROGESTERONE IN MODULATION OF RENAL ELECTROLYTES IN FEMALE RATS

Autores 1MENEZES, A. L.

1, BARBOSA, C. M. D. L.

2, GRACELI, J. B.

1, MORALES, M. M.

1 Instituto de

Biofísica Carlos Chagas Filho - UFRJ, 2 Departamento de Morfologia - UFES

Apoio Financeiro: CAPES, CNPq, FAPERJ

Resumo Introdução Renal transporter of ions along the nephron is known to be regulated by female hormones such as estrogen and progesterone. The evidence of this influence is the retention of water and electrolytes during pregnancy. Also, during menstrual cycle the excretion of water and electrolytes by the kidneys is altered. Objetivos This work aimed to study the possible modulation of renal excretion of water, electrolytes and glucose in female rats subjected to ovariectomy and ovariectomy followed by replacement of estrogen and/or progesterone, compared to control animals. Código de Experimentação Animal IBCCF155 Código de Experimentação Humana Métodos (Animal Protocol Number IBCCF155). Adult female Wistar rats weighting 200-250 g (three months old) had their estrous cycles evaluated for at least two consecutive weeks presenting normal cycles before starting the experiments. The animals were separated in two groups, the sham-operated group was kept as the control group (CTRL) and the other group underwent bilateral ovariectomy (OVX). After 21 days recovery the OVX group were divided into four groups receiving daily subcutaneous injections of 17β-estradiol benzoate (2.0µg/kg body weight) (OVE), progesterone (1.7mg/kg body weight) (OVP), both hormones in the same doses (OVEP) or corn oil as a vehicle (OVX) such as the CTRL group. On the last day of replacement the animals were placed in metabolic cages for evaluation of renal function. One-way analysis of variance

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(ANOVA) followed by the Bonferroni multiple comparison test was used to compare the changes in electrolytes and fractional excretion (FE). Differences were assumed to be significant when P Resultados Group of rats from OVX, OVE, OVP showed increased levels of glomerular filtration rate (GFR) (0.131±0.005 ml/min; 0.145±0.015 mL/min; 0.132±0.017 mL/min, respectively; n=5) compared to CTRL group (0.028±0.001 mL/min; n=5). The replacement of both hormones (OVEP) led the GFR to normal values (0.083±0.005 mL/min;n=5), compared with the control group. The OVX group also had a decrease in the FE (%) of glucose (FEglucose), urea (FEurea), potassium (FEK+), sodium (FENa+) and chloride (FECl‾) compared to control group, without recovery of these parameters in replacement groups (FEglucose- CTRL: 1.864±0.259; OVX: 0.433±0.088; OVE: 0.146±0.096; OVP: 0.058±0.024; OVEP: 0.686±0.191) (FEurea- CTRL: 12.54±2.277; OVX: 2.743±0.649; OVE: 4.234±1.476; OVP: 4.55±0.338; OVEP: 4.458±1.268) (FEK+- CTRL: 155.8±15.54; OVX: 49.83±6.893; OVE: 49.78±15.7; OVP: 57.99±12.29; OVEP: 78.25±19.58) (FENa+- CTRL: 28.97±0.23; OVX: 4.978±0.204; OVE: 4.773±0.586; OVP: 4.82±0.432; OVEP: 5.585±0.417) (FECl‾- CTRL: 22.07±3.348; OVX: 5.062±1.944; OVE: 6.514±3.101; OVP: 3.756±1.33; OVEP: 5.788±0.611; n=5, p <0.05). Conclusão These data show the influence of estrogen and progesterone on renal function regulating the renal excretion of electrolytes. These data lead to a better understanding about the role of female hormones in the modulation of renal ion excretion possibly by its effects on epithelium transporters expression along the nephron.

Palavras-chaves: ELECTROLYTES, ESTROGEN, KIDNEY, OVARIECTOMY, PROGESTERONE

Resumo: 07.025

Sedentary aging promote changes in renal function, blood pressure and oxidative stress in rats

Autores

1NOGUEIRA, L. C.

1, FELTRAN, G. D. S.

2, OLIVEIRA, H. D.

2, CASTIGLIONE, R. C.

2,

BARBOSA, C. M. L. 2, MORALES, M. M.

1, MORAES, J. L. C.

1, FONSECA, R. N. D.

1, SILVA, J.

R. D. 1,2

, Souza-Menezes, J 1 Laboratório Integrado de Bioquímica Hatsaburo Masuda - UFRJ,

2

Laboratório de Fisiologia Celular e molecular - UFRJ

Apoio Financeiro: FAPERJ, CNPq, CAPES, FUNEMAC

Resumo Introdução New demands in geriatric healthcare appear, with aspecial focus on obesity, cancer, cardiovascular and renal disease.Therefore, understanding the aging process and the functional decline of organic systems, such as the renal system is essential. Objetivos In this work it was investigate the changes in renal solute clearance, blood pressure and renal oxidative stress in Wistar male rats subject to aging. Código de Experimentação Animal

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Macae015 Código de Experimentação Humana Métodos 7 weeks-old male Wistar rats (170-210 g) were divided in the following experimental groups: Young (Y; n=8), Adult (A; n=7) and Old (O; n=7). The rats were kept into the cages until 8 (Y), 24 (A) and 40 (O) weeks of age with free access of water and food. One day before the euthanasia the systolic, diastolic and mean blood pressure were measured. Urine samples (24h urine) were collected in all experimental groups. Food and water intake and urinary flow were measured. After urine collection, kidneys were excised where their weights were determined (with animal under deep anesthesia and sedation). Glomerular filtration rate and clearance of sodium, potassium, chloride, urea, glucose and protein were calculated. Statistical analysis was performed by One-Way ANOVA (Newman-Keuls post-test). Differences were considered significant when p Resultados The systolic, diastolic and mean blood pressure (mmHg) were higher in O group (157.3±8.9, 111.8±7.1 and 126.1±8.1, respectively) compared to Y and A groups (Y=134.3±3.2, A=139.2±.4.7, Y=90.5±4.5, A=99.9±4.7, Y=104.6±3.8; A=111.6±4.2, respectively). During the aging it was observed that the GFR (ml/min/cm²) was lower in A and O groups (1.8x10-3±1.4x10-4 and 1.5x10-3±1.7x10-4) compared to Y group (2.8x10-3±2.8x10-4). Urinary flow (ml/min) was lower in A and O (6.4x10-3±7.7x10-4 and 4.5x10-3±3.6x10-4) compared to Y group (8.4x10-3±1.2x10-3). The sodium clearance (ml/min/cm2) was lower in A and O groups (9.9x10-6±9.9x10-7 and 5.2x10-6±7.3x10-7) compared to Y group (1.8x10-5±7.3x10-6). Chloride and potassium clearance were lower only in O group (3.6x10-6±8.1x10-7 and 3.6x10-4±4.5x10-5) compared to Y and A groups (1.24x10-5±2.4x10-6, 8.8x10-4±1.4x10-4.and 9.8x10-6±1.5x10-6, 7.2x10-4±5.5x10-5). The protein and glucose clearance (ml/min/cm²) was lower in A and O groups (2.0x10-4±1.7x10-5, 2.5x10-6±2.7x10-7 and 2.1x10-4±3.5x10-5, 1.1x10-6±6.4x10-8) compared to Y group (3.4x10-4±4.4x10-5 and 3.4x10-6±6.2x10-7). It was not observed changes in urea clearance. Renal oxidative stress was analyzed by measuring the activity of SOD (Superoxide Dismutase), CAT (Catalase) and Gluthatione Reductase. In the renal cortex, CAT activity (Δ Abs/min/ugPtn) was lower in A group (3.29 ± 1) compared to O (12.4 ± 1.7) and Y (14.7 ± 2) groups. The SOD activity (% of Y group) was significantly lower in groups A and O in renal cortex (59.87± 10.04 and 47.07± 11.93) and renal medulla (49,8±6,8 e 58,3±6). Glutatione Reductase activity (% of Y group) was higher in the renal cortex of A and O groups (141,3±29,51 and 165,1±33,80) compared to group Y. It was not observed significant changes in Glutatione Reductase activity in renal medulla of A and O groups (92,2±20 and 84,18±12,22) compared to Y group. Conclusão The renal function of Wistar male rats changes significantly during the aging. Also it was observed a reduction in GFR and a rising in blood pressure. The last one can be associated with the increasing in sodium and chloride reabsorption observed in 40 weeks old Wistar rats. It was observed changes in the pattern of antioxidant enzymes activity in the process of aging.

Palavras-chaves: Aging, antioxidant enzymes, Kidney, oxidative stress, Renal function

Resumo: 07.026

PERFUSION- DECELLULARIZATION OF RENAL TISSUES AND RECELLULARIZATION WITH PORCINE PROXIMAL TUBULE CELL LINE LLC-PK1: PERSPECTIVES IN TISSUE ENGINEERING.

Autores

1MARTINS, A. B.

1, MAISSNER, F. F.

2, MENDES, B. J. D. S.

1, SILVA, J. N.

2, CARVALHO, A. C.

C. D. 1, FONSECA, R. N. D.

1, SILVA, J. R. D.

1, BARROS, C. M. D.

2, GOLDENBERG, R. C. D. S.

1, MENEZES, J. D. S.

1 Laboratório Integrado de Bioquímica Hatisaburo Masuda - UFRJ,

2

Laboratório de Cardiologia Celular e Molecular - IBCCF, 3 Laboratório Integrado de Morfologia -

UFRJ

Apoio Financeiro: FAPERJ, CNPq, INCTEM and FUNEMAC

Resumo Introdução The extracellular matrix (ECM) is produced by the resident cells of each tissue and organ and is in a state of dynamic equilibrium with its surrounding microenvironment. Tissue engineering using ECM is used to repair or reconstitute organ function. A variety of remarkably different approaches have been proposed, and these range from tissue repair to growth of entirely new organs. It has been postulated that only organ-derived intact ECMs can be carefully decellularized to retain the innate matrix constituents needed for promoting cell adhesion, migration, proliferation, differentiation, and regulation of intercellular signaling Objetivos The goal of this study was the production of a decellularized kidney scaffold with structural and mechanical properties necessary for engineering basic renal structures in vitro. Código de Experimentação Animal Macaé019 Código de Experimentação Humana Métodos All animal procedures were approved by the Institutional Animal Care and Use Committee (Centro de Ciências da Saúde UFRJ). The rats were sedated and anesthetized with 10 mg/kg xylasine and 100 mg/kg ketamine solution. Following sedation and anesthesia, 200 UI of heparin solution was intraperitoneally administrated to avoid blood clotting. After five minutes a laparotomy was performed for kidney excision. The kidneys were washed twice with PBS followed by decellularization with 1% sodium dodecyl sulfate (SDS) for 15 hours followed by perfusion for 15 minutes with phosphate buffered saline solution. The kidney extracellular matrix (ECM) was fixed in 4% paraformaldehyde (Sigma-Aldrich) at room temperature for 3 days and embedded in paraffin or stored in antibiotic-antimicotic solution (100 U/ml penicillin, 100 U/ml streptomycin and 2.5μg/mL amphotericin B, Gibco) in PBS to use as scaffolds for cell culture. The porcine proximal tubule cell line (LLC-PK1) was expanded in DMEM medium supplemented with 5% fetal bovine serum (FBS),100 U/ml penicillin, 100 U/ml streptomycin at 37°C in 5% CO2 atmosphere. The LLC-PK1 cells were plated in ECM recovered from decellularized kidney, after antibiotic-antimicotic treatment, using the medium described above. Three, seven and fourteen days after culture initiation, partially recellularized ECM were fixed in 4% paraformaldehyde (Sigma-Aldrich) and embedded in paraffin for histochemical analyses with H&E and periodic acid-Schiff (PAS). Resultados After 15h of decellularization process, the kidneys became translucid. Qualitative analysis of decellularized tissues with 1% SDS at room temperature revealed well-preserved architecture and demonstrated the absence of cell nuclei, confirming removal of intact cells. The detergent-based perfusion protocol successfully produced acellular kidneys that retained the web-like basement membrane. HE and Picrosirius staining confirmed the removal of cellular material. After LLC-PK1 recellularization procedure cell adhesion on renal ECM was observed. PAS staining showed cell adhesion to the decellularized kidney ECM.

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Conclusão These findings demonstrate that decellularized kidney sections retain critical structural properties necessary to use as a three-dimensional scaffold and promote cellular recellularization. This study provides the initial steps in developing strategies for renal tissue engineering and repair

Palavras-chaves: Extracellular Matrix, Bioengineering, Cellular Therapy, Kidney

Resumo: 07.027

Avaliação da função tubular em pacientes com Leishmaniose Visceral antes do tratamento específico com Antimônio Pentavalente

Autores

1COSTA, M. F. B.

2, OLIVEIRA, M. J. C.

1, MENESES, G. C.

2, ALVES, M. P.

2, SAMPAIO, A. M.

2, MONTENEGRO, B. R. L.

2, JÚNIOR, G. B. S.

2, DAHER, E. F.

1, MARTINS, A. M. C.

1

Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas - UFC, 2 Faculdade de Medicina - UFC

Apoio Financeiro: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq

Resumo Introdução O envolvimento renal tem sido descrito na leishmaniose visceral (Calazar). A principal anomalia é a disfunção tubular, e a fisiopatologia exata ainda é incerta. Objetivos O objetivo deste estudo é investigar a função tubular em pacientes com leishmaniose visceral. Código de Experimentação Animal Código de Experimentação Humana Métodos Um estudo prospectivo foi realizado com 13 pacientes com diagnóstico confirmado de leishmaniose visceral (LV). Testes de acidificação e concentração urinária foram realizadas usando cloreto de cálcio (CaCl2), depois de um período de 12 horas de privação de comida e água. Foi calculado a fração de excreção de sódio (FENa), gradiente transtubular de potássio (TTKG) e transporte de água livre de solutos (TcH2O). O grupo com leishmaniose visceral foi comparado com um grupo de 15 voluntários saudáveis (grupo de controle). Resultados A idade média dos pacientes foi de 40,8 ± 19 anos, e 92% eram do sexo masculino. Pacientes e controles apresentaram

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níveis semelhantes de creatinina (0,9 ± 0,1 vs 0,8 ± 0,1 mg, p = 0,99). Os níveis de microalbuminúria foi maior entre os pacientes com leishmaniose visceral (17,3 ± 6,5 vs 25,7 ± 6mg/24h, p = 0,0001), enquanto que a taxa de filtração glomerular foi menor (80,8 ± 24,8 vs 102 ± 17mL/min/1, 73m2, p = 0,01). Déficit de acidificação urinária foi encontrado em sete pacientes (53,8%), que apresentaram pH urinário > 5,5 após administração de CaCl2. A Osmolalidade urinária foi menor entre os pacientes (483 ± 91 vs 818 ± 202mOsm/kg, p = 0,0001), após 12h de privação de água. Déficit de concentração urinária foi encontrado em 10 pacientes (76,9%), que apresentaram relação osmolalidade urinária / osmolalidade plasmática (U/Posm) < 2,8 após a privação de água. Fração de excreção de sódio foi maior entre os pacientes (0,1 ± 0,05 vs 0,04 ± 0,02%, p = 0,0002). TTKG foi semelhante em ambos os grupos (4,98 ± 4,3 vs 2,7 ± 1,5, p = 0,06), bem como CH2O (-0,89 ± 0,56 vs -1,1 ± 0,3, p = 0,21). Conclusão A leishmaniose visceral está associada a anormalidades tubulares importantes. Déficits Concentração e acidificação urinária foram encontrados em uma porcentagem significativa de pacientes ( > 50%). A avaliação da função renal deve ser cuidadosamente realizada em todos os pacientes com esta doença para detectar precocemente essas anormalidades e instituído um tratamento adequado.

Palavras-chaves: Leishmaniose Visceral, Antimônio Pentavalente, Função Tubular

Resumo: 07.028

ALBUMIN ROLE ON RENAL SODIUM EXCRETION

Autores

1LOPES, J. V.

1, PERUCHETTI, D. B.

1, Landgraf, S.S.

2,1, TAKIYA, C. M.

2, ZAPATA-SUDO, G.

1,3, CARUSO-NEVES

1 Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho - UFRJ,

2 Instituto de Ciências

Biológicas - UFRJ, 3 Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia em Biologia Estrutural e Bioimagem -

UFRJ

Apoio Financeiro: FAPERJ, CAPES and CNPq

Resumo Introdução The kidney has an important role on sodium homeostasis and the proximal tubule (PT) is responsible for the reabsorption of 70% of total sodium filtrated by the glomerulus. The (Na+K+)-ATPase plays a key role on sodium reabsorption by creating an electrochemical gradient. Therefore, modulations on this enzyme may lead to alterations on sodium reabsorption and consequently on renal sodium excretion. Recent studies demonstrate that albumin overload on PT leads to the progression of renal disease with alterations on sodium reabsorption. Moreover, our group showed that physiological albumin concentration (0.01 mg/mL) stimulates the (Na+K+)-ATPase activity and expression in LLC-PK1 cells (pig kidney proximal tubule cells) and that phatophysiological concentration (20 mg/mL) inhibited it. (D. Peruchetti. 286(52):45041-7, 2011). However, there is no report in the literature about in vivo modulation of (Na+K+)-ATPase by albumin and therefore, renal sodium excretion. Objetivos Evaluate the role of albumin on renal sodium excretion. Código de Experimentação Animal

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IBCCF186-05/16 Código de Experimentação Humana Métodos 14 weeks male Wistar rats were used and separated into two experimental groups: Control which received intraperitonial 0.9% saline injections (n=17) and Albumin overload group (AOG), which received intraperitonial 10g/kg/day bovine serum albumin (BSA) injections (n=20), for 7 days. During treatment animals were allocated into metabolic cages. By the end of treatment animals were euthanized and their kidneys removed. One was designated for cortex and medulla tissue preparations and the other to histological assays. Resultados Corporal weight did not change with treatment. The kidney:body weight ratio increased 30% on AOG when compared to the control group. Proteinuria on AOG was 30-fold higher than the control, confirming our experimental model of protein overload. Histological parameters were found increased in albumin-challenged rats when compared to the control group: 1) interstitial collagen deposition (1.52 ± 0.22 vs 3.28 ± 0.69); 2) interstitial macrophage infiltrate (8.12 ± 0.32 vs 50.91 ± 7.46); 3) glomerular area (0.49 ± 0.03 vs 0.64 ± 0.05); 4) tubulointerstitial space (0.25 ± 0.02 vs 0.35 ± 0.03). The expression of nephrin and podocin was lower in AOG rats than in control, respectively (0.74 ± 0.14 vs 0.55 ± 0.16; 1.67 ± 0.22 vs 1.03 ± 0.14). The ratio between angiotensin II receptors expression AT1 and AT2 decreased 3 times in albumin treated rats. Sodium intake was lower on day 7 in animals treated with BSA (15% of control) but water intake and urinary volume were not altered. No changes in creatinine levels were observed between groups. Sodium clearance and FENa+ was increased on day 7 on AOG (39% and 49% of control, respectively). (Na+K+)-ATPase activity decreased 75% of control on renal córtex and 38.8% on renal medulla. Accordingly, immunoblotting (0.88 ± 0.066 vs 0.57 ± 0.02) and immunofluorescence assays revealed a reduction in the (Na+K+)-ATPase expression. This result seems to be specific and not caused by albumin injury, because the expression of AQP1 did not differ. Conclusão Our results show that albumin overload contributes to kidney injury and that there is a possible correlation among albuminuria, (Na+K+)-ATPase inhibition and increase in FENa+.

Palavras-chaves: albumin, caruso-neves, kidney, sodium potassium atpase, sodium excretion

Resumo: 07.029

Estudo das alterações renais em modelo experimental de cirrose por ligadura de ducto biliar.

Autores 1SOUZA, A. P. S. D.

1, NECTOUX, P.

1, SCHREINER, L. A.

1, SILVEIRA, K.

1, PORAWSKI, M.

1

Fisiologia - UFCSPA

Apoio Financeiro: FIPE-HCPA, FAPERGS

Resumo

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Introdução A Síndrome Hepatorrenal (SHR) é uma insuficiência renal funcional que freqüentemente se desenvolve em pacientes com cirrose avançada e disfunção grave na função circulatória sistêmica. Tradicionalmente considera-se conseqüência de uma progressão da vasodilatação arterial esplâncnica que ocorre nestes pacientes. Objetivos Avaliar o dano oxidativo no tecido renal de animais cirróticos por ligadura de ducto biliar (LDB), assim como a atividade das enzimas antioxidantes e a presença de alterações estruturais no parênquima renal. Código de Experimentação Animal 076/12. Código de Experimentação Humana Métodos O projeto de pesquisa foi aprovado pelo comitê de ética institucional sob o número: 076/12. Os animais foram divididos em dois grupos (CO=6) e (LDB=6). A cirrose biliar secundária foi induzida em ratos machos Wistar pesando entre 200 e 300g através de uma dupla ligadura seguida de secção do ducto biliar comum (LDB), os animais controle foram submetidos ao procedimento cirúrgico, porém sem a ligadura e secção do duto biliar (sham operated). Os animais foram sacrificados após 28 dias de obstrução, tempo suficiente para o desenvolvimento completo de colestase e fibrose hepática (J. Hepatol., 27, 1997). Os dois rins foram retirados, sendo um deles fixado em formol tamponado a 10% para avaliação histológica (técnica de HE) e o outro rim foi congelado e armazenado para as análises bioquímicas de estresse oxidativo. Os dados quantitativos foram descritos por média e erro padrão da média. Para a comparação dos grupos foi utilizado o teste de t de Student com nível de significância de 5% (p <0,05). Resultados Nos animais com cirrose biliar secundária não foi observado alterações estruturais no parênquima renal, porém houve um aumento significativo no dano oxidativo medido pelo TBARS (substâncias que reagem ao ácido tiobarbitúrico) (CO=17,877±2,016; LDB=41,022±3,638) e um aumento significativo na atividade das enzimas antioxidantes catalase (CO=1,888±0,132; LDB=6,349 ±1,144) e glutationa peroxidase (CO=207,63±23,351; LDB=313,42 ±28,042). Conclusão Esses dados sugerem que no modelo experimental de cirrose por ligadura de ducto biliar, embora não haja mudanças estruturais no tecido renal, ocorre mudanças funcionais que envolvem alterações no equilíbrio redox com aumento significativo na atividade as enzimas antioxidantes, sugerindo uma proteção ao dano oxidativo renal.

Palavras-chaves: alterações renais, modelo experimental, cirrose

Resumo: 07.030

UROGUANYLIN INHIBITS THE (Na++K+)ATPase ACTIVITY IN LLC-PK1 PROXIMAL TUBULE CELLS.

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Autores

1,2ARNAUD-BATISTA, F. J.

1, CORDEIRO-PEREIRA, V.

1, FREITAS-OLIVEIRA, C.

2,1,

FONTELES, M. C. 3, MALNIC, G.

1, CARUSO-NEVES, C.

1 IBCCF - UFRJ,

2 ISCB - UECE,

3 ICB -

USP

Apoio Financeiro: FAPERJ, FUNCAP, CAPES, CNPq

Resumo Introdução Uroguanylin (UGN) is a small guanylyl cyclase-activating natriuretic peptide produced in the kidney in response to hypernatremia with autocrine/paracrine functions including modulation of renal sodium excretion. Usually, the effects of this peptide on renal sodium balance are associated to changes in proximal tubule (PT) sodium reabsorption. However, the mechanisms involved in this process are not completely known. Objetivos In the present work, we tested the possibility that the modulation of the (Na + +K + )ATPase by UGN could mediate the effect of this peptide on the PT sodium reabsorption. Código de Experimentação Animal Código de Experimentação Humana Métodos LLC-PK1 cells, a porcine proximal tubule cell line, were maintained in DMEM supplemented with 10% fetal bovine serum at 5% CO 2 /37 o C, for 48 or 72 h. After confluence, cells were washed and deprived from serum overnight (starvation). During starvation, cells received or not treatment with UGN (10 -12 to 10 -6 M). The (Na + +K + )ATPase activity was measured as described previously (J. Biol. Chem. 256:3718-3727, 1981). Immunoblotting assay was used to determine enzyme expression. Resultados UGN inhibited enzyme activity in a dose-dependent manner with effect of 51.89±3.4% inhibition at 10 -8 M (n=3). This effect was reversed by 10 -6 M KT5823, a selective inhibitor of PKG (n=2), but not by 10 -6 M U0126, a potent specific inhibitor of ERK1/2 (n=3). Moreover, UGN effects on the sodium pump was mimicked by 10 -6 M cGMP (n=3). Furthermore, it was observed that 10 -8 M UGN decreased in 37.97±5.28% (n=3) the expression of (Na + +K + )ATPase α1 subunit. In addition, 10 -6 M cGMP or 10 -8 M UGN inhibited (32.0±3.8%; 45.87±5.5%, respectively) PKB expression. Conclusão The present study indicate that UGN inhibits the proximal tubule (Na + +K + )ATPase activity and expression and this effect involves cGMP.

Palavras-chaves: cGMP, Uroguanylin, Proximal tubule cells, Renal sodium excretion, (Na++K

+)ATPase

Resumo: 07.031

Malaria-surviving mice are less susceptible to a secondary kidney insult

Autores 1ABREU, T. P. D.

1, LANDGRAF, S.

1, SILVA, L. D. S.

1, MAEDA, T.

1, SOUZA, M.

1, ACACIA, A.

1, CARUSO, C.

1 Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho - UFRJ

Apoio Financeiro:

Resumo Introdução Malaria is a disease that currently affects 500 million people worldwide each year leading to approximately 1 million deaths. The disease is transmitted by the bite of Anopheles mosquito in the vertebrate host where the parasite initially develops in the liver and then in red blood cells. < i > Plasmodium falciparum < i > is the species responsible for the most severe form of the disease leading to the development of different complications, especially in children in Africa. Beyond the development of cerebral malaria, the impairment of renal function is a mortality indicator in these patients infected with malaria. Moreover, the treatment with antimalarial drugs is able to increase the survival, however it is not known the correlation between the survival and renal disease and mainly the long-term effects of malaria on renal disease even after the antimalarial drugs treatment Objetivos The aim of this study was to evaluate the effect of antimalarial drugs treatment on renal function of murine model of severe malaria and then to evaluate the consequence of infection in the kidney propensity to become more or less susceptible to a second renal insult. Código de Experimentação Animal IBCCF098 Código de Experimentação Humana Métodos C57BL/6 mice (6-8weeks) were infected with 106 parasitized red blood cells (pRBC) with Plasmodium berghei ANKA. Parasitemia was monitored daily and described as the number of parasitized red blood cells (pRBC) in 100 erythrocytes. On the day 5 and 21 after infection, the animals were euthanized and the kidney removed for histological analysis. In a second moment mice were infected with Plasmodium berghei ANKA and after treatment with antimalarials, underwent a second insult using the model of renal damage induced by protein overload. (Eddy,A;1989) Resultados Initially, the parasitemia achieved 20% at day 5 post infection and was zeroed after treatment with artesunate 25 mg/kg and mefloquine 40 mg/kg. Moreover, treatment with the drug decreased in 43% the levels of plasma creatinine and partially reversed the decline of glomerular filtration rate (GFR) induced by infection. The ratio proteinuria:urinary creatinine (UP:Cr), collagen deposition and interstitial space size decreased 75%, 40% and 20% respectively after treatment with antimalarial when compared to untreated infected animals. Infected animals, treated and underwent a second renal insult decreased 60% the levels of plasma creatinine and showed an increase in GFR when compared to infected animals only treated with antimalarial. Histological data such as number of glomerular cells, collagen deposition and size of the interstitial space showed a drop of 20%, 39.4% and 41.3% in the infected group underwent a second renal insult compared to the group infected and treated. Conclusão

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These functional and structural data together show that renal injury observed in murine model of severe malaria is partially reversed after antimalarial drugs treatment leading the kidney less susceptible to a second renal insult.

Palavras-chaves: Malaria, renal, creatinine, proteinuria, colagen

Resumo: 07.032

Papel protetor das CTAds em modelo animal de nefrite túbulo-intersticial induzido por adenina

Autores 1DONIZETTI-OLIVEIRA, C.

1, ALMEIDA, D. C.

2, AGUIAR, C. F.

1, SILVA-FILHO, A. P.

2,1,

CÂMARA, N. O. S. 1 Medicina - UNIFESP,

2 Imunologia - USP

Apoio Financeiro: Fapesp

Resumo Introdução Células-tronco são uma promissora terapia celular para doenças renais. Entre estas células as derivadas do tecido-adiposo (CTAd) tornam-se possíveis alvos terapêuticos uma vez que são facilmente isoladas e têm propriedades semelhantes com as células-tronco oriundas da medula óssea, com propriedades regenerativas, principalmente por ações parácrinas. As nefrites túbulos-intersticiais (NTI) podem ser definidas possuindo um envolvimento inflamatório no interstício renal acometendo os túbulos, com edema intersticial e lesão tubular aguda, e, caso persista o agente agressor, com formação de fibrose intersticial e atrofia tubular. Estudos em animais mostram que a ingestão de adenina a longo prazo mimetiza os danos decorrentes da NTI. Objetivos Pretendemos neste estudo avaliar o papel protetor das CTAds em modelo animal de nefrite túbulo-intersticial induzido por adenina. Código de Experimentação Animal 0058/10 Código de Experimentação Humana Métodos Os animais foram divididos em três grupos experimentais, sendo dois grupos alimentados com ração contendo 0,25% de adenina durante 10 dias: grupo sham (n=5), que não recebeu a ração; grupo adenina (ADN)(n=6), que recebeu somente a ração; e grupo adenina + CTAd (ADN + CTAd)(n=6), que além da ração recebeu administração de CTAd. Após os 10 dias, os animais foram sacrificados e coletamos fragmentos renais e sangue para as análises. Resultados

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O grupo de animais tratados com CTAd apresentou melhor função renal quando comparada com o grupo não tratado, tendo níveis menores de creatinina (0,95±0,14 vs 1,15±0,19) e uréia (137,3±42,2 vs 170,5±38,3). Por citometria de fluxo pudemos observar um menor infiltrado de células inflamatórias nos animais tratados com CTAd (37,53±1,52 vs 27,43±3,8). Seguindo-se a esta menor inflamação verificamos também uma diminuição de fibrose renal nestes animais, através de análise pela coloração de PicroSirius e por análise de imunohistoquimica. Conclusão Concluímos então que o tratamento com CTAd em modelo de NTI, pode, além de promover uma melhora funcional, também prevenir quanto a formação de fibrose túbulo-intersticial.

Palavras-chaves: células-tronco, nefrite tubulo-intersticial, adenina

Resumo: 07.033

Ações endógenas do peptídeo-1 semelhante ao glucagon (GLP-1)sobre os níveis pressóricos de ratos espontaneamente hipertensos.

Autores 1ARAGÃO, G. C.

1, GIRARDI, A. C. C.

1 Ciências Médicas - InCor– HCFMUSP

Apoio Financeiro: FAPESP

Resumo Introdução Introdução: O peptídeo-1 semelhante ao glucagon (GLP-1) exerce uma série de ações insulinotrópicas que contribuem para a manutenção da glicemia, constituindo, portanto, um potencial alvo terapêutico para o tratamento do diabetes melito tipo II (DM2). Notadamente, ensaios clínicos recentes evidenciaram que a administração de agonistas do receptor de GLP-1 (GLP-1R) é capaz de causar reduções significativas nos níveis de pressão arterial em pacientes hipertensos diabéticos e não-diabéticos. Entrentanto, nada se sabe ainda sobre o papel do GLP-1 endógeno na modulação da pressão arterial. Objetivos Objetivos: Testar a hipótese que o receptor GLP-1R modula os níveis pressóricos e a homeostase hidrossalina em ratos espontaneamente hipertensos (SHR). Código de Experimentação Animal 3055/07/130 Código de Experimentação Humana Métodos Métodos: Animais SHR com 5 semanas de vida foram divididos em três grupos e tratados por via subcutânea, durante quatro semanas com: (1) 5 µg/kg/dia do agonista do receptor GLP-1R, exendin-4, Ex-4; (2) 50 µg/kg/dia do antagonista do

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receptor GLP-1, exendin-9, Ex-9: (3) salina, CTRL. Antes do início do tratamento e, a seguir, quinzenalmente, a pressão arterial dos ratos foi aferida por pletismografia caudal. Na 4º semana de tratamento, os ratos foram alojados em gaiolas metabólicas para a avaliação da função renal. A análise estatística foi realizada por análise de variância (ANOVA), seguida pelo teste de Bonferroni. Resultados Resultados: Duas semanas após início do tratamento, SHR tratados com Ex-4 apresentaram níveis pressóricos inferiores aos CTRL (137±6 vs. 155±6; P < 0,05), enquanto os níveis pressóricos do grupo tratado com Ex-9 foram significativamente superior ao CTRL (167±9 vs.155±6, P < 0,05) e ao Ex-4 (167±9 vs. 137±6; P < 0,001). Este padrão foi mantido ao final da quarta semana de tratamento, ou seja, o grupo Ex-9 continuou a apresentar níveis pressóricos superiores ao CTRL (182±4 vs. 172±1 mmHg) e o grupo Ex-4 valores pressóricos inferiores ao CTRL (161±4 vs. 172±1 mmHg). O fluxo urinário e a carga excretada de sódio não diferenciaram significativamente entre os grupos após quatro semanas de tratamento, entretanto, o ritmo de filtração glomerular foi maior no grupo tratado com Ex-4 (5,24 ± 0,81 vs. 4,81 ± 0,79 mL/min/kg) e menor no grupo tratado com Ex-9 (4,30 ± 0,43 vs. 4,81 ± 0,79 mL/min/kg) em comparação ao grupo controle. Conclusão Conclusão: Em conjunto, os dados obtidos sugerem que o GLP-1 endógeno modula a pressão arterial em SHR, ao menos em parte, por meio de ações sobre a hemodinâmica renal. Em estudos futuros investigaremos os mecanismos moleculares que medeiam as ações renais e anti-hipertensivas deste hormônio incretina.

Palavras-chaves: peptídeo-1 semelhante ao glucagon, função renal, hipertensão, SHR

Resumo: 07.034

FUNÇÃO E MORFOLOGIA RENAL NA HIPERLEPTINEMIA EXPERIMENTAL: INTERAÇÃO COM O SISTEMA RENINA-ANGIOTENSINA II

Autores 1THIEME, K.

1, Oliveira-Souza, M

1 Departamento de Fisiologia e Biofísica - ICB-USP

Apoio Financeiro: Fapesp e CNPq

Resumo Introdução Diversos estudos tem demonstrado a participação da leptina no processo de hipertensão arterial associada à obesidade. A leptina exerce seus efeitos no rim de maneira direta e indireta. Objetivos O objetivo deste estudo é avaliar os efeitos do tratamento com leptina por 28 dias sobre a pressão arterial, a função renal, a morfologia renal e a a ativação do Sistema Renina-Angiotensina II (SRA) intrarenal. Esses parâmetros foram avaliados também em animais tratados com Losartan, para que avaliação da participação do SRA. Código de Experimentação Animal 150/09

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Código de Experimentação Humana Não se aplica Métodos Ratos machos Wistar (n=24), com idade de 60 dias foram submetidos à implantação de mini-bombas osmóticas (Alzet, 2ML4) para liberação de leptina (0.25 mg/kg/dia) por 28 dias. O grupo controle foi submetido à cirurgia fictícia e o grupo Losartan receberam a droga por injeção subcutânea diária (10 mg/kg/dia). A pressão arterial (PA) foi avaliada através de pletismografia de cauda, semanalmente, antes e durante os 28 dias de tratamento. Para avaliação da função renal, os animais foram submetidos ao clearance, através da canulação da artéria carótida para coleta de amostras de sangue, da veia jugular para infusão de inulina e para-aminohipurato de sódio (PAH) e da bexiga para coleta de urina. O ritmo de filtração glomerular (RFG, em ml/min/kg) e o fluxo plasmático renal (FPR, em ml/min/kg) foram avaliados por análises das concentrações plasmáticas e urinárias de inulina e PAH, respectivamente. As concentrações plasmáticas e urinárias de Na+ e K+ foram avaliadas por fotometria de chama. A área glomerular foi calculada medindo-se a área de 50 glomérulos de 5 animais de cada grupo. A ativação do SRA intrarenal será avaliada por real-time PCR. Resultados O tratamento por 28 dias com leptina induziu um aumento significante e progressivo na pressão arterial, durante os 28 dias de tratamento (delta da PA em mmHg: sham: -2,13 ± 0,56; Losartan: -1,17 ± 0,82; leptina: +23,46 ± 0,99*; leptina + Losartan: -0,92 ± 0,67#. *p Conclusão O tratamento com leptina deslocou a pressão arterial progressivamente e induziu hipertensão nos animais tratados por 28 dias. O tratamento com leptina alterou a função renal, levando a uma queda no FPR e aumento da fração de filtração; além disso, o tratamento com leptina induziu hipertrofia glomerular. Estes efeitos foram parcialmente revertidos nos animais tratados com leptina + Losartan, indicando uma interação entre a leptina e o SRA.

Palavras-chaves: Leptina, Sistema Renina-Angiotensina II, Função Renal, Morfologia Renal