fraksi n-heksana-etil asetat herba bandotanrepository.usd.ac.id/36666/2/168114005_full.pdfmetabolit...
TRANSCRIPT
FRAKSI n-HEKSANA-ETIL ASETAT HERBA BANDOTAN (Ageratum
conyzoides L.) DAN UJI PENGHAMBATAN AKTIVITAS MATRIKS
METALOPROTEINASE-9 (MMP9) IN VITRO
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi
Diajukan oleh:
Wiwy
NIM : 168114005
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2020
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Pensetujuan Pembimbing
FRAKSI r-HEKSANA-ETIL ASETAT HERBA BANDOTAN (Ageratum
conyzoidesL.l DAN UJI PENGHAN{BATAN AKTMTAS MATRIKS
METALOPROTETNASE-9 (MMp9) IN VrTRO
Skipsi yang diajukan oleh:
Wiwy
MM : 168114005
telah disetujui oleh
Perhbimbing Utarna
A,E
( Maywan Hariono, Ph.D., Apt.) Senin, 14 Januari 2020
l1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
iv
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
v
LEMBAR PENYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH
UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS
.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
vi
HALAMAN PERSEMBAHAN
In everything give thanks: for this is
the will of God in Christ Jesus
concerning you.
1 Thessalonians 5: 18
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
vii
PRAKATA
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
viii
DAFTAR ISI
HALAMAN JUDUL ....................................................................................... i
PERSETUJUAN PEMBIMBING ................................................................... ii PENGESAHAN SKRIPSI BERJUDUL ......................................................... iii PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ......................................................... iv PENYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI .............................................. v HALAMAN PERSEMBAHAN ..................................................................... vi
PRAKATA .................................................................................................... vii
DAFTAR ISI ................................................................................................... viii
DAFTAR TABEL ........................................................................................... ix DAFTAR GAMBAR ...................................................................................... x DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................... xi ABSTRAK .................................................................................................... xii
ABSTRACT .................................................................................................... xiii PENDAHULUAN .......................................................................................... 1 METODE PENELITIAN ................................................................................ 3
TATA CARA ANALISIS ............................................................................... 6 HASIL DAN PEMBAHASAN ....................................................................... 7
KESIMPULAN ............................................................................................... 17 SARAN .................................................................................................... 17 UCAPAN TERIMA KASIH ........................................................................... 17
DAFTAR PUSTAKA ..................................................................................... 18
LAMPIRAN .................................................................................................... 20 BIOGRAFI PENULIS .................................................................................... 33
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ix
DAFTAR TABEL
Tabel I. Organoleptis partisi herba bandotan........................................... 8
Tabel II. Organoleptis fraksi n-heksana-etil asetat herba bandotan .......... 8
Tabel III. Rendemen ekstrak, partisi dan fraksi dari herba bandotan ........ 9
Tabel IV. Nilai fluoresensi dari uji bioaktivitas MMP9 ............................. 11
Tabel V. Prediksi senyawa hits dari spektroskopi massa senyawa 1 ........ 14
Tabel VI. Prediksi senyawa hits dari spektroskopi massa senyawa 2 ........ 14
Tabel VII. Prediksi senyawa hits dari spektroskopi massa senyawa 3 ........ 15
Tabel VIII. Prediksi senyawa hits dari spektroskopi massa senyawa 4 ........ 15
Tabel IX. Senyawa yang telah diisolasi dari Ageratum conyzoides L. ...... 16
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
x
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Struktur genomik MMP ............................................................. 2 Gambar 2. Serbuk dan ekstrak herba bandotan ........................................... 7
Gambar 3. Partisi dan fraksi herba bandotan ............................................... 8 Gambar 4. Profil KLT partisi n-heksana dan fraksi herba bandotan ........... 10 Gambar 5. Kromatogram fraksi 2 herba bandotan ....................................... 12 Gambar 6. Spektroskopi massa senyawa 1 fraksi 2 herba bandotan ........... 14 Gambar 7. Spektroskopi massa senyawa 2 fraksi 2 herba bandotan ........... 14
Gambar 8. Spektroskopi massa senyawa 3 fraksi 2 herba bandotan ........... 15 Gambar 9. Spektroskopi massa senyawa 4 fraksi 2 herba bandotan ........... 15
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xi
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Volume bahan pengujian............................................................ 20 Lampiran 2. Desain 96-microwell plate ......................................................... 21
Lampiran 3. Profil KLT fraksi n-heksana-etil asetat pada Panjang gelombang
365 nm (a) dan 254 nm (b) ......................................................... 22 Lampiran 4. Profil KLT fraksi n-heksana-etil asetat pada Panjang gelombang
(a) 365 nm dan (b) 254 nm ......................................................... 23 Lampiran 5. Struktur senyawa prediksi dari spektroskopi massa fraksi 2
herba bandotan ........................................................................... 24 Lampiran 6. Surat determinasi tanaman ......................................................... 28
Lampiran 7. Parameter kromatografi gas-spektrometri massa ....................... 32
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xii
ABSTRAK
Kanker payudara adalah kanker yang paling sering dialami oleh wanita di
dunia dengan angka kejadian 2,1 juta setiap tahunnya dan merupakan penyebab
kematian terbesar bagi wanita. Terapi yang tersedia berupa operasi pengangkatan
tumor dan kemoterapi, memiliki efek samping yang merugikan. Bahan alam
dipercaya mempunyai rasio manfaat dan keamanan yang lebih baik daripada obat
sintetik. Penemuan obat dari bahan alam diharapkan dapat menambah kandidat obat
baru untuk mengatasi kanker payudara dengan efektivitas yang lebih baik serta efek
samping yang sekecil mungkin. Penelitian ini termasuk non-eksperimental
deskriptif pada tahap fraksinasi dan eksperimental murni pada tahap uji bioaktivitas
terhadap MMP9, suatu metaloenzim yang terlibat dalam metastasis kanker
payudara. Fraksinasi dilakukan dengan kromatografi kolom menggunakan fase
gerak n-heksana-etil asetat dan diuji aktivitasnya terhadap MMP9 menggunakan
fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based MMP9 assay. Terdapat 4
kelompok fraksi dengan rendemen sebesar 8.88%; 15,75%; 6,98% dan 6,96 %.
Kelompok 2 diuji penghambatannya terhadap MMP9 secara in vitro menunjukkan
penghambatan sebesar 68% pada konsentrasi 1000 ppm. Profil kromatografi gas-
spektrometri massa (KG-SM) dari fraksi aktif tersebut menunjukkan 4 senyawa
pada masing-masing menit yaitu 8,823; 11,257; 12,176 dan 14,460 beserta
massa/ion untuk masing-masing puncak adalah 522, 538, 543 dan 539.
Kata Kunci: Kanker payudara, MMP9, Ageratum conyzoides L., fraksinasi,
bandotan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xiii
ABSTRACT
Breast cancer mostly occurred in female with incidence rate of 2.1 million
per year and is the leading cause of death among female. To date, the therapies that
are available including surgeries and chemotherapy having an adverse side effect.
Natural product is believed to be safer than synthetic drugs, therefore, the drug
discovery from natural product is expected to be capable to provide drug candidates
for breast cancer effectively with less side effect. This is a non-experimental
descriptive study in fractionation as well as an experimental study in FRET-based
MMP9 bioassay. Fractionation was performed using conventional column
chromatography with mobile phase of n-hexane-ethyl acetate. The collected
fraction was tested for inhibition activity against MMP9. The yields of the fractions
are of 8.88%; 15,75%; 6,98% dan 6,96 %. Interestingly, fraction 2 demonstrates
68% inhibition activity at a concentration 1000 µg/mL. The fraction was identified
its chemical substances using gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)
reveals 4 peaks at retention time as follows 8,823; 11,257; 12,176; 14,460 mins
with its respective mass/ion as followed: 522, 538, 543 dan 539.
Keywords: breast cancer, MMP9, Ageratum conyzoides L., fractionation, goat
weeds
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
1
PENDAHULUAN
Kanker payudara merupakan tumor ganas dengan patogenesis yang
kompleks dan sering terjadi pada wanita (Li et al., 2017). Berdasarkan reseptornya,
terdapat beberapa jenis kanker payudara yaitu luminal A, luminal B, HER-2
positive, triple negative (estrogen receptor, progesterone, dan HER-2 negative)
dan claudin-low dengan prognosis berbeda-beda (Ma et al., 2015). Pada tahun
2018, diestimasikan 627.000 wanita meninggal akibat kanker payudara dengan
angka kematian 15% (WHO, 2019). Di samping itu, angka kejadian penyakit
kanker payudara di Indonesia dilaporkan sebanyak 42,1 per 100.000 penduduk
dengan rata-rata kematian 17 per 100.000 penduduk (Kemenkes, 2019).
Drug Discovery Research Group (DDRG) Fakultas Farmasi Universitas
Sanata Dharma telah melakukan seleksi tanaman Indonesia yang berpotensi sebagai
penghambat matriks metaloproteinase 9 (MMP9) (Karamoy et al., 2019). Seleksi
ini dilakukan dengan uji in silico (komputasi) berupa docking molekular struktur
kristal enzim MMP9 terhadap 200 senyawa dari in-house database yang dikoleksi
dari salah satu situs herbal Indonesia (http://herbaldb.farmasi.ui.ac.id/v3/)
menggunakan software AutoDock Vina (www.scripps.edu.my). Dua puluh
senyawa yang terpilih (hits), diketahui terkandung di dalam 17 tanaman lokal
berdasarkan energi bebas ikatan dengan nilai yang terendah (-11,2 sehingga -8,1
kkal/mol).
Sepuluh tanaman terpilih berdasarkan hits sudah diekstraksi dari bagian
tanaman yang dimaksud dan diuji aktivitas penghambatannya secara in vitro
terhadap enzim MMP9 dengan % penghambatan bervariasi dari 0-92% pada
konsentrasi 1 mg/mL. Salah satu ekstrak tanaman yang menunjukkan
penghambatan tinggi adalah herba bandotan (Ageratum conyzoides L.) dengan
hambatan sebesar 75% dan IC50 = 64,35 µg/ml.
Pada kanker payudara triple negative, sel mengalami ekspresi MMP9 yang
dikenal sebagai gelatinase B secara berlebihan dan diasosiasikan dengan metastasis
kanker payudara (Mehner et al., 2014). Matriks metaloproteinase (MMP)
merupakan enzim Zn-dependent yang berfungsi dalam mendegradasi matriks
ekstraseluler (Adhipandito et al., 2019). Selain sebagai pendegradasi matriks
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
2
ekstraseluler, MMP juga berperan dalam mengaktifkan growth factor, sitokin,
kemokin dan protein pada permukaan sel seperti reseptor (Bauvois, 2012). Fungsi
dari MMP9 tersebut diketahui memiliki peran penting dalam pembentukan tumor
dan metastasis sel kanker yang disebabkan oleh melemahnya membran sel dan
ikatan antar sel sehingga dapat terjadi peningkatan invasi dan metastasis sel kanker
(Stuelten et al., 2005). Struktur MMP secara umum berupa tiga domain yaitu
propeptida, domain katalitik dan hemopexin (Nagase et al., 2006) yang disajikan
pada Gambar 1. Signal peptide merupakan bagian dari enzim MMP yang berfungsi
untuk mengarahkan protein menuju retikulum endoplasma, sedangkan propeptida
memiliki peran dalam menjaga enzim berada pada bentuk inaktif (Patil dan Kundu,
2006). Domain katalitik merupakan bagian enzim yang mengandung ion Zn dan
memiliki kemiripan yang sangat tinggi antara satu dengan yang lainnya pada semua
subfamili MMP (MMP1-MMP28) (Brkic et al., 2015). Karena itu, obat dengan
target domain katalitik memiliki spesifisitas yang rendah, namun domain katalitik
dihubungkan oleh hinge region dengan bagian unik yang dikenal sebagai
hemopexin-binding site (Brkic et al., 2015). Hemopexin-binding site berfungsi
dalam mendegradasi substrat dan bisa dibedakan dari suatu MMP dengan subfamili
lainnya (Dufour et al., 2010).
Gambar 1. Struktur genomik MMP
Bandotan (Ageratum conyzoides L.) adalah tanaman sejenis gulma dari
familia Asteraceae yang berasal dari Brasil dan daerah tropis Amerika (NSW Flora
Online, 2007). Tanaman ini juga dapat ditemukan di Afrika, Australia, Amerika
dan Asia Tenggara (CABI, 2019) dan biasa digunakan sebagai pengobatan
tradisional di India untuk mengatasi disentri dan diare (Panda and Luyten, 2018).
Metabolit sekunder yang sudah teridentifikasi di dalam bandotan adalah 87
senyawa terpenoid, 8 senyawa steroid, 23 senyawa flavonoid, 1 senyawa alkaloid,
kumarin dan 1 senyawa lignan berupa sesamin (Kaur and Dogra, 2014).
Berdasarkan ekstrak metanol herba bandotan yang aktif di atas, telah
ditelusuri senyawa aktif yang bertanggung jawab terhadap penghambatan MMP9
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
3
melalui proses fraksinasi yang diawali dengan proses ekstraksi menggunakan
metode maserasi. Ekstrak kemudian dipartisi dengan menggunakan 4 pelarut yaitu
n-heksana, etil asetat, n-butanol dan akuades. Pada penelitian kali ini, partisi n-
heksana dipilih untuk fraksinasi lebih lanjut menggunakan fase gerak n-heksana-
etil asetat. Ketiga partisi yang lain disimpan untuk penelitian lebih lanjut. Hasil
fraksinasi dikelompokkan berdasarkan profil KLT dan diuji secara in vitro
penghambatannya terhadap aktivitas enzim MMP9. Fraksi kemudian diidentifikasi
senyawa yang terkandung di dalamnya menggunakan kromatografi gas-
spektrometri massa (KG-SM).
METODE PENELITIAN
Alat Penelitian
Mesin penyerbuk, corong pisah, oven Memmert, rotary evaporator
Butchi, KG-SM QP2010 SE SHIMADZU, Multimode Reader SYNERGY HTX-3,
96 well micro-plate, microtube, vortex, kolom kromatografi, mikropipet
SOCOREX dan alat gelas umumnya dengan merek Pyrex dan Iwaki
Bahan penelitian
Herba bandotan, metanol teknis, n-heksana teknis, etil asetat teknis, n-
butanol pro analisis EMSURE®, etil asetat pro analisis EMSURE®, n-heksana pro
analisis EMSURE®, akuades, kertas whatmann, kertas saring, pipet tips, silika
untuk kromatografi kolom merek MERCK, plat silika F254 merek MERCK, kits
enzim BIOVISION yang mengandung enzim MMP-9 terliofilisasi, substrat
peptida, dapar uji, N-Isobutil-N-(4-metoksifenilsulfonil)glisil hidroksamat
(NNGH) sebagai kontrol positif, gliserol untuk mengencerkan enzim dan
dimetilsulfoksida (DMSO) sebagai pelarut sampel.
Prosedur Penelitian
Determinasi Tanaman
Herbarium bandotan dibuat dari bagian akar, batang, daun dan bunga dari
tanaman bandotan. Herbarium kemudian dikirimkan ke Laboratorium Sistematika
Tumbuhan Fakultas Biologi Universitas Gadjah Mada untuk dideterminasi.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
4
Pemanenan dan pengumpulan simplisia
Pemanenan herba bandotan dilakukan dengan mengambil bagian batang,
daun dan bunga dari tanaman di daerah Paingan, Maguwoharjo, Daerah Istimewa
Yogyakarta. Herba bandotan dipanen pada musim kemarau dan diambil bagian di
atas tanah (aerial part) yaitu batang, daun dan bunga bandotan. Herba yang dipilih
berupa bandotan yang tidak layu dan tidak ada parasit secara visual dengan tinggi
berkisar 30-50 cm. Herba bandotan yang telah dikumpulkan dibersihkan dan
dirajang sebelum dikeringkan menggunakan oven pada suhu 45°C. Pengeringan
dilakukan hingga herba bandotan kering kemudian diserbuk dengan mesin
penyerbuk.
Ekstraksi
Ekstraksi herba bandotan dilakukan dengan metode maserasi
menggunakan pelarut metanol. Maserasi dilakukan dengan merendam serbuk
simplisia menggunakan pelarut metanol dengan perbandingan serbuk
simplisia:pelarut 1:3 b/v dan diaduk pada suhu ruang selama 24 jam. Setelah
pengadukan 24 jam, maserat disaring dengan kertas saring, kemudian residu
maserasi dimaserasi kembali dengan volume pelarut dan waktu pengadukan yang
sama. Remaserasi residu dilakukan sebanyak 4 kali. Maserat yang diperoleh
diuapkan menggunakan rotary evaporator dengan suhu 50°C.
Partisi
Ekstrak yang telah didapatkan kemudian dipartisi dengan menggunakan
metode ekstraksi cair-cair dengan alat corong pisah menggunakan 4 pelarut yaitu
n-heksana, etil asetat, n-butanol dan akuades. Ekstrak dilarutkan dalam akuades
dengan perbandingan ekstrak:akuades 1:20 b/v kemudian dituang ke dalam corong
pisah (Abu et al., 2017). Pelarut n-heksana dituang dengan volume yang sama
dengan akuades ke dalam corong pisah dan dikocok, kemudian ditunggu selama 30
menit. Selanjutnya, fase akuades dan n-heksana ditampung pada wadah yang
berbeda. Fase akuades yang telah tertampung dituang kembali ke dalam corong
pisah untuk dipartisi kembali dengan n-heksana sejumlah volume sebelumnya.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
5
Partisi dengan pelarut n-heksana dilakukan sebanyak 3 kali, kemudian fase akuades
kembali digunakan untuk partisi menggunakan pelarut etil asetat dan n-butanol.
Fraksinasi
Fraksinasi dilakukan dengan metode kromatografi kolom menggunakan
Silica G 60. Silika dimasukkan ke dalam kolom hingga tingginya mencapai kurang
lebih 15 cm. Sampel berupa partisi n-heksana ditimbang kurang lebih 1 gram dan
dilarutkan secukupnya dengan fase gerak yang telah dioptimasi. Sampel kemudian
dimasukkan ke dalam kolom yang telah dibasahi sebelumnya. Fase gerak n-
heksana-etil asetat dituang ke dalam kolom dan hasil eluat ditampung setiap 10 ml.
Fraksi yang diperoleh diuji pemisahannya dengan KLT, kemudian dikelompokkan
berdasarkan profil KLT yang sama.
Uji In Vitro Penghambatan MMP9
Preparasi sampel dilakukan dengan cara membuat larutan stok dengan
konsentrasi 100.000 ppm (100 mg/mL) menggunakan pelarut DMSO. Enzim
MMP9 yang telah diliofilisasi sebelumnya, direkonstitusi dengan 110 µl 30%
gliserol dalam aqua demineralisata dan disimpan pada suhu -20°C. Pada pengujian,
N-Isobutil-N-(4-metoksifenilsulfonil)glisil hidroksamat (NNGH) digunakan
sebagai kontrol positif, sedangkan peptida digunakan sebagai substrat enzim
MMP9 beserta larutan dapar MMP9 untuk mempertahankan pH optimal aktivitas
enzim.
Setiap bahan ditambahkan sesuai dengan kategori secara urut dari nomor
1 hingga 7 (Lampiran 1) sesuai dengan desain 96-well micro-plate (Lampiran 2).
Blanko terdiri dari 100 µL larutan dapar; kontrol negatif terdiri dari 45 µl dapar
dan 5 µl enzim; sedangkan kontrol positif terdiri dari 2 µl NNGH, 5 µl enzim
MMP9 dan 43 µl dapar. Kelompok perlakuan terdiri dari sampel fraksi bandotan 1
µl, enzim 5 µl dan dapar 43 µl. Micro-plate diinkubasi selama 30 menit pada suhu
37°C dalam keadaan shaking. Setelah diinkubasi, setiap sumuran ditambahkan 44
µl larutan dapar dan 1 µl substrat MMP9 dan kembali diinkubasi selama 60 menit
pada suhu 37°C. Fluoresensi diukur dengan menggunakan multimode reader
dengan panjang gelombang eksitasi 325 nm dan panjang gelombang emisi 393 nm.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
6
Analisis Kromatografi Gas-Spektrometri Massa (KG-SM)
Analisis menggunakan KG-SM diawali dengan penimbangan sampel
fraksi sebanyak 5 mg dan dilarutkan dengan 1 mL kloroform. Sampel tersebut
diinjeksikan ke instrumen KG-SM dengan pengaturan berupa : kolom RTX 5 MS
yang dialiri dengan fase gerak berupa gas helium dengan kecepatan alir total berupa
24,1 mL/min dan kecepatan alir kolom berupa 0,42 mL/min; temperatur oven
kolom 100,0°C; ditingkatkan 5°C setiap 5 menit hingga suhu 300,00°C; tekanan
12,0 kPa dan ionisasi EI 70 Ev.
TATA CARA ANALISIS
Organoleptis
Simplisia, ekstrak, partisi dan fraksi Ageratum conyzoides L. diamati
warna, bau dan tekstur.
Rendemen
Bobot awal simplisia, ekstrak dan partisi ditimbang dan dicatat. Setelah
dilakukan proses ekstraksi, partisi dan fraksinasi, hasil ekstraksi dikeringkan
kemudian ditimbang. Rendemen ekstrak, partisi, fraksinasi dihitung dengan rumus
berikut :
𝑅𝑒𝑛𝑑𝑒𝑚𝑒𝑛 =𝑏𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑏𝑎ℎ𝑎𝑛
𝑏𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑏𝑎ℎ𝑎𝑛 𝑎𝑤𝑎𝑙 × 100%
Susut Pengeringan
Serbuk simplisia ditimbang dan dimasukkan ke dalam oven. Simplisia
dikeringkan dan ditimbang setiap pengeringan. Pengeringan dengan oven
dilakukan hingga bobot yang ditimbang konstan. Bobot konstan ditetapkan sebagai
bobot serbuk setelah pengeringan tidak lebih dari 0,5 mg dari bobot serbuk sebelum
pengeringan (Depkes,2008).
Profil KG-SM
Profil dari KG-SM akan menunjukkan waktu retensi dan massa relatif
molekul dari senyawa-senyawa yang terdapat dalam fraksi. Profil-profil tersebut
dilihat kromatogram dan spektra massanya.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
7
Persentase Hambatan Enzim MMP9
Persentase hambatan enzim MMP9 dihitung dengan rumus:
(1 − 𝐵𝑎𝑐𝑎𝑎𝑛 𝑓𝑙𝑢𝑜𝑟𝑒𝑠𝑒𝑛𝑠𝑖 𝑠𝑒𝑛𝑦𝑎𝑤𝑎 ℎ𝑎𝑠𝑖𝑙 𝑢𝑗𝑖 𝑖𝑛 𝑣𝑖𝑡𝑟𝑜 − 𝑏𝑙𝑎𝑛𝑔𝑘𝑜
𝐵𝑎𝑐𝑎𝑎𝑛 𝑓𝑙𝑢𝑜𝑟𝑒𝑠𝑒𝑛𝑠𝑖 𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑛𝑒𝑔𝑎𝑡𝑖𝑓 − 𝑏𝑙𝑎𝑛𝑔𝑘𝑜) 𝑥 100%
HASIL DAN PEMBAHASAN
Organoleptis
Tanaman Bandotan (Ageratum conyzoides L.) diambil dari daerah
Paingan, Maguwoharjo, Daerah Istimewa, Yogyakarta. Gambar 2 menyajikan
gambar serbuk simplisia dan ekstrak metanol herba bandotan.
(a) (b)
Gambar 2. Serbuk dan ekstrak herba bandotan
(a) Serbuk simplisia herba bandotan (b) ekstrak metanol dari herba bandotan
Serbuk simplisia dari herba bandotan (Ageratum conyzoides L.) yang
didapatkan memiliki organoleptis berupa serbuk halus berwarna hijau dengan bau
yang khas. Serbuk yang didapatkan memiliki organoleptis yang mirip dengan
deskripsi simplisia pada Farmakope Herbal Indonesia. Hal tersebut berarti serbuk
simplisia yang didapatkan sudah sesuai dan dalam kondisi yang baik. Serbuk
kemudian diekstraksi menggunakan metode maserasi selama 4 X 24 jam dan
dikentalkan dengan cara diuapkan dengan rotary evaporator dengan suhu maksimal
50° C.
Ekstrak kental herba bandotan yang didapatkan memiliki organoleptis
berupa cairan kental berwarna hijau tua dengan bau yang khas. Pada Farmakope
Herbal Indonesia (2008), ekstrak herba bandotan dideskripsikan memiliki
karakteristik berwarna hijau kehitaman, berbau khas serta berasa pahit dan kelat.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
8
Organoleptis dari ekstrak kental yang didapatkan sesuai dengan deskripsi yang
tertulis di Farmakope Herbal Indonesia, sehingga ekstrak yang didapatkan sesuai
dengan rujukan standar dan dalam kondisi yang baik. Ekstrak herba bandotan yang
didapat kemudian ditimbang sejumlah 10 g untuk dilakukan partisi menggunakan
n-heksana, etil asetat, n-butanol dan akuades. Organoleptis dari partisi dan fraksi
yang didapatkan tersaji pada Gambar 3, Tabel I dan Tabel II dibawah.
(a) (b)
Gambar 3. Partisi dan fraksi herba bandotan
(a) Partisi herba bandotan (b) fraksi n-heksana-etil asetat herba bandotan
Tabel I. Organoleptis partisi herba bandotan
Partisi Organoleptis
n-heksana Berwarna hijau kehitaman dan kental
Etil asetat Berwarna hijau kehitaman dan kental
n-butanol Berwarna oranye dan cair
Akuades Berwarna oranye, cair, terdapat gumpalan-gumpalan
Partisi n-heksana kemudian difraksinasi menggunakan kromatografi
kolom konvensional dengan fase gerak n-heksana-etil asetat dengan perbandingan
yang sudah dioptimasi yaitu n-heksana:etil asetat (5:3). Eluat fraksi yang
didapatkan adalah sejumlah 53 vial dan dikelompokkan berdasarkan profil KLT
menjadi 4 kelompok.
Tabel II. Organoleptis fraksi n-heksana-etil asetat herba bandotan
Kelompok Fraksi Organoleptis
1 Berwarna oranye dan kental
2 Berwarna hijau gelap dan kental
3 Berbentuk seperti jarum dan berwarna hijau gelap
4 Berwarna hijau gelap dan kental
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
9
Rendemen
Dari keempat partisi yang didapatkan dari ekstrak herba bandotan, partisi
air memiliki rendemen terbanyak sebesar 39,32%, diikuti partisi n-heksana sebesar
27,44%, kemudian n-butanol sebesar 14,59% dan rendemen paling sedikit adalah
partisi etil asetat sebesar 8,16%. Partisi air dari herba bandotan memiliki rendemen
terbesar dapat menunjukkan bahwa herba bandotan mengandung banyak senyawa
polar. Senyawa polar yang dapat larut dalam partisi air biasanya adalah senyawa
glikosida yang polar. Sedangkan, pada partisi n-heksana yang memiliki rendemen
terbanyak setelah partisi air kemungkinan mengandung senyawa non-polar seperti
lipid, klorofil dan sebagainya. Senyawa yang larut dalam partisi n-butanol dan etil
asetat memiliki sifat semi polar atau sebagian senyawa polar dan non-polar yang
terlarut seperti senyawa monoglikosida (Otsuka, 2006). Rendemen ekstrak, partisi
dan fraksi yang didapat dari penelitian tersaji pada Tabel III.
Tabel III. Rendemen ekstrak, partisi dan fraksi dari herba bandotan
Fraksinasi partisi n-heksana menggunakan fase gerak n-heksana-etil asetat
menghasilkan sebanyak 4 kelompok fraksi. Fraksi 2 bandotan dipilih untuk
dilakukan pengujian aktivitas penghambatan MMP9 in vitro karena memiliki
rendemen terbanyak, yaitu sebesar 15,75%.
Profil KLT partisi n-heksana yang didapatkan seperti pada Gambar 4,
menunjukkan 12 bercak pada 365 nm dan 11 bercak pada 254 nm. Pada fraksi 1,
Bahan Bobot Bahan Awal Bobot Bahan Rendemen
Ekstrak 100 g 11,9704 g 11.97%
Partisi
n-heksana
9,97 g
2,736 g 27.44%
Etil asetat 0,814 g 8.16%
n-butanol 1,4545 g 14.59%
Akuades 3,9199 g 39.32%
Fraksi
Fraksi 1
1,0068 g
0.0894 g 8.88%
Fraksi 2 0.1586 g 15.75%
Fraksi 3 0.0703 g 6.98%
Fraksi 4 0.0701 g 6.96%
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
10
terdapat 2 bercak pada 365 nm dan 254 nm; fraksi 2 terdapat 3 bercak pada 365 nm
dan 4 bercak pada 254 nm; fraksi 3 terdapat 6 bercak pada 365 nm dan 254 nm; dan
fraksi 4 terdapat 9 bercak pada 365 nm dan 7 bercak pada 254 nm. Senyawa-
senyawa yang dapat terdeteksi di bawah UV 254 nm adalah senyawa yang memiliki
ikatan rangkap terkonjugasi seperti anthraglikosida, flavonoid, polifenol dan
sebagian senyawa alkaloid, sedangkan senyawa yang terdeteksi pada UV 365 nm
adalah senyawa anthraglikosida, kumarin, flavonoid, fenolkarboksilat dan sebagian
senyawa alkaloid (Lederer, 1985). Warna bercak yang terdeteksi pada partisi dan
fraksi dibawah UV 365 nm adalah warna kuning, pink dan biru, sedangkan bercak
yang terdeteksi pada UV 254 berupa bercak gelap, bercak warna kuning dan biru
keabuan.
Gambar 4. Profil KLT partisi n-heksana dan fraksi herba bandotan
Profil KLT (1) fraksi 1 ;(2) fraksi 2 ;(3) fraksi 3 ;(4) fraksi 4 ;(5) partisi n-heksana
Susut Pengeringan
Susut pengeringan didapatkan dengan melakukan pemanasan pada serbuk
simplisia hingga bobot konstan, yang berarti selisih bobot penimbangan tidak lebih
dari 0,5 mg (FHI, 2008). Susut pengeringan bertujuan untuk mengukur atau
mengetahui kandungan air dan minyak atsiri dalam serbuk simplisia. Dari hasil
susut pengeringan, didapatkan hasil penyusutan bobot berupa 9,41%. Menurut
Farmakope Herbal Indonesia (2008), susut pengeringan dari herba bandotan tidak
lebih dari 10%, sehingga simplisia herba bandotan memenuhi persyaratan.
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
11
Persentase Hambatan Enzim MMP9
Pengujian penghambatan MMP9 dilakukan secara in vitro dengan enzim
kits dari BIOVISION berdasarkan pada prinsip FRET (Fluorescence Resonance
Energy Transfer). Pada pengujian menggunakan FRET, substrat peptida
dikoneksikan dengan gugus fluorofor yang akan berfluorensi dan terdeteksi jika
substrat peptida terdegradasi (Lee dan Kim, 2015). Nilai fluoresensi yang tinggi
proporsional dengan aktivitas enzim, sedangkan nilai fluoresensi yang rendah
dibandingkan kontrol negatif menunjukkan adanya penghambatan aktivitas enzim.
Kelompok kontrol yang terdapat pada pengujian ini berupa blanko yang berfungsi
sebagai patokan nilai fluoresensi tanpa aktivitas enzim. Kontrol negatif hanya
terdiri dari enzim, larutan dapar dan substrat bertujuan untuk mengetahui nilai
fluoresensi enzim MMP9 tanpa penghambatan, sedangkan kontrol positif yang
terdiri dari NNGH, larutan dapar, enzim dan substrat bertujuan untuk memastikan
bahwa prosedur dan kits enzim sudah sesuai dan dalam keadaan baik untuk
dilakukan pengujian. Kelompok perlakuan terdiri dari enzim, larutan dapar, substrat
dan sampel yang berupa kelompok fraksi 2. Nilai fluoresensi yang didapatkan dari
pengujian penghambatan MMP9 in vitro tertera pada Tabel IV berikut.
Tabel IV. Nilai fluoresensi dari uji bioaktivitas MMP9
Bacaan fluoresensi Rata-
rata
Base
line
Aktivitas
enzim % peghambatan
1 2 3
Blanko 82 68 70 73 0 -
Kontrol
negatif 181 209 192 194 121 100% 0
Kontrol
positif 81 68 68 72 -1 -1% 101±6
Solvent
control 184 186 194 188 115 95% 5±4
Fraksi
bandotan 113 88 115 105 32 27% 73±12
Pada pengujian in vitro, solvent control (SC) yang berisikan 1 mL DMSO
bertujuan untuk melihat interferensi berupa penghambatan enzim oleh pelarut yang
digunakan yaitu DMSO. Hasil pengujian menunjukkan DMSO menghambat
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
12
sebesar 5%, sehingga, nilai penghambatan yang didapatkan dari perhitungan nilai
fluoresensi pada kelompok perlakuan, yaitu 73% dikurangkan dari nilai
penghambatan oleh solvent control. Berdasarkan hasil pengujian bioaktivitas
tersebut, fraksi 2 herba bandotan memiliki aktivitas penghambatan enzim MMP9
sebesar 68% pada konsentrasi 1000 ppm.
Bandotan dilaporkan pada beberapa penelitian memiliki beragam manfaat
seperti menyembuhkan luka, anti-bakteri (Chah et al., 2006), anti-fungal (Nogueira
et al., 2010), anti-parasit (Panda and Luyten, 2018), antioksidan dan aktivitas
sitotoksik (Adebayo, 2010). Penelitian yang dilakukan oleh Adebayo (2010)
menunjukkan adanya efek sitotoksik dari ekstrak bandotan terhadap berbagai sel
kanker meliputi sel kanker paru line A549, sel kanker lambung SGC 7901, kanker
kolon HT-29, kanker otak U-251, kanker karsinoma payudara triple negative
dengan diferensiasi rendah tipe MDA-MB-231, kanker karsinoma prostat DU-145,
kanker karsinoma hati BEL-7402, dan sel murine leukemia P-388 (Adebayo et al.,
2010). Efek sitotoksik ekstrak bandotan terhadap sel MDA-MB-231 dapat
disebabkan oleh salah satu atau sebagian senyawa yang terkandung dalam fraksi 2
bandotan.
Profil KG-SM
Pengujian KG-SM dilakukan terhadap kelompok fraksi ke-2 dengan
parameter yang telah ditetapkan (Lampiran 7) dan didapatkan hasil kromatogram
(Gambar 5) yang menunjukkan adanya 4 puncak yang terlihat pada waktu retensi
secara berurut berupa 8,823; 11,257; 12,176 dan 14,460 menit.
Gambar 5. Kromatogram gas fraksi 2 herba bandotan
1
2
3 4
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
13
Pada kromatografi gas, titik didih merupakan salah satu faktor penting
yang berperan dalam waktu retensi. Semakin rendah titik didih dari senyawa
tersebut, maka retention time dari senyawa akan semakin singkat (M. McNair dan
M. Miller, 2009). Kromatogram menunjukkan secara berurutan titik didih senyawa
terendah hingga titik didih tertinggi adalah senyawa 1 (8,823 menit) < senyawa 2
(11,257 menit) < senyawa 3 (12,176 menit) < senyawa 4 (14,460 menit). Selain dari
temperatur, jenis kolom yang digunakan merupakan faktor penting lainnya yang
berperan dalam waktu retensi. Kolom yang digunakan berupa RTX 5 MS
(difenildimetilsiloksan) yang bersifat non-polar. Afinitas senyawa yang besar
terhadap kolom akan menyebabkan waktu retensi senyawa tersebut menjadi besar
(Hübschmann, 2015). Sehingga dapat disimpulkan bahwa polaritas senyawa yang
didapatkan dari non polar ke lebih polar adalah senyawa 4 < senyawa 3 < senyawa
2 < senyawa 1.
Senyawa yang telah melalui kolom kromatografi gas dideteksi dengan
spektrometri massa yang kemudian dibandingkan dengan library Wiley7.lib. Hasil
spektra massa puncak pertama didapatkan seperti pada Gambar 6 memiliki mass
peak sebanyak 301 dan base peak pada 175 dengan Mr 522. Spektra massa tersebut
dicocokkan dengan library dan diprediksi sebanyak 5 senyawa hits yang disajikan
pada Tabel V dengan fragmen 190, 179, 190, 232 dan 190. Gambar 7
menunjukkan spektra massa puncak kedua yang memiliki mass peak sebanyak 352
dan base peak pada 205 dengan Mr 538. Spektra massa tersebut dicocokkan dengan
library dan diprediksi sebanyak 5 senyawa hits yang disajikan pada Tabel VI
dengan 5 prediksi senyawa yang didapatkan memiliki fragmen yang sama yaitu
220. Gambar 8 memiliki mass peak sebanyak 306 dan base peak pada 201 dengan
Mr 543 dan diperoleh sebanyak 5 prediksi senyawa hits yang disajikan pada Tabel
VII dengan 5 prediksi senyawa yang didapatkan memiliki fragmen yang sama yaitu
216. Gambar 9 memiliki mass peak sebanyak 273 dan base peak pada 55 dengan
Mr 539 dan diperoleh sebanyak 5 prediksi senyawa yang disajikan pada Tabel VIII
dengan fragmen 170, 208, 142, 142 dan 142.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
14
Gambar 6. Spektroskopi massa senyawa 1 fraksi 2 herba bandotan
Tabel V. Prediksi senyawa hits dari spektroskopi massa senyawa 1
Retention
time %Area Mr Fragmen Prediksi
8,823 10,77% 522 190
Hit 1: 3-(4-tertiobutylphenyl)-
propanal
179
Hit 2: 1H-Indol-2-ol,2,3-dihydro-5-
methoxy-1-methyl-
190
Hit 3: 6-
Demethoxyageratochromene
232 Hit 4: pentaethylmethyl-disiloxane
190
Hit 5: 1H-Indene-4-carboxylic acid,
2,3-dihydro-1,1-dimethyl-
Gambar 7. Spektroskopi massa senyawa 2 fraksi 2 herba bandotan
Tabel VI. Prediksi senyawa hits dari spektroskopi massa senyawa 2
Retention
time %Area Mr Fragmen Prediksi
11,257 66,34% 538 220
Hit 1: 2H-1-Benzopyran, 6,7-
dimethoxy-2,2-dimethyl-
220 Hit 2: Phenol, 2,6-bis(1,1-
dimethylethyl)-4-methyl-
220 Hit 3: Phenol, 2,6-bis(1,1-
dimethylethyl)-4-methyl-
220 Hit 4: Phenol, 2,6-bis(1,1-
dimethylethyl)-4-methyl-
220 Hit 5: butylated hydroxy toluene
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
15
Gambar 8. Spektroskopi massa senyawa 3 fraksi 2 herba bandotan
Tabel VII. Prediksi senyawa hits dari spektroskopi massa senyawa 3
Retention
time %Area Mr Fragmen Prediksi
12,176 17,39% 543
216
Hit 1: 1H-Inden-1-one, 5-(1,1-
dimethylethyl)-2,3-dihydro-3,3-
dimethyl-
216
Hit 2: 1H-Inden-1-one, 7-(1,1-
dimethylethyl)-2,3-dihydro-3,3-
dimethyl-
216 Hit 3: 2,3-Hexadienoic acid, 2-
methyl-4-phenyl-, methyl este
216 Hit 4: Benzene, 2-(butenyl)-5-(1,1-
dimethylethyl)-1,3-dimethyl-
216 Hit 5: 3-isobutylidene-6,7-
dimethyl-3h-isobenzofuran-1-one
Gambar 9. Spektroskopi massa senyawa 4 fraksi 2 herba bandotan
Tabel VIII. Prediksi senyawa hits dari spektroskopi massa senyawa 4
Retention
time %Area Mr Fragmen Prediksi
14,460 5,50% 539 170
Hit 1: methyl 1-methyl-2-
oxocyclohexane-1-carboxylate
208 Hit 2: Cyclohexane, 1,1'-(1-methyl-
1,2-ethanediyl)bis-
142 Hit 3: methyl ester of 4-methylene-
hexanoic acid
142 Hit 4: methyl 4-methylhexa-2-
enoate
142 Hit 5: Cyclohexanecarboxylic acid,
methyl ester
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
16
Berdasarkan literarur, terdapat beberapa senyawa yang telah diisolasi dari
herba bandotan. Senyawa tersebut disajikan pada Tabel IX.
Tabel IX. Senyawa yang telah diisolasi dari Ageratum conyzoides L.
No. Nama senyawa Mr
1 Stigmasterol 412,7
2 β-sitosterol 414,7
3 Kumarin 146,1
4 5,6,7,8,3,4,5-heptametoksiflavon 432,4
5 5,6,7,8,3-pentametoksi-4,5–metilenedioksiflavon 416,4
6 2,2- dimethylchromene 7-methoxy-6-O-β-D-glucopyranoside 369,15
7 eugenyl-O-β-D-glucopyranoside 326,35
8 Methyleugenol 178,23
9 3-(2'-O-β-D-glucopyranosyl)- phenyl-2-trans-propenoic acid 310,3
10 α-pinene 136,23
11 (9Z,12Z,15Z)-octadeca-9,12,15-trienoic acid 278,4
12 7,3',5'-tri-O-methyltricetin 344,3
13 Cirsilineol 344,1
14 Precocene I 190,24
15 Precocene II 220,26
16 6-(1-methoxyethyl)-7-methoxy-2,2-dimethylchromene) 248,32
17 2,2-dimethylchromene-7-O-β-D-glucopyranoside 338,36
18 3,5,7,4'- tetrahydroxyflavone 286,2
19 5,6,7,3',4',5'- hexamethoxyflavone 402,4
20 Tritriacontane, 1 464
21 Henitriacontane, 2 436
22 23-Pentatetraacontanone, 3 646
23 3,4, -Seco-lup- 20 (29)-en-3-OMe, 4 456
24 3° Butyl triacosanoate, 5 412
25 Methyltetracosanoate, 6 382
26 Friedeline 426
27 Encecanescin 450
28 Brassicasterol 398,7
29 Quercetin-3-rhamnopiranoside 448,4
30 Β-caryophyllene 204,35
31 Caffeic acid 180,16
32 Caryophyllene epoxide 220,35
33 Dihydrobrassicasterol 398,7
34 Echinatine 299,36
35 Eugenol 164,2
36 Fumaric acid 116,07
37 Kaempferol-3,7- diglucopiranoside 610,5
38 Lycopsamine 299,36
(Adebayo et al., 2011; Chauhan and Rijhwani, 2015; Kamboj and Saluja, 2011; O
Duke and B Powles, 2008; Singh et al., 2013)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
17
KESIMPULAN
Dari penelitian yang telah dilakukan, fraksi n-heksana-etil asetat dari herba
bandotan dapat menghasilkan fraksi aktif yang dapat menghambat enzim MMP9
secara in vitro. Fraksi aktif tersebut merupakan kelompok fraksi 2 dengan
penghambatan 68% pada konsentrasi 1000 ppm. Hasil kromatogram dari fraksi
aktif menunjukkan adanya 4 senyawa dengan retention time 8,823; 11,257; 12,176
dan 14,460 menit dengan masing-masing MR yaitu 522, 538, 543 dan 539.
SARAN
Fraksi 1, 3 dan 4 dilakukan pengujian penghambatan MMP9 in vitro untuk
mengetahui apakah dalam fraksi tersebut terdapat senyawa aktif dengan aktivitas
penghambatan enzim MMP9. Sedangkan fraksi 2 herba bandotan yang diketahui
memiliki aktivitas penghambatan MMP9 dapat dilanjutkan ke tahap isolasi
senyawa untuk mendapatkan senyawa aktif murni.
UCAPAN TERIMA KASIH
Ucapan terima kasih diberikan kepada Perakmi Timmerman Award 2017
dan Student Club Drug Discovery Research Group Fakultas Farmasi USD 2019
atas dukungan dana pada penelitian ini.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
18
DAFTAR PUSTAKA
Abu, F., Mat Taib, C.N., Mohd Moklas, M.A., Mohd Akhir, S., 2017. Antioxidant
Properties of Crude Extract, Partition Extract, and Fermented Medium of
Dendrobium sabin Flower. Evidence-based Complementary and Alternative
Medicine, 2017.
Adebayo, A.H., Ji, C.J., Zhang, Y.M., He, W.J., Zeng, G.Z., Han, H.J., Xu, J.J.,
Akindahunsi, A.A., Tan, N.H., 2011. A new chromene isolated from Ageratum
conyzoides. Natural Product Communications, 6(9), 1263–1265.
Adebayo, A.H., Tan, N.H., Akindahunsi, A.A., Zeng, G.Z., Zhang, Y.M., 2010.
Anticancer and antiradical scavenging activity of Ageratum conyzoides L.
(Asteraceae). Pharmacognosy Magazine, 6(21), 62–66.
Adhipandito, C.F., Ludji, D.P.K.S., Aprilianto, E., Jenie, R.I., Al-Najjar, B.,
Hariono, M., 2019. Matrix metalloproteinase9 as the protein target in anti-
breast cancer drug discovery: an approach by targeting hemopexin domain.
Future Journal of Pharmaceutical Sciences, 5(1), 1–15.
Bauvois, B., 2012. New facets of matrix metalloproteinases MMP-2 and MMP-9
as cell surface transducers: Outside-in signaling and relationship to tumor
progression. Biochimica et Biophysica Acta - Reviews on Cancer, 1825(1), 29–
36.
Brkic, M., Balusu, S., Libert, C., Vandenbroucke, R.E., 2015. Friends or Foes:
Matrix Metalloproteinases and Their Multifaceted Roles in Neurodegenerative
Diseases. Mediators of Inflammation, 2015(December).
CABI, current year. Invasive Species Compendium. Wallingford, UK: CAB
International. www.cabi.org/isc, diakses pada tanggal 1 September 2019.
Chah, K.F., Eze, C.A., Emuelosi, C.E., Esimone, C.O., 2006. Antibacterial and
wound healing properties of methanolic extracts of some Nigerian medicinal
plants. Journal of Ethnopharmacology, 104(1–2), 164–167.
Chauhan, A., Rijhwani, S., 2015. A comprehensive review on phytochemistry of
Ageratum conyzoides Linn.(Goat weed). International Journal of Engineering
Technology, Management and Applied Sciences, 3(March), 348–58.
Departemen Kesehatan RI, 2008. Farmakope Herbal Indonesia. Edisi 1. Jakarta.
Dufour, A., Zucker, S., Sampson, N.S., Kuscu, C., Cao, J., 2010. Role of matrix
metalloproteinase-9 dimers in cell migration: Design of inhibitory peptides.
Journal of Biological Chemistry, 285(46), 35944–35956.
Hübschmann, H.-J., 2015. Handbook of GC-MS, Third Ed. ed, Handbook of GC-
MS. Wiley-VCH, Singapore.
Kamboj, A., Saluja, A.K., 2011. Isolation of stigmasterol and β-sitosterol from
petroleum ether extract of aerial parts of Ageratum conyzoides (Asteraceae).
International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 3(1), 94–
96.
Karamoy, J.R., Hariyono, P., Nuwarda, R.F., Salin, N.H., Hariono, M., 2019.
Incorporation of In Silico and In Vitro Study for Identifying Local Plants with
Anti Human Breast Cancer Matrix Metalloproteinase 9 ( MMP9 ) Activities.
Review Artikel,.
Kaur, R., Dogra, N.K., 2014. A Review on Traditional Uses , Chemical
Constituents and Pharmacology of Ageratum conyzoides L . ( Asteraceae )
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
19
5(5), 33–45.
Lederer, M., 1985. Plant drug analysis: a thin layer chromatography atlas, Second
Edi. ed, Journal of Chromatography A. Springer, Munich.
Lee, H., Kim, Y.P., 2015. Fluorescent and bioluminescent nanoprobes for in vitro
and in vivo detection of matrix metalloproteinase activity. BMB Reports,
48(6), 313–318.
Li, H., Qiu, Z., Li, F., Wang, C., 2017. The relationship between MMP-2 and MMP-
9 expression levels with breast cancer incidence and prognosis. Oncology
Letters, 14(5), 5865–5870.
Ma, R., Feng, Y., Lin, S., Chen, J., Lin, H., Liang, X., Zheng, H., Cai, X., 2015.
Mechanisms involved in breast cancer liver metastasis. Journal of
Translational Medicine, 13(1), 1–10.
McNair, H.M., Miller, J.M., Snow, N.H., 2019. Basic Gas Chromatography, 2nd
ed, Basic Gas Chromatography. John Wiley & Sons, Inc.
Mehner, C., Hockla, A., Miller, E., Ran, S., Radisky, D.C., Radisky, E.S., 2014.
Tumor cell-produced matrix metalloproteinase 9 (MMP-9) drives malignant
progression and metastasis of basal-like triple negative breast cancer.
Oncotarget, 5(9), 2736–2749.
Nagase, H., Visse, R., Murphy, G., 2006. Structure and function of matrix
metalloproteinases and TIMPs. Cardiovascular Research,.
Nogueira, J.H.C., Gonçalez, E., Galleti, S.R., Facanali, R., Marques, M.O.M.,
Felício, J.D., 2010. Ageratum conyzoides essential oil as aflatoxin suppressor
of Aspergillus flavus. International Journal of Food Microbiology, 137(1),
55–60.
O Duke, S., B Powles, S., 2008. Glyphosate: a once-in-a-century herbicide. Pest
management science, 63(11), 1100–1106.
Otsuka, H., 2006. Purification by Solvent Extraction Using Partition Coefficient.
Natural Products Isolation, 20, 269–273.
Panda, S.K., Luyten, W., 2018. Antiparasitic activity in Asteraceae with special
attention to ethnobotanical use by the tribes of Odisha, India. Parasite, 25.
Patil, D. P., & Kundu, G. C., 2006. MMP9 (matrix metallopeptidase 9 (gelatinase
B, 92kDa gelatinase, 92kDa type IV collagenase)). Atlas of Genetics and
Cytogenetics in Oncology and Haematology.
PlantNET (The NSW Plant Information Network System), 2019. Royal Botanic
Gardens and Domain Trust, Sydney. http://plantnet.rbgsyd.nsw.gov.au,
diakses pada tanggal 25 Juni 2019.
Singh, S.B., Devi, W.R., Marina, A., Devi, W.I., Swapana, N., Singh, C.B., 2013.
Ethnobotany, phytochemistry and pharmacology of Ageratum conyzoides
Linn (Asteraceae). Journal of Medicinal Plants Research, 7(8), 371–385.
Stuelten, C.H., DaCosta Byfield, S., Arany, P.R., Karpova, T.S., Stetler-Stevenson,
W.G., Roberts, A.B., 2005. Breast cancer cells induce stromal fibroblasts to
express MMP-9 via secretion of TNF-α and TGF-β. Journal of Cell Science,
118(10), 2143–2153.
WHO, 2019, https://www.who.int/cancer/en/, diakses pada tanggal 20 Juni 2019
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
20
LAMPIRAN
Lampiran 1. Volume bahan pengujian in vitro
BC: Background Control; EC: Enzyme Control; SC: Solvent Control; IC:
Inhibitory Control; S:Sample
No. Bahan Volume (µl)
BC EC SC IC S
1 Dapar uji 100 45 44 43 44
2 Enzim
MMP9 - 5 5 5 5
3 Sampel - - - - 1
4 NNGH - - - 2 -
5 DMSO - - 1 - -
Inkubasi pada 37° C selama 30 menit
6 Dapar uji - 49 49 49 49
7 Substrat
MMP9 - 1 1 1 1
Total 100 100 100 100 100
Inkubasi pada 37° C selama 60 menit
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
21
Lampiran 2 . Desain 96-microwell plate
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A BC
B100
BC
B100
BC
B100
IC
B43
E5
KP2
S50
IC
B43
E5
KP2
S50
IC
B43
E5
KP2
S50
EC
B45
E5
S50
EC
B45
E5
S50
EC
B45
E5
S50
SC
B44
E5
P1
S50
SC
B44
E5
P1
S50
SC
B44
E5
P1
S50
B S
B44
E5
FB1
S50
S
B44
E5
FB1
S50
S
B44
E5
FB1
S50
B: Buffer; E: Enzim MMP9; KP: Kontrol positif (NNGH); S: Subtrat enzim; P:
Pelarut; FB: Fraksi bandotan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
22
Lampiran 3. Profil KLT fraksi n-heksana-etil asetat pada Panjang gelombang
365 nm (a) dan 254 nm (b)
(a) (b)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
23
Lampiran 4. Profil KLT fraksi n-heksana-etil asetat pada Panjang gelombang (a)
365 nm dan (b) 254 nm
(a) (b)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
24
Lampiran 5. Struktur senyawa prediksi dari spektroskopi massa fraksi 2 herba
bandotan
Nama Senyawa Struktur senyawa
3-(4-tertiobutylphenyl)-propanal
1H-Indol-2-ol,2,3-dihydro-5-
methoxy-1-methyl-
6-Demethoxyageratochromene
pentaethylmethyl-disiloxane
1H-Indene-4-carboxylic acid, 2,3-
dihydro-1,1-dimethyl-
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
25
2H-1-Benzopyran, 6,7-dimethoxy-
2,2-dimethyl-
Phenol, 2,6-bis(1,1-dimethylethyl)-
4-methyl-
Phenol, 2,6-bis(1,1-dimethylethyl)-
4-methyl-
Phenol, 2,6-bis(1,1-dimethylethyl)-
4-methyl-
butylated hydroxy toluene
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
26
1H-Inden-1-one, 5-(1,1-
dimethylethyl)-2,3-dihydro-3,3-
dimethyl-
1H-Inden-1-one, 7-(1,1-
dimethylethyl)-2,3-dihydro-3,3-
dimethyl-
2,3-Hexadienoic acid, 2-methyl-4-
phenyl-, methyl ester
Benzene, 2-(butenyl)-5-(1,1-
dimethylethyl)-1,3-dimethyl-
3-isobutylidene-6,7-dimethyl-3h-
isobenzofuran-1-one
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
27
methyl 1-methyl-2-oxocyclohexane-
1-carboxylate
Cyclohexane, 1,1'-(1-methyl-1,2-
ethanediyl)bis-
methyl ester of 4-methylene-
hexanoic acid
methyl 4-methylhexa-2-enoate
Cyclohexanecarboxylic acid, methyl
ester
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
28
Lampiran 6. Surat determinasi tanaman
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
29
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
30
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
31
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
32
Lampiran 7. Parameter kromatografi gas-spektrometri massa
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
33
BIOGRAFI PENULIS
Penulis skripsi bernama Wiwy, lahir di Batam, 07 Agustus
1998 sebagai anak ketiga dari tiga bersaudara dari pasangan
Tjo Koei dan Pho Tju. Penulis menempuh pendidikannya di
SD Kristen Kalam Kudus I Batam, SMP Kristen Kalam Kudus
I Batam dan SMA Maitreyawira Batam. Pada tahun 2016,
penulis melanjutkan pendidikan di program studi farmasi di
Universitas Sanata Dharma. Selama perkuliahan, penulis
mengikuti beberapa kegiatan kepanitiaan seperti Pharmacy Performance, Seminar
nasional 2017 dan Herbal Cosmetic Competition 2017. Penulis juga pernah
memenangkan juara 3 lomba menulis esai IPSF APRO dan juara 2 Lomba Karya
Tulis Ilmiah Nasional Pharmacopeia tahun 2018. Selain itu, pada bidang akademis,
penulis pernah menjadi asisten dosen Praktikum Biologi Sel dan Molekular,
Praktikum Kimia Analisis, Praktikum Kimia Dasar.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI