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Free Testosterone

Coat-A-Count® Free Testosterone

2 Coat-A-Count Free Testosterone (PITKTF-11, 2010-10-21)

English

Intended Use: Coat-A-Count Free Testosterone is a solid-phase 125I radioimmunoassay designed for the quantitative measurement of free testosterone in serum. It is intended strictly for in vitro diagnostic use as an aid in the clinical diagnosis and management of hirsutism due to hyperandrogenism. Catalog numbers: TKTF1 (100 tubes), TKTF2 (200 tubes)

The 100-tube kit contains less than 4 microcuries (148 kilobecquerels) of

radioactive 125I-labeled testosterone analog; the 200-tube kit contains less than 8 microcuries (296 kilobecquerels).

Summary and Explanation of the Test Testosterone circulates almost entirely bound to transport proteins: normally less than one percent is free. The principal transport protein for testosterone is known as sex hormone binding globulin (SHBG) or testosterone-estradiol binding globulin (TeBG), since it binds not only to testosterone but also to estradiol (and dihydrotestosterone). Albumin and cortisol binding globulin (CBG) are the other testosterone transport proteins. For three reasons, SHBG is the most important of these transport proteins. It carries, at least in females, a higher percentage of the testosterone in circulation than either albumin or CBG. Furthermore, it binds to testosterone with a much higher affinity than do the other two transport proteins. (The testosterone bound to albumin and CBG is collectively known as "weakly bound" testosterone.) Finally, SHBG has a responsiveness, not associated with albumin, insofar as the SHBG level is sensitive to changes in the ratio of circulating estrogens to circulating androgens. SHBG thus plays a greater role in determining the level of free testosterone in circulation. In pregnancy, SHBG levels show a progressive increase that mirrors the rise

in estradiol levels. Although the total testosterone level also shows some increase during pregnancy, the rise in estradiol, and hence also in SHBG, is more dramatic. The net result is a decrease in free testosterone as a percent of total testosterone. Women taking oral contraceptives likewise have increased SHBG levels, at least if they are taking high dose ethinyl estradiol preparations. Conversely, the administration of androgens to prepubertal boys, or the elevation of endogenous testosterone by HCG stimulation, induces a significant decrease in the SHBG level. Obesity is also associated with a decrease in the SHBG level. Other things being equal, we expect the concentration of free testosterone in circulation to increase if the testosterone level (T) increases or if the SHBG level decreases. The T/SHBG ratio, i.e. the ratio of total testosterone to (the concentration or binding capacity of) SHBG, thus serves as a rough guide to the concentration of free testosterone in circulation. The T/SHBG ratio is sometimes referred to as the Testosterone Free Index (TFI). The Testosterone Free Index is often increased in severe acne, male androgenic alopecia (balding), hirsutism and other conditions. A low SHBG level, often in combination with a normal total testosterone level, is a common finding in these conditions. An increase in the testosterone production rate typically induces a decrease in the SHBG level. This stimulates cellular uptake and metabolism of testosterone, by making more available in the free form. The result is that the total testosterone level is often normal, because the increased production rate is offset by an increased rate of clearance. Total testosterone measurements have traditionally been used to help screen for hirsutism. In view of the mechanism just described, it is natural to expect free testosterone levels, measured directly or indexed by the T/SHBG ratio, to correlate better with hirsutism. Some investigators, notably Paulson, have found free testosterone to be overwhelmingly superior to total testosterone in screening

Coat-A-Count Free Testosterone (PITKTF-11, 2010-10-21) 3

for hirsutism. In his study of 32 hirsute women, only 44 percent had elevated total testosterone levels, while all 32 had elevated free testosterone levels. Not all investigators have achieved this degree of success. On balance, however, judging from the studies reviewed by Wu, it appears that free testosterone is at least marginally superior to total testosterone in this context. (The varied outcomes could possibly be due to differences in methodology and differences in the selection of patients.)

Principle of the Procedure In Coat-A-Count Free Testosterone procedure, 125I-labeled testosterone analog competes for a fixed time with free testosterone in the patient sample for sites on testosterone-specific antibody immobilized to the wall of a polypropylene tube. The tube is then decanted, to isolate the antibody-bound fraction, and counted in a gamma counter, the counts being inversely related to the concentration of free testosterone in the sample. The assay is designed to leave essentially unchanged the original equilibrium between free and protein-bound testosterone in the patient sample. It employs a tracer which does not bind to steroid hormone transport proteins, and an antiserum with an affinity for testosterone slightly less than that of the principal transport protein, sex hormone-binding globulin (SHBG). Moreover, it operates under physiological conditions of temperature, pH and ionic strength. The Coat-A-Count Free Testosterone procedure is a direct or single-tube assay: its results are not calculated as a function of total testosterone and SHBG or some other parameter, but interpolated from a standard curve calibrated in free testosterone concentrations. In this respect it differs from conventional equilibrium dialysis methods and from so-called testosterone free index (TFI) determinations. It is also a single-stage assay, requiring neither a pre-incubation step nor preliminary isolation of the free fraction by dialysis, filtration or column chromatography. In addition, it has the following noteworthy features: Total Incubation Time: 4 hours.

Total counts at iodination: approximately 60,000 cpm Reagents to Pipet: 1

Warnings and Precautions For in vitro diagnostic use. Reagents: Store at 2–8°C in a refrigerator designated for incoming radioactive materials. Dispose of in accordance with applicable laws. Do not use reagents beyond their expiration dates. Some components supplied in this kit may contain human source material and/or other potentially hazardous ingredients which necessitate certain precautions. Follow universal precautions, and handle all components as if capable of transmitting infectious agents. Source materials derived from human blood were tested and found nonreactive for syphilis; for antibodies to HIV 1 and 2; for hepatitis B surface antigen; and for antibodies to hepatitis C. Sodium azide, at concentrations less than 0.1 g/dL, has been added as a preservative. On disposal, flush with large volumes of water to prevent the buildup of potentially explosive metal azides in lead and copper plumbing. Water: Use distilled or deionized water.

Radioactivity A copy of any radioisotope license certificate (Specific or General) issued to a US customer must be on file with Siemens Healthcare Diagnostics before kits or components containing radioactive material can be shipped. These radioactive materials may be acquired by any customer with the appropriate Specific license. Under a General license these radioactive materials may be acquired only by physicians, veterinarians in the practice of veterinary medicine, clinical laboratories and hospitals—and strictly for in vitro clinical or laboratory tests not involving external or internal administration of the radioactive material or its radiation to human beings or other animals. Its acquisition, receipt, storage, use, transfer and disposal are all subject to the regulations and a (General or Specific) license of the U.S. Nuclear Regulatory Commission or a State with


which the NRC has entered into an agreement for the exercise of regulatory control. Handle radioactive materials according to the requirements of your General or Specific license. To minimize exposure to radiation, the user should adhere to guidelines set forth in the National Bureau of Standards publication on the Safe Handling of Radioactive Materials (Handbook No. 92, issued March 9, 1964) and in subsequent publications issued by State and Federal authorities. Wipe up spills promptly and decontaminate affected surfaces. Avoid generation of aerosols. Dispose of solid radioactive waste according to license requirements. General licensees (holders of NRC Form 483) may dispose of solid radioactive waste as nonradioactive waste, after removing labeling. Specific licensees (NRC Form 313) should refer to Title 10, Code of Federal Regulations, Part 20. Licensees in Agreement States should refer to the appropriate regulations of their own state. General licensees may dispose of liquid radioactive waste of the type contained in this product through a laboratory sink drain. Licensees must remove or deface labels from empty containers of radioactive materials before disposal of solid waste. Specific licensees may dispose of small quantities of liquid radioactive waste of the type used in this product through a laboratory sink drain. Refer to the appropriate regulations applicable to your laboratory.

Materials Supplied: Initial Preparation The materials supplied in this kit are not interchangeable with those in the Coat-A-Count Total Testosterone kit, which is designed for measuring total testosterone.

Free Testosterone Ab-Coated Tubes (TTF1) Polypropylene tubes coated with rabbit antibodies to free testosterone and packaged in zip-lock bags. Store refrigerated and protected from moisture, carefully resealing the bags after opening. Stable at 2–8°C until the expiration date marked on the bag. Color: robin's-egg blue. TKTF1: 100 tubes. TKTF2: 200 tubes.

125I Free Testosterone (TTF2) 105 mL of iodinated testosterone analog with sodium azide as a preservative. Stable at 2–8°C for 30 days after opening, or until the expiration date marked on the vial. TKTF1: 1 vial. TKTF2: 2 vials.

Free Testosterone Calibrators (TFC3–8) Six vials of free testosterone calibrators, ready-to-use, in processed human serum with preservatives (sodium azide and gentamicin). The zero calibrator vial A contains 2.0 mL, while the remaining calibrator vials B through F contain 1.0 mL each. Stable at 2–8°C for 30 days after opening. TKTF1: 1 set. TKTF2: 1 set. The calibrators have lot-specific free testosterone values of approximately 0, 0.55, 2.5, 9.0, 25 and 50 picograms per milliliter (pg/mL); equivalently: approximately 0, 1.9, 8.7, 31, 87 and 173 picomoles per liter (pmol/L). Refer to the vial labels for exact values in pg/mL.

Materials Required But Not Provided Gamma counter—compatible with standard 12x75 mm tubes Vortex mixer Plain 12x75 mm polypropylene tubes—for use as T and NSB tubes, available from Siemens Healthcare Diagnostics (catalog number: PPO) Micropipets: 50 µL and 1.0 mL Incubation bath capable of maintaining 37°C Foam decanting rack—available from Siemens Healthcare Diagnostics (catalog number: FDR) Logit-log graph paper A tri-level, human serum-based immunoassay control, containing testosterone as one of over 25 assayed constituents, is available from Siemens Healthcare Diagnostics (catalog number: CON6).

Specimen Collection The patient need not be fasting, and no special preparations are necessary. Collect blood by venipuncture29 into plain


tubes (without anticoagulant), and separate the serum from the cells. Because EDTA would have a significant effect on results, it should not be used as an anticoagulant. Grossly lipemic serum samples may yield erroneously high free testosterone results. The use of an ultracentrifuge is recommended to clear lipemic samples. Hemolyzed samples may indicate mistreatment of a specimen before receipt by the laboratory; hence the results should be interpreted with caution. Blood collection tubes from different manufacturers may yield differing values, depending on materials and additives, including gel or physical barriers, clot activators and/or anticoagulants. Coat-A-Count Free Testosterone has not been tested with all possible variations of tube types. Consult the section on Alternate Sample Types for details on tubes that have been tested. Danazol Therapy: Danazol, a derivative of the synthetic steroid ethisterone, is used in the treatment of endometeriosis and fibrocystic breast disease. The androgenic side-effects have been attributed to the increased availability of free testosterone in patients undergoing Danazol therapy. Thus, patients taking Danazol will present with increased concentrations of free testosterone. In vitro studies with the Coat-A-Count Free Testosterone assay also show an increase in apparent free testosterone concentration in samples spiked with Danazol.31 The maximum Danazol plasma concentrations after a 100 mg oral dose is reported to be up to 199 ng/mL, yielding an appreciable change in concentrations of free testosterone despite the low cross-reactivity reported.32 See the “Specificity” section for the percent crossreactivity. Therefore, caution must be exercised when interpreting free testosterone levels in patients who are undergoing Danazol therapy. Volume Required: 50 µL per tube. Storage: 2 days at 2–8°C or 2 months (aliquotted) at –20°C. Before assay, allow the samples to come to room temperature (15–28°C) and mix by gentle swirling or inversion. Aliquot, if

necessary, to avoid repeated thawing and freezing. Do not attempt to thaw frozen specimens by heating them in a waterbath.

Radioimmunoassay Procedure All components must be at room temperature (15–28°C) before use. 1 Plain Tubes: Label four plain

(uncoated) 12x75 mm polypropylene tubes T (total counts) and NSB (nonspecific binding) in duplicate. Because nonspecific binding in the Coat-A-Count procedure is characteristically low, the NSB tubes may be safely omitted without compromising accuracy or quality control.

Coated Tubes: Label twelve Free Testosterone Ab-Coated Tubes A (maximum binding) and B through F in duplicate. Label additional antibody-coated tubes, also in duplicate, for controls and patient samples.

Calibrator Approximate

pg/mL Approximate

pmol/L

A (MB) 0 0

B 0.55 1.9

C 2.5 8.7

D 9.0 31

E 25 87

F 50 173

Note: The values of the calibrators are lot-specific. Refer to the calibrator vial labels for values in pg/mL.

2 Pipet 50 µL of the zero calibrator A into the NSB and A tubes, and 50 µL of each remaining calibrator, control and patient sample into the tubes prepared. Pipet directly to the bottom. Do not attempt to dilute patient samples expected to contain high concentrations in the zero calibrator. (Since dilution shifts the equilibrium between free and bound testosterone, the assay system cannot be expected to maintain linearity under dilution.) It is good practice to use a disposable-tip micropipet, changing the tip between samples, in order to avoid carryover contamination.


3 Add 1.0 mL of 125I Free Testosterone to every tube. Vortex. No more than 10 minutes should elapse during the dispensing of the tracer. Set the T tubes aside for counting (at step 6); they require no further processing.

4 Incubate for 4 hours at 37°C. The rack should be covered with Parafilm to prevent evaporation.

5 Decant thoroughly. Removing all visible moisture will greatly enhance precision. Using a foam decanting rack, decant or aspirate the contents of all tubes (except the T tubes) and allow them to drain for 2 or 3 minutes. Then strike the tubes sharply on absorbent paper to shake off all residual droplets.

6 Count for 1 minute in a gamma counter.

Calculation of Results To obtain results in terms of concentration from a logit-log representation of the calibration curve, first calculate for each pair of tubes the average NSB-corrected counts per minute: Net Counts = Average CPM minus Average NSB CPM

Then determine the binding of each pair of tubes as a percent of maximum binding (MB), with the NSB-corrected counts of the A tubes taken as 100%: Percent Bound = (Net Counts / Net MB Counts) × 100

(The calculation can be simplified by omitting the correction for nonspecific binding; samples within range of the calibrators yield virtually the same results when Percent Bound is calculated directly from Average CPM.) Using logit-log graph paper, plot Percent Bound on the vertical (probability) axis against Concentration on the horizontal (logarithmic) axis for each of the nonzero calibrators, and draw a straight line approximating the path of these points. Results for the unknowns may then be read from the line by interpolation. It is good practice to inspect results for agreement within replicates, and to

construct a graph of the calibration curve (even if the calculations are handled by computer) as a visual check on the appropriateness of the transformation used and as a way to detect deviant calibration points. We also recommend keeping track of these data reduction parameters: T = Total Counts (as counts per minute)

%NSB = 100 × (Average NSB Counts / Total Counts)

%MB = 100 × (Net Counts / Total Counts)

And the 20, 50 and 80 percent "intercepts," where 20% = Concentration at 20 Percent Bound, etc.

Note that other approaches, e.g. a sound implementation of the 4-parameter logistic, are also acceptable. See Dudley RA, et al. Guidelines for immunoassay data reduction. Clin Chem 1985;31:1264-71. Example Run: For illustration only, not for calculating results from another run. Because the calibrator values are lot-specific, concentrations listed in the right-most column may not match the values of the calibrators supplied in your shipment. (See “Example Run” table.)

Quality Control Controls (or serum pools) with at least two free testosterone concentration levels—low and high—should routinely be assayed as unknowns. Report patient results only if the control results for that assay meet your laboratory's established criteria for acceptability. It is good laboratory practice to record for each assay the lot numbers of the components used, as well as the dates when they were first reconstituted or opened. We also recommend charting control results from day to day—as described, for example, in Westgard JO, et al. A multi-rule chart for quality control. Clin Chem 1981;27:493-501. Note that repeat samples can serve as a valuable additional tool for monitoring interassay precision, and that pairs of control tubes can be spaced throughout the assay to help verify the absence of significant drift.


Expected Values Free testosterone values for adults with no apparent or suspected gonadal dysfunction are summarized below by sex and by age. The statistics show, as expected, a gradual decline in free testosterone levels as a function of age during the adult years. Results for men and women 20 to 80 years of age—a total of 472 males and 113 females—were used in the analysis. The reference group consisted of healthy volunteers and also subjects in whom gonadal disease was not suspected or was excluded by further laboratory tests. The data set (kindly provided by the authors) derives from a published study30 on reference intervals for the Coat-A-Count Free Testosterone assay.

Mass Units (pg/mL)

Age (years) n Median Central

95% Range

Males

20 – 39 154 17.2 8.8 – 27

40 – 59 210 14.4 7.2 – 23

60 – 80 108 11.7 5.6 – 19

Females

20 – 39 47 0.87 ND – 2.57

40 – 59 39 0.68 ND – 2.03

60 – 80 27 0.51 ND – 1.55

ND: Not detectable

Molar Units (pmol/L)

Age (years) n Median Central

95% Range

Males

20 – 39 154 60 31 – 94

40 – 59 210 50 25 – 80

60 – 80 108 41 19 – 66

Females

20 – 39 47 3.0 ND – 8.9

40 – 59 39 2.3 ND – 7.0

60 – 80 27 1.8 ND – 5.4

ND: Not detectable

Note that selection criteria can have a significant impact on the determination of reference intervals: in particular, wider intervals were obtained in the published study30 when the data set was expanded to include results for patient samples

which had been submitted for free testosterone analysis. Consider these limits as guidelines only. Each laboratory should establish its own reference ranges.

Performance Data The following sections contain data representative of the Coat-A-Count Free Testosterone kit's performance. Results are expressed in pg/mL. Conversion Factor: pg/mL × 3.467 → pmol/L Calibration Range: Approximately 0.55 – 50 pg/mL (1.9 – 173 pmol/L). The calibrators are lot-specific. Analytical Sensitivity: 0.15 pg/mL. Precision: Statistics were calculated for samples from the results of pairs of tubes in over 160 different assays. (See “Precision” table.) Precision Profile: The graph shows a precision-dose profile for the assay based on the within-run CVs (open circles) for twelve samples, calculated by analysis of variance from 34 runs. The bowl-shaped contour line, which traces the approximate path of these points, represents the within-run CVs to be expected for samples assayed in duplicate. For reference, the run-to-run CVs tabulated in the "Precision" table are displayed as solid squares. (See “Precision Profile” graph.) End-of-Run Effect: None up to approximately 200 tubes. (See "End-of-Run Effect" table.) Effect of SHBG: To investigate the effect of sex hormone-binding globulin levels (SHBG levels) on the assay system, a charcoal-absorbed human serum pool was spiked with SHBG to a concentration of 400 micrograms per milliliter, a level which is approximately 1,000 times normal. The SHBG-spiked pool, when assayed by the Coat-A-Count Free Testosterone procedure, showed a percent bound value of 99% B/B0. Since charcoal absorption removes testosterone from the pool, it should have free (and total) testosterone concentrations of zero—that is, percent bound values of approximately 100% B/B0—both before and after spiking. The


results show, as expected, that the assay is not influenced by SHBG levels. Effect of Albumin: Lyophilized samples were reconstituted with aqueous solutions containing 0, 1.0, 2.0 and 3.0 g/dL of charcoal-absorbed human serum albumin, and assayed in parallel. (See "Effect of Albumin " table.) Effect of Charcoal Absorption: Patient samples were analyzed by the Coat-A-Count Free Testosterone procedure both before and after charcoal absorption. The free testosterone concentrations (in pg/mL) before charcoal absorption, and the percent bound (%B/B0) values following charcoal absorption are tabulated. (See "Effect of Charcoal Absorption" table.) The results demonstrate that charcoal absorption essentially reduces the apparent free testosterone level of patient samples, as measured by the Coat-A-Count procedure, to zero, that is, to percent bound values of approximately 100% B/B0. Since charcoal absorption removes testosterone along with other steroids and small molecules from serum samples while leaving larger molecules such as albumin, SHBG and other binding proteins, this experiment helps to confirm that the Coat-A-Count Free Testosterone procedure is not influenced by levels of transport proteins. Bilirubin: Presence of bilirubin in concentrations up to 200 mg/L has no effect on results, within the precision of the assay. Hemolysis: Presence of packed red blood cells in concentrations up to 30 µL/mL has no effect on results, within the precision of the assay. Alternate Sample Type: To assess the effect of alternate sample types, blood was collected from 49 volunteers into plain, heparinized and EDTA vacutainer tubes. The absolute ranges observed for the male and female volunteers are tabulated below.

Absolute Range

19 Male Lab Volunteers

pg/mL

30 Female Lab Volunteers

pg/mL

Serum 9 – 47 0.7 – 3.6

Heparin 8 – 45 0.9 – 3.8

EDTA 13 – 79 1.3 – 5.7

The combined results for these 49 samples – plus one additional sample – yielded the following statistics when subjected to linear regression analysis. (Heparin) = 0.95 (Serum) + 0.4 pg/mL r = 0.996

(EDTA) = 1.48 (Serum) + 1.1 pg/mL r = 0.957

Means: 11.9 pg/mL (Heparin) 12.2 pg/mL (Serum) 19.2 pg/mL (EDTA)

The results indicate that heparinized plasma yields virtually the same results as serum, whereas EDTA plasma yields higher values. Specificity: The free testosterone antibody is highly specific for testosterone, with an extremely low crossreactivity to other naturally occurring steroids or therapeutic drugs that may be present in patient samples. (See “Specificity” table.) Method Comparison: The assay was compared to a conventional equilibrium dialysis method on 85 serum samples (43 male and 42 female). By linear regression:

Male (43) (TKTF) = 0.42 (Dialysis) + 9.8 pg/mL r = 0.67

Means: 26.3 pg/mL (TKTF) 39.0 pg/mL (Dialysis)

Female (42) (TKTF) = 0.79 (Dialysis) + 1.0 pg/mL r = 0.75


Combined (85) (TKTF) = 0.55 (Dialysis) + 3.4 pg/mL r = 0.87



The Coat-A-Count Free Testosterone procedure was also compared to a total testosterone assay—Coat-A-Count Total Testosterone procedure—on 109 serum samples (51 male and 58 female). By linear regression:

Male (51) (Free) = 4.7 (Total) + 0.7 r = 0.984

Means: 23.6 pg/mL (Free) 4.84 ng/mL (Total)

Female (58) (Free) = 6.1 (Total) + 0.6 r = 0.978


Combined (109) (Free) = 4.6 (Total) + 1.2 r = 0.992


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Tables and Graphs

Example Run

Tube1 Duplicate

CPM2 Average

CPM3 Net

CPM4 Percent Bound5

Approx.Free

Testo. pg/mL6

T7 56,991 57,127 57,059

NSB8 254 292 273 0

A (MB)9

32,409 29,906 31,158 30,885 100% 0

B 28,232 27,879 28,056 27,783 90% 0.5

C 22,426 23,385 22,906 22,633 73% 2.7

D 17,197 17,188 17,193 16,920 55% 9.4

E 12,350 12,530 12,440 12,167 39% 24.0

F 9,262 10,208 9,735 9,462 31% 47.0

Unknowns10

X1 21,807 21,938 21,873 21,600 70% 4.3

X2 16,493 17,123 16,808 16,535 54% 10.9

X3 10,249 10,462 10,356 10,083 33% 36

Quality Control Parameters:11 T7 = 57,059 cpm %NSB8 = 0.5%

%MB9 = 54% 20% Intercept12 = 107 pg/mL 50% Intercept = 12.8 pg/mL 80% Intercept = 1.5 pg/mL

Precision (pg/mL)

Mean1 SD2 CV3

1 1.2 0.22 18.3%

2 8.9 0.76 8.5%

3 20 1.6 8.0%

Precision Profile

Coat-A-Count Free Testosterone, pg/mL 0.5 1 3 10 30 50

CV

%

0

5

10

15

20

25

End-of-Run Effect (pg/mL)

Tubes1 28–37

Tubes 87–96

Tubes 143–152

Tubes 199–208

1 10.9 12.2 11.7 10.9

2 18.3 19.2 18.6 18.3

3 19.0 17.0 18.8 19.1

4 20.6 18.3 17.9 18.4

5 49.0 52.4 48.7 47.1

Effect of Albumin (pg/mL)

Spiked with Albumin1

Unspiked2 1.0 g/dL 2.0 g/dL 3.0 g/dL

1 4.7 4.4 4.2 3.9

2 16.7 16.4 16.7 15.8

3 37.0 37.0 34.2 34.0

Mean3 19.5 19.3 18.4 17.9

% S/U4 — 99% 94% 92%


Effect of Charcoal Absorption

Before1 (pg/mL) After2 (%B/B0)

Males3 21.24 96%

14.33 98%

19.91 99%

21.03 98%

15.01 95%

Females4 0.80 105%

2.32 104%

1.73 104%

3.47 104%

1.93 105%

3rd Trimester 4.75 99%

9.10 96%

3.58 96%

4.44 97%

3.86 96%

Specificity

Compound1 % Cross-reactivity2

Aldosterone ND

5β-Androstan-3α,17β-diol ND

Androstenedione 0.01%

5α-Androstan-3β,17β-diol 0.005%

∆5-Androsten-3β,17-diol 0.007%

5α-Androstan-3,17-dione 0.001%

Androsterone ND

Corticosterone ND

Cortisol ND

Cortisone ND

Danazol 0.001%

11-Deoxycortisol ND

Dexamethazone ND

DHEA 0.003%

DHEA-sulfate ND

Estradiol ND

∆4-Estren-17α-methyl-17β-ol-3-one

0.007%

∆4-Estren-17-ol-3-one 0.16%

Estrone ND

Ethisterone 0.022%

∆4-Androsten-19-ol-3,17-dione 0.007%

11-Ketotestosterone 0.027%

Norethindrone 0.005%

Norethyrodrel 0.004%

Prednisone ND

Progesterone ND

Spironolactone ND

11β-Hydroxytestosterone 0.004%

Trianicinolone ND

5α-Dihydrotestosterone 0.041%

Methyltestosterone 0.10%

ND: Not detectable.3

Deutsch. Example Run: 1Röhrchen, 2Duplikat CPM, 3Mittelwert CPM, 4Netto CPM, 5Prozent Bindung, 6Ca. Freies Testosteron, pg/mL, 7Total, 8%NSB, 9%MB, 10Unbekannte, 11Qualitätskontrollparameter, 1220% Intercept. Precision: 1Mittelwert, 2SD (Standardabweichung), 3CV (Variationskoeffizient). End-of-Run Effect: 1Röhrchen. Effect of Albumin: 1Versetzt mit Albumin, 2Ohne Zugabe von, 3Mittelwert, 4%S/U.


Effect of Charcoal Absorption: 1Vor, 2Nach, 3Männer, 4Frauen. Spezifität: 1Verbindung, 2% Kreuzreaktivität, 3NN: Nicht nachweisbar.

Español. Example Run: 1Tubo, 2Duplicado CPM, 3Media CPM, 4CPM Netas, 5Porcentaje de unión, 6Testosterona Libre aprox., pg/mL, 7Total, 8%NSB, 9%MB, 10Desconocido, 11Parámetros del control de calidad, 12Corte al 20%. Precisión: 1Media, 2DS, 3CV. End-of-Run Effect: 1Tubos. Effect of Albumin: 1Sobrecargado con Albúmina, 2Sin añadir, 3Media, 4%S/N. Effect of Charcoal Absorption: 1Antes, 2Después, 3Hombres, 4Mujeres. Especificidad: 1Compuesto, 2% Reacción cruzada, 3ND: no detectable.

Français. Exemple Série : 1Tube, 2Duplicate CPM, 3CPM moyen, CPM corrigé, 5Pourcentage lié, 6Approx. Testosterone Libre, pg/mL, 7Total, 8%NSB, 9%MB, 10Patients, 11Paramètres Contrôle de Qualité, 1220% Intercept. Précision : 1Moyenne, 2SD, 3CV. Effet de la position des tubes : 1Tubes. Effet de l'Albumine : 1Chargé en Albumine, 2Non chargés, 3Moyenne, 4%S/U. Effet de l'Adsorption sur charbon : 1Avant, 2Après, 3Hommes, 4Femmes. Spécificité : 1Composé, 2Réaction croisée%. 3ND: non détectable.

Italiano. Seduta Esemplificativa: 1Provetta, 2CPM in duplicato, 3CPM Medio, 4CPM Netti, 5Percentuale di Legato, 6Appross. Testosterone Libero, pg/mL, 7Totale, 8%NSB, 9%MB, 10Campioni Non Noti, 11Parametri per il Controllo di Qualità, 12Intercetta al 20%. Precisione: 1Media, 2SD (Deviazione Standard), 3CV (Coefficiente di Variazione). Effetto fine Seduta: 1Provette. Effetto dell'Albumina: 1Con albumina, 2Semplice, 3Media, 4%S/U. Effetto dovuto ad Assorbimento di Charcoal: 1Prima, 2Dopo, 3Maschi, 4Femmine. Specificità: 1Composto, 2Percentuale di Crossreattività, 3ND: non determinabile.

Português. Example Run: 1Tubo, 2Duplicado CPM, 3Média de CPM, 4Net CPM, 5Percentagem de Ligação, 6Aprox. Testosterona Livre, pg/mL, 7Total, 8%NSB, 9%MB, 10Desconhecidos, 11Parâmetros do controlo de qualidade, 1220% Intercepção. Precisão: 1Média, 2Desvio padrão, 3Coeficiente de variação. Efeito fim-de-série: 1Tubos. Efeitos da Albumina: 1Adicionado com Albumina, 2Não adicionada, 3Média, 4%S/U. Efeitos da absorção pelo carvão: 1Antes, 2Depois, 3Homens, 4Mulheres. Especificidade: 1Composto, 2Percentagem de reacção cruzada, 3ND: não detectável.

Deutsch

Coat-A-Count Freies Testosteron Anwendung: Festphasen Radioimmunoassay (coated tubes) zur direkten quantitativen Bestimmung des freien Testosterons im Serum. Dieses In-vitro Diagnostikum ist ausschließlich als Hilfsmittel zu Diagnose und Management von Hirsutismus auf Grund von Hyperandrogenämie gedacht. Artikelnummern: TKTF1 (100 Tests), TKTF2 (200 Tests)

Die Packung mit 100 Röhrchen enthält weniger als 4 Microcurie (148 Kilobequerel) an

radioaktivem 125I-markiertem Testosteron-Analog; die Packung mit 200 Röhrchen enthält weniger als 8 Microcurie (296 Kilobecquerel).

Klinische Relevanz Testosteron zirkuliert im Serum an Transportproteine gebunden, normaler-weise liegt nur ca. 1% in freier Form vor. Das wichtigste Transportprotein für Testosteron ist das sexualhormon-bindende Globulin (SHBG) oder Testosteron-Östradiol-bindende Globulin (TeBG), denn es bindet neben dem Testosteron auch Dihydrotestosteron und Östradiol. Albumin und Cortisol-bindendes Globulin (CBG) dienen ebenfalls als Transportproteine für Testosteron. Aus drei Gründen ist SHBG das wichtigste der drei genannten Transportproteine. Es transportiert, iNSBesondere bei Frauen, einen höheren Prozentsatz des Testo-sterons als Albumin und CBG. Weiterhin bindet es Testosteron mit einer wesentlich höheren Affinität im Vergleich zu den anderen Transportproteinen. (Das an Albumin und CBG gebundene Testo-steron wird auch als „schwach gebundenes“ Testosteron bezeichnet.) Letztlich hat SHBG eine vom Albumin unabhängige Bedeutung, insofern, dass die SHBG Spiegel sensitiv auf Verän-derungen im Verhältnis der zirkulierenden Östrogene zu den zirkulierenden An-drogenen reagieren. Deshalb spielt SHBG


eine größere Rolle in der Ausprägung der Spiegel des freien Testosteron. Während der Schwangerschaft zeigen die SHBG Spiegel einen progressiven Anstieg, der den Anstieg der Östradiol Werte widerspiegelt. Obwohl auch die Gesamt-Testosteron Spiegel während der Schwangerschaft ansteigen, fällt der Anstieg beim Östradiol und damit auch beim SHBG wesentlich deutlicher aus. Unter dem Strich ist ein Abfall des Freien Testosteron als Teil vom Gesamt Testosteron zu beobachten. Frauen, die orale Kontrazeptiva einnehmen, ins-besondere Ethinylestradiol in hohen Dosen, haben normalerweise erhöhte SHBG Spiegel. Umgekehrt führt die Gabe von Androgenen bei präpubertären Jungen oder die Erhöhung des endo-genen Testosterons durch HCG-Stimu-lation zu einem Rückgang der SHBG Spiegel. Bei ansonsten gleichbleibenden Verhält-nissen ist ein Anstieg der Konzentration des Freien Testosteron zu erwarten, wenn der Testosteronspiegel (T) ansteigt oder die SHBG Konzentration abfällt. Das Verhältnis T/SHBG dient zur groben Abschätzung der Konzentration des Freien Testosteron in der Zirkulation. Die T/SHBG Ratio wird auch als freier Androgenindex (FAI) bezeichnet. Der Freie Androgenindex ist häufig erhöht bei milder Akne, androgener Alopezie, Hirsutismus und anderen Zuständen. Ein erniedrigter SHBG Wert bei gleichzeitig normalem Gesamt-Testosteron ist eine häufig gefundene Konstellation bei diesen Zuständen. Ein Anstieg der Testosteron-produktion induziert typischerweise einen Abfall der SHBG-Werte. Hierdurch wird die zelluläre Aufnahme und der Metabolis-mus des Testosterons stimuliert, mit dem Ergebnis, dass mehr in der freien Form zur Verfügung steht. Die gesteigerte Produktion wird durch eine ebenfalls ge-steigerte Clearance überlagert, was dazu führt, dass der Testosteronspiegel normal bleibt. Gesamt-Testosteron Messungen wurden traditionell als Hilfsmittel im Screening auf Hirsutismus eingesetzt, allerdings ist im Hinblick auf die oben beschriebenen Mechanismen zu erwarten, dass die direkte Messung oder die Berechnung des Indexes T/SHBG besser mit dem Krank-

heitsbild Hirsutismus korrelieren. Einige Autoren, iNSBesondere Paulson, be-schreiben die deutliche Überlegenheit des freien Testosteron im Screening auf Hirsutismus. In dieser Studie an 32 hirsuten Frauen hatten im Screening nur 44% einen erhöhten Gesamt Testosteron Wert, während das Freie Testosteron in allen 32 Fällen erhöht gefunden wurde. Nicht alle Studien kommen zu einem so eindeutigen Ergebnis. Wu hat mehrere Studien in einem Review bewertet und kommt zu dem Schluss, dass die Bestimmung des Freien Testosteron dennoch Vorteile gegenüber der Gesamt Testosteron Bestimmung hat. (Die unterschiedlichen Studienergebnisse sind durch Unterschiede in der Methodik und in der Auswahl des Patientenkollektivs zu erklären.)

Methodik Im Coat-A-Count RIA zur Bestimmung des freien Testosteron konkurriert ein 125I-markiertes Testosteron-Analog eine vorgegebene Zeit mit dem freien Testo-steron im Patientenserum um die Bindung an Testosteron spezifische Antikörper, die auf die Innenwandung von Polypropylen-Röhrchen fest aufgebracht sind. Nach Ablauf der Inkubationszeit wird der Überstand abgegossen oder abgesaugt, und die an die Antikörper gebundene Fraktion in einem Gamma-Counter gemessen. Die Counts sind zu der Kon-zentration umgekehrt proportional. Durch Vergleich mit unter gleichen Bedingungen behandelten Standards lässt sich die Konzentration des freien Testosteron im Serum aus der Standardkurve ablesen. Der Test ist so aufgebaut, dass das ursprüngliche Gleichgewicht zwischen dem freien und dem an Bindeproteine gebundenen Testosteron im Patienten-serum nicht verändert wird. Dazu wird ein Tracer verwendet, der nicht mit den Transportproteinen für Steroide reagiert, und ein Antiserum, das eine etwas geringere Affinität für Testosteron hat, als das hauptsächliche Trägerprotein SHBG. Außerdem findet die Reaktion unter physiologischen Bedingungen von Temperatur, pH und Ionenstärke statt. Die Konzentration des freien Testosteron wird mit diesem Testsatz direkt in nur einem Teströhrchen bestimmt. Es handelt sich nicht um eine Berechnung als


Funktion von Testosteron und SHBG oder anderen Parametern. Die Methode unterscheidet sich demnach von der Gleichgewichtsdialyse oder dem Freien Androgen Index (FAI). Die Bestimmung des freien Testosteron erfolgt in nur einem Schritt ohne Vorinkubation oder vorherige Abtrennung des freien Testosteron durch Dialyse, Filtration oder Säulenchromatographie. Zusätzlich sind folgende Faktoren nennenswert: Testdauer: 4 Stunden. Total counts zum Zeitpunkt der Markierung: ca. 60 000 cpm Zu pipettierende Reagenzien: 1

Hinweise und Vorsichtsmaßnahmen Zur In-vitro-Diagnostik. Reagenzien: Die Packung mit den Reagenzien sollte bei 2–8°C in einem Kühlschrank gelagert werden, der für radioaktives Material ausgewiesen ist. Die Entsorgung muss nach den jeweils gültigen Gesetzen erfolgen. Die Reagenzien dürfen nur bis zum Verfallsdatum verwendet werden. Einige Komponenten des Kits können Material humanen Ursprungs und/oder in anderer Weise gefährliche Inhaltsstoffe enthalten, die es unbedingt notwendig machen die folgenden Vorsichtsmaßnahmen einzuhalten. Die generell geltenden Vorsichtsmaßnahmen sind einzuhalten und alle Komponenten als potenziell infektiös zu behandeln. Alle aus menschlichem Blut gewonnenen Materialien wurden auf Syphilis, Antikörper gegen HIV-1 und HIV-2, Hepatitis-B-Oberflächenantigen und Hepatitis-C-Antikörper untersucht und negativ befundet. Bestimmten Komponenten wurde Natriumazid (<0,1 g/dl) hinzugefügt. Um die Bildung von explosiven Metallaziden in Blei- und Kupferrohren zu vermeiden, sollten die Reagenzien nur zusammen mit großen Wassermengen in die Kanalisation gespült werden. Wasser: Destilliertes bzw. deionisiertes Wasser benutzen.

Radioaktivität Der Umgang mit radioaktivem Material ist in Deutschland genehmigungspflichtig. Deshalb muss der Siemens Healthcare Diagnostics eine Kopie der aktuellen gültigen Umgangsgenehmigung des Kunden vorliegen, bevor radioaktive Reagenzien versendet werden dürfen. Die Strahlenschutzverordnung ist zu beachten. Das radioaktive Material ist gemäß der jeweiligen Umgangsgenehmigung zu handhaben. Die Strahlenexposition ist zu minimieren. Spritzer sind sofort aufzuwischen und die betroffene Oberfläche zu dekontami-nieren. Aerosolbildung ist zu vermeiden. Flüssiger und fester radioaktiver Abfall sind unter Beachtung der gültigen Richtlinien zu entsorgen.

Bestandteile der Testpackung: Vorbereitung Die in diesem Kit enthalten Bestandteile sind nicht austauschbar mit denen im Coat-A-Count Gesamt Testosteron Kit, welcher zur Bestimmung des Gesamt Testosteron entwickelt wurde.

Freies Testosteron Ak beschichtete Röhrchen (TTF1) Polypropylen-Röhrchen* beschichtet mit Antikörpern vom Kaninchen gegen das freie Testosteron, verpackt in wieder-verschließbaren Plastikbeuteln. Kühl lagern, vor Feuchtigkeit schützen und nach dem Öffnen wieder sorgfältig verschließen. Lagerung bei 2–8°C bis zum Verfallsdatum. Farbe: Hellblau. TKTF1: 100 Röhrchen. TKTF2: 200 Röhrchen.

125I Freies Testosteron (TTF2) 105 ml jodiertes Testosteron-Analog mit Natruimazid als Konservierungsmittel. Lagerung bei 2–8°C. Haltbar bis 30 Tage nach dem Öffnen oder bis zum Verfallsdatum auf der Flasche. TKTF1: 1 Flasche. TKTF2: 2 Flaschen.

Freies Testosteron Standards (TFC3–8) 6 Flaschen mit Freiem Testosteron, gebrauchsfertig, in behandeltem Humanserum mit Konservierungsmitteln (Natriumazid und Gentamicin). Der Nullstandard (A) enthält 2,0 ml während


die Standards B – F je1,0 ml enthalten. Bei 2–8°C bis 30 Tage nach dem Öffnen haltbar. TKTF1: 1 Set. TKTF2: 1 Set. Die Standards haben chargenspezifische Werte von ca. 0; 0,55; 2,5; 9,0; 25 und 50 pg/ml; bzw. ca. 0; 1,9; 8,7; 31; 87 und 173 pmol/l. Die exakten Konzentrationen entnehmen Sie bitte den Etiketten der Standardflaschen.

Erforderliche Laborgeräte und Hilfsmittel Gammacounter—kompatibel mit 12x75 mm Röhrchen Wirbelmischer Unbeschichtete 12x75 mm Polyprophylen-Röhrchen—für T und NSB Röhrchen, erhältlich bei Siemens Healthcare Diagnostics (Artikelnummer: PPO) Mikropipetten: 50 µl und 1,0 ml. Wasserbad oder Heizblock für Inkubation 37°C. Dekantierständer—erhältlich bei Siemens Healthcare Diagnostics (Artikelnummer: FDR). Logit-Log-Papier Immunoassay-Kontrolle (> 25 Parameter, 3 Konzentrationen) (Artikelnummern: CON6).

Probengewinnung Es ist keine besondere Vorbereitung der Patienten nötig. Blutentnahme durch Venenpunktion29 in Röhrchen ohne Zusätze (ohne Antikoagulantien), Trennung des Serums von den Blutzellen. EDTA würde die Resultate erheblich verfälschen und sollte daher nicht als Antikoagulans verwerdet werden. Stark lipämische Seren führen zu falsch hohen Freies Testosteron Werten. Lipämische Seren sollten durch Ultrazentrifugieren geklärt werden. Bei hämolysierten Proben besteht die Möglichkeit einer unsachgemäßen Handhabung vor Eintreffen im Labor, daher sind die Ergebnisse mit Vorsicht zu interpretieren. Blutentnahmeröhrchen von verschiedenen Herstellern können differierende Werte verursachen. Dies hängt von den

verwendeten Materialien und Additiven (Gel oder physische Trennbarrieren, Gerinnungsaktivatoren und /oder Antikoagulantien) ab. Coat-A-Count Freies Testosteron sind nicht mit allen möglichen Röhrchenvariationen ausgetestet worden. Details der getesteten Röhrchenarten sind dem Kapitel "Alternative Probenarten" zu entnehmen. Danazol Therapie: Danazol, ein Derivat des synthetischen Steroids Ethisteron, wird zur Behandlung der Endometriose und fibrocystischer Brusterkrankungen eingesetzt. Die androgenen Nebenwirkungen bei Patienten unter Danazol-Therapie werden der gesteigerten Verfügbarkeit von freiem Testosteron zugeschrieben. Dem entsprechend werden Patienten, die Danazol einnehmen, erhöhte Konzentrationen an freiem Testosteron aufweisen. In-vitro Studien mit dem Coat-A-Count Freies Testosteron Assay haben gezeigt, dass in Proben, die mit Danazol versetzt wurden, die scheinbar gemessene Konzentration an freiem Testosteron ansteigt.31 Die maximale Danazol Plasma-Konzentration nach oraler Gabe von 100 mg wurde mit 199 ng/ml berichtet, was zu einer merklichen Veränderung der Konzentration an freiem Testosteron führt, trotz der beobachteten niedrigen Kreuzreaktivität.32 Siehe Kapitel „Specificity“ für die Angaben zur prozentualen Kreuzreaktivität Bei Patienten unter Danazol Therapie sind deshalb die gemessenen Spiegel an freiem Testosteron mit Vorsicht zu interpretieren. Erforderliche Menge: 50 µl pro Röhrchen. Lagerung: 2 Tage bei 2–8°C oder 2 Monate (portioniert) bei –20°C. Die Proben vor Testbeginn auf Raumtemperatur (15–28°C) bringen und vorsichtig durchmischen. Um wiederholtes Einfrieren und Auftauen zu vermeiden bei Bedarf portionieren. Gefrorene Proben dürfen nicht durch Erhitzen im Wasserbad aufgetaut werden.

Testansatz und Durchführung Alle Testkomponenten vor Testbeginn auf Raumtemperatur (15–28°C) bringen.


1 Unbeschichtete Röhrchen: Jeweils 2 unbeschichtete 12x75 mm Polypropylen-Röhrchen mit T (Total Counts) und NSB (unspezifische Bindung) beschriften. Da die unspezifische Bindung im Coat-A-Count RIA normalerweise niedrig ist hat sie keinen signifikanten Einfluss auf die Messwerte. Es kann deshalb auch auf das Mitführen der NSB-Röhrchen verzichtet werden.

Beschichtete Röhrchen: Jeweils 2 Antikörper-beschichtete Freies Testosteron Röhrchen mit A (maximale Bindung, 0-Standard) und von B bis F beschriften. Jeweils 2 weitere Antikörper-beschichtete Röhrchen für Kontrollen und Patientenproben beschriften.

Standard ca. pg/ml ca. pmol/l

A (MB) 0 0

B 0,55 1,9

C 2,5 8,7

D 9,0 31

E 25 87

F 50 173

Bitte beachten: Die Konzentrationen der Standards sind chargenspezifisch. Bitte entnehmen Sie die exakten Konzentrationen der Beschriftung der Flaschen.

2 Jeweils 50 µl des 0-Standards A in die NSB und A Röhrchen und jeweils 50 µl der restlichen Standards, Kontrollen und Patientenproben in die vorbereiteten Röhrchen pipettieren. Direkt auf den Boden des Röhrchens pipettieren. Proben mit hohen zu erwartenden Konzentrationen dürfen nicht mit 0-Standard verdünnt werden. (Eine Verdünnungslinearität kann nicht erwartet werden, da durch die Verdünnung sich das Gleichgewicht verschiebt.) Es ist gute Laborpraxis Pipetten mit Einmalspitzen zu verwenden und die Spitze von Probe zu Probe zu wechseln um Verschleppung zu vermeiden.

3 Jeweils 1,0 ml 125I Freies Testosteron Analog hinzufügen. Mischen. Das Verteilen des Tracers sollte nicht länger als 10 Minuten dauern. Die T-

Röhrchen bis zur Messung (siehe Schritt 6) beiseite stellen; sie bedürfen keiner weiteren Behandlung.

4 Für 4 Stunden bei 37°C im Wasserbad inkubieren. Um Verdunstung zu vermeiden, sollten die Ständer mit Parafilm abgedeckt werden.

5 Vollständig dekantieren. Vollständiges Entfernen der Flüssigkeit verbessert die Präzision deutlich. Mit Hilfe eines Dekantierständers alle Röhrchen (außer die T-Röhrchen) dekantieren oder absaugen und 2-3 Minuten umgedreht stehen lassen. Anschließend werden die Röhrchen kräftig auf Fließpapier ausgeklopft, um alle restlichen Tröpfchen zu entfernen.

6 Alle Röhrchen 1 Minute im Gamma-Counter messen.

Berechnung der Ergebnisse Um die Konzentrationen aus der Logit-Log Darstellung der Standardkurve abzulesen werden zunächst der Mittelwert der zwei Röhrchen bereinigt um den Mittelwert der NSB Counts pro Minute (cpm) berechnet: Netto CPM = Mittelwert CPM minus Mittelwert NSB CPM

Anschließend wird die Bindung jedes Röhrchenpaars als Prozent der Maximalbindung (MB, B0) bestimmt. Hierzu werden die mittleren CPM des A-Standards korrigiert um die mittlere NSB als 100% gesetzt: Prozentbindung = (Netto Counts / Netto MB Counts) × 100

(Die Berechnung kann durch weglassen der Korrektur um die NSB vereinfacht werden. Für Proben innerhalb des Standardbereichs werden nahezu identische Konzentrationen berechnet, wenn B/B0 direkt aus den CPM ermittelt wird.) Die so ermittelten B/B0 aller Standards außer des 0-Standards werden auf der y-Achse auf Logit-Log Papier gegen die Konzentration auf der x-Achse (logarithmisch) aufgetragen. Die Punkte werden mit bestmöglicher Annäherung durch eine gerade Linie verbunden. Die


Ergebnisse der unbekannten Proben können dann durch Interpolation an der Kurve abgelesen werden. Es ist gute Laborpraxis die Ergebnisse der Doppelbestimmung auf Übereinstimmung zu prüfen und eine Grafik der Standardkurve darzustellen (auch wenn die eigentliche Berechnung durch ein Computerprogramm erfolgt) um visuell zu überprüfen, ob für die Standardkurve die geeignete Transformation verwendet wurde und um eventuell abweichende Standardkurvenpunkte zu entdecken. Es wird weiterhin empfohlen, folgende Parameter der Berechnung zu protokollieren: T = Total Counts (als Counts pro Minute)

%NSB = 100 × (Mittlere NSB Counts / Total Counts)

%MB = 100 × (Netto Counts / Total Counts)

und die 20, 50 und 80 Prozent "intercepts," wobei 20% = Konzentration bei 20 Prozent Bindung, etc.

Bitte beachten Sie, dass auch andere Auswertungen z. B. nach der 4-Para-meter-Logistik akzeptabel sind. Siehe: Dudley RA, et al. Guidelines for immunoassay data reduction. Clin Chem 1985;31:1264-71. Auswertebeispiel: Dieses Beispiel dient nur zur Veranschaulichung und ist nicht dazu geeignet Werte aus einem anderen Testansatz damit zu ermitteln. Aufgrund der Chargenabhängigkeit der Standard-konzentrationen müssen die in der rechten Spalte der Tabelle gelisteten Konzentrationen nicht mit den Konzen-trationen in Ihrer Lieferung überein-stimmen. (Siehe “Example Run” Tabelle.)

Qualitätskontrolle Es wird empfohlen Kontrollen mit mindestens 2 Konzentrationen (niedrig und hoch) an Freiem Testosteron routinemäßig als unbekannte Proben einzusetzen. Patientenergebnisse dürfen nur dann freigegeben werden, wenn die laborspezifischen Akzeptanzkriterien erfüllt sind. Hierzu sind die jeweils gültigen Richtlinien zu berücksichtigen.

Es ist gute Laborpraxis die Chargennummern, sowie das Datum der ersten Öffnung bzw. Rekonstitution der verwendeten Komponenten zu protokollieren. Die wiederholte Messung von Proben kann bei der Beurteilung der Interassay Präzision hilfreich sein. Der Einsatz von Kontrollprobenpaaren an unterschiedlichen Positionen des Testansatzes ist hilfreich, um einen eventuellen Drift zu erkennen.

Referenzwerte In der u. g. Tabelle sind die Freien Testosteron Werte für Erwachsene ohne bestehende oder vermutete Funktions-störung der Keimdrüsen, aufgegliedert nach Alter und Geschlecht aufgelistet. Wie zu erwarten zeigt die Statistik, dass die Testosteron Spiegel mit zunehmendem Alter niedriger werden. Es wurden die Werte von 472 Männern und 113 Frauen im Alter von 20 – 80 Jahren analysiert. Die Referenzgruppe bestand aus gesunden Freiwilligen und Personen ohne Hinweise auf Erkrankungen der Keimdrüsen, bzw. eine Erkrankung konnte aufgrund weiterer Laborwerte ausgeschlossen werden. Die Daten stammen aus einer publizierten Studie30 über Referenzbereiche für den Freies Testosteron Coat-A-Count RIA und wurden von den Autoren freundlicher-weise zur Verfügung gestellt.

Masseneinheit (pg/ml) Alter

(Jahre) N Median 95%

Bereich

Männer

20 – 39 154 17,2 8,8 – 27

40 – 59 210 14,4 7,2 – 23

60 – 80 108 11,7 5,6 – 19

Frauen

20 – 39 47 0,87 NN – 2,57

40 – 59 39 0,68 NN – 2,03

60 – 80 27 0,51 NN – 1,55

NN: Nicht nachweisbar


Molare Einheiten (pmol/l) Alter

(Jahre) n Median 95%

Bereich

Männer

20 – 39 154 60 31 – 94

40 – 59 210 50 25 – 80

60 – 80 108 41 19 – 66

Frauen

20 – 39 47 3,0 NN – 8,9

40 – 59 39 2,3 NN – 7,0

60 – 80 27 1,8 NN – 5,4

NN: Nicht nachweisbar

Es ist zu beachten, dass Auswahlkriterien einen signifikanten Einfluss auf Referenzbereiche haben können: in der publizierten Studie30 wurden breitere Bereiche gefunden, wenn auch Proben von Patienten berücksichtigt wurden. Die genannten Bereiche sind als Richtlinie zu interpretieren. Jedes Labor sollte seine eigenen Referenzbereiche etablieren.

Leistungsdaten Im folgenden Abschnitt sind Daten gezeigt, die für die Leistung des Freies Testosterone Assays repräsentativ sind. Die Ergebnisse sind in pg/ml angegeben. Umrechnungsfaktor: pg/ml × 3,467 → pmol/l Messbereich: ca. 0,55 – 50 pg/ml (1,9 – 173 pmol/l). Die Standards sind chargenspezifisch. Analytische Sensitivität: 0,15 pg/ml. Präzision: Zur Überprüfung der Inter-Assay-Varianz des Coat-A-Count Freies Testosteron – RIA wurden die Messwerte von 3 Proben unterschiedlicher Konzentration, gemessen in mehr als 160 Testansätzen in Doppelbestimmung ausgewertet bestimmt. (Siehe Tabelle „Präzision“.) Präzisionsprofil: Die Grafik zeigt die Präzision in Abhängigkeit von der Konzentration. Die offenen Kreise repräsentieren die Intra-Assay-VK´s für Doppelbestimmungen ermittelt an 12 Proben in 34 Testansätzen. Die durchgezogene Linie als Ausgleichskurve zwischen den Punkten zeigt die zu erwartenden Intra-Assay-VK´s

in der Doppelbestimmung. Die geschlossenen Quadrate repräsentieren die o. g. Daten zur Inter-Assay-Varianz. (Siehe Tabelle „Präzision“.) “End of Run” Effekt: Tritt bis ca. 200 Röhrchen nicht auf. (Siehe Tabelle "End of Run”-Effect".) Einfluss von SHBG: Um den Einfluss von Sexualhormonbindendem Globulin (SHBG) auf das Testsystem zu unter-suchen wurde ein mit Aktivkohle- Ab-sorption vorbehandelter Humanserum-pool mit SHBG in einer Konzentration von 400 mg/ml versetzt, einer Konzentration die 1 000mal höher als der normale SHBG Serumspiegel ist. Der so behandelte Pool zeigte im Freies Testosteron Coat-A-Count RIA eine B/B0 von 99%. Da durch die Aktivkohle-Absorption das gesamte Testosteron aus dem Pool-Serum entfernt wurde, sollte die Konzentration sowohl für Testosteron und Freies Testosteron vor und nach SHBG Zugabe 0 sein, was einer B/B0 von 100% entspricht. Wie erwartet zeigen die Untersuchungen, dass SHBG keinen Einfluss auf die Ergebnisse hat. Einfluss von Albumin: Lyophilisierte Proben wurden mit einer wässrigen Lösung aufgelöst, die 0; 1,0; 2,0 und 3,0 g/dl aktivkohle-absorbiertes, humanes Serum-Albumin enthält und parallel gemessen. (Siehe Tabelle "Effect of Albumin ") Einfluss von Aktivkohle-Absorption: Patientenproben wurden vor und nach Aktivkohle-Absorption im Freies Testosteron Coat-A-Count RIA gemessen. Die Konzentrationen an Freiem Testosteron (in pg/ml) vor Aktivkohle-Absorption und die Prozentbindungen (%B/B0) nach Aktivkohle-Absorption sind aufgelistet. (Siehe Tabelle "Effect of Charcoal Absorption") Die Ergebnisse zeigen, dass durch die Aktivkohle-Absorption die Konzentrationen an Freiem Testosteron in Patientenproben gemessen mit dem Coat-A-Count RIA signifikant bis auf Null und damit auf ca. 100% B/B0 reduziert werden können. Durch die Aktivkohle-Absorption werden Testosteron sowie andere Steroide und kleine Moleküle aus dem Serum entfernt, während größere Moleküle wie Albumin, SHBG und andere Bindeproteine im Serum verbleiben. Somit bestätigt dieses


Experiment, dass der Freies Testosteron Coat-A-Count Assay von unterschied-lichen Konzentrationen an Transport-proteinen nicht beeinflusst wird. Bilirubin: Bilirubin hat in Konzentration von bis zu 200 mg/l keinen Einfluss auf die Ergebnisse, der größer als die Unpräzision des Assays selbst ist. Hämolyse: Erythrozytenkonzentrate haben in Konzentrationen bis zu 30 µl/ml keinen Einfluss auf die Ergebnisse, der größer als die Unpräzision des Assays selbst ist. Alternativer Probentyp: Um die Auswirkungen von verschiedenen Probenarten zu untersuchen, wurde Blut von 49 Freiwilligen in Röhrchen ohne Additiva, in Heparin- und EDTA Rörchen gesammelt. Die gemessenen absoluten Bereiche für Männer und Frauen sind nachstehend aufgeführt.

Absoluter Bereich

19 männliche freiwillige

Labormitarbeiterpg/ml

30 weibliche freiwillige

Labormitarbeiterpg/ml

Serum 9 – 47 0,7 – 3,6

Heparin 8 – 45 0,9 – 3,8

EDTA 13 – 79 1,3 – 5,7

Die zusammengefassten Resultate dieser 49 Proben, plus einer zusätzlichen Probe, führen nach linearer Regression zu folgender Statistik: (Heparin) = 0,95 (Serum) + 0,4 pg/ml r = 0,996

(EDTA) = 1,48 (Serum) + 1,1 pg/ml r = 0,957

Mittelwerte: 11,9 pg/ml (Heparin) 12,2 pg/ml (Serum) 19,2 pg/ml (EDTA)

Die Ergebnisse zeigen, dass heparinisiertes Plasma im Wesentlichen die gelatin Resultate aufweist we Serum, wohingegen EDTA-Plasma höhere Were ergot. Spezifität: Das in diesem Testbesteck verwendete Antiserum ist hochspezifisch mit sehr niedrigen Kreuzreaktivitäten zu anderen natürlich vorkommenden Steroiden oder Medikamenten. Bei Untersuchungen im Labor des Herstellers wurden folgende Kreuzreaktivitäten gemessen: (siehe Tabelle „Specificity“.)

Methodenvergleich: Der Assay wurde mit einem konventionellen Gleichgewichts-dialyse-Verfahren an 85 Serumproben (43 Männer, 42 Frauen) verglichen. Durch lineare Regression:

Männer (43) (TKTF) = 0,42 (Dialyse) + 9,8 pg/ml r = 0,67

Mittelwerte: 26,3 pg/ml (TKTF) 39,0 pg/ml (Dialyse)

Frauen (42) (TKTF) = 0,79 (Dialyse) + 1,0 pg/ml r = 0,75


Gesamt (85) (TKTF) = 0,55 (Dialyse) + 3,4 pg/ml r = 0,87


Der Freies Testosteron Coat-A-Count RIA wurde ebenfalls mit dem Gesamt Testosteron Coat-A-Count RIA an 109 Serumproben (51 Männer, 58 Frauen) verglichen. Durch lineare Regression:

Männer (51) (Frei) = 4,7 (Gesamt) + 0,7 r = 0,984

Mittelwerte: 23,6 pg/ml (Frei) 4,84 ng/ml (Gesamt)

Frauen (58) (Frei) = 6,1 (Gesamt) + 0,6 r = 0,978

Mittelwerte: 3,9 pg/ml (Frei) 0,54 ng/ml (Gesamt)

Gesamt (109) (Frei) = 4,6 (Gesamt) + 1,2 r = 0,992

Mittelwerte: 13,1 pg/ml (Free) 2,6 ng/ml (Gesamt)

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Coat-A-Count Testosterona libre Utilidad del análisis : El kit Coat-A-Count Testosterona libre es un radioinmunoanálisis (125I) en fase sólida diseñado para la determinación cuantitativa de la testosterona libre en suero. Su uso es estrictamente para el diagnóstico in vitro como ayuda en el diagnóstico clínico y en el manejo del hirsutismo debido a hiperandrogenismo. Referencia: TKTF1 (100 tubos), TKTF2 (200 tubos)

El kit de 100 tubos contiene menos de 4 microcurios (148 kilobequerelios) del análogo

de testosterona marcado con 125I radioactivo; El kit de 200 tubos contiene menos de 8 microcurios (296 kilobequerelios).

Resumen y explicación del Test La testosterona circula casi en su totalidad unida a proteínas transportadoras: normalmente, menos del uno por ciento está libre. La principal proteína transportadora de testosterona es conocida como globulina transportadora de hormonas sexuales (SHBG) o globulina transportadora de testosterona-estradiol (TeBG), ya que no sólo se une a testosterona sino también al estradiol (y a la dihidrotestosterona). La albúmina y la globulina transportadora de cortisol (CBG) son otras proteínas transportadoras de testosterona. Por tres razones, la SHBG es la más importante de esas proteínas transportadoras. Transporta, al menos en las mujeres, un porcentaje mayor de testosterona en la sangre que la albúmina ó CBG. Es más, se une a la testosterona con mayor afinidad que las otras dos proteínas transportadoras. (La testosterona unida a albúmina y CBG se conoce vulgarmente como testosterone “débilmente unida”). Finalmente, la SHBG

tiene una respuesta, no asociada a la albúmina, en el sentido de que los niveles de SHBG son sensibles a la proporción de estrógenos circulantes con respecto a los andrógenos circulantes. La SHBG, por ello, juega un papel más importante en la determinación de la testosterona libre circulante. En el embarazo, los niveles de SHBG muestran un incremento progresivo haciendo espejo con la elevación de los niveles de Estradiol. Como los niveles de testosterone total también muestran un cierto incremento durante el embarazo, la subida de Estradiol, y por ello de SHBG, es más pronunciada. El resultado neto es una disminución del porcentaje de testosterona libre en función de la testosterona total. Las mujeres que toman anticonceptivos orales van a tener elevados los niveles de SHBG, al menos si toman dosis elevadas de preparaciones de etinil-estradiol. Consecuentemente, la administración de andrógenos a los prepúberes, o la elevación de la testosterone endógena por estimulación con HCG, conllevan a una disminución significativa del nivel de SHBG. La obesidad también está asociada a una disminución del nivel de SHBG. Se puede esperar que la concentración de testosterone libre circulante aumente si el nivel de testosterone total (T) aumente o diminuya el nivel de SHBG. La relación T/SHBG sirve como una guía de la concentración de testosterona libre circulante. Esta relación T/SHBG, aveces, es denominada Indice de Testosterona Libre (TFI). El Indice de Testosterona Libre, a veces, se incrementa en acne severo, alopecia masculine androgénica, hirsutismo y otras enfermedades. En dichos casos, se puede observar un nivel bajo de SHBG, asociado aun nivel normal de testosterona total. Un incremento en la velocidad de producción de testosterona provoca la disminución de los niveles de SHBG. Esto provoca una estimulación celular y del metabolismo de la testosterona, haciendo más disponible su forma libre. El resultadoes que el nivel de testosterona total es normal debido a que se compensa su velocidad de producción elevada con un incremento de la velocidad de eliminación.


Las mediciones de testosterona total han sido tradicionalmente utilizadas como cribaje del hirsutismo. En vista del mecanismo explicado anteriormente, se espera que los niveles de testosterona libre, medidos directamente o mediante la proporción T/SHBG, correlacionen mejor con el hirsutismo. Algunos investigadores, sobre todo Paulson, han encontrado que la testosterona libre es extremadamente superior a la testosterona total para el cribaje de hirsutismo. En este estudio de 32 mujeres hirsutas, solo el 44 por ciento tenían elevados los niveles de testosterona total, mientras que las 32 mujeres tenían elevados los niveles de testosterona libre. No todos los investigadores han obtenido este grado de éxito. No obstante, a juzgar por los estudios revisados por Wu, parece ser que la testosterona libre es al menos marginalmente superior a la testosterona total en este contexto. (Los diferentes resultados pueden deberse a diferencias en la metodología y a la selección de los pacientes).

Principio del análisis En el procedimiento de Coat-A-Count Free Testosterone, el análogo de testosterona marcado con 125I compite por un periodo de tiempo determinado con la testosterona libre de la muestra del paciente por los sitios de unión de los anticuerpos específicos de testosterona inmovilizados en las paredes del tubo de polipropileno. Al decantarse los tubos, se aisla la fracción unida al anticuerpo y se cuenta en un contador gamma, siendo las cuenatas inversamente proporcional a la concentración de testosterona libre en la muestra. El ensayo está diseñado para mantener esencialmente inalterado el equilibrio original entre la testosterone libre y la unida a proteínas en la muestra del paciente. Se utiliza un trazador que no se une a las proteínas transportadoras de esteroides y un antisuero con una afinidad menor que la de la principal proteína transportadora de testosterona, la globulina transportadora de hormonas sexuales (SHBG). Además, se trabaja bajo condiciones fisiológicas de temperatura, pH y fuerza iónica. El procedimiento Coat-A-Count Free Testosterona es un ensayo directo o

único-tubo : su resultado no se calcula en función de la testosterona total y SHBG o algún otro parámetro, sino por interpolación en una curva estándar de concentraciones de testosterona libre. Por ello, difiere de los métodos tradicionales de diálisis al equilibrio y de los llamados índices de testosterona libre (TFI). También, es un ensayo monopaso, sin necesidad de un paso previo de incubación o aislamiento preliminar por diálisis de la fracción libre, filtración o cromatografía en columna. Además, el ensayo presenta las siguientes características: Tiempo total de incubación: 4 horas. Cuentas totales en la iodización: aproximadamente 60 000 cpm Reactivos a pipetear: 1

Advertencias y precauciones Para uso diagnóstico in vitro. Reactivos: Almacenar de 2–8°C en una cámara preparada para almacenar material radioactivo. Desechar de acuerdo a la legislación en vigor. No usar los reactivos después de su fecha de caducidad. Algunos componentes suministrados en el kit pueden contener material de origen humano y/o otros componentes potencialmente peligrosos que necesiten ciertas precauciones. Siga las precauciones universales y manipule todos los componentes como si fueran capaces de transmitir agentes infecciosos. Los materiales derivados de sangre humana han sido analizados y son negativos para sífilis; para anticuerpos frente al HIV 1 y 2; para el antígeno de superficie de hepatitis B y para los anticuerpos de hepatitis C. Se ha usado Azida sódica, en concentraciones menores de 0,1 g/dl, como conservante. Para su eliminación, lavar con grandes cantidades de agua para evitar la constitución de residuos de azidas metálicas, potencialmente explosivas, en las cañerías de cobre y plomo. Agua: Usar agua destilada o desionizada.


Radioactividad Una copia de cualquier certificado de licencia de radioisótopos (específico o general) emitido a la aduana de los EEUU se registrará en los ficheros de Siemens Healthcare Diagnostics antes de que se puedan enviar kits o componentes conteniendo material radioactivo. Estos materiales radioactivos pueden adquirirse por cualquier cliente con la licencia específica apropiada. Con una licencia general, estos materiales radioactivos pueden adquirirse solo por medicos, veterinarios en la prácrica de la medicina veterinaria, laboratorios clínicos y hospitales—y estrictamente para la clínica in vitro o test de laboratorio que no conlleven la administración interna o externa de material radioactivo o su radiación a humanos u otros animales. Su adquisición, recepción, almacenaje, uso, trasferencia y desecho están regulados y se expenderá una licencia (general o específica) de la Comisión Nuclear de EEUU o de un Estado con el NRC para su consiguiente control. Manejar los materiales radioactivos de acuerdo a los requerimientos de su licencia general o específica. Para minimizar la exposición a la radiación, el usuario debe adherirse al cuarto conjunto de guías publicadas por el National Bureau of Standards con el nombre Safe Handling of Radioactive Materials (Handbook No. 92, issued March 9, 1964) y en las consiguientes publicaciones de las autoridades Federales o Estatales. Limpiar y decontaminar rápidamente las superficies afectadas. Evitar la generación de aerosols. Eliminar los residuos sólidos radioactivos de acuerdo con los requerimientos de su licencia. Licencias generales (NRC Form 483) pueden eliminar sus residuos sólidos radioactivos como residuos no radioactivos, después de retirar las etiquetas. Licencias específicas (NRC Form 313) se deben referir al Título 10, Código de Regulaciones Federales, Parte 20. Las licencias en Estados Asociados deben referirse a las normativas de su correspondiente Estado. Licencias generales pueden eliminar sus residuos líquidos radioactivos contenidos en este tipo de productos como cualquier otro material líquido, quitando las etiquetas de los contenedores y procesándolos como

residuos sólidos. Licencias específicas pueden eliminar pequeñas cantidades de residuos líquidos radioactivos contenidos en este tipo de productos como cualquier otro material líquido. Refiérase a la normativa aplicable a su laboratorio.

Materiales Suministrados: Preparación Inicial Los materiales suministrados en este kit no son intercambiables con aquellos incluidos en el kit Coat-A-Count Total Testosterone, que está diseñado para la medición de la testosterona total.

Tubos recubiertos de anticuerpo frente a la testosterona libre (TTF1) Tubos de Polipropileno recubiertos con anticuerpos de conejo frente a la testosterona libre embalados en bolsas de cierre hermético. Almacenar refrigerados y protegidos de la condensación, cerrando cuidadosamente las bolsas después de su uso. Estable a 2–8°C hasta la fecha de caducidad impresa en la bolsa. Color: azul. TKTF1: 100 tubos. TKTF2: 200 tubos.

125I testosterona libre (TTF2) 105 ml de un análogo de testosterona radioactivo con azida sódica como conservante. Estable a 2–8°C durante 30 días después de su apertura, o hasta la fecha de caducidad impresa en el vial. TKTF1: 1 vial. TKTF2: 2 viales.

Calibradores de testosterona libre (TFC3–8) Seis viales de calibradores de testosterona libre, listos para su uso, en suero humano procesado con conservantes (azida sódica y gentamicina). El vial A ó calibrador cero contiene 2,0 ml, mientras que el resto de calibradores, viales B – F, contienen cada uno 1,0 ml. Estable a 2–8°C durante 30 días después de su apertura. TKTF1: 1 juego. TKTF2: 1 juego. Los calibradores tienen valores lote específicos de testosterona libre, aproximadamente: 0, 0,55, 2,5, 9,0, 25 y 50 picogramos por mililitro (pg/ml); equivalentemente: 0, 1,9, 8,7, 31, 87 y 173 picomoles por litro (pmol/l). Ver las etiquetas de los viales para conocer los valores exactos en pg/ml.


Materiales Requeridos pero no suministrados Contador Gamma compatible con los tubos de 12x75 mm. Vortex Tubos de ensayo de polipropileno de 12×75 mm para su uso como tubos T y NSB, disponibles en Siemens Healthcare Diagnostics (Referencia: PPO) Micropipetas: 50 µl y 1,0 ml. Baño de incubación capaz de mantener 37°C Rack de decantación – disponible en Siemens Healthcare Diagnostics (Referencia: FDR) Papel gráfico Logit-log Un control de inumoanálisis, a tres niveles, basado en suero humano, que contiene testosterona como uno de sus 25 constituyentes, disponible en Siemens Healthcare Diagnostics (Referencia: CON6).

Recogida de la muestra El paciente no necesita estar en ayunas así como tampoco cualquier otro tipo de preparación. Recoger la sangre por venopunción29 en tubos sin anticoagulante, y separar el suero de las células sanguíneas. Como EDTA tendría un efecto significativo en los resultados, no debe usarse como anticoagulante. Las muestras altamente lipémicas pueden dar lugar a resultados de testosterona libre erróneamente elevados. Se recomienda el uso de una ultracentrífuga para limpiar las muestras lipémicas. Las muestras hemolizadas podrían indicar una mala manipulación de la muestra antes de ser recibida por el laboratorio; en este caso, los resultados deben interpretarse con precaución. Los tubos para recoger sangre de distintos fabricantes pueden producir valores diferentes, dependiendo del material del tubo y de los aditivos, incluyendo barreras de gel o barreras físicas, activadores de la coagulación y/o anticoagulantes. El testosterona libre Coat-A-Count no ha sido analizado con todos los distintos tipos de tubos. Para obtener detalles sobre los tipos tubos que

se han analizado, consulte la sección de Tipos de Muestras Alternativos. Tratamiento con danazol: El danazol, un derivado sintético de la etisterona, se utiliza en el tratamiento de la endometriosis y la enfermedad fibroquística de las mamas. Los efectos secundarios androgénicos se han atribuido a un aumento en la disponibilidad de testosterona libre en pacientes sometidos a tratamiento con danazol. Por lo tanto, los pacientes que tomen danazol presentarán un aumento en las concentraciones de testosterona libre. Los estudios in vitro con el ensayo Coat-A-Count testosterona libre también muestran un incremento en la concentración aparente de la testosterona libre, en muestras cargadas con danazol.31 Después de una dosis oral de 100 mg, las concentraciones más altas de danazol en plasma informadas son de hasta 199 ng/ml, resultando en un cambio apreciable en las concentraciones de testosterona libre, a pesar de la baja reactividad cruzada informada.32 Consulte el porcentaje de reactividad cruzada en la Sección de “Especificidad”. Debido a esto se deberán interpretar las concentraciones de testosterona libre con precaución en pacientes sometidos a tratamiento con danazol. Volumen requerido: 50 µl por tubo. Conservación: 2 días a 2–8°C o 2 meses (alicuotados) a –20°C. Antes del ensayo, llevar todas las muestras a temperatura ambiente (15–28°C) y mezclar por inversión. Alicuotar, si es necesario, para evitar la repetición de congelación y descongelación. No intentar la descongelación de muestras congeladas calentándolas en un baño de agua.

Procedimiento del Radioinmunoanálisis Todos los componentes deben llevarse a temperatura ambiente (15–28°C) antes de su uso. 1 Tubos de ensayo: Marcar cuatro

tubos de ensayo de polipropileno (sin recubrir) 12x75 mm. Tubos T (cuentas


totales) y NSB (unión no específica) en duplicado. Al ser característicamente bajo la unión no específica en el ensayo Coat-A-Count, los tubos NSB pueden ser omitidos sin comprometer la precisión y control de calidad del ensayo.

Tubos recubiertos: Marcar doce tubos recubiertos de anticuerpo frente a la testosterona libre: A (máxima unión) y B hasta F por duplicado. Marcar tubos recubiertos de anticuerpo adicionales, también en duplicado, para controles y muestras de pacientes.

Calibrador Aproximado

pg/ml Aproximado

pmol/l

A (MB) 0 0

B 0,55 1,9

C 2,5 8,7

D 9,0 31

E 25 87

F 50 173

Nota: Los valores de los calibradores son lote específicos. Ver las etiquetas de cada vial de calibrador para conocer el valor en pg/ml.

2 Pipetear 50 µl del calibrador cero A en los tubos NSB y A, y 50 µl del resto de los calibradores, controles y muestras de los pacientes en sus correspondientes tubos. Pipetear directamente en el fondo del tubo. No intentar diluir las muestras que se prevén con alta concentración en el calibrador cero. (Como la dilución rompe el equilibrio entre la testosterona libre y unida, el sistema de ensayo puede no mantener la linealidad después de la dilución). Es una buena práctica el uso de micropipetas con punta desechables, cambiando las puntas entre las muestras, para evitar la contaminación por arrastre.

3 Añadir 1,0 ml de 125I Testosterona libre a todos los tubos. Mezclar en el Vortex. No se debe tardar más de 10 minutos durante la dispensación del trazador. Dejar los tubos T a un lado para su contaje (paso 6); no requieren más procesamiento posterior.

4 Incubar durante 4 horas a 37°C. El rack debe cubrirse con Parafilm para evitar la evaporación.

5 Decantar. Eliminar toda la humedad visible para mejorar la precisión. Decantar o aspirar el contenido de todos los tubos (excepto los tubos T) y dejar escurrir durante 2 o 3 minutos. Golpear los tubos contra papel absorbente para eliminar las gotas residuales.

6 Contar durante 1 minuto en un contador gamma.

Cálculo de resultados Para obtener resultados en términos de concentración a partir de una representación logit-log de la curva de calibración, primero hay que calcular para cada pareja de tubos las cuentas medias por minuto corregidas con el NSB: Cuentas netas = Media CPM menos Media NSB CPM

Entonces, determinar la unión de cada pareja de tubos como un porcentaje de la unión máxima (MB), tomando las cuentas corregidas con el NSB de los tubos A como 100%: Porcentaje de Unión = (Cuentas netas / Cuentas MB netas) × 100

(El cálculo puede simplificarse omitiendo la corrección de las uniones no específicas; las muestras dentro del rango de calibración van a dar virtualmente el mismo resultado cuando el porcentaje de unión es calculado directamente a partir de la media de las CPM). Usando papel gráfico logit-log, representar el porcentaje de unión en el eje vertical frente a la concentración en el eje horizontal (logarítmico) para cada calibrador no cero y dibujar la línea que pase por esos puntos aproximadamente. Los resultados de las muestras pueden ser leídos en la curva por interpolación. Es una buena práctica inspeccionar los resultados para comprobar la concordancia entre los replicados, y realizar una gráfica de la curva de calibración (aunque los cálculos se realicen por ordenador) para ver la


transformación más apropiada a usar y las posibles desviaciones en los puntos de calibración. También, recomendamos mantener un registro de los siguientes parámetros de la reducción de datos: T = Cuentas totales (como CPM)

%NSB = 100 × (Media cuentas NSB / Cuentas totales)

%MB = 100 × (Cuentas netas / Cuentas totales)

Y los cortes 20, 50 y 80 por ciento, donde 20% = Concentración al 20 Porciento de unión, etc.

Otras aproximaciones, por ejemplo, logística 4-parámetros, también son acep`tables. Ver Dudley RA, et al. “Guidelines for immunoassay data reduction”. Clin Chem 1985;31:1264-71. Ejemplo: Sólo como ilustración, no se puede utilizar para calcular resultados. Al ser los valores de los calibradores lote-específicos, las concentraciones expresadas en la columna derecha no pueden coincidir con los valores de los calibradores suministrados en su envío. (Ver tabla “Example Run”)

Control de Calidad Se deben procesar de manera rutinaria al menos dos niveles de controles (o pool de sueros) con diferente concentración de testosterona libre—baja y alta —. Informar de los resultados de los pacientes sólo si los resultados de los controles para este ensayo están dentro de los criterios de aceptabilidad establecidos por su laboratorio. Es una buena práctica de laboratorio registrar para cada ensayo los números de lote de los componentes usados, así como las fechas en las que fueron abiertos por primera vez y reconstituidos. También recomendamos el uso de gráficos diarios de los controles—como se describe, por ejemplo, en Westgard JO, et al. A multi-rule chart for quality control. Clin Chem 1981;27:493-501. Las muestras repetidas pueden servircomo una herramienta de valor adicional para monitorizar la precision interensayo, y que las parejas de los tubos del control pueden espaciarse a lo largo de la tanda de ensayo para verificar la ausencia de deriva significativa.

Valores esperados Los valores de testosterona libre para adultos sin disfunción gonadal aparente están recogidos tabulados abajo por sexo y edad. Las estadísticas muestras, como era de esperar, un decaimiento gradual en los niveles de testosterona libre en función de la edad en los adultos. Se han usado en este análisis resultados de hombres y mujeres entre 20 y 80 años—un total de 472 hombres y 113 mujeres —. El grupo de referencia consistía en voluntarios sanos en los que no se sospechaba enfermedad gonadal o que fue excluida por otros test de laboratorio. Los datos (cedidos desinterasadamente por los autores) provienen de su estudio publicado30 sobre los valores de referencia del ensayo Coat-A-Count Free Testosterona assay.

Unidades de masa (pg/ml)

Edad (años) n Media Rango

central 95%

Hombres

20 – 39 154 17,2 8,8 – 27

40 – 59 210 14,4 7,2 – 23

60 – 80 108 11,7 5,6 – 19

Mujeres

20 – 39 47 0,87 ND – 2,57

40 – 59 39 0,68 ND – 2,03

60 – 80 27 0,51 ND – 1,55

ND: no detectable

Unidades molares (pmol/l)

Edad (años) n Media Rango

central 95%

Hombres

20 – 39 154 60 31 – 94

40 – 59 210 50 25 – 80

60 – 80 108 41 19 – 66

Mujeres

20 – 39 47 3,0 ND – 8,9

40 – 59 39 2,3 ND – 7,0

60 – 80 27 1,8 ND – 5,4

ND: no detectable

Obsérvese que los criterios de selección pueden tener un impacto significativo en la determinación de los rangos de normalidad: en particular, se obtuvieron rangos más amplios en dicho estudio30


cuando se incluyeron en los datos resultados de pacientes sometidos a análisis de testosterona libre. Considerar estos límites solo como una guía. Cada laboratorio deberá establecer sus propios intervalos de referencia.

Características analíticas Las siguientes secciones contienen datos representatives de las características del kit Coat-A-Count Free Testosterone. Los resultados se expresan en pg/ml. Factor de Conversión: pg/ml × 3,467 → pmol/l Intervalo de calibración: Approximadamente 0,55 – 50 pg/ml (1,9 – 173 pmol/l). Los calibradores son lote-específicos. Sensibilidad analítica: 0,15 pg/ml. Precisión: Las estadísticas fueron calculadas en muestras procesadas por duplicado en más de 160 ensayos diferentes. (Véase la tabla "Precisión".) Perfil de Precisión: La gráfica muestra el perfil de precision con respecto a la dosis en base a los CVs intraensayo (círculos blancos) para doce muestras, calculado por análisis de varianza de 34 tandas. La línea que pasa aproximadamente por estos puntos representa los CVs intraensayo esperados par alas muestras que se procesen por duplicado. Para más información, los CVs interensayo mostrados en la tabla "Precision" se muestran como cuadrados negros (Ver tabla “Precision Profile”) Efecto deriva: Ninguno hasta aproximadamente 200 tubos. (Véase la tabla "End-of-Run Effect") Efecto de la SHBG: Para investigar el efecto de los niveles de la globulina transportadora de hormonas sexuales (niveles de SHBG) en el ensayo, un pool de suero humano absorbido en charcoal fue sobrecargado con SHBG hasta una concentración de 400 microgramos por mililitro, un nivel aproximadamente 1 000 veces superior a la normalidad. El suero sobrecargado de SHBG al ser ensayado con el kit Coat-A-Count Free Testosterona, mostró un valor de porcentaje de unión del 99% B/B0. Como la absroción con charcoal elimina testosterona del pool, debe tener

concentraciones cero de testosterone libre (y total)—esto es, los valores del porcentaje de unión serán cercanos al 100% B/B0—tanto antes como depués de la sobrecarga. Los resultados muestran, como se esperaba, que elensayo no está influenciado con los niveles de SHBG. Efecto de la Albúmina: Muestras liofilizadas fueron reconstituidas con soluciones acuosas que contenían 0, 1,0, 2,0 and 3,0 g/dl de albúmina sérica humana absorbida en charcoal, y se procesaron en paralelo. (Ver tabla "Effect of Albumin") Efecto de la absorción del Charcoal: Se analizaron muestras de pacientes con el kit Coat-A-Count Free Testosterona antes y depués de abosroción con charcoal. Se muestran las concentraciones de testosterona libre (en pg/ml) antes de la absorción con charcoal, y los valores del porcentaje de unión (%B/B0) siguientes a la absorción con charcoal. (Ver tabla "Effect of Charcoal Absorption") Los resultados demuestran que la absorción con charcoal esencialmente reduce el nivel aparente de testosterona libre en las muestras de los pacientes, analizadas con el kit Coat-A-Count, a cero, esto es a un valor de porcentaje de unión aproximado al 100% B/B0. Como la absroción con charcoal elimina testosterona conjuntamente con otros esteroides y moléculas pequeñas del suero de los pacientes, mientras que deja moléculas más grandes como la albúmina, SHBG y otras proteínas transportadoras, el experimento confirma que el kit Coat-A-Count Free Testosterona no está influenciado por los niveles de proteínas transportadoras. Bilirrubina: La presencia de bilirrubina en concentraciones hasta 200 mg/l no afecta a los resultados, en lo concerniente a precisión del ensayo. Hemólisis: La presencia de eritrocitos hasta concentraciones de 30 µl/ml no tiene efecto en los resultados, en lo concerniente a la precisión del ensayo. Tipo de Muestra Alternativa: para evaluar el efecto de los diferentes tipos de muestras alternativos, se recogió sangre de 49 voluntarios en tubos normales, tubos con Heparina y tubos con EDTA. Los rangos absolutos observados para


voluntarios masculinos y femeninos están recogidos en la siguiente tabla.

Intervalo absoluto

19 Voluntarios Masculinos

pg/ml

30 Voluntarios Femeninos

pg/ml

Suero 9 – 47 0,7 – 3,6

Heparina 8 – 45 0,9 – 3,8

EDTA 13 – 79 1,3 – 5,7

Los resultados combinados de estas 49 muestras – añadiendo una muestra adicional – cuando se sometieron a análisis de regresión lineal dieron lugar a las siguientes estad´siticas. (Heparina) = 0,95 (Suero) + 0,4 pg/ml r = 0,996

(EDTA) = 1,48 (Suero) + 1,1 pg/ml r = 0,957

Medias: 11,9 pg/ml (Heparina) 12,2 pg/ml (Suero) 19,2 pg/ml (EDTA)

Los resultados indican que el plasma heparinizado genera prácticamente los mismos resultados que el suero, mientras que el plasma con EDTA genera valores más elevados. Especificidad: El anticuerpo frente a la testosterona libre es altamente específico para la testosterona, con una reactividad cruzada extremadamente baja con otros esteroides naturales o medicamentos que puedan estar presentes en el suero del paciente. (Véase la tabla "Especificidad".) Comparación de los métodos: El ensayo fué comparado con el método convencional de diálisis de equilibrio en 85 muestras séricas (43 hombres y 42 mujeres). Por regresión lineal:

Hombres (43) (TKTF) = 0,42 (Diálisis) + 9,8 pg/ml r = 0,67

Medias: 26,3 pg/ml (TKTF) 39,0 pg/ml (Diálisis)

Mujeres (42) (TKTF) = 0,79 (Diálisis) + 1,0 pg/ml r = 0,75


Combinado (85) (TKTF) = 0,55 (Diálisis) + 3,4 pg/ml r = 0,87


El ensayo Coat-A-Count Free Testosterone también se compare con el ensayo Coat-A-Count Total Testosterone en 109 muestras séricas (51 hombres y 58 mujeres). Por regresión lineal:

Hombres (51) (Libre) = 4,7 (Total) + 0,7 r = 0,984

Medias: 23,6 pg/ml (Libre) 4,84 ng/ml (Total)

Mujeres (58) (Libre) = 6,1 (Total) + 0,6 r = 0,978


Combinado (109) (Libre) = 4,6 (Total) + 1,2 r = 0,992


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Testostérone Libre Coat-A-Count Domaine d'utilisation : Testostérone libre Coat-A-Count est un radioimmunodosage à l'iode 125 en phase solide destiné à la mesure quantitative de la testostérone libre dans le sérum. Il est strictement réservé à un usage diagnostic in vitro et constitue une aide au diagnostic


clinique et au suivi de l'hirsutisme dû à une hypersécrétion d'androgènes. Référence catalogue : TKTF1 (100 tubes), TKTF2 (200 tubes)

Le coffret de 100 tubes contient moins de 4 microcuries (148 kilobecquerels) de

testostérone analogue réactive marquée à l'iode 125. Le coffret de 200 tubes contient moins de 8 microcuries (296 kilobecquerels).

Introduction La testostérone ne circule que presque entièrement liée à des protéines de transport: normalement, moins de 1% est libre. La principale protéine de transport de la testostérone est connue pour être la SHBG (sex hormone binding globulin) ou la TEBG (testosterone-estradiol binding globulin), puisque cette dernière se lie non seulement à la testostérone mais également à l'estradiol (et à la dihydrotestostérone). Albumine et cortisol binding globulin (CBG) sont les autres protéines de transport de la testostérone. Pour 3 raisons, la SHBG est la protéine de transport la plus importante: elle transporte, au moins chez les femmes, un pourcentage plus élevé de testostérone en circulation que l'albumine ou la CBG. De plus, elle se lie à la testostérone avec une affinité beaucoup plus élevée que ne le font les deux autres protéines de transport (La testostérone liée à l' albumine et à la CBG est reconnue comme une testostérone « faiblement liée »). Finalement, la SHBG a une réaction non liée à l'albumine, dans la mesure où le taux de SHBG est sensible aux modifications du rapport entre les estrogènes et les androgènes circulants. La SHBG joue ainsi un rôle plus important dans la détermination du taux de testostérone libre en circulation. Lors d'une grossesse, les taux de SHBG montrent une augmentation progressive qui reflète l'augmentation des taux d'estradiol. Bien que le taux de testostérone totale montre également une certaine augmentation durant la grossesse, l'augmentation en estradiol, et par conséquent celle en SHBG, sont beaucoup plus impressionnantes. Le résultat net est une diminution de la testostérone libre qui est un pourcentage

de la testostérone totale. Les femmes sous contraceptifs oraux ont des taux de SHBG augmentés, au moins si elles prennent des fortes doses de préparations d'éthinyl estradiol. A l'inverse, l'administration d'androgènes chez les garçons prépubères, ou l'élévation de la testostérone endogène par une stimulation par l'HCG, induisent une diminution significative du taux de SHBG. L'obésité est également associée à une baisse du taux de SHBG. Toutes choses étant égales par ailleurs, la concentration de testostérone libre dans la circulation augmente si la testostérone (T) augmente ou si le taux de SHBG diminue. Le rapport T/SHBG, c'est à dire testostérone totale sur la concentration ou la capacité de liaison de SHBG, est utilisé comme une approche de la concentration de testostérone libre dans la circulation. Le rapport T/SHBG est parfois appelé Index de Testostérone libre (TFI). L'Index de Testostérone libre est souvent augmenté dans l'acné sévère, l'alopécie mâle androgénique, l'hirsutisme et d'autres situations. Un taux bas de SHBG, souvent associé avec un taux normal de testostérone totale, est un profil habituel dans ces conditions. Une augmentation de la production de testostérone est typiquement due à une diminution du taux de SHBG. Ceci stimule le passage cellulaire et le métabolisme de la testostérone, en augmentant la disponibilité de la forme libre. Le résultat est que le taux de testostérone totale est souvent normal, car le taux de production augmente et est compensé par une augmentation de la clairance. Les dosages de testostérone totale sont traditionnellement utilisés pour le dépistage de l'hirsutisme. Selon le mécanisme décrit ci-dessus, il est logique d'observer des taux de testostérone libre, mesurés directement ou approchés par le rapport T/SHBG, mieux corrélés à l' hirsutisme. Quelques experts, dont Paulson, ont observé que la testostérone libre a une supériorité accablante sur la testostérone totale dans le dépistage de l'hirsutisme. Dans cette étude sur 32 femmes hirsutes, seulement 44 % ont des taux de testostérone totale élevés, alors que les 32 ont des taux de testostérone libre élevés. Toutes les études n'ont pas confirmé ce succès. Cependant sur la


base d'une revue d'études faite par Wu, il apparaît que la testostérone libre peut être parfois supérieure à la testostérone totale dans ce contexte. (Les diverses conclusions pourraient être dues à des différences de méthodologie et de sélection des patients.)

Principe du test Le dosage Coat-A-Count Testostérone libre est une méthode radioimmunologique qui repose sur la compétition au cours d'une incubation donnée entre l'analogue de la Testostérone marquée à l'Iode 125 et la Testostérone libre contenue dans l'échantillon du patient, vis-à-vis des sites de l'anticorps spécifique de la testostérone immobilisé sur la paroi des tubes en polypropylène. On élimine le surnageant et on sépare ainsi la fraction radioactive liée à l'anticorps. On compte le tube dans un compteur gamma, la radioactivité étant inversement proportionnelle à la concentration de Testostérone libre dans l'échantillon. La méthode ne modifie pas l'équilibre entre la Testostérone libre et celle liée aux protéines dans l'échantillon du patient. Elle utilise un traceur, qui ne se lie pas aux protéines de transport des hormones stéroïdes, et un antisérum possédant, pour la Testostérone, une affinité légèrement plus faible que pour la protéine de transport la plus importante : la SHBG (Sex Hormone Binding Globulin). De plus, le dosage est réalisé dans des conditions de température, de pH et de force ionique physiologiques. La technique Coat-A-Count Testostérone libre est une méthode directe. Les résultats ne sont pas déterminés à partir de la concentration totale de Testostérone, de SHBG ou d'autres paramètres mais ils sont calculés à partir d'une courbe standard établie à l'aide de concentrations en Testostérone libre. Cette méthode diffère donc des méthodes conventionnelles de dialyse à l'équilibre et de celles fondées sur la détermination de l'index de Testostérone libre (TFI). C'est une méthode en une seule étape, ne nécessitant ni pré-incubation ni isolement préalable de la fraction libre par dialyse, filtration ou chromatographie sur colonne. Elle présente également les caractéristiques suivantes :

Temps total d'incubation : 4 heures. Activité totale en début de marquage : environ 60 000 cpm Réactifs à distribuer : 1

Précautions d'emploi Réservé à un usage diagnostique in vitro. Réactifs : Conserver à +2–8°C dans un réfrigérateur autorisé à recevoir du matériel radioactif. Éliminer les déchets conformément aux lois en vigueur. Ne pas utiliser les réactifs au delà de leur date d'expiration. Certains composants fournis avec ce coffret peuvent contenir des agents humains et/ou d'autres éléments potentiellement infectieux qui nécessitent certaines précautions. Respecter les précautions d'emploi et manipuler tous les composants du coffret comme des produits potentiellement infectieux. Les réactifs dérivés de produits humains et utilisés dans ce coffret ont subi un test sérologique pour la Syphilis et des tests de dépistage pour les anticorps anti-VIH1 et 2, anti-VHC et pour l'antigène de surface de l'hépatite B, qui se sont tous avérés négatifs. De l'azide de sodium à des concentrations inférieures à 0,1 g/dl a été ajouté comme conservateur ; lors de l'élimination, l'évacuer avec de grandes quantités d'eau pour éviter une accumulation d'azides métalliques explosifs dans les canalisations. Eau : utiliser de l'eau distillée ou désionisée.

Radioactivité Ce coffret de réactif est reservé à l'usage in vitro (Autorisation DGSNR). Règles de base de protection contre les rayonnements ionisants et précautions d'emploi. Ce produit radioactif ne peut être reçu, acheté, détenu ou utilisé que par des personnes autorisées à cette fin et dans des laboratoires dotés de cette autorisation. Cette solution ne peut en aucun cas être administrée à l'homme ou aux animaux. Respecter impérativement les dates de péremption indiquées sur l'emballage extérieur et sur les étiquettes


des différents réactifs du coffret. Tous les réactifs, dont les tubes revêtus d'anticorps, doivent être conservés à + 4/+ 8° C dans leur conditionnement d'origine avant d'être utilisés. L'achat, la possession, l'utilisation et l'échange de matières radioactives sont soumis aux réglementations en vigueur dans le pays de l'utilisateur. Les règles de base de protection contre les rayonnements ionisants doivent être respectées selon des procédures en vigueur. Ne pas pipeter des solutions radioactives avec la bouche. Eviter le contact direct avec la peau ou les muqueuses de tout produit radioactif en utilisant des blouses et gants de protection. Toute manipulation de matières radioactives se fera dans un local ad hoc éloigné de tout passage. Les produits radioactifs seront stockés dans leur conditionnement d'origine dans un local approprié. Un cahier de réception et de stockage de produits radioactifs sera tenu à jour. Le matériel de laboratoire et la verrerie qui ont été contaminés doivent être éliminés au fur et à mesure afin d'éviter une contamination croisée de plusieurs isotopes. Chaque contamination ou perte de substance radioactive devra être réglée selon les procédures établies. Toute mise aux déchets de matière radioactive se fera en accord avec les réglementations en vigueur. Ne pas manger, ni boire, ni fumer, ni appliquer des cosmétiques dans les laboratoires où des produits radioactifs sont utilisés. Les réactifs radioactifs ne peuvent être vendus qu'à des personnes habilitées à manipuler des substances radioactives.

Materiel Fourni : Préparation Initiale Les composants fournis avec ce coffret ne sont pas interchangeables avec ceux du coffret Testostérone Totale Coat-A-Count qui n'est dédié qu'à la mesure de la testostérone totale.

Tubes revêtus d'anticorps anti Testostérone libre (TTF1) Tubes en polypropylène revêtus d'anticorps de lapin anti testostérone libre, conditionnés dans des sacs hermétiques. Les conserver réfrigérés et protégés de l'humidité, bien refermer les sachets après utilisation. Stable à +2–8°C jusqu'à la date d'expiration notée sur le sachet. Couleur:

bleu vert. TKTF1 : 100 tubes. TKTF2 : 200 tubes.

Traceur I125 Testostérone libre (TTF2) 105 ml de testostérone analogue marquée à l'I125 avec de l'azide de sodium comme conservateur. Stable à +2–8°C pendant 30 jours après ouverture, ou jusqu'à la date d'expiration notée sur le flacon. TKTF1 : 1 flacon. TKTF2 : 2 flacons.

Standards Testostérone libre (TFC3–8) Six flacons de standards Testostérone libre, prêts à l'emploi, dans du sérum humain prétraité avec conservateurs (azide de sodium et gentamicine). Le flacon A de standard zéro contient 2 ml, alors que les autres flacons de standards, de B à F, contiennent 1 ml chacun. Stable à +2–8°C pendant 30 jours après ouverture. TKTF1 : 1 jeu. TKTF2 : 1 jeu. Les standards Testostérone libre ont des valeurs propres à leur lot, approximativement 0, 0.55, 2.5, 9, 25 et 50 picogrammes par millilitres (pg/ml); équivalant à environ 0, 1.9, 8.7, 31, 87 et 173 picomoles par litre (pmol/l). Se reporter à l'étiquette du flacon pour les valeurs exactes en pg/ml.

Matériel requis mais non fourni Compteur Gamma—permettant l'utilisation de tubes standards 12x75 mm Agitateur de type Vortex Tubes secs en polypropylène 12x75 mm—à utiliser comme les tubes T et NSB, disponibles chez Siemens Healthcare Diagnostics (Référence catalogue : PPO) Micropipettes : 50 µl et 1 ml. Bain-marie pouvant maintenir une température d'incubation de 37°C Un portoir de décantation—disponible chez Siemens Healthcare Diagnostics (Référence catalogue : FDR) Papier graphe Logit-log Un contrôle, à base de sérum humain, à trois niveaux de concentration, contenant de la testostérone (parmi l'un des plus de 25 constituants dosés), est disponible chez Siemens Healthcare Diagnostics (Référence catalogue : CON6).


Recueil des échantillons Le patient n'a pas besoin d'être à jeun et aucune préparation spéciale n'est requise. Prélever le sang par ponction veineuse 29 sur tubes secs (sans anticoagulant), et séparer le sérum des cellules. L'EDTA étant susceptible d'avoir un impact significatif sur les résultats, il ne devrait pas être utilisé comme anti-coagulant. Les échantillons de sérum lipémiques peuvent entraîner des résultats de testostérone libre faussement élevés. L'utilisation d'une ultracentrifugeuse est recommandé pour la clarification des échantillons lipémiques Des échantillons hémolysés peuvent être révélateurs d'une préparation inadéquate du prélèvement avant son envoi au laboratoire ; il faudra donc interpréter les résultats avec prudence. Des tubes pour prélèvements sanguins provenant de fabricants différents peuvent donner des résultats différents, selon les matériaux et additifs utilisés, y compris gels ou barrières physiques, activateurs de la coagulation et/ou anticoagulants. Le coffret Testostérone libre Coat-A-Count n'a pas été testé sur tous les types de tubes possibles. Veuillez consulter le chapitre intitulé Autres Types d'Échantillons pour plus de renseignements sur les tubes qui ont été évalués. Traitement par Danazol : Le Danazol, dérivé d'un stéroïde de synthèse l'éthistérone, est utilisé pour le traitement de l'endométriose et dans les maladies fibrokystiques du sein. Les effets secondaires androgéniques ont été attribués à la présence augmentée de testostérone libre chez les patients sous traitement par Danazol. Ainsi, les patients prenant du Danazol auront des concentrations augmentées de testostérone libre. Des études in vitro avec le dosage Coat-A-Count Testostérone Libre montre également une augmentation apparente des concentrations de testostérone libre dans les échantillons surchargés en Danazol.31 La concentration plasmatique maximale en Danazol après absorption orale d'une dose de 100 mg est reportée comme étant supérieure à 199 ng/ml,

conduisant à une modification nette des concentrations de testostérone libre malgré la faible réaction croisée rapportée.32 Se reporter au chapitre Spécificité pour les pourcentages de réactions-croisées. Il est donc recommandé une grande attention lors de l'interprétation des taux de testostérone libre chez les patients sous traitement par Danazol. Volume nécessaire : 50 µl par tube. Conservation : 2 jours à +2–8°C ou 2 mois (aliquotés) à –20°C. Avant le dosage, laisser les échantillons revenir à température ambiante (15–28°C), mélanger doucement par rotations ou retournement. Aliquoter, si nécessaire, afin d'éviter de répéter les cycles congélation / décongélation. Ne pas tenter de décongeler les spécimens congelés à l'aide d'un bain marie.

Protocole de dosage Tous les composants doivent être à température ambiante avant leur utilisation (15–28°C). 1 Tubes secs : Etiqueter deux séries

de tubes (non revêtus) en polypropylène 12x75 mm tubes T et NSB (Non Specific Binding) en duplicate. La valeur du NSB dans la technique Coat-A-Count étant très faible, elle peut être négligée sans que la précision ou le contrôle de qualité ne soient modifiés.

Tubes revêtus d'anticorps : Etiqueter 12 tubes revêtus d'anticorps anti Testostérone libre de A (liaison maximale) et B jusqu'à F en duplicate. Etiqueter une série de tubes en double pour les échantillons de patients et les contrôles.

Standard Environ pg/ml

Environ pmol/l

A (B0) 0 0

B 0,55 1,9

C 2,5 8,7

D 9,0 31

E 25 87

F 50 173

Note: Les concentrations des standards sont spécifiques d'un lot. Se reporter à l'étiquette du


flacon pour les valeurs exactes en pg/ml.

2 Pipeter 50 µl de standard zéro A dans les tubes du LNS, dans les tubes A, et 50 µl de chacun des autres standards, contrôles et échantillons de patient dans les tubes correspondants. Pipeter directement au fond du tube. Ne pas diluer avec le standard zéro les échantillons de patients suspectés de contenir de fortes concentrations. (Puisque la dilution déplace l'équilibre entre la testostérone libre et la testostérone liée, le système de dosage ne reste pas linéaire au cours de la dilution.) Il est bon d'utiliser des embouts jetables de micropipettes, de changer d'embout entre les échantillons de manière à éviter toute contamination.

3 Ajouter 1 ml de Testostérone libre marquée à l'Iode 125 dans chaque tube. Agiter au Vortex. Le temps d'addition du traceur ne doit pas dépasser 10 minutes. Les tubes T peuvent être mis de côté jusqu'au comptage (étape 6); ils n'ont pas d'autre traitement.

4 Laisser incuber pendant 4 heures à 37°C. Le portoir doit être recouvert d'un film protecteur afin d'éviter toute évaporation.

5 Décanter complétement. Eliminer toute trace d'humidité pour améliorer la précision du dosage. A l'aide d'un portoir de décantation, décanter ou aspirer le contenu de tous les tubes (excepté les tubes T) et laisser les tubes retournés pendant 2 ou 3 minutes. Puis appliquer les fortement sur du papier absorbant afin d'éliminer les gouttelettes résiduelles.

6 Compter 1 minute dans un compteur gamma.

Calcul des Résultats Afin d'obtenir des résultats en concentrations à partir d'une représentation logit-log de la courbe de calibration, calculer pour chaque doublet de tubes les coups corrigés: moyenne cpm-moyenne des cpm du LNS :

Coups corrigés = Moyenne CPM moins Moyenne LNS CPM

Puis déterminer pour chaque doublet la capacité de liaison en pourcentage de liaison maximale (MB), corrigée des cpm dus au NSB des tubes A tubes considérés à 100%: % liaison = (Cpm corrigés / Cpm corrigés B0) × 100

(Le calcul peut être simplifié en négligeant la correction due au LNS. Les échantillons dans la gamme de calibration donnent des résultats pratiquement identiques quand la capacité de liaison est calculée directement à partir de la moyenne des CPM.) En utilisant un papier logit-log, on porte en ordonnée les pourcentages de liaison en fonction des concentrations des standards qui ne sont pas à zero, en abscisse. On trace une ligne droite passant approximativement par ces points. Les concentrations en Testostérone libre des échantillons inconnus sont déterminées par interpolation sur la courbe standard. Il est bon de vérifier les doublets et de construire une représentation graphique de la courbe de calibration (même si celle-ci est faite par ordinateur) avec les différentes valeurs de façon à visualiser le meilleur tracé et c'est une façon de détecter les points deviants. Nous recommandons aussi de suivre les paramètres suivants : T = Activité totale (cpm)

%LNS = 100 × (Moyenne des cpm du LNS / pm Totaux)

%B0 = 100 × (cpm corrigés / cpm totaux)

Et les intercepts à 20, 50 et 80 % avec 20% = Concentration à 20 % de liaison, etc.

Note : d'autres approches sont possibles comme l'intégration de paramètres 4-p logistique. Se rapporter à Dudley RA, et al. Guidelines for immunoassay data reduction. Clin Chem 1985;31:1264-71. Exemple de série: A titre d'exemple uniquement, et non pour calculer des résultats provenant d'une autre série. Comme les valeurs des standards sont lot-dépendantes, les concentrations indiquées peuvent être différentes de


celles de vos livraisons. (Se rapporter au tableau « Example Run ».)

Contrôle de Qualité Les contrôles (ou pools de sérums) avec au moins deux taux de concentration de testostérone libre – haut et bas - doivent être dosés en routine comme des échantillons inconnus. Les résultats de patient ne doivent être validés que si les résultats des contrôles correspondent aux critères d'acceptation établis par votre laboratoire. Il est bon d'enregistrer pour chaque dosage les numéros de lots des composants utilisés ainsi que la date à laquelle ils ont été reconstitués ou ouverts. Nous recommandons également de noter jour après jour les résultats des contrôles—comme décrit par exemple dans Westgard JO, et al. A multi-rule chart for quality control. Clin Chem 1981;27:493-501. Noter qu'un redosage d'échantillon peut être précieux pour suivre la précision inter essai, et que les doublets de tubes contrôle peuvent être espacés de façon à vérifier l'absence de dérive significative.

Valeurs de référence Les valeurs de testostérone libre chez les adultes sans dysfonctionnement gonadique apparent ou suspecté sont résumés ci-dessous par sexe et âge. Les statistiques montrent, de façon attendue, une diminution progressive des taux de testostérone libre en fonction de l'âge chez les adultes. Des résultats d'hommes et femmes de 20 à 80 ans—au total 472 hommes et 113 femmes—ont été utilisés. Le groupe de référence comprend des volontaires sains et des sujets chez qui une atteinte gonadique n'était pas suspectée ou avait été écartée par des examens de laboratoire. Cet ensemble donné (communiqué par les auteurs) vient d'une étude publiée30 sur les valeurs de référence pour le Coat-A-Count Testostérone libre.

Unités (pg/ml)

Age (années) n Médiane

DomaineCentré à

95%

Hommes

20 – 39 154 17,2 8,8 – 27

40 – 59 210 14,4 7,2 – 23

60 – 80 108 11,7 5,6 – 19

Femmes

20 – 39 47 0,87 ND – 2,57

40 – 59 39 0,68 ND – 2,03

60 – 80 27 0,51 ND – 1,55

ND: non détectable

Unités (pmol/l)

Age (années) n Médiane

DomaineCentré à

95%

Hommes

20 – 39 154 60 31 – 94

40 – 59 210 50 25 – 80

60 – 80 108 41 19 – 66

Femmes

20 – 39 47 3,0 ND – 8,9

40 – 59 39 2,3 ND – 7,0

60 – 80 27 1,8 ND – 5,4

ND: non détectable

Noter que les critères de sélection peuvent avoir un impact significatif sur la détermination des intervalles de référence: en particulier, des intervalles plus larges ont été obtenus dans les études publiées 30 lorsque le recrutement était étendu afin d'inclure des patients ayant été soumis à un dosage de testostérone libre. Utiliser ces valeurs à titre indicatif uniquement. Chaque laboratoire devrait établir ses propres valeurs de référence.

Performances du test Le chapitre suivant contient des données représentatives des performances du coffret Coat-A-Count Testostérone libre. Les résultats sont donnés en pg/ml. Facteur de conversion : pg/ml × 3,467 → pmol/l Domaine de mesure : Approximativement 0,55 – 50 pg/ml


(1,9 – 173 pmol/l). Les calibrateurs sont lot-dépendants. Sensibilité analytique : 0,15 pg/ml. Précision : Les valeurs ont été calculées pour des échantillons à partir de résultats de doublets sur plus de 160 dosages différents. (Voir le tableau « Précision ».) Profil de Précision : Le graphe montre un profil de précision pour le test basé sur les CVs intra série (cercles) pour 12 échantillons, chaque point a été calculaté par analyse de variance à partir de 34 séries. La courbe, qui passe approximativement par tous ces points, représente le CV intra série attendu pour des échantillons testés en double. Pour information les CVs inter série indiqués dans le tableau « Précision » sont représentés par des carrés pleins. (Se reporter au graphe « Precision Profile ».) Effet de la position des tubes : Aucun jusqu'à 200 tubes. (Se reporter au tableau « End-of-Run Effect ».) Effet de la SHBG : Afin de déterminer l'effet sur le dosage de la SHBG, on a ajouté à un pool de sérum humain adsorbé sur du charbon, une solution à 400 µg/ml de SHBG (concentration 1 000 fois supérieure à la normale). Le pool ainsi traité, dosé par la technique Coat-A-Count Testostérone libre a donné la valeur de 99 % pour B/Bo. Le but de l'adsorption sur le charbon étant de soustraire la Testostérone du pool de sérums, les concentrations de testostérone libre (et totale) doivent être nulles et les valeurs du pourcentage B/Bo avant et après addition de la SHBG doivent être proches de 100 %. C'est ce que démontrent les résultats : il n'y a aucune influence du taux de la SHBG sur le dosage. Albumine : Des échantillons lyophilisés ont éte reconstitués avec des solutions aqueuses contenant 0, 1, 2 et 3 g/dl de sérum albumine humaine adsorbée sur du charbon et dosés en parallèle. (Se rapporter au tableau « Effect of Albumin ».) Effet de l'adsorption sur charbon : Des échantillons de patients ont été dosés par la méthode Coat-A-Count Testostérone libre avant et après adsorption sur charbon. La concentration en Testostérone libre (en pg/ml) avant

adsorption sur charbon, et les valeurs du pourcentage de liaison (%B/Bo) après adsorption sur charbon sont indiquées dans le tableau. (Se rapporter au tableau « Effect of Charcoal Absorption ».) Les résultats montrent que l'adsorption sur charbon abaisse le taux de Testostérone libre des échantillons de patients, mesurés par Coat-A-Count Testostérone libre jusqu'à zéro, soit des pourcentages B/Bo proches de 100 %. L'adsorption par le charbon a pour but d'éliminer des échantillons sériques la Testostérone ainsi que d'autres stéroïdes et petites molécules, en conservant les grosses molécules telles que l'albumine, la SHBG et autres protéines de liaison. Cette expérience confirme donc que la concentration des protéines de « transport » de la Testostérone libre n'a aucune influence sur le dosage. Bilirubine : La présence de bilirubine à des concentration allant jusqu'à 200 mg/l n'a aucun effet sur les résultats ni sur la précision du dosage. Hémolyse : La présence d'hémoglobine jusqu'à une concentration de 30 µl/ml, n'a aucun effet sur les résultats de précision du dosage. Autres types d'échantillons : pour estimer l'effet de l'utilisation de différents type d'échantillons, 49 volontaires ont été prélevés sur tubes secs, héparinés et sur tubes EDTA. Les valeurs absolues observées chez les hommes et les femmes volontaires sont reportées dans le tableau ci-dessous.

Domaine absolu

19 Hommes volontaires

pg/ml

30 Femmes volontaires

pg/ml

Sérum 9 – 47 0,7 – 3,6

Hépariné 8 – 45 0,9 – 3,8

EDTA 13 – 79 1,3 – 5,7

Les résultats combinés de ces 49 échantillons—plus un supplémentaire—ont donné les statistiques suivantes lors d'un traitement par test de régression linéaire. (Hépariné) = 0,95 (Sérum) + 0,4 pg/ml r = 0,996

(EDTA) = 1,48 (Sérum) + 1,1 pg/ml r = 0,957

Moyennes : 11,9 pg/ml (Hépariné)


12,2 pg/ml (Sérum) 19,2 pg/ml (EDTA)

Les résultats démontrent que le plasma hépariné donne pratiquement les mêmes résultats que le sérum alors que le plasma EDTA donne des valeurs plus élevées. Spécificité : L'anticorps anti testostérone libre est hautement spécifique de la testostérone et a une réaction croisée très faible avec les autres stéroïdes courants ou médicaments qui peuvent être présents dans l'échantillon du patient. (se reporter au tableau « Specificity ».) Comparaison de méthodes : Le dosage a été comparé à une méthode de dialyse à l'équilibre sur 85 échantillons de sérum (43 hommes et 42 femmes). Par régression linéaire :

Hommes (43) (TKTF) = 0,42 (Dialyse) + 9,8 pg/ml r = 0,67

Moyennes : 26,3 pg/ml (TKTF) 39,0 pg/ml (Dialyse)

Femmes (42) (TKTF) = 0,79 (Dialyse) + 1,0 pg/ml r = 0,75

Moyennes : 4,3 pg/ml (TKTF) 4,1 pg/ml (Dialysis)

Ensemble (85) (TKTF) = 0,55 (Dialyse) + 3,4 pg/ml r = 0,87

Moyennes : 15,4 pg/ml (TKTF) 21,8 pg/ml (Dialyse)

La procédure Coat-A-Count Testostérone libre a été également comparée à un dosage de la Testostérone totale —Coat-A-Count Testostérone Totale—sur 109 échantillons de sérum (51 hommes et 58 femmes). Par régression linéaire :

Hommes (51) (Libre) = 4,7 (Total) + 0,7 r = 0,984

Moyennes : 23,6 pg/ml (Libre) 4,84 ng/ml (Total)

Femmes (58) (Libre) = 6,1 (Total) + 0,6 r = 0,978


Ensemble (109) (Libre) = 4,6 (Total) + 1,2 r = 0,992


Assistance technique Contacter votre distributeur national. www.siemens.com/diagnostics

Le Système Qualité de Siemens Healthcare Diagnostics Inc. est certifié ISO 13485:2003.

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Coat-A-Count Testosterone Libero Uso: Il dosaggio Coat-A-Count Testosterone Libero è un dosaggio radioimmunologico marcato con I125 in fase solida per la determinazione quantitativa del testosterone libero nel siero. A solo uso diagnostico in vitro quale ausilio nella diagnosi clinica e nella gestione dell'irsutismo dovuto ad iperandrogenismo. Codice:TKTF1 (100 provette), TKTF2 (200 provette)

Il kit a 100 determinazioni contiene meno di 4 microcurie (148 kilobecquerel) di analogo del

testosterone marcato con I125; il kit da 200 determinazioni contiene meno di 8 microcurie (296 kilobecquerel).

Riassunto e Spiegazione del Test Il Testosterone circola quasi interamente legato alle proteine di trasporto: normalmente meno dell'1% è libero. La proteina principale di trasporto per il testosterone è nota come globulina legante gli ormoni sessuali (SHBG) o globulina legante il testosterone-estradiolo (TeBG), poiché si lega non solo al testosterone, ma anche all'estradiolo (ed al diidrotestosterone). Le globuline leganti


l'albumina ed il cortisolo (CBG) sono le altre proteina di trasporto del testosterone. Per tre ragioni, l'SHBG è la più importante di queste proteine di trasporto. Porta, almeno nelle donne, una percentuale più elevata di testosterone in circolo di quanto non facciano sia l'albumina che la CBG. Inoltre, si lega al testosterone con un'affinità molto più elevata di quanto non facciano le altre due proteine di trasporto. (Il testosterone legato all'albumina ed alla CBG è noto come testosterone a “legame debole”). Infine, l'SHBG ha una rispondenza, non associata all'albumina, dal momento che il livello di SHBG è sensibile ai cambiamenti in rapporto agli estrogeni circolanti verso gli androgeni circolanti. L'SHBG gioca un ruolo preponderante nella determinazione del livello di testosterone libero in circolo. In gravidanza, i livelli di SHBG presentano un innalzamento progressivo che rispecchia l'incremento dei livelli di estradiolo. Benchè il livello di testosterone totale presenti anche degli incrementi durante la gravidanza, l'aumento dell'estradiolo, e quindi dell'SHBG è più drammatico. Il risultato netto è un decremento del testosterone libero sulla percentuale di testosterone totale. Donne che assumono contraccettivi orali presentano in maniera analoga un incremento dei livelli di SHBG, almeno nei casi in cui assumano dosi elevate di preparati a base di etinil estradiolo. Diversamente, la somministrazione di androgeni a fanciulli prepubertà, o l'aumento di testosterone endogeno attraverso stimolazione con HCG, provoca un decremento significativo nei livelli di SHBG. L'obesità è anch'essa associata ad un decremento del livello di SHBG. Se le altre condizioni rimangono immutate, ci si attende che la concentrazione di testosterone libero in circolo aumenti se i livelli di testosterone (T) aumentano o se il livello di SHBG diminuisce. Il rapporto T/SHBG, cioé il rapporto tra testosterone totale a (la concentrazione o la capacità legante dell') SHBG, serve come linee guida sommarie per la concentrazione di testosterone libero in circolo. Il rapporto T/SHBG viene anche indicato come Indice di Testosterone Libero (TFI). L'Indice di Testosterone Libero spesso subisce un aumento nelle forme gravi di

acne, nell'alopecia androgenica maschile (calvizie), nell'irsutismo ed in altre patologie. In questi casi è tipicamente riscontrabile un livello basso di SHBG, spesso in combinazione con un livello normale di testosterone. Un aumento nella produzione di testosterone induce tipicamente un decremento nel livello di SHBG. Ciò stimola l'uptake cellulare ed il metabolismo del testosterone, rendendolo più disponibile nella forma libera. Il risultato è che il livello di testosterone totale è spesso normale, poiché l'aumento nella produzione viene equilibrato da un aumento nel tasso della clearance. Le misurazioni di testosterone totale sono state da sempre di grande aiuto nello screening dell'irsutismo. In vista del meccanismo appena descritto, è naturale attenderci livelli di testosterone libero, misurati direttamente o indicizzati attraverso il rapporto T/SHBG, per correlare meglio con l'irsutismo. Alcuni studiosi, in maniera particolare Paulson, hanno riscontrato che il testosterone libero è di molto superiore al testosterone totale nello screening dell'irsutismo. Nel suo studio sulle 32 donne con irsutismo, solo il 44% presentava livelli elevati di testosterone totale, mentre tutte e 32 avevano livelli elevati di testosterone libero. Non tutti gli studiosi hanno raggiunto questi successi. D'altra parte, tuttavia, a giudicare dagli studi rivisti da Wu, sembra che il testosterone libero sia almeno marginalmente superiore al testosterone totale in questo contesto. (I diversi risultati potrebbero essere dovuti alle differenze nel metodo ed alle differenze nella selezione dei pazienti).

Principio della Procedura Nel dosaggio Coat-A-Count Testosterone Libero, l'analogo del testosterone marcato con I125 compete per un tempo fisso con il testosterone libero contenuto nel campione del paziente per i siti sull'anticorpo testosterone-specifico adeso alle pareti della provetta di polipropilene. La provetta viene quindi decantata, per isolare la frazione legata all'anticorpo, e contata in un gamma counter, le conte sono inversamente legate alla concentrazione di testosterone libero presente nel campione. Il dosaggio è strutturato in maniera tale da lasciare essenzialmente inalterato


l'equilibrio originario tra il testosterone libero e quello legato alle proteine nel campione del paziente. Utilizza un tracciante che non si lega alle proteine di trasporto degli steroidi ed un antisiero con un'affinità per il testosterone leggermente inferiore a quella della proteina di trasporto principale, la globulina legante l'ormone sessuale (SHBG). Inoltre, opera a condizioni fisiologiche di temperatura, pH e potenza ionica. Il dosaggio Coat-A-Count Testosterone Libero è un dosaggio diretto o a provetta-singola: i risultati non vengono calcolati in funzione del testosterone totale e dell'SHBG o di altri parametri, ma interpolati da una curva standard calibrata in concentrazioni di testosterone libero. A questo proposito, differisce dai metodi convenzionali di dialisi di equilibrio e dalle così dette determinazioni dell'indice di testosterone libero (TFI). Si tratta anche di un dosaggio a stadio-unico, che non richiede né pre-incubazione né isolamento preliminare della frazione libera attraverso dialisi, filtrazione o cromatografia a colonna. Inoltre, presenta le seguenti caratteristiche di rilievo: Tempo Totale di Incubazione: 4 ore. Conte Totali alla iodinazione: circa 60 000 cpm Reagenti da Dispensare: 1

Avvertenze e Precauzioni Ad uso diagnostico in vitro. Reagenti: Conservare a 2–8°C in un frigorifero appositamente destinato al materiale radioattivo. Eliminare secondo le normative di legge vigenti. Non utilizzare reagenti oltre la data di scadenza. Alcuni componenti forniti in questo kit possono contenere materiale di origine umana e/o altri ingredienti potenzialmente pericolosi che necessitano di precauzioni di utilizzo. Seguire le precauzioni universali, e manipolare tutti i componenti come se potessero trasmettere agenti infettivi. Sono stati analizzati i materiali di origine umana e sono stati trovati non reattivi per la Sifilide; per gli Anticorpi Anti-HIV 1 e 2; per l'Antigene di Superficiale dell'Epatite B; e per gli Anticorpi Anti-Epatite C.

E' stata aggiunta Sodio Azide a concentrazioni inferiori a 0,1 g/dL come conservante. Al momento dell'eliminazione, irrorare con molta acqua per evitare la formazione di azidi metalliche potenzialmente esplosive nelle tubature di piombo e di rame. Acqua: Utilizzare solo acqua distillata o deionizzata.

Radioattività Una copia di tutti i certificati di Autorizzazione per radioisotopi (Specifica o Generica) rilasciata ad un cliente americano deve essere conservata in file presso la Siemens Healthcare Diagnostics prima che i kit o i componenti contenenti materiale radioattivo possano essere spediti. Questi materiali radioattivi possono essere acquisiti da qualsivoglia cliente in possesso dell'Autorizzazione Specifica. Con l'Autorizzazione Generica questi materiali radioattivi possono essere acquistati solo da medici, veterinari che esercitino la professione, laboratori clinici ed ospedalieri – e solo per l'esecuzione di test clinici o di laboratorio in vitro che non implichino somministrazione interna o esterna del materiale radioattivo o delle sue radiazioni alle persone o animali. La sua acquisizione, ricevimento, conservazione, utilizzo, trasferimento ed eliminazione sono soggette a regolamentazioni e ad Autorizzazione (Generica o Specifica) della Commissione Statunitense per il Nucleare o dello Stato con il quale l'NRC abbia stipulato un accordo per l'esercizio del controllo regolatorio. Manipolare i materiali radioattivi secondo quanto previsto dall'Autorizzazione Generica o Specifica. Per minimizzare l'esposizione alle radiazioni, l'utilizzatore deve attenersi alle linee guida stabilite dal National Bureau of Standards publication su “Safe Handling of Radioactive Materials” “Norme per una corretta manipolazione dei Materiali Radioattivi”.(Guida N° 92, pubblicata il 9 Marzo 1964) e successive edizioni pubblicate dallo Stato e dalle Autorità Federali. Assorbire immediatamente le fuoriuscite e decontaminare le superfici contaminate. Evitare la formazione di aerosol. Eliminare i rifiuti solidi radioattivi secondo quanto previsto dall'Autorizzazione. Le licenze


generiche (possessori di NRC Form 483) possono eliminare i rifiuti radioattivi solidi come non radioattivi, dopo aver rimosso l'etichetta. I detentori di autorizzazioni specifiche (NRC Form 313) devono fare riferimento al Titolo 10, Codice delle Regolamentazioni Federali Parte 20. I detentori di Autorizzazioni negli Stati che hanno stipulato un accordo con l'NRC dovrebbero far riferimento alle regolamentazioni idonee dei loro stati. I detentori di Autorizzazioni Generali possono eliminare i rifiuti radioattivi liquidi del tipo contenuto in questo prodotto attraverso il lavello del laboratorio. I detentori di autorizzazione devono eliminare o rendere illeggibili le etichette dei contenitori vuoti di materiali radioattivi prima di eliminare i rifiuti solidi. I detentori di autorizzazioni specifiche possono eliminare piccoli quantitativi di rifiuti radioattivi liquidi del tipo utilizzato in questo prodotto attraverso il lavello del laboratorio. Fare riferimento alle regolamentazioni appropriate applicabili al Vostro laboratorio.

Materiali Forniti: Preparazione Iniziale I materiali forniti in questo kit non sono interscambiabili con quelli contenuti nel kit Coat-A-Count Testosterone Totale, che è stato predisposto per la determinazione del Testosterone Totale.

Provette Testosterone Libero coattate con anticorpo (TTF1) Provette di polipropilene coattate con anticorpi di coniglio anti-testosterone libero confezionate in buste chiuse. Conservare refrigerate al riparo dall'umidità, richiudendole dopo l'utilizzo. Stabili a 2–8°C fino alla data di scadenza indicata sulla confezione. Colore: Blu. TKTF1: 100 provette. TKTF2: 200 provette.

Testosterone Libero Marcato con I125 (TTF2) 105 mL di analogo iodinato del testosterone con sodio azide come conservante. Stabile a 2–8°C per 30 giorni dopo l'apertura, o fino alla data di scadenza indicata sulla provetta. TKTF1: 1 provetta TKTF2: 2 provette.

Calibratori Testosterone Libero (TFC3–8) Sei flaconi contenenti i calibratori testosterone libero, pronti all'uso, in siero umano processato con conservanti (sodio azide e gentamicina). Il calibratore zero, flacone A, contiene 2,0 mL, mentre gli altri calibratori dal flacone B al flacone F contengono 1,0 mL ciascuno. Stabili a 2–8°C per 30 giorni dopo l'apertura. TKTF1: 1 set. TKTF2: 1 set. I calibratori hanno valori di testosterone libero lotto-specifici di circa 0, 0,55, 2,5, 9,0, 25 e 50 picogrammi per millilitro (pg/mL); equivalenti a circa 0, 1,9, 8,7, 31, 87 e 173 picomoli per litro (pmol/L). Fare riferimento alle etichette delle provette per i valori esatti in pg/mL.

Materiali Richiesti Ma Non Forniti Gamma counter—compatibile con le provette standard 12x75 mm Vortex mixer Provette semplici 12x75 mm di polipropilene—da utilizzarsi come provette T ed NSB, disponibili presso la Siemens Healthcare Diagnostics (Codice: PPO). Micropipette: 50 µL e 1,0 mL. Bagnetto termostatato che mantenga la temperatura a 37°C Foam per la decantazione delle provette—disponibile presso la Siemens Healthcare Diagnostics (Codice: FDR) Carta millimetrata per grafici Logit-log Un controllo per immunodosaggi a tre livelli su base sierica, contenente testosterone oltre agli altri 25 costituenti dosati, disponibile presso la Siemens Healthcare Diagnostics. (Codice: CON6).

Prelievo dei Campioni Non è necessario che il paziente sia a digiuno, non sono necessarie preparazioni particolari. Prelevare il sangue29 in provette semplici (senza anticoagulanti) e separare il siero dalle cellule. Perchè l'EDTA avrebbe un effetto significativo sui risultati, non dovrebbe essere utilizzato come un anticoagulante. Campioni di siero molto lipemici possono produrre risultati di testosterone libero falsamente elevati. Si consiglia l'utilizzo di


un'ultracentrifuga per schiarire i campioni lipemici. I campioni emolizzati posson indicare il trattamento non idoneo del campione prima dell'arrivo al laboratorio; per questo motivo, i risultati devono essere interpretati con prudenza. Provette per il prelievo di sangue di produttori diversi possono dare valori differenti, a seconda dei materiali e degli additivi usati, incluso gel o barriere fisiche, attivatori di coaguli e/o anticoagulanti. L'Coat-A-Count Testosterone Libero non é stato verificato con tutte le possibili variazioni di tipi di provette. Consultare la sezione riguardante Campioni Alternativi per dettagli sulle provette testate. Terapia con Danazolo: il Danazolo, un derivato dello steroide etisterone sintetico, viene usato nel trattamento dell'endometriosi e della mastopatia fibrocistica. Gli effetti collaterali androgenici sono da attribuirsi all'aumentata disponibilità di testosterone libero nei pazienti che si sottopongono alla terapia con Danazolo. Di conseguenza, i pazienti che assumono Danazolo mostreranno elevate concentrazioni di testosterone libero. Studi condotti in vitro con il dosaggio Coat-A-Count Free Testosterone hanno inoltre dimostrato un aumento evidente della concentrazione di testosterone libero in campioni addizionati con Danazolo.31 Dopo somministrazione per via orale di 100 mg le concentrazioni massime di Danazolo possono arrivare a 199 ng/mL, inducendo una variazione apprezzabile nelle concentrazioni di testosterone libero nonostante la bassa cross-reattività riportata.32 Vedere la sessione "Specificità" per le percentuali di cross-reattività. Quindi, deve essere usata cautela nell'interpretazione dei livelli di testosterone libero nei pazienti che si sottopongono a terapia con Danazolo. Volume Richiesto: 50 µL per provetta. Conservazione: 2 giorni a 2–8°C o 2 mesi (aliquotato) a –20°C. Prima del dosaggio, consentire ai campioni di raggiungere temperatura ambiente (15–28°C) e mescolare scuotendo leggermente o capovolgendo la provetta. Aliquotare, se necessario per

evitare cicli ripetuti di congelamento e scongelamento. Non tentare di scongelare i campioni congelati riscaldandoli in un bagnetto termostatato.

Dosaggio Radioimmunologico Tutti i componenti devono essere a temperatura ambiente (15–28°C) prima dell'utilizzo. 1 Provette Semplici: Etichettare

quattro provette 12x75 mm di polipropilene semplici (non coattate) T (conte totali) ed NSB (legame non specifico) in duplicato. Poiché il legame non specifico nel dosaggio Coat-A-Count è caratteristicamente basso, le provette NSB possono essere anche omesse senza compromettere l'accuratezza o il controllo di qualità.

Provette Coattate: Etichettare dodici provette coattate con anticorpo (A) (legame massimo) e dalla B alla F in duplicato. Etichettare altre provette coattate con anticorpo, anch'esse in duplicato, per i controlli ed i campioni dei pazienti.

Calibratore Circa pg/mL

Circa pmol/L

A (MB) 0 0

B 0,55 1,9

C 2,5 8,7

D 9,0 31

E 25 87

F 50 173

Nota: I valori dei calibratori sono lotto-specifici. Fare riferimento alle etichette dei calibratori per i valori in pg/mL.

2 Dispensare 50 µL del calibratore zero A nelle provette NSB ed A, e 50 µL di ciascun calibratore, controllo e campione rimanenti nelle provette preparate. Pipettare direttamente al fondo. Non tentare di diluire i campioni dei pazienti che presentino concentrazioni elevate nel calibratore zero. (poiché le diluizioni spostano l'equilibrio tra testosterone libero e legato, non ci si può attendere che il dosaggio mantenga la linearità se vengono effettuate diluizioni).


Si consiglia di utilizzare un puntale monouso, cambiando il puntale tra un campione e l'altro, per evitare la contaminazione da carryover.

3 Aggiungere 1,0 mL di Testosterone Libero marcato con I125 in ogni provetta. Vortexare. Non devono passare più di 10 minuti nella dispensazione del tracciante. Mettere da parte le provette T per la conta (al punto 6); non sono necessari ulteriori passaggi.

4 Incubare per 4 ore a 37°C. Il rack deve essere coperto con una pellicola per evitare l'evaporazione.

5 Decantare, rimuovendo l'umidità visibile ed aumentando così la precisione. Utilizzare un foam per la decantazione, decantare o aspirare i contenuti di tutte le provette (ad eccezione delle provette T) e fare in modo che si asciughino per 2 o 3 minuti. Tamponarle su carta assorbente per eliminare completamente i liquidi.

6 Contare per 1 minuto in un gamma counter.

Calcolo dei Risultati Per ottenere i risultati in termini di concentrazione da una rappresentazione logit-log della curva di calibrazione, calcolare inizialmente per ogni coppia di provette le conte medie al minuto corrette con NSB: Conte Nette = Media dei CPM Meno Media CPM NSB

Quindi determinare il legame di ogni coppia di provette come percentuale del legame massimo (MB), con le conte corrette-NSB delle provette A prese al 100%: Percentuale di Legato = (Counte Nette / Conte Nette MB) × 100

(Il calcolo può essere semplificato omettendo la correzione per il legame non specifico; i campioni entro il range dei calibratori danno virtualmente gli stessi risultati quando la Percentuale di Legato viene calcolata direttamente dai CPM Medi).

Utilizzando la carta logit-log, tracciare la Percentuale di Legato sull'asse verticale (probabilità) verso la Concentrazione sull'asse orizzontale (logaritmica) per ciascuno dei calibratori non zero e tracciare una linea retta approssimativamente lungo il tracciato di questi punti. I risultati per i campioni sconosciuti possono essere letti dalla retta attraverso interpolazione. Si consiglia di visionare i risultati per stabilire la correlazione entro i replicati e tracciare un grafico della curva di calibrazione (anche se i calcoli vengono effettuati dal computer) per visualizzare l'appropriatezza della trasformazione utilizzata e per individuare i punti devianti all'interno della calibrazione. Consigliamo anche di mantenere una rintracciabilità dei parametri utilizzati per la riduzione dei dati: T = Conte Totali (conte al minuto)

%NSB = 100 × (Conte NSB Medie / Conte Totali)

%MB = 100 × (Conte Nette / Conte Totali)

E le “intercette” al 20, 50 ed 80%, dove 20% = Concentrazione al 20% di Legato ecc.

Nota: sono accettabili anche altri tipi di approccio, quali: l'implementazione della logistica a 4 parametri. Vedi Dudley Ra et al. Guidelines for immunoassay data Reduction. Clin Chem 1985;31:1264-71. Seduta Esemplificativa: a solo scopo illustrativo e non per calcolare i risultati di un'altra seduta. I valori dei calibratori sono lotto-specifici, le concentrazioni elencate nella colonna più a destra possono non essere in linea con i valori dei calibratori forniti nel kit (vedi tabella “Example Run”).

Controllo di Qualità Dovrebbero essere dosati di routine come campioni non noti i Controlli (o pool di sieri) con alMeno due livelli di concentrazione di testosterone libero, basso ed alto. Riportare i risultati dei pazienti solo se i risultati dei controlli sono conformi ai criteri di accettabilità del Vostro laboratorio. Si consiglia per ogni dosaggio di annotare i numeri di lotto dei componenti utilizzati, quali le date di ricostituzione o di apertura. Si consiglia anche di tracciare i grafici dei


risultati dei controlli giorno dopo giorno—come descritto, ad esempio, in Westgard JO, et al. A multi-rule chart for quality control. Clin Chem 1981;27:493-501. Campioni ripetuti possono servire come ulteriore strumento per monitorare la precisione inter-dosaggio; coppie di campioni intervallate lungo tutto il dosaggio possono essere d'aiuto nel verificare l'assenza di deviazioni significative.

Valori Attesi Di seguito sono riportati i valori di testosterone libero in adulti che non presentano apparenti o sospette disfunzioni alle gonadi ripartiti secondo il sesso e l'età. Le statistiche mostrano, come atteso, un declino graduale nei livelli di testosterone libero, durante la maturità, in funzione dell'età. Nell'analisi sono stati utilizzati i risultati ottenuti da uomini e donne di età compresa tra 20 ed 80 anni—un totale di 472 maschi e 113 femmine. Il gruppo di riferimento era formato da volontari sani ed anche soggetti nei quali non si sospettavano patologie gonadiche o le stesse erano già state escluse da test di laboratorio effettuati. Il set di dati (gentilmente fornito dagli autori) deriva da uno studio30 pubblicato sugli intervalli di riferimento per il dosaggio Coat-A-Count Testosterone Libero.

Unità di Massa (pg/mL)

Età (anni) n Mediana

Range Centrale

95%

Maschi

20 – 39 154 17,2 8,8 – 27

40 – 59 210 14,4 7,2 – 23

60 – 80 108 11,7 5,6 – 19

Femmine

20 – 39 47 0,87 ND – 2,57

40 – 59 39 0,68 ND – 2,03

60 – 80 27 0,51 ND – 1,55

ND: non determinabile

Unità Molari (pmol/L)

Età (anni) n Mediana

Range Centrale

95%

Maschi

20 – 39 154 60 31 – 94

40 – 59 210 50 25 – 80

60 – 80 108 41 19 – 66

Femmine

20 – 39 47 3,0 ND – 8,9

40 – 59 39 2,3 ND – 7,0

60 – 80 27 1,8 ND – 5,4

ND: non determinabile

Fare attenzione che i criteri di selezione possono avere un impatto significativo sulla determinazione degli intervalli di riferimento: in particolare, sono stati ottenuti intervalli più ampi nello studio pubblicato30 che ha incluso risultati per campioni di pazienti sottoposti ad analisi per il testosterone libero. Considerare questi limiti solo come linee guida. Ogni laboratorio dovrebbe stabilire i propri range di riferimento.

Prestazioni del Dosaggio Le sezioni di seguito riportate contengono i dati rappresentativi delle prestazioni del dosaggio Coat-A-Count Testosterone Libero. I risultati sono espressi in pg/mL. Fattore di Conversione: pg/mL × 3,467 → pmol/L Range di Calibrazione: Circa da 0,55 – 50 pg/mL (1,9 – 173 pmol/L). Questi calibratori sono lotto-specifici. Sensibilità Analitica: 0,15 pg/mL. Precisione: Sono state calcolate statistiche per i campioni dai risultati di coppie di provette in più di 160 dosaggi differenti. (Vedi tabella “Precision”.) Profilo di Precisione: Il grafico mostra un profilo di precisione basato sulla dose per i CV intra-dosaggio (cerchi aperti) per dodici campioni, calcolati attraverso l'analisi della varianza da 34 sedute. La curva, che traccia il percorso approssimativo di questi punti rappresenta i CV intra-dosaggio che ci si attendono dai campioni dosati in duplicato. I CV da seduta a seduta tabulati nella tabella


“Precision” vengono visualizzati sottoforma di quadratini (vedi grafico “Precision Profile”). Effetto Fine-Seduta: Nessuno fino a circa 200 provette. (Vedi tabella "End-of-Run Effect".) Effetto dell'SHBG: per studiare gli effetti dei livelli di globulina legante gli ormoni sessuali (livelli di SHBG) sul dosaggio, ad un pool di sieri umani assorbiti con charcoal è stato aggiunto SHBG ad una concentrazione di 400 microgrammi per millilitro, un livello che risulta approssimativamente 1 000 volte il livello normale. Il pool cui è stato aggiunto l'SHBG, è stato dosato con il kit Coat-A-Count Testosterone Libero ed ha prodotto una percentuale di ormone legato del 99% B/B0. Poiché l'assorbimento con charcoal elimina il testosterone dal pool, dovrebbe presentare concentrazioni zero di testosterone libero (e totale)—cioè i valori percentuali del legato erano di circa il 100% B/B0—sia prima che dopo l'aggiunta di SHBG. I risultati mostrano, come atteso, che il dosaggio non è influenzato dai livelli di SHBG. Effetto dell'Albumina: I campioni liofili sono stati ricostituiti con soluzioni acquose contenenti 0, 1,0, 2,0 e 3,0 g/dL di albumina sierica umana assorbita con charcoal e dosati in parallelo. (Vedi tabella "Effect of Albumin”). Effetto dell'Assorbimento con Charcoal: I campioni dei pazienti sono stati dosati utilizzando il kit Coat-A-Count Testosterone Libero sia prima che dopo assorbimento con charcoal. Di seguito sono tabulate le concentrazioni di testosterone libero (in pg/mL) prima dell'assorbimento con charcoal ed i valori della percentuale di legato (%B/B0) dopo assorbimento (Vedi tabella “ Effect of Charcoal Absorption”). I risultati dimostrano che l'assorbimento con charcoal riduce il livello di testosterone libero apparente a zero, cosiccome misurato dal kit Coat-A-Count, cioè a valori percentuali di legato approssimativamente del 100% B/B0. Poiché l'assorbimento con charcoal rimuove il testosterone insieme ad altri steroidi e piccole molecole provenienti dai campioni di siero mentre lascia intatte le molecole più grandi quali l'albumina,

l'SHBG ed altre proteine leganti, questo esperimento è di aiuto nella conferma che il dosaggio Coat-A-Count Testosterone Libero non è influenzato dai livelli delle proteine di trasporto. Bilirubina: La presenza di bilirubina in concentrazioni fino a 200 mg/L non ha nessun effetto, entro il range di precisione del dosaggio. Emolisi: La presenza di globuli rossi impaccati in concentrazioni fino a 30 µL/mL non ha effetto sui risultati entro il range di precisione del dosaggio. Tipo di Campione Alternativo: Per determinare l'effetto di campioni alternativi, è stato prelevato del sangue da 49 volontari in provette semplici, eparinizzate e EDTA. I range assoluti osservati per i volontari Maschi e femmine sono tabulati di seguito.

Gamma assoluta

19 Volontari maschi pg/mL

30 Volontari femmine pg/mL

Siero 9 – 47 0,7 – 3,6

Eparina 8 – 45 0,9 – 3,8

EDTA 13 – 79 1,3 – 5,7

I risultati combinati per questi 49 campioni – più un campione aggiuntivo – hanno prodotto le seguenti statistiche con analisi della regressione lineare. (Eparina) = 0,95 (Siero) + 0,4 pg/mL r = 0,996

(EDTA) = 1,48 (Siero) + 1,1 pg/mL r = 0,957

Valore medio: 11,9 pg/mL (Eparina) 12,2 pg/mL (Siero) 19,2 pg/mL (EDTA)

I risultati indicano che il plasma eparinizzato produce virtualmente gli Stessi risultati del siero, mentre il plasma EDTA produce valori più elevati. Specificità: L'anticorpo anti-testosterone libero è altamente specifico con una crossreattività estremamente bassa verso altri steroidi esistenti in natura o farmici somministrati a livello terapeutico e presenti nei campioni dei pazienti. (Vedi tabella "Specificity".) Comparazione di Metodi: Il dosaggio è stato comparato ad un metodo convenzionale basato sulla dialisi di equilibrio su 85 campioni di siero (43


maschi e 42 femmine). Mediante regressione lineare:

Maschi (43) (TKTF) = 0,42 (Dialisi) + 9,8 pg/mL r = 0,67

Valore Medio: 26,3 pg/mL (TKTF) 39,0 pg/mL (Dialisi)

Femmine (42) (TKTF) = 0,79 (Dialisi) + 1,0 pg/mL r = 0,75


Combinati (85) (TKTF) = 0,55 (Dialisi) + 3,4 pg/mL r = 0,87


Il dosaggio Coat-A-Count Testosterone Libero è stato anche comparato ad un dosaggio del testosterone totale—Coat-A-Count Testosterone Totale— su 109 campioni di siero (51 maschi e 58 femmine). Mediante regressione lineare:

Maschi (51) (Libero) = 4,7 (Totale) + 0,7 r = 0,984

Valore Medio: 23,6 pg/mL (Libero) 4,84 ng/mL (Totale)

Femmine (58) (Libero) = 6,1 (Totale) + 0,6 r = 0,978

Valore Medio: 3,9 pg/mL (Libero) 0,54 ng/mL (Totale)

Combinati (109) (Libero) = 4,6 (Totale) + 1,2 r = 0,992

Valore medio: 13,1 pg/mL (Libero) 2,6 ng/mL (Totale)

Assistenza Tecnica All'estero: Si prega di contattare il proprio Distributore Nazionale. www.siemens.com/diagnostics

Il Sistema Qualità della Siemens Healthcare Diagnostics Inc. è certificato ISO 13485:2003.

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Coat-A-Count Free Testosterone Utilização: Coat-A-Count Free Testosterone é um rádioimunoensaio de fase sólida marcado com 125I para o doseamento quantitativo da testosterona livre no soro. Destina-se exclusivamente ao diagnóstico in vitro como auxiliar do diagnóstico e tratamento do hirsutismo devido ao hiperandrogenismo. Números de catálogo: TKTF1 (100 tubos), TKTF2 (200 tubos)

O Kit com 100 tubos contem Menos que 4 microcuries (148 kilobecquerels) de 125I

radioactivo ligado ao analogo da testosterona; o Kit com 200 tubos contem Menos que 8 microcuries (296 kilobecquerels).

Sumário e Explicação do Teste A testosterona circula quase inteiramente ligada às proteínas de transporte: normalmente Menos de um porcento está livre. A principal proteína de transporte da testosterona é conhecida como globulina de ligação das hormonas sexuais (SHBG) ou globulina de ligação da testosterona-estradiol (TeBG), uma vez que não se liga apenas à testosterona mas também ao estradiol (e dihidrotestosterona). A proteina de ligação da albumina e cortisol (CBG) são as outras proteinas de transporte da testosterona. Por três razões, SHBG é a mais importante destas proteinas de transporte. Transporta, nas mulheres, em circulação uma percentagem de testosterona mais alta que albumina ou CBG. Por outro lado, liga-se à testosterona com muito maior afinidade que as outras duas proteinas de transporte. (A testosterona ligada à albumina e CBG é conhecida por testosterona de “fraca ligação”.) Finalmente, a SHBG tem uma reacção, não associada com a albumina, mas é sensivel ás alterações na razão entre os estrogénios e androgénios circulantes. A


SHBG tem um papel muito importante na determinação dos niveis de testosterona livre em circulação. Na gravidez, os niveis de SHBG mostram um aumento progressivo que espelha o crescimento dos niveis de estradiol. Embora os niveis de testosterona total mostrem algum aumento durante a gravidez, o crescimento no estradiol, e por isso também em SHBG, é mais dramático. O resultado é um decréscimo na testosterona livre como percentagem da testosterona total. As mulheres a tomarem contraceptivos orais tem niveis de SHBG aumentados, pelo Menos se estão a tomar doses altas de etinil estradiol. Reciprocamente, a administração de androgénios a rapazes na pré-puberdade, ou a elevação da testosterona endógena pela estimulação da HCG, induz um decréscimo significativo nos niveis de SHBG. A obesidade está também associada com o decréscimo dos niveis de SHBG. Outras entidades permanecem iguais, espera-se que a concentração de testosterona livre em circulação aumente se os niveis de de testosterona (T) aumentarem ou se os niveis de SHBG diminuirem. A razão T/SHBG, isto é, a razão da testosterona total por (a concentração ou capacidade de ligação) SHBG, servindo como guia grosseiro para a concentração de testosterona livre em circulação. A razãoT/SHBG é algumas vezes referida como Index da Testosterona Livre (TFI). O Index da Testosterona Livre está com frequência aumentado em casos de acne severo, alopécia androgénica masculina (calvice), hirsutismo e outras situações. Um nivel baixo de SHBG, geralmente em combinação. Nestas condições, niveis baixos de SHBG, geralmente em combinação com niveis normais de testosterona, são encontrados com frequência. Um aumento nas taxas de produção da testosterona tipicamente induz o decréscimo nos niveis de SHBG. Isto estimula a libertação celular e o metabolismo da testosterona, por tela mais disponivel na forma livre. O resultado é que os niveis de testosterona total são geralmente normais, porque o aumento na taxa de produção é compensado por um aumento na taxa de eliminação.

Os doseamentos de testosterona total tem sido tradicionalmente usados como ajuda no painel do hirsutismo. Em função dos mecanismos descritos, é natural esperar que niveis de testosterona livre, doseados directamente ou indexados pela razão T/SHBG, se correlacionem melhor com o hirsutismo. Alguns investigadores, particularmente Paulson, tem encontrado niveis de testosterona livre esmagadoramente superiores aos da testosterona total no quadro do hirsutismo. No seu estudo de 32 mulheres hirsutas, apenas 44 por cento tem niveis elevados de testosterona total, enquanto todas as 32 tiveram niveis elevados de testosterona livre. Nem todos os investigadores atingiram este nivel de sucesso. Em conclusão, contudo, da apreciação dos estudos revistos por Wu, parece que a testosterona livre é no minimo marginalmente superior à testosterona total neste contexto. (a variação nos resultados pode possilvelmente ser devida às diferenças nas metodologias e na selecção dos doentes.)

Princípio do Procedimento No procedimento do Coat-A-Count Free Testosterone, um análogo da testosterona marcado com 125I compete durante um tempo fixado com a testosterona livre da amostra do paciente para os anticorpos especificos da testosterona imobilizados nas paredes dos tubos de polipropileno. O tubo é decantado, para isolar a fracção ligada ao anticorpo, e lidos num contador gama, sendo as contagens inversamente proporcionais à concentração de testosterona livre na amostra. O ensaio está desenhado para deixar o equilibrio entre testosterona da amostra do doente livre e ligada essencialmente inalterado. Emprega um marcador que não se liga a proteinas de transporte de hormonas esteroides, e um antisoro com uma afinidade para a testosterona ligeiramente Menor que a principal proteina de transporte, globulina de ligação à hormona sexual (SHBG). Além disso, opera-se sobre condições fisiológicas de temperatura, pH e força iónica. O procedimento do Coat-A-Count Free Testosterone é um ensaio directo ou de tubo-simples:os seus resultados não são


calculados em função da testosterona total e SHBG ou algum outro parametro, mas interpolados numa curva padrão calibrada com várias concentrações de testosterona livre. Neste contexto difere dos métodos convencionais de diálise e das determinações chamadas de indexe da testosterona livre (TFI). È também um ensaio de ciclo-ùnico, não requerendo o passo de pré-incubação nem o passo preliminar de isolamento da fracção livre por diálise, filtração ou cromatografia de coluna. Adicionalmente, apresenta as seguintes caracteristicas dignas de atenção: Tempo de Incubação Total: 4 horas. Contagens Totais na Marcação com o Iodo: aproximadamente 60 000 cpm Reagentes para Pipetar: 1

Precauções Para uso de diagnóstico in vitro. Reagentes: Conservar a 2–8°C num frigorífico destinado para materiais radioactivos. Eliminar de acordo com as leis aplicáveis. Não utilize reagentes com prazo de validade expirado. Alguns componentes fornecidos com este dispositivo podem conter matéria de origem humana e/ou outros ingredientes potencialmente perigosos que necessitem de algumas precauções. Manipule com as devidas precauções todos os materiais capazes de transmitir doenças infecciosas. As matérias primas, obtidas de soro humano, foram testadas, revelando resultados negativos para a sífilis, para os anticorpos do vírus da imunodeficiência humana (HIV) 1 e 2; para o antigénio de superfície da hepatite B (HBsAg) e para os anticorpos do vírus da hepatite C. Azida de sódio foi adicionada como conservante; para evitar acumulações de azidas metálicas explosivas em canalizações de cobre e alumínio, os reagentes devem ser rejeitados no esgoto apenas se estiverem diluídos e forem lavados com grandes volumes de água. Água: Utilize água destilada ou desionizada.

Radioactividade Uma cópia da licença de uso de produtos radioactivos (especifico ou geral) enviada pelo cliente, deve estar em poder da Siemens Healthcare Diagnostics antes do envio dos kits ou componentes contendo material radioactivo. Estes materiais radioactivos podem ser adquiridos por qualquer cliente que possua a necessária licença especifica. Com uma licença generalista estes produtos radioactivos só podem ser adquiridos por médicos, veterinários na prática de medicina veterinária, laboratórios clinicos e hospitais. E somente para uso clinico in vitro ou testes laboratoriais não envolvendo administração externa ou interna do material radioactivo ou da sua radiação para o ser humano ou outros animais. A sua aquisição, receita, armazenamento uso, transporte e eliminação estão sujeitas aos regulamentos e à licenciada Comissão de Regulação Nuclear ou do Estado respectivo de acordo com a lei em vigor. Tratar os materiais radioactivos de acordo com a regulamentação da sua licença, específica ou generalista. De modo a minimizar a exposição à radiação deve o utilizador seguir as instruções da publicação do Departamento Nacional de Padrões (Utilização segura de materiais radioactivos-Livro No. 92, publicado em Março de 1964) e publicações seguintes do Estado e Autoridades Federais. Limpar os derrames prontamente e descontamine as superficies afectadas. Evitar os aerossois. Elimine os lixos radioactivos de acordo com a regulamentação da licença. As licenças generalistas (portadores da licença NRC 483) podem eliminar os lixos sólidos radioactivos como lixo não radioactivo depois de remover os rótulos. Licenças Especificas (Licença NRC 313) devem ter em conta o Capitulo 10 do artigo 20, do Código de Regulamentações Federais. Cada Estado deve referir a legislação em vigor aprovada para o seu território. As licenças generalistas podem eliminar os lixos radioactivos liquidos do tipo deste produto para um esgoto de laboratório. Os licenciados devem remover os rótulos dos frascos vazios de materiais radioactivos antes de os colocar no esgoto sólido. As licenças especificas podem eliminar pequenas quantidades de lixo radioactivo


deste tipo de produto para o esgoto normal do laboratório. Ter em atenção as regulamentações em vigor para o seu laboratório.

Materiais fornecidos: Preparação inicial Os materiais fornecidos com este dispositivo não podem ser trocados pelos do dispositivo da Testosterona Total Coat-A-Count, o qual é desenhado para o doseamento da Testosterona Total.

Tubos revestidos com Anticorpos de Testosterona Livre (TTF1) Tubos de polipropileno revestidos com anticorpos de coelho para a testosterona livre e embalados em sacos com fecho de segurança. Conservar refrigerado e protegido da humidade, selar os sacos cuidadosamente após cada abertura. Estável a 2–8°C até à data de validade inscrita na embalagem. Cor: Tom azulado TKTF1: 100 tubos. TKTF2: 200 tubos.

125I Testosterona Livre (TTF2) 105 mL de testosterona marcada com 125I, com azida de sódio como conservante. Estável a 2–8°C durante 30 dias depois de aberto, ou até à data de validade inscrita no frasco. TKTF1: 1 frasco. TKTF2: 2 frascos.

Calibradores de Testosterona Livre (TFC3–8) 6 frascos de calibradores de testosterona livre pronto-a-usar, em soro humano processado com conservante (azida de sódio e gentamicina). O calibrador zero frasco A contém 2,0 mL, enquanto que os calibradores frasco B até ao F contém 1,0 mL cada. Estável a 2–8°C durante 30 dias depois de aberto. TKTF1: 1 conjunto. TKTF2: 1 conjunto. Os calibradores têm valores de testosterona livre lote-específico de aproximadamente 0, 0,55, 2,5, 9,0, 25 e 50 picogramas por mililitro (pg/mL); equivalente: aproximado: 0, 1,9, 8,7, 31, 87 e 173 picomoles por litro (pmol/L). Ver as etiquetas dos frascos para valores exactos em pg/mL.

Materiais necessários mas não fornecidos Contador Gama—compatível com os tubos normais (12x75 mm). Agitador Vortex Tubos não revestidos de polipropileno (12x75 mm)—para uso com os tubos T e NSB, disponíveis na Siemens Healthcare Diagnostics (Números de catálogo: PPO). Micropipetas: 50 µL e 1,0 mL. Incubar num banho-maria a 37°C Espuma de decantação—disponível na Siemens Healthcare Diagnostics (Números de catálogo: FDR) Papel logaritmico Controlo com três níveis baseado em soro humano, contendo testosterona como um dos mais de 25 constituintes ensaiados; disponíveis na Siemens Healthcare Diagnostics (Números de catálogo: CON6).

Colheita O paciente não necessita dieta. Não são necessárias preparações especiais. Colher o sangue por punção venosa29 em tubos lisos (sem anticoagulante), e separar o soro das celulas. Como EDTA teria um efeito significativo nos resultados, não deve ser usado como anticoagulante. Soros altamente lipémicos podem dar origem a resultados falsamente elevados de testosterona livre. O uso de uma ultracentrifuga é recomendado para clarificar as amostras lipémicas. Amostras hemolisadas podem indicar tratamento incorrecto de uma amostra antes do envio para o laboratório; portanto os resultados devem ser interpretados com cuidado. Os tubos para colheita sanguínea de diferentes fabricantes, podem originar diferentes valores, dependendo dos materiais e aditivos, incluíndo gel ou barreiras fisicas, activadores do coágulo e/ou anti coagulantes. Coat-A-Count Testosterona Livre não foram ainda testados com todas as possiveis variações originadas pelos tipos de tubos. Consultar a secção Tipos de Amostras Alternativas para obter detalhes sobre os tubos que foram testados.


Terapia por Danazol: O danazol é um derivado do esteróide sintético: ethisterona, usado no tratamento de endometriose e doença fibrocistíca da mama. Os efeitos colaterais do androgênico têm sido atribuídos ao aumento da disponibilidade da testosterona livre em pacientes sob terapia do Danazol. Assim, pacientes tomando Danazol irão apresentar um aumento nas concentrações de testosterona livre. Estudos In Vitro com o ensaio de Testosterona Livre Coat-A-Count também mostraram um aumento na concentração aparente em amostras adicionadas de Danazol.31 A concentração máxima de Danazol plasmático, após uma dose oral de 100 mg está relatada como sendo até 199 ng/mL, gerando uma variação apreciável nas concentrações de testosterona plasmática, apesar da baixa reação cruzada reportada.32 Ver seção de "Especificidade" para a porcentagem de reação cruzada. Entretanto, deve-se ter cautela para a interpretação dos níveis de testosterona livre em pacientes sob terapia de Danazol. Volume de Amostra: 50 µL por tubo. Armazenamento : 2 dias a 2–8°C ou 2 meses (aliquotado) a –20°C. Deixar as amostras atingir a temperatura ambiente (15–28°C) e agitar suavemente ou por inversão. Aliquotar se necessário para evitar repetidos congelamentos / descongelamentos. Não descongelar as amostras por aquecimento em banho-maria.

Técnica de Radioimunoensaio Todos os componentes devem estar à temperatura ambiente(15–28°C) antes de usar. 1 Tubos lisos: Rotular quatro tubos de

polipropileno (não revestidos) de 12x75 mm—T (contagens totais) e NSB (ligações não especificas) em duplicado. Devido ao facto das ligações não especificas no método de Coat-A-Count serem geralmente baixas os valores de NSB podem ser omitidos sem comprometer a precisão ou controle de qualidade.

Tubos revestidos: Rotular doze tubos revestidos com anticorpos de testosterona livre, A (máxima ligação) e B a F em duplicado. Rotular outros tubos revestidos em duplicado para controlos e amostras.

Calibrador +/- pg/mL +/- pmol/L

A (MB) 0 0

B 0,55 1,9

C 2,5 8,7

D 9,0 31

E 25 87

F 50 173

Nota: Os valores dos calibradores são lote-especificos. Têr em atenção os valores nos frascos em pg/mL.

2 Pipetar 50 µL do calibrador zero(A) nos tubos NSB e A, e 50 µL dos outros calibradores, controlos e amostras nos respectivos tubos. Pipetar directamente para a base dos tubos. Não é tecnicamente aceitável a diluição das amostras com o calibrador zero. (A linearidade do sistema não é fiável após diluição pela perda de equilibrio entre a testosterona livre e ligada). É boa prática usar uma pipeta de pontas descartáveis, mudando a ponta entre as amostras de modo a evitar contaminação.

3 Adicionar 1,0 mL de 125I Testosterona livre para cada tubo. Homogeneizar. Adicionar o marcador 125I no espaço de 10 minutos após pipetar os calibradores, controlos e amostras. Deixar os tubos T para as contagens (nº 6); não necessitam mais processamento.

4 Incubar 4 horas a 37°C. As amostras devem ser cobertas com Parafilme para prevenir a evaporação.

5 Decantar vigorosamente. Removendo todo o líquido remanescente melhora-se bastante a precisão. Usar uma espuma de decantação, decante ou aspire o conteúdo de todos os tubos (excepto os T) e deixar invertidos durante 2 ou 3 minutos. Eliminar todas as gotas residuais com papel absorvente.


6 Contar 1 minuto em contador gama.

Cálculo dos Resultados Para obter resultados de concentrações duma representação logit-log da curva de calibração, deve em primeiro lugar calcular-se para cada par de tubos a média de NSB-contagens por minuto corrigidas: Contagens reais = Média CPM minutos Média NSB CPM

Determine a ligação de cada par de tubos como percentagem do máximo de ligação (MB), com o NSB-contagens por minuto corrigidas dos tubos A tidas como 100%: Percentagem de Ligação = (Contagens reais / Contagens MB reais) × 100

(O cálculo pode ser simplificado omitindo a correcção para a ligação não especifica; amostras dentro da gama de calibração originam virtualmente os mesmos resultados quando a Percentagem de Ligação é calculada directamente da Média de CPM.) Usando um papel milimétrico logit-log, represente a Percentagem de Ligação no eixo vertical (probabilidade) contra a Concentração no eixo horizontal (logaritmico) para cada um dos calibradores diferentes de zero, e representar uma linha recta em função da trajectória destes pontos. Resultados de amostras desconhecidas podem então ser lidas nessa recta por interpolação. È boa prática verificar os resultados pela concordância entre as réplicas, e construir um gráfico da curva de calibração (mesmo que os cálculos sejam efectuados por computador) para verificação visual da aplicabilidade da transformação usada e como forma para detectar pontos de calibração que se afastem. Também se recomenda guardar estas curvas: T = Contagens totais (contagens por minuto)

%NSB = 100 × (Média Contagens NSB / Contagens Totais)

%MB = 100 × (Contagens Reais / Contagens Totais)

E os 20, 50 e 80 porcento "intercepa," onde 20% = Concentração a 20 Porcento de Ligação, etc.

Note que para outras perspectivas, como a implementação de uma logística de 4 parâmetros, também é aceitável. Ver Dudley RA, et al. Guidelines for immunoassay data reduction. Clin Chem 1985;31:1264-71. Exemplo de Ensaio: Apenas para ilustração, não para calcular resultados de outro ensaio. Porque os valores dos calibradores são lote-especifico, as concentrações listadas na coluna mais à direita podem não corresponder aos valores dos calibradores fornecidos com o dispositivo fornecido na sua encomenda. (Ver tabela “Example Run”.)

Controlo de Qualidade Controlos (ou misturas de soros) com o minimo de duas concentrações de testosterona livre—baixa e alta—devem ser ensaiados rotineiramente como amostras desconhecidas. Os resultados dos pacientes devem apenas ser reportados se os resultados dos controlos para este ensaio estiverem dentro dos critérios de aceitação estabelecidos pelo laboratório. È boa prática laboratorial registar para cada ensaio o número do lote dos componentes usados, bem como as datas de quando foram primeiro reconstituidas ou abertas. Recomenda-se registar os valores diários em gráfico—como descrito, por exemplo, in Westgard JO, et al. A multi-rule chart for quality control. Clin Chem 1981;27:493-501. Note que amostras repetidas podem servir como ferramenta adicional para monitorizar a precisão inter-ensaio, e que pares de controlos podem ser colocados ao longo do ensaio para ajudar a verificar a ausência de variação significativa.

Valores de Referência Os valores de referência para adultos sem suspeita de disfunção gonadal estão referidos em baixo por sexo e idade. A estatistica mostra, como esperado, um declinio gradual nos valores de testosterona livre em função da idade na idade adulta. Os resultados para homens e mulheres dos 20 aos 80 anos-no total de 472 homens e 113 mulheres—foram usados no estudo.Tomou-se como grupo de referência voluntários saudáveis e pacientes nos quais não se tivesse


suspeita de doença gonadal, ou fosse excluida por testes laboratoriais.Os dados (gentilmente cedidos pelos autores) foram obtidos através de um estudo30 publicado em intervalos de referência para o ensaio de Testosterona livre Coat-A-Count.

Unidades de massa (pg/mL) Idade (anos) n Media

Central 95%

Homens

20 – 39 154 17,2 8,8 – 27

40 – 59 210 14,4 7,2 – 23

60 – 80 108 11,7 5,6 – 19

Mulheres

20 – 39 47 0,87 ND – 2,57

40 – 59 39 0,68 ND – 2,03

60 – 80 27 0,51 ND – 1,55

ND: não detectável

Unidades molar (pmol/L) Idade (anos) n Media

Central 95%

Homens

20 – 39 154 60 31 – 94

40 – 59 210 50 25 – 80

60 – 80 108 41 19 – 66

Mulheres

20 – 39 47 3,0 ND – 8,9

40 – 59 39 2,3 ND – 7,0

60 – 80 27 1,8 ND – 5,4

ND: não detectável

Notar que o critério de selecção pode ter um impacto significativo na determinação dos intervalos de referência: intervalos maiores foram obtidos30 quando os valores foram expandidos de modo a incluir resultados de amostras que tinham sido submetidos a análise de testosterona livre. Considerar estes limites sómente como indicativo. Cada laboratório deve estabelecer os seus próprios valores de referência.

Características do Ensaio A seguinte informação contem dados representativos do desempenho do ensaio da Testosterona Livre Coat-A-Count. Os resultados são apresentados em pg/mL.

Factor de conversão: pg/mL × 3,467 → pmol/L Calibração: Aproximadamente 0,55 – 50 pg/mL (1,9 – 173 pmol/L). Os calibradores são lote-especifico. Sensibilidade Analítica: 0,15 pg/mL. Precisão: Foram feitos cálculos estatísticos com os resultados de amostras de pares de tubos em mais de 160 diferentes ensaios. (Consulte a tabela “Precisão”.) Perfil de precisão: o gráfico mostra um perfil de dose-precisão para o ensaio baseado nos CVs intra ensaio (circulos abertos) para doze amostras, calculadas pela análise da variância em 34 ensaios. A linha em forma de concavidade ao longo destes pontos representa os CVs intra ensaio esperados para amostras ensaiadas em duplicado. Como referência os CVs inter ensaio referidos na tabela de Precisão são apresentados como quadrados sólidos. (ver o gráfico de perfil de precisão.) Efeito fim-de-série: Nenhum até aproximadamente 200 tubos. (Ver tabela "Efeito fim-de-série".) Efeitos da SHBG: Para investigar os efeitos dos níveis da globulina de ligação das hormonas sexuais (níveis de SHBG) no sistema do ensaio, uma mistura de soros foi adicionada com SHBG para uma concentração de 400 microgramas por ml, um nível que é aproximadamente 1 000 vezes o normal. A mistura adicionada com SHBG, quando ensaiada pelo método Testosterona Livre Coat-A-Count, mostrou um valor de percentagem de ligação de 99% (B/B0). Uma vez que a absorção do carvão elimina a testosterona da “mistura”, não deverá existir nenhuma concentração de testosterona livre (e total)—isto é, valores de percentagem de ligação de aproximadamente 100% B/B0—ambos antes e depois da adição. Os resultados mostram, conforme esperado, que o ensaio não é influenciado pelos níveis de SHBG. Efeitos da Albumina: Amostras liofilizadas foram reconstituidas com soluções aquosas contendo 0, 1,0, 2,0 e 3,0 g/dL absorvida pelo carvão de albumina sérica humana, e ensaiadas em


paralelo. (Ver tabela "Efeitos da Albumina".) Efeitos da absorção do carvão: Amostras de pacientes foram testadas pelo procedimento da Testosterona Livre Coat-A-Count ambos antes e depois da absorção pelo carvão. As concentrações de testosterona livre (em pg/mL) antes da absorção, e os valores de percentagem de ligação (%B/B0) seguidos da absorção do carvão estão referidos. (Ver tabela "Effect of Charcoal Absorption") Os resultados demonstram que a absorção pelo carvão reduz o nível de testosterona livre das amostras de pacientes, doseado pelo método Coat-A-Count, para zero, isto é, os valores de percentagem de ligação de aproximadamente 100% B/B0 Uma vez que a absorção do carvão retira a testosterona bem como outros esteroides e pequenas moléculas das amostras de soro enquanto que mantém as moléculas maiores como a albumina, SHBG e outras proteínas de ligação, este procedimento ajuda a confirmar que o método testosterona livre Coat-A-Count não é influenciado por níveis de proteínas de transporte. Bilirrubina: A presença de bilirrubina em concentrações acima de 200 mg/L não tem interferência nos resultados, dentro da precisão do ensaio. Hemólise: A Presença de eritrocitos em concentrações até 30 µL/mL não tem efeito no resultado, dentro da precisão do ensaio. Tipo de amostra alternativa: Para determinar o efeito de amostras alternatives, foi colhido sangue de 49 voluntários em tubos secos, heparinizados e tubos de EDTA. Os valores absolutos obtidos para homens e mulheres voluntários estão tabelados em baixo.

Faixa absoluta

19 Voluntários de laboratório masculinos

pg/mL

30 Voluntários de laboratório

femininos pg/mL

Soro 9 – 47 0,7 – 3,6

Heparina 8 – 45 0,9 – 3,8

EDTA 13 – 79 1,3 – 5,7

Os resultados combinados destas 49 amostras – adicionada de mais uma –

forneceram as seguintes estatísticas quando sujeitas a regressão linear. (Heparina) = 0,95 (Soro) + 0,4 pg/mL r = 0,996

(EDTA) = 1,48 (Soro) + 1,1 pg/mL r = 0,957

Médias: 11,9 pg/mL (Heparina) 12,2 pg/mL (Soro) 19,2 pg/mL (EDTA)

Os resultados obtidos indicam que se obtem resultados semelhantes para o soro e plasma heparinizado, obtendo-se valores mais elevados com o plasma com EDTA. Especificidade: O anticorpo da testosterona livre é altamente específico para a testosterona, com uma reacção cruzada extremamente baixa a outros esteroides existentes ou drogas terapêuticas que podem estar presentes nas amostras dos pacientes. (Ver tabela de "Specificity".) Comparação de Métodos: O ensaio foi comparado a um método convencional de diálise em 85 amostras de soro (43 masculinas e 42 femininas). Regressão linear:

Homens (43) (TKTF) = 0,42 (Diálise) + 9,8 pg/mL r = 0,67

Médias: 26,3 pg/mL (TKTF) 39,0 pg/mL (Diálise)

Mulheres (42) (TKTF) = 0,79 (Diálise) + 1,0 pg/mL r = 0,75


Combinadas (85) (TKTF) = 0,55 (Diálise) + 3,4 pg/mL r = 0,87


O procedimento da Testosterona livre Coat-A-Count foi também comparado ao procedimento da Testosterona Total—Testosterona Total Coat-A-Count—em 109 amostras de soro (51 masculinas e 58 femininas). Regressão linear:


Homens (51) (Livre) = 4,7 (Total) + 0,7 r = 0,984

Médias: 23,6 pg/mL (Livre) 4,84 ng/mL (Total)

Mulheres (58) (Livre) = 6,1 (Total) + 0,6 r = 0,978


Combinadas (109) (Livre) = 4,6 (Total) + 1,2 r = 0,992


Assistência Técnica Por favor contacte o seu Distribuidor Nacional. www.siemens.com/diagnostics

O Sistema da Qualidade da Siemens Healthcare Diagnostics Inc. está registado sob a norma ISO 13485:2003.

Coat-A-Count® is a trademark of Siemens Healthcare Diagnostics.

©2010 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. All rights reserved.

Origin: US

Siemens Healthcare Diagnostics Inc.Los Angeles, CA 90045 USA

Siemens Healthcare Diagnostics Ltd.Sir William Siemens Sq. Frimley, Camberley, UK GU16 8QD

2010-10-21

PITKTF – 11

Changes in this Edition: cc#19759: In Materials Required But Not Provided section, added FDR catalog number for foam decanting rack and PPO catalog number for polypropylene tubes; removed “available from Siemens” claim for graph paper ZP797.

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The following symbols may appear on the product labeling: / Die folgenden Symbole können auf dem Produktetikett verwendet werden: / Los siguientes símbolos pueden aparecer en la etiqueta del producto: / Les symboles suivants peuvent apparaître sur les étiquettes des produits : / Sull'etichetta del prodotto possono essere presenti i seguenti simboli: / Os seguintes símbolos podem aparecer no rótulo dos produtos:

Symbol Definition

En: In vitro diagnostic medical device De: Medizinisches Gerät zur In-vitro Diagnose Es: Dispositivo médico para diagnóstico in vitro Fr: Dispositif médical de diagnostic in vitro It: Dispositivo medico per diagnostica in vitro Pt: Dispositivo médico para diagnóstico in vitro

En: Catalog Number De: Katalog-Nummer Es: Número de referencia Fr: Numéro de référence catalogue It: Numero catalogo Pt: Número de catálogo

En: Manufacturer De: Hersteller Es: Fabricante Fr: Fabricant It: Produttore Pt: Fabricante

En: Authorized Representative in the European Community De: Autorisierte Vertretung in der Europäischen Union Es: Representante autorizado en la Unión Europea Fr: Représentant agréé pour l’Union européenne It: Rappresentante autorizzato nella Comunità europea Pt: Representante Autorizado na Comunidade Europeia


Symbol Definition

En: CE Mark De: CE-Kennzeichen Es: Símbolo de la CE Fr: Marque CE It: Marchio CE Pt: Marca CE

En: CE Mark with identification number of notified body De: CE-Kennzeichen Identifikationsnummer der benannten Stelle Es: Marca de la CE con número de identificación del organismo notificado Fr: Marque CE avec numéro d’identification du corps notifié It: Marchio CE con numero identificativo dell'ente notificato Pt: Marca CE, com número de identificação do órgão notificado

En: Consult instructions for use De: Bedienungshinweise beachten Es: Consulte las instrucciones de uso Fr: Consulter le mode d’emploi It: Consultare le istruzioni per l'uso Pt: Consulte as instruções de utilização

En: Caution! Potential Biohazard De: Vorsicht! Biologisches Risikomaterial Es: ¡Precaución! Peligro BiológicoPotencial Fr: Avertissement ! Risque biologique potentiel It: Attenzione! Potenziale Pericolo Biologico Pt: Precaução! Potenciais Riscos Biológicos

En: Radioactive Materials De: Radioaktives Material Es: Materiales radiactivos Fr: Matériaux radioactifs It: Materiali radioattivi Pt: Materiais Radioactivos

En: Caution De: Vorsicht Es: Precaución Fr: Avertissement It: Attenzione Pt: Precaução

Symbol Definition

En: Temperature limitation (2–8°C) De: Temperaturgrenze (2–8°C) Es: Limitación de la temperatura (2–8°C) Fr: Limites de température (2–8°C) It: Limiti di temperatura (2–8°C) Pt: Limites de temperatura (2–8°C)

En: Upper limit of temperature (≤ -20°C) De: Obere Temperaturgrenze (≤ -20°C) Es: Limitación superior de la temperatura (≤ -20°C) Fr: Limite supérieure de température (≤ -20°C) It: Limite superiore di temperatura (≤ -20°C) Pt: Limite máximo de temperatura (≤ -20°C)

En: Lower limit of temperature (≥2°C) De: Mindesttemperatur (≥2°C) Es: Temperatura maxima (≥2°C) Fr: Limite inférieure de température (≥2°C) It: Limite inferiore di temperature ( ≥2°C) Pt: Limite inferior de temperatura (≥2°C)

En: Do not freeze (> 0°C) De: Nicht einfrieren (> 0°C) Es: No congelar (> 0°C) Fr: Ne pas congeler (> 0°C) It: Non congelare (> 0°C) Pt: Não congele (> 0°C)

En: Keep away from sunlight De: Vor Sonneneinstrahlung schützen Es: Mantener protegido de la luz solar Fr: Maintenir hors de portée de la lumière du soleil It: Non esporre alla luce del sole Pt: Manter protegido da luz solar

LOT

En: Batch code De: Chargenbezeichnung Es: Código de lote Fr: Numéro de code du lot It: Codice lotto Pt: Código de lote


Symbol Definition

En: Contains sufficient for (n) tests De: Es reicht für (n) tests Es: Contiene material para (n) pruebas Fr: Suffisant pour (n) tests It: Contiene materiale sufficiente per (n) test Pt: Contém o suficiente para (n) testes

2008-01 En: Date format (year-month) De: Datumsformat (Jahr-Monat) Es: Formato de fecha (año-mes) Fr: Format de la date (année-mois) It: Formato data (anno-mese) Pt: Formato de data (ano-mês)

En: Use by De: Verwendbar bis Es: Fecha de caducidad Fr: A utiliser avant It: Usare entro Pt: Use até

En: Harmful De: Gesundheitsschädlich Es: Nocivo Fr: Nocif It: Nocivo Pt: Nocivo

En: Corrosive De: Ätzend Es: Corrosivo Fr: Corrosif It: Corrosivo Pt: Corrosivo

En: Toxic De: Giftig Es: Tóxico Fr: Toxique It: Tossico Pt: Tóxico

En: Dangerous for the environment De: Umweltgefährlich Es: Peligroso para el medio ambiente Fr: Dangereux pour l'environnement It: Pericoloso per l'ambiente Pt: Perigoso para o ambiente

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