fotoinduccion m. anisopliae
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INSTITUTO TECNOLÓGICO DE SONORA
“EFECTOS DE LA LUZ EN EL HONGO ENTOMOPATÓENO
Metarhizium anisopliae”
TESIS
QUE PARA OBTENER EL TITULO DE INGENIERO BIOTECNOLOGO
PRESENTA
PAÚL VALDEZ LEYVA
CD. OBREGÓN, SONORA FEBRERO 2009
RESUMEN
El hongo entomopatógeno Metarhizium anisopliae se ha destacado por su
amplia utilización en el control de numerosos insectos, sin embargo a nivel
industrial no existen evidencias de la de la aplicación de luz para maximizar la
producción de conidios. Se utilizan diferentes filtros de luz los cuales abarcan
en amplio espectro de UV visible como lo son: luz azul filtro azul (LEE 183,
transmisión máxima de 450 nm). Para la luz verde filtro verde (LEE 124,
transmisión máxima de 500 nm). Para la luz roja filtro rojo (LEE 019,
transmisión máxima de 680 nm) y luz blanca provenientes de focos de 16 W.
A las 60 h de cultivo se observó una gran cantidad de conidióforos y conidios,
Mientras que a las 60 h de cultivo en obscuridad se observó la producción
escasa de conidióforos y conidios. Con respecto a la aplicación de luz
constante a los 10 días de cultivo, hay una producción de un orden de
magnitud mayor que la exposición del hongo a los filtros de luz.
La aplicación de pulsos de luz a las 36 h es mayor que los demás tratamientos
en el cual se obtiene un incremento de 2.70 x106 UFC/caja el cual no es
significativo, por lo que se concluye que la aplicación de luz constante durante
la incubación de M. anisopliae es la mejor opción para obtener mayor cantidad
de conidios.
INDICE GENERAL
RESUMEN I
INDICE GENERAL II
INDICE DE TABLAS III
INDICE DE FIGURAS IV
I. INTRODUCCIÓN.
1.1.- Antecedentes.
1.2.- Planteamiento del problema.
1.3.- Justificación.
1.4.- Objetivos.
1.4.1.- Objetivo general.
1.4.2- Objetivos Específicos.
1.5.- Hipótesis.
II. MARCO TEÓRICO.
2.1. Hongos entomopatógenos.
2.1.1 Generalidades.
2.1.2. Clasificación taxonómica.
2.1.2.1 Subdivisión Deuteromycotina.
2.1.2.2. Clase Hyphomycetes.
2.1.3. Mecanismo de acción.
2.1.3.1. Adhesión de la espora a la cutícula del hospedero.
2.1.3.2. Germinación de la espora.
2.1.3.3. Penetración del integumento.
2.1.3.4. Penetración a través de cuerpos abiertos.
2.1.3.5. Reproducción en el hemocele.
2.1.3.6. Dispersión de las esporas.
2.2. Producción de hongos entomopatógenos.
2.2.1. Medios de Cultivo.
2.2.2. Formulaciones de Hongos Entomopatógenos.
2.2.3. Reactivación de los Hongos Entomopatógenos.
2.3. Factores que influyen en el establecimiento y acción de hongos
entomopatógenos.
2.3.1. Humedad Relativa (HR).
2.3.2. Temperatura (T).
2.3.3. Radiación solar (RS).
2.3.4. Suelo.
2.3.5. Los agroquímicos y su efecto sobre los entomopatógenos.
2.4. Metarhizium anisopliae.
2.5. Estudios de luz en hongos.
2.5.1. Trichoderma viride.
2.5.1.1 Aspectos fisiológicos de fotoconidiación.
2.5.1.2 Fotorreceptores.
2.5.2. Neurospora crassa.
2.5.3. Phycomyces.
III. MATERIALES Y METODOS
3.1. Ubicación.
3.2. Microorganismo.
3.3. Conservación de la cepa.
3.4. Medio de Cultivo.
3.5. Condiciones de cultivo.
3.6. Determinación de crecimiento.
3.7. Microcultivos.
3.8. Microscopía óptica.
3.9. Fotoinducción de la conidiación.
3.10. Determinación del periodo de competencia.
3.11. Conteo directo de conidias.
3.12. Determinación de la viabilidad.
IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN.
4.1. Efecto de la luz en el desarrollo asexual de M. anisopliae.
4.2. Efecto de los diferentes tipos de luz en la conidiación de M.
anisopliae.
4.3. Periodo de competencia de respuesta a la luz del hongo
entomopatógeno Metarhizium anisopliae.
CONCLUCIONES.
RECOMENDACIONES.
BIBLIOGRAFIA.
INDICE DE TABLAS
1.- Bioinsecticidas basados en el hongo entomopatógeno Metarhizium anisopliae.
2.- Resultados de conteo directo y viabilidad de conidios.
3.- Viabilidad para las cajas en completa obscuridad y luz constante medida
como conidios por caja.
INDICE DE FIGURAS
1.- Microcultivos de M. anisopliae
2.- Cajas de cartón con diferentes filtros.
3.- Cambios morfológicos durante la conidiacion de M. anisopliae.
4.- Morfología colonial y producción de conidios en Metarhizium anisopliae
cultivado en diferentes condiciones de luz.
5.- Tubos de ensaye conteniendo esporas de M. anisopliae.
6.- Viabilidad para los tratamientos con luz color blanca, obscuridad, luz verde,
luz roja y luz azul.
7.- Viabilidad para esporas de M. anisopliae.
8.- Viabilidad para esporas expuestas a luz y a obscuridad.
I INTRODUCCIÓN
1.1. Antecedentes
El creciente interés en agentes biológicos para el control de insectos plaga
ocurre en parte por la conciencia del peligro del uso indiscriminado de
insecticidas químicos. Además, las investigaciones publicadas en las últimas
décadas donde relacionan a los insecticidas químicos con mutaciones, cáncer,
daños a la fauna y toxicidad a las plantas.
Una posible alternativa es el control biológico de plagas. Este se realiza usando
agentes macroscópicos, depredadores y parásitos o agentes microscópicos
patógenos, a este último se le conoce como control microbiano de plagas.
Dentro de los agentes entomopatógenos se incluyen bacterias, hongos, virus,
nemátodos y protozoos. Se caracterizan por su baja toxicidad sobre otros
organismos del ambiente, por su facilidad para producirlo a escala industrial; se
cultivan, formulan, empacan, almacenan y se comercializan como un
insecticida convencional.
Los hongos entomopatógenos son considerados como los patógenos más
promisorios contra insectos chupadores como el caso de los áfidos, escamas y
moscas blancas, ya que pueden infectar a los insectos directamente a través
de la penetración de la cutícula (Hajek y Leger 1994). Así como sus múltiples
mecanismos de acción que les confiere una alta capacidad para evitar que el
hospedero desarrolle resistencia.
Metarhizium anisopliae ataca naturalmente más de 300 especies de insectos
de diversos órdenes. Entre las plagas afectadas por este hongo se encuentra el
salivazo de la caña de azúcar (Aeneolamia varia) y chinches plagas de
diversos cultivos. Los insectos muertos por este hongo son cubiertos
completamente por micelio, el cual inicialmente es de color blanco pero se
torna verde cuando el hongo esporula (Castillo, 2006).
M. anisopliae, se ha utilizado exitosamente como agente de biocontrol. Se ha
desarrollado la tecnología de producción masiva de M. anisopliae y existen en
el mercado productos formulados con conidios de este hongo. Sin embargo, se
desconoce el efecto de la luz en el desarrollo de M. anisopliae. El objetivo de
este trabajo es estudiar el efecto de la luz durante el desarrollo y la
reproducción asexual de M. anisopliae.
1.2. Planteamiento del problema
En la actualidad existen estudios del efecto de diferentes factores o
condiciones de incubación para el hongo entomopatógeno M. anisopliae, tanto:
pH, temperatura, humedad relativa tipos de medio etc. pero no hay registros de
la aplicación de diferentes fuentes de luz, con esto se busca la manera de
aumentar la producción de conidios, mediante la estimulación del periodo de
competencia del hongo.
1.3. Justificación
Los conidios de Metarhizium anisopliae se utilizan en la formulación de
bioinsecticidas comerciales que se han aplicado exitosamente tanto en
invernadero como en campo, para combatir una gran variedad de plagas
agrícolas. Sin embargo, no existen reportes sobre el efecto de la luz en la
reproducción asexual de Metarhizium anisopliae, por lo que es necesario
realizar un esfuerzo de investigación básica para entender los mecanismos
fisiológicos que rigen este el proceso de reproducción asexual para mejorar la
producción de conidios en los sistemas de producción masiva. Este trabajo
forma parte de un proyecto de ingeniería y diseño para la construcción de un
bioreactor industrial de fermentación sólida.
1.4. Objetivos.
1.4.1. Objetivo general.
Estudiar el efecto de la luz en la reproducción asexual de Metarhizium
anisopliae
1.4.2. Objetivos Específicos.
1. Determinar el efecto de la luz en el crecimiento de Metarhizium anisopliae.
2. Caracterizar el efecto de la luz en la reproducción asexual de Metarhizium
anisopliae.
3. Observar la respuesta a los diferentes tipos de luz durante la reproducción
asexual de Metarhizium anisopliae.
4. Identificar el periodo de fotocompetencia de Metarhizium anisopliae.
1.5. Hipótesis
La luz afecta la conidiación del hongo entomopatógeno Metarhizium anisopliae.
II MARCO TEORICO
2.1. HONGOS ENTOMOPATÓGENOS.
2.1.1 Generalidades
Los primeros microorganismos que se encontraron causando enfermedad en
insectos, fueron los hongos por su crecimiento macroscópico sobre la
superficie de sus hospederos. Algunos hongos entomopatógenos, sin embargo,
no producen crecimiento superficial o producen muy poco. La mayoría son
patógenos obligados o facultativos y algunos son simbióticos. Su crecimiento y
desarrollo están limitados principalmente por las condiciones ambientales
externas en particular, alta humedad y temperatura adecuada para la
esporulación y germinación de esporas. Las enfermedades causadas por estos
hongos son denominadas “micosis” (Tanada y Kaya 1993).
2.1.2. Clasificación taxonómica.
Según la clasificación taxonómica hecha por Ainsworth (1973), la cual separa
los hongos en dos divisiones: Myxomycota por formar plasmodios y Eumycota
por no formarlos y ser frecuentemente miceliales. Los hongos
entomopatógenos se encuentran en la división Eumycota y en las
subdivisiones: Mastigomycotina, Zygomycotina, Ascomycotina,
Basidiomycotina y Deuteromycotina (Tanada y Kaya 1993).
Los hongos entomopatógenos infectan individuos en todos los órdenes de
insectos; la mayoría comúnmente son Hemíptera, Díptera, Coleóptera,
Lepidóptera, Hymenóptera y Ortóptera. (Tanada y Kaya 1993; Ferron et al.
1975). La especificidad del hospedero varía considerablemente, algunos
hongos infectan un amplio rango de hospederos y otros están restringidos a
unos pocos o a una sola especie de insectos.
Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae infectan cerca de 100 especies
diferentes de insectos en varios órdenes, pero aislamientos de estos dos
hongos tienen un alto grado de especificidad (Guerrero, 1999)
2.1.2.1. Subdivisión Deuteromycotina.
Los Deuteromycotina u hongos imperfectos se llaman así porque la mayoría de
los hongos carecen de fase sexual, o bien ésta no se conoce. Al tener
reproducción asexual, son formadores de conidias (Tanada y Kaya 1993).
En una clasificación jerárquica, estos hongos no son iguales a los
Ascomycotina y Basidiomycotina pero ambos son complementarios
taxonómicamente (Ainsworth 1973). Los Deuteromycotina entomopatógenos
son encontrados en dos clases, Hyphomycetes y Coleomycetes. Muchos son
patógenos altamente virulentos y han sido aplicados en el control de insectos
plaga (Samson et al. 1988).
La descripción hecha por Valiela (1979) sugiere que en esta clase las conidias
no se forman ni en acérvulos ni en picnidios, sino que se originan en
conidióforos libres o directamente en las hifas somáticas.
2.1.3. Mecanismo de acción.
El desarrollo de micosis puede estar dividido en tres fases: (1) adhesión y
germinación de la espora en la cutícula del insecto, (2) penetración en el
hemocele y (3) desarrollo del hongo. Lo cual generalmente resulta en la muerte
del insecto (Alean, 2003).
2.1.3.1. Adhesión de la espora a la cutícula del hospedero
El primer contacto que hace la espora con la superficie del hospedero es por la
cutícula. Las características físicas y químicas de las superficies de la cutícula
del insecto y la espora son las responsables de esta unión. En algunos hongos
la adhesión es un fenómeno no específico. Algunas glicoproteínas pueden
servir como un receptor específico para las esporas (Tanada y Kaya 1993).
2.1.3.2. Germinación de la espora
Se entiende por germinación al proceso mediante el cual una espora emite uno
o varios pequeños tubos germinales, los cuales por crecimiento y alargamiento
dan origen a las hifas (Volcy y Pardo 1994). La germinación de las esporas en
gran parte depende de la humedad ambiental y temperatura, y en menor grado
de las condiciones nutricionales y de luz (Tanada y Kaya 1993).
El nivel de humedad es determinante en el crecimiento de los hongos y
pequeñas diferencias en los niveles de humedad relativa después de la
aplicación de conidias, pueden determinar de un modo u otro el éxito del hongo
en el control de insectos plaga (Guillespie, 1988).
El resultado de la germinación y la penetración no depende necesariamente del
porcentaje total de germinación sino del tiempo de duración de la germinación,
modo de germinación, agresividad del hongo, el tipo de espora y la
susceptibilidad del hospedero (Samson et al. 1988).
2.1.3.3. Penetración del integumento
La penetración de la cutícula del insecto por conidias germinadas, ocurre como
resultado de una combinación entre la degradación enzimática de la cutícula y
la presión mecánica por el tubo germinal (Gillespie 1988). El modo de
penetración principalmente depende de las propiedades de la cutícula, grosor,
esclerotización y la presencia de sustancias antifúngicas y nutricionales
(Charnley 1984). La fuerza mecánica es notable en el extremo de una hifa
invasiva donde la capa cuticular es deformada por presión (Tanada y Kaya
1993). Se produce un tubo germinativo y un apresorio, con éste se fija en la
cutícula y con el tubo germinativo o haustorio (hifa de penetración) se da la
penetración al interior del cuerpo del insecto. En la penetración participa un
mecanismo físico y uno químico, el primero consiste en la presión ejercida por
la estructura de penetración, la cual rompe las áreas esclerosadas y
membranosas de la cutícula. El mecanismo químico consiste en la acción
enzimática, principalmente proteasas, lipasas y quitinasas, las cuáles causan
degradación del tejido en la zona de penetración, lo que facilita la penetración
física (Monzón 2001).
Las enzimas identificadas en el tubo germinativo son proteasas,
aminopeptidasas, lipasas, esterasas, y N-acetil-glucosamidasa (quitinasas).
Estudios in vitro indican que en la digestión del integumento sigue una
secuencia de lipasa-proteasa-quitinasa (Tanada y Kaya 1993).
Gillespie, (1988) reportó que los hongos B. bassiana, M. anisopliae,
Paecilomyces spp. y V. lecanii, producen grandes cantidades de proteasas y
quitinasas en medios de cultivo líquido. La producción de proteasa, lipasa y
quitinasa sobre la cutícula del insecto, se ha demostrado con M. anisopliae
mediante coloración de enzimas específicas, recuperadas de moscas
previamente inoculadas con conidias del hongo. En varios aislamientos de
B. bassiana y M. anisopliae la enzima principal es una endoproteasa que
disuelve la proteína matriz que cubre la quitina cuticular. Por lo tanto, la
producción de quitinasa ocurre después del proceso de infección y una vez que
el hongo atraviesa la cutícula debe vencer el sistema inmunológico del
hospedero antes de entrar a la hemolinfa y desarrollarse dentro del insecto.
2.1.3.4. Penetración a través de cuerpos abiertos.
Los hongos pueden infectar insectos a través de la cavidad bucal, espiráculos y
otras aberturas externas de un insecto. Puesto que la humedad no es un
problema en el tracto alimenticio, la espora puede germinar rápido en este
ambiente; por otra parte, los fluidos digestivos pueden destruir la espora o la
hifa germinativa. En algunos casos, la digestión de estructuras fúngicas puede
causar la muerte por toxicidad más que por micosis (Charnley, 1984).
Los hongos pueden infectar insectos a través de los espiráculos y otros
cuerpos abiertos, Metarhizium anisopliae ocasionalmente infecta larvas a
través de los espiráculos y poros de órganos de los sentidos.
Beauveria bassiana infecta varias especies de mosquitos a través del sifón
posterior; en Heliothis zea a través del espiráculo y en el gorgojo de la alfalfa
Hypera postica a través de la tráquea y no por la delgada cutícula del
integumento. La región anal de las larvas del gusano de seda es más
frecuentemente infectada por el hongo Aspergillus flavus oryzae (Tanada y
Kaya 1993).
2.1.3.5. Reproducción en el hemocele.
Después de llegar al hemocele, la mayoría de los hongos convierten el
crecimiento micelial en una fase de levadura o sea crecimiento por gemación.
Se producen toxinas y enzimas, aunque algunos hongos aparentemente no
poseen toxinas, matan el insecto al consumir todos los nutrientes o por física
destrucción (Bustillo, 2001).
Los hongos pueden evitar la defensa inmune de un insecto por (1) desarrollo
de protoplastos que no son reconocidos por la población de hemocitos del
insecto, (2) formando cuerpos hifales multiplicándose y dispersándose
rápidamente y (3) produciendo micotoxinas, producto de la pérdida de la
integridad estructural de las membranas seguido de la deshidratación de las
células por pérdida de fluido (Alean, 2003).
Posterior al crecimiento del hongo en el hemocele, la micosis induce a
síntomas fisiológicos anormales en el insecto tales como convulsiones,
carencia de coordinación y comportamientos alterados. Ocurre una
competencia entre el hongo y la flora intestinal. En la mayoría de los casos los
hongos producen sustancias antibacteriales y cambio de color del cadáver.
Después de muerto el insecto, si la disponibilidad de agua es alta los hongos
emergen al exterior a través de la cutícula y esporulan sobre el cadáver
produciendo inóculo para infectar a otros insectos. Si las condiciones no son
favorables, queda dentro del cadáver del insecto, donde puede sobrevivir por
algunos meses y eventualmente producirá esporas cuando lleguen las
condiciones favorables. La esporulación ocurre generalmente en cadáveres
pero puede también ocurrir en insectos vivos (Alean, 2003).
2.1.3.6. Dispersión de las esporas
La dispersión de la espora puede ser un proceso activo o pasivo y depende de
las características de la espora y el esporangio. Cada conidia puede adherirse
o pasar de un invertebrado a otro por dispersión (Alean, 2003).
2.2. Producción de hongos entomopatógenos.
La producción de hongos entomopatógenos se basa en la multiplicación
masiva del hongo y sus estructuras reproductivas en un sustrato (Monzón
2001).
2.2.1. Medios de Cultivo.
Todos los medios de cultivo utilizados en micología deben contener los
nutrientes suficientes para asegurar el desarrollo de los hongos (carbono,
nitrógeno, vitaminas, oligoelementos, etc.). El pH ha de ser ligeramente ácido
para facilitar el crecimiento de los hongos e inhibir al mismo tiempo el
desarrollo de otros microorganismos. Además se deben añadir antibióticos
antibacterianos para inhibir el crecimiento de las bacterias saprófitas que
suelen contaminar las muestras. Los más usados son el Cloranfenicol y la
Gentamicina.
Existen tres tipos de medios de cultivo para los hongos de acuerdo a su
procedencia y origen de sus componentes: 1). Medios naturales, se
caracterizan por estar preparados por compuestos de origen natural y su
composición no es exacta, como pedazos o infusiones de frutas, vegetales,
granos de cereales o tejidos animales. Estos medios varían mucho en su
composición, no son fácilmente reproducibles, ni de amplio uso. 2). Medios
semisintéticos, están conformados por compuestos de origen natural y químico,
estos medios de cultivo están preparados con peptonas, extractos de plantas,
agar y otros compuestos de procedencia desconocida o variable. 3). Medios
sintéticos, presentan composición química definida cuantitativa y conocida. La
mayoría de las fórmulas de los medios de cultivo utilizados para hongos
contienen peptona, algún carbohidrato y agar (Pelczar y cols. 1997)
2.2.2. Formulaciones de Hongos Entomopatógenos.
La formulación del hongo (ver tabla 1) es el proceso mediante el cual el
ingrediente activo, es decir las conidias del hongo, se mezclan con materiales
inertes, tales como vehículos, solventes, emulsificantes y otros aditivos. Estos
materiales inertes ayudan a que el hongo este más protegido al momento de la
aplicación, así mismo, la facilita evitando que se sedimente fácilmente y/o que
forme grumos que tapen la boquillas. Todo esto se hace con el fin de lograr una
buena homogeneidad y distribución de las partículas del hongo, para poder ser
manipuladas y aplicadas adecuadamente (Monzón 2001).
Tabla 1. Bioinsecticidas basados en el hongo entomopatógeno Metarhizium anisopliae.
PRODUCTO EMPRESA PAIS PLAGABio-Blast Biological Termiticide
Ecoscience USA Termites
Bio-Path Cockroach Control
Ecoscience USA Cucarachas
BioCane Granules
Bio-Care Technology Pty
Australia Dermolepida albohirtum
BioGreen Granules
Bio-Care Technology Pty
Australia Aphodius tasmaniae
Biotrol FMA Nutrilite Products USA Mahanarva posticataBio 1020 Bayer Alemania Otiorhynchus sulcatusMetarhizium Schweizer
Eric Schweizer Seed
Suiza Gusanos blancos
Metasav-11 Biasav CubaMetasav-11 Biasav Cuba Lissorhoptrus brevirostris /picudo acuático en arroz
Cosmopolites sordidus /picudo negro en plátanosMocis spp. /falso medidor en pastosMonecphora bicincta fraterna /salivita en pastos
Meta-sin Agrobionsa México Diatraea saccharalis, Antonomus grandisMosca pinta, picudo del chile
Metarril M – 102 Italforte BioProductos
Brasil Mahanarva fimbriolata, Deois, Zulia /pasturas.M. fimbriolata y posticata /caña de azúcar
Metaquino Codecap, IAA Brasil Mahanarva posticata /caña de azúcarCombio Equi.Con.Biol. Brasil Mahanarva posticata /caña de azúcarBioCerto BioCerto Ind. e
Com. de Prod. Agrop.
Brasil Mahanarva fimbriolata, Deois, Zulia /pasturas.M. fimbriolata y posticata /caña de azúcar
Metabio Plan Terra Brasil Mahanarva fimbriolata, Deois, Zulia /pasturasMET-92 (varias cepas)
Agrícola El Sol Guatemala Pulgones, moscas blancas, cucarachas, Anthonomus spp., H. hampei, L. decemlineta,, Diabrotica, Phyllophaga, Anomala, Agriotes, Conedorus, Schistocerca, Cosmopolites sordidus...
Zero QK Agrícola El Sol Guatemala CucarachasAgo Biocontrol Metarhizium 50
Ago Biocontrol Colombia Coleópteros, lepidópteros /invernáculo, ornamentales
Destruxin WP Laverlam S.A. Colombia Hypothenemus hampei /café, Phyllophaga sp. y Ancognatha sp./papa y flores, Spodoptera frugiperda y Tagosodes aryzicola /arroz,Aeneolamia sp. y Perkinsiella saccharicida /caña de azúcar, Collaria columbiensis /pastos
Cobijan Probioagro Venezuela M. fimbriolata y posticata /caña de azúcar
Hay dos tipos de formulaciones: 1). Seca o polvo humectable en la cual se
utiliza un vehículo, el cual puede ser de origen mineral o vegetal, que ayuda a
absorber la humedad de las conidias y mantiene la viabilidad por un tiempo
considerable. 2). Líquida o emulsificable que utiliza un líquido solvente y un
emulsificante. El líquido utilizado tiene la función de mantener suspendidas las
conidias en el medio para lograr una mezcla homogénea que garantice una
buena aplicación. Además, este líquido debe evitar la absorción de agua por
las conidias y mantener su viabilidad (Monzón 2001).
La comercialización de insecticidas basados en hongos entomopatógenos
requiere un control de las propiedades biológicas, físicas y químicas. Para esto
se realizan pruebas microbiológicas como concentración de esporas,
germinación de esporas y prueba de pureza. Además de las pruebas
físico-químicas de determinación de pH, porcentaje de humedad,
humectabilidad, suspensibilidad y taponamiento de boquillas, que aseguren al
usuario un producto con la máxima eficacia de control en el campo (Vélez y
cols. 1997).
2.2.3. Reactivación de los Hongos Entomopatógenos.
Procedimiento para mantener la virulencia constante, mediante inoculación del
hongo a un insecto hospedero vivo y su posterior reaislamiento una vez muerto
el mismo. La frecuencia de estos pases por insectos está dada por las veces
que la cepa puede ser multiplicada sin perder su virulencia recomendándose
generalmente hacerla cada 3 ó 4 pases por medio nutriente natural o sintético
(Ocpi, 1986).
2.3. Factores que influyen en el establecimiento y acción de hongos
Entomopatógenos.
Los factores ambientales cumplen una función esencial en la iniciación y
desarrollo o en la prevención y supresión de las epizootias naturales afectando
las condiciones fisiológicas del hospedante, su densidad y distribución espacial
y temporal. Forman un complejo de factores que interactúan entre sí y entre
otros componentes del ambiente, siendo los más estudiados la temperatura y
humedad relativa. El mayor problema es que pocos estudios se refieren al
microclima del cultivo que es el que directamente influye sobre los patógenos.
A diferencia de las condiciones constantes en el laboratorio, en el
agroecosistema se presentan situaciones normalmente fluctuantes del
conjunto de factores climáticos. Esto explica la complejidad del tema y las
múltiples interacciones posibles como para poder cuantificar, con más
precisión, el efecto del microclima natural sobre los entomopatógenos.
Los principales factores ambientales que afectan la eficiencia de los hongos
entomopatógenos como agentes de control biológico son: humedad relativa,
temperatura y brillo solar (Aelean, 2003).
2.3.1.- Humedad Relativa (HR).
La humedad relativa es un factor de gran importancia, tanto para el hospedante
como para el patógeno. Es indispensable en las diferentes fases del ciclo de
las relaciones entre ambos organismos. Tiene efecto sobre la germinación,
penetración y para la reproducción de los hongos entomopatógenos. La falta
de humedad relativa adecuada puede perjudicar una epizootia (Lecuona,
1996). Se requiere de humedad relativa alta para la germinación del hongo
entomopatógeno Metarhizium anisopliae. El estudio de Walstad y Cols.. 1970,
indica que la mayor germinación ocurre al 100% de humedad relativa y
disminuye a 0 al 85% de HR. Niveles altos de HR son necesarios para la
esporulación. A un nivel de HR del 100% la esporulación ocurre en cuatro días,
pero a una HR de 92.5% son necesarios cinco o más días, mientras que la
esporulación es inhibida con humedad relativa menor del 90% (Sosa-Gómez y
Alves 1983).
2.3.2. Temperatura (T).
La temperatura puede afectar la estabilidad de los patógenos en el
almacenamiento, durante las aplicaciones en el campo y en su ocurrencia
natural en el agroecosistema. Los entomopatógenos no poseen condiciones
biológicas para defenderse de las grandes variaciones de temperatura y puede
ser limitante para varios microorganismos. El rango favorable de temperatura
para los diferentes grupos de entomopatógenos varía entre 20 y 30 °C, sin
embargo, existe una temperatura ideal para cada patógeno y para cada fase
del ciclo de la relación con su hospedante. La temperatura es uno de los
factores abióticos más importantes para los hongos entomopatógenos, debido
a que puede afectar la germinación de las esporas, el desarrollo y penetración
del tubo germinativo y la colonización y reproducción. Los requerimientos
térmicos de los hongos entomopatógenos son variables en función de la
especie, cepa y fase de desarrollo. El desarrollo de las enfermedades fúngicas
en los insectos puede ser perjudicado por temperaturas superiores a 30 °C.
Las esporas de hongos entomopatógenos germinan a temperaturas entre 15 y
35 °C, siendo el rango óptimo entre 25 y 30°C, y se requieren cuatro días para
la esporulación de Metarhizium anisopliae. La esporulación es inhibida a
temperaturas inferiores de 10 °C y superiores a 35 °C (Castillo, 2006).
2.3.3. Radiación solar (RS).
Para evaluar el efecto de la radiación solar sobre los patógenos y sobre la
ocurrencia de las enfermedades es necesario considerar los siguientes
aspectos: espectro de luz visible con sus diferentes longitudes de onda (luz
verde, amarilla, azul, etc.), fotoperiodo y faja de luz ultravioleta germicida. La
exposición a la luz ultravioleta puede ser letal para los conidios de los
patógenos se observó que el crecimiento y esporulación de los hongos es
retrasado por la radiación solar y que la nubosidad tiene un papel importante en
el desarrollo de las epizootias causadas por hongos entomopatógenos
(Castillo, 2006).
2.3.4 Suelo.
El suelo puede abrigar tanto a los insectos como a los entomopatógenos y es
un ambiente complejo donde los microorganismos sufren la acción de los
factores bióticos y abióticos, que dan como resultado una mayor o menor
permanencia de acuerdo a las condiciones de campo. Los hongos
entomopatógenos pueden vivir en el suelo por periodos variables. M. anisopliae
después de parasitar insectos puede permanecer colonizando el cadáver por
un periodo relativamente largo a la espera de un nuevo hospedante. La mayor
parte de sus conidios difícilmente conseguirán sobrevivir por más de tres
meses en los diferentes tipos de suelo (Castillo, 2006).
2.3.5. Los agroquímicos y su efecto sobre los entomopatógenos.
La susceptibilidad de los entomopatógenos a los agroquímicos puede variar de
acuerdo con el grupo y cepa del patógeno, con la naturaleza química del
producto y con la dosis empleada. Existen sustancias que son letales para los
microorganismos, otras poseen efecto fungistático o bacteriostático y
finalmente, productos que en dosis normales y/o subletales pueden favorecer
su crecimiento, reproducción y virulencia. Esto demuestra la importancia de
conocer la acción de los agroquímicos sobre las diferentes fases del desarrollo
de los entomopatógenos (Castillo, 2006).
2.4. Metarhizium anisopliae.
El conidióforo es ramificado, el conidio inicial es producido por el conidióforo en
una abstricción simple en la parte distal. En cada conidióforo se forma una
cadena de conidios basipetal, las cuales crecen densas y adheridas unas con
otras formando masas prismáticas en columnas (Tanada y Kaya, 1993). Los
conidios de este género son blancos cuando son jóvenes, pero conforme
maduran el color se torna verde oscuro. Se mencionan solamente a dos
especies, M. anisopliae (Metschnikoff) Sorokin y M. flavoviride Gams &
Rozsypal. (Sosa-Gómez y Aalves, 1983)
Las características de M. flavoviride son que sus conidios son ovoides con las
terminaciones redondeadas o una de ellas ligeramente truncada, colonias de
color gris, amarillo verde de 7-11μm de longitud; Para el caso de M. anisopliae
sus conidios son de forma cilíndrica u ovales frecuentemente angosto en la
parte media, usualmente truncado en ambos lados, colonias verdes,
M. anisopliae tiene dos variedades: M. anisopliae var. anisopliae con conidios
de 3.5 - 9.0 mm de largo usualmente 5.0 -8.0 mm y M. anisopliae var. mayor
cuyos conidios miden de 9.0 - 18.0 mm de largo usualmente entre 10 - 14 mm
(Humber 1997).
2.5. ESTUDIOS DE LUZ EN HONGOS.
La luz es la fuente de energía fundamental para la vida en la tierra, es una
señal ambiental importante para los organismos de todos los reinos de la vida.
En el reino fungi, la luz puede regular el crecimiento, la dirección del
crecimiento, la reproducción sexual y asexual y la formación de pigmentos, que
son aspectos importantes para la supervivencia y la distribución de la especie.
Estos procesos tienen implicaciones negativas a muchos aspectos de la vida
humana, pues la proliferación incontrolada de hongos puede conducir a
enfermedades devastadora en plantas, a la tierra y a los humanos.
Por otra parte, los hongos son esenciales para la degradación de la materia
orgánica, en interacciones micorrizicas con las plantas y como fuente de
sustrato para los metabolitos farmacéuticos de los seres humanos. Entender el
papel de señales ambientales en el desarrollo de los hongos es vital para
aumentar las ventajas y disminuir los costos. A pesar de la importancia de la
luz en el desarrollo de los hongos, todavía hay mucho que estudiar sobre el
efecto, el mecanismo de percepción y respuesta a la misma (Idnurm, 2005).
2.5.1. Trichoderma viride.
La luz influye en varios procesos del desarrollo de los hongos de diferentes
maneras, esto puede afectar el metabolismo de crecimiento, conidiacion
formación de pigmentos, tropismo etc. (Betina, 1995)
2.5.1.1 Aspectos fisiológicos de fotoconidiación.
Se han estudiado tres factores en la fotoconidiación en hongos: 1) Las
longitudes de honda en donde no todos los hongos responden a los mismos
rangos de espectro de luz; T. viride responde a la luz UV y a la azul, mientras
que la conidiación de Paecilomyces fumosoroseus responde únicamente al
espectro de luz azul (Sánchez Murillo y Cols. 2004). Se a reportado que la luz
azul induce la conidiación de Ascochya pisi (Leach y Trione 1965) mientras que
en A. nidulans la conidiación es inducida por luz roja (Mooney y Yager 1990);
2). La intensidad de la luz por ejemplo estudios en P. fumosoroseus muestran
una fluencia de 540 µmoles m-2 en la cual se observo un incremento en la
conidiación produciéndose 2x108 conidios por colonia
(Sanchez Murillo y Cols, 2004); y 3). Pulsos de luz, en donde se le aplican
pulsos de luz por determinados periodos de tiempo para la determinar en que
etapa del desarrollo del hongo y la dosis de luz que requiere para su desarrollo
óptimo.
En Trichoderma, los primeros cambios morfológicos del crecimiento de
conidióforos pueden ser observados microscópicamente 4 h después de la
fotoinducción. La espora gradualmente cambia su color de blanco a amarillo y
café, después de 24 h se pone verde oscuro.
2.5.1.2. Fotorreceptores.
La luz produce cambios fotobiológicos o fotoquímicos al ser absorbida por una
o varias moléculas. T. viride responde a la luz UV y a la azul por lo que se
sugiere que deben existir receptores que absorben luz de estas longitudes de
onda.
La identidad química de los fotorreceptores citocromos involucrados en
fotorespuestas en hongos es deducida por acción de respuesta a espectros.
Los receptores podrían ser pigmentos amarillos, carotenoides y flavinas o
probablemente la unión de varias proteínas. Sin embargo, en estudios en
Neurospora crassa con resultados concluyentes el fotorreceptor sugerido es el
fotorreceptor de luz azul WC-1 para el ciclo circadiano y otras respuestas a luz.
(Qiyang y Cols. 2002)
2.5.2. Neurospora crassa.
Neurospora crassa, es un hongo pleomórfico que produce tres tipos de esporas
vegetativas: blastoconidios multinucleasa, artroconidia (usualmente llamada
macroconidios) y microconidios uninucledos.
N. crassa se ha utilizado como organismo modelo por que es fácil de cultivar y
tiene un ciclo vital haploide que hace el análisis genético simple puesto que los
rasgos recesivos se manifiestan en el descendiente.
Este hongo eucariótico responde a la luz azul, estudios bioquímicos y
fotobiológicos lo afirman. Sin embargo, los genes fotorreceptores que codifican
la luz roja han sido descubiertos recientemente en su genoma (Kritsky, 2005).
pero la detección de estos genes no afecta la respuesta de cualquier
fotoreacción conocida, dejando su función incierta. (HeQ, y cols 2002).
Dos proteínas son requeridas para la percepción de la luz azul en Neurospora
crassa, White collar (WC)-1 y WC-2. WC-1 es el fotorreceptor (He y Cols.
2002), con un sensor dominante llamado LOV (Luz, Oxigeno, y Voltaje),
homólogos a eso las plantas fototrópicas. WC-1 es asociado con WC-2 en vivo,
formando un heterodiometro nuclear, el complejo White Collar (WCC);
(Schwerdtfger y Linden 2000). El complejo WCC está asociado con varios
puntos del ciclo circadiano, como la frecuencia de oscilación (FRQ) (Froehlich,
2002) y la proteína quinasa C. En la irradiación de luz azul, la conformación
WCC pasa a través de cambios para activar los genes dependientes de luz.
Inicialmente WC-1 incrementa su fosforilación y después de 1 h la proteína
hiperfosforilizada comienza apagarse. Como parte del feedback loop, el gen
wc-1 solo es sujeto a trascripción por el WCC (Froehlich, 2002)
2.5.3. Phycomyces.
Phycomyces blankesleeanus es un hongo zigomiceto filamentoso que produce
células individuales alargadas de hasta 10 cm de altura las cuales cada
extremidad tiene una esfera que contiene las esporas de dispersión. Este
organismo se ha usado como modelo para detectar señales ambientales como:
la diversidad de la luz, químicos, tacto, viento, gravedad y objetos cercanos. En
particular, el crecimiento de esporangios es regulado por la luz y esto muestra
fototropismo por inclinación hacia la fuente luminosa (las longitudes de onda de
la luz UV y azul) (Idnurm y cols, 2006).
Los mutantes madA de phycomyces exhiben sensibilidad reducida a la luz, ya
se identificaron dos homólogos (duplicados) en la familia White collar 1 de
fotorreceptores azul en Phycomyces. Las mutantes madA contienen puntos de
mutación en uno de estos genes entonces estas mutaciones se relacionan con
el fototropismo defectuoso antes de las cruzas genéticas. Las respuestas
fototrópicas en hongos son a través de madA y en las plantas a través de
diferentes proteínas fototrópicas las cuales comparten enlaces entre flavinas
para la detección de fotones de luz (Idnurm y cols, 2006).
III MATERIALES Y METODOS
3.1. Ubicación.
El estudio se realizó en el Laboratorio de Investigación y Desarrollo de la
empresa SinQuímica, S.A. de C.V., ubicada en los Mochis Sinaloa.
3.2. Microorganismo.
Se utilizó la cepa QM01 de Metarhizium anisopliae, aislada en el Laboratorio de
Investigación y Desarrollo de SinQuímica, S.A. de C.V.
3.3. Conservación de la sepa.
La cepa se conservó en refrigeración como una suspensión a una
concentración de 5 x106 conidios / mL, en Tween al 0.05%.
3.4. Medio de Cultivo.
Se utilizó el medio SDYA (65 g/L de agar dextrosa sabouraud suplementado
con 10 g/L de extracto de levadura), de Bioxon.
3.5. Condiciones de cultivo.
En cada experimento, con el fin de obtener colonias aisladas, se sembró por
extensión a M. anisopliae en cajas de Petri de 95 mm de diámetro conteniendo
de 15 a 20 mL de medio SDYA, se incubaron en una incubadora Binder a
26±1 ºC por 48 h en completa obscuridad.
Para los diferentes tratamientos se incubó el hongo en un cuarto de cultivo a
una temperatura de 26±2 ºC y a 65 ± 10% de humedad relativa, provisto con
lámparas de luz blanca marca Philips de 40 W.
Para la aplicación de pulsos de luz se diseñó una caja de madera provista con
2 lámparas luz blanca marca Gs de 16 W.
3.6. Determinación de crecimiento radial.
El crecimiento de Metarhizium anisopliae se midió como velocidad de
crecimiento radial, se inoculó una colonia aislada incubada previamente en el
centro de las cajas de Petri conteniendo de 15 a 20 mL de medio fresco SDYA.
Se realizaron mediciones ortogonales del diámetro de la colonia a los 7 días de
cultivo. Con las medias de estas distancias se determinó la velocidad de
crecimiento radial en mmh-1. Este experimento se hizo en 4 repeticiones.
3.7. Microcultivos.
Para determinar el efecto de la luz en el desarrollo morfogenético de
Metarhizium anisopliae se utilizó la técnica de microcultivos. Se colocó un papel
filtro impregnado con 10 mL de glicerol al 10% en la superficie para mantener la
humedad relativa seguidos de dos porta objetos en cada caja de Petri de cristal
(ver figura 1). Se colocó una película de 1 cm2 de medio SDYA y en cada lado
se inoculó 10 µL de una suspensión de 1 x 106 de esporas por mL, las cajas se
cultivaron en un cuarto de cultivo a 26±2°C, algunas cajas fueron cubiertas con
papel aluminio para cultivar en completa oscuridad. El experimento se realizó
por duplicado.
Figura 1. Microcultivos con M. anisopliae.
3.8. Microscopía óptica.
Se estudió la reproducción asexual de de Metarhizium anisopliae mediante la
observación de los microcultivos en las diferentes etapas de desarrollo, usando
una tinción azul algodón de lactófenol y un microscopio óptico de contraste de
fases (Nikon, modelo e400) a 40 x.
3.9. Fotoinducción de la conidiación.
Se diseñaron cajas de cartón de 30 cm de largo x 10 cm de ancho x 7 cm de
profundidad (Ver Figgura 2). En la parte superior se cortó una sección de
cartón de 7 cm de ancho x 27 cm de largo para colocar diferentes filtros:
transparente, azul, verde o rojo. Para simular completa obscuridad, una caja se
envolvió completamente con papel aluminio. En el interior se colocaron las
cajas de Petri conteniendo de 15 a 20 mL de SDYA fresco e inoculadas en el
centro con una colonia aislada previamente 48 h cultivadas en completa
obscuridad. La transferencia de las colonias se realizó en un gabinete de
bioseguridad provisto de un filtro rojo de seguridad.
Figura 2. Cajas de cartón con diferentes filtros.
Para la luz azul se utilizó un filtro azul (LEE 183, transmisión máxima de 450
nm). Para obtener la luz verde se utilizó el filtro verde (LEE 124, transmisión
máxima de 500 nm). Para la luz roja se obtuvo utilizando un filtro rojo (LEE 019,
transmisión máxima de 680 nm). Se incubó en el cuarto de cultivo con luz
constante a una temperatura de 26±2 °C y todos los tratamientos se hicieron
por triplicado.
3.10. Determinación del periodo de competencia.
Colonias aisladas de M. anisopliae cultivadas durante 48 h a 26±1 °C en
completa obscuridad, se transfirieron a cajas de Petri conteniendo de 15 a 20
mL de SDYA fresc. La transferencia de colonias se realizó en un gabinete de
bioseguridad provisto de un filtro rojo de seguridad.
Las cajas de Petri se cubrieron en paquetes de tres con hojas de papel
aluminio para simular la obscuridad, como control positivo se cultivaron algunas
cajas con luz constante. Todas se incubaron en el cuarto de cultivo a 26±2 °C
durante siete días. Se aplicaron pulsos cada 12 h para identificar el periodo de
competencia de M. anisopliae.
Para este experimento se utilizó una lámpara con dimensiones de 60 cm de
largo x 40 cm de altura y 40 cm de profundidad especialmente diseñada para
los pulsos de luz provista de 2 tubos de luz blanca marca Gs de 16 W a una
distancia de 35 cm de los cultivos a irradiar.
3.11. Conteo directo de conidios.
Al tiempo indicado, los conidios fueron cosechadas con 10 mL de una solución
de tween al 0.05%, se hicieron diluciones decimales de acuerdo a la Norma
oficial mexicana NOM-110-SSA1-1994, bienes y servicios. Preparación y
dilución de muestras de alimentos para su análisis microbiológico. De cada
condición de cultivo se contaron los conidios en una cámara de Neubauer con
un microscopio óptico de contraste de fases (Nikon, modelo e400) a 40 x.
3.12. Determinación de la viabilidad.
Para la determinación de la viabilidad se realizó de acuerdo a lo establecido en
la NOM-111-SSA1-1994, bienes y servicios. Método para la cuenta de mohos y
levaduras en alimentos.
IV RESULTADOS Y DISCUSION
4.1. Efecto de la luz en el desarrollo asexual de Metarhizium anisopliae.
M. anisopliae es un hongo entomopatógeno de interés para el control de
diversas plagas, se requiere conocer las condiciones de reproducción masiva,
un punto de interés es el efecto de la luz en la producción de conidios. Se ha
visto que en otros hongos la esporulación puede ser promovida por la
aplicación de luz, se diseñaron experimentos para comprobar si la luz afecta el
crecimiento y conidiación de Metarhizium anisopliae.
El hongo se incubó bajo condiciones de luz continua en un cuarto de cultivo
26±2 °C con dos tubos de luz blanca de 25 W a una distancia de 40 cm sobre
la superficie del agar. Los testigos se mantuvieron en completa obscuridad. Se
observó las etapas de desarrollo asexual en microcultivo a las 24, 48 y 60h de
cultivo.
Los microcultivos expuestos a la luz continua, mostraron una coloración
amarillenta, mientras los mantenidos en completa obscuridad el micelio se
observó de color blanco (sin pigmentación).
Se observó en el microscopio las etapas de desarrollo del conidióforo en
M. anisopliae (ver figura 3). En presencia de luz se observó la formación de la
fiálide (célula fértil) alas 24 h de cultivo (Fig. 3a); a las 48 h de cultivo (Fig. 3b),
se observó la formación del conidióforo maduro y a las 60 h de cultivo se
observó una gran cantidad de conidióforos y conidios (Fig. 3c). Mientras que a
las 60 h de cultivo en obscuridad se observó la producción escasa de
conidióforos y conidios (Fig. 3f).
Con este ensayo se demuestra que la luz tiene un efecto significativo en el
desarrollo asexual de M. anisopliae. Estos resultados motivaron a continuar la
investigación.
Figura 3. Cambios morfológicos durante la conidiacion de M. anisopliae.
a, b y c corresponden a 24, 48 y 60 h respectivamente, con luz constante,
mientras que d, e y f, corresponden a 24, 48 y 60 h respectivamente en
completa obscuridad.
Se ha estudiado ampliamente los factores que afectan la fotoconidiación de
Trichoderma viride, siendo éste, usado como modelo fotomorfogénico por su
habilidad de producir conidios mediante la exposición a la luz. En condiciones
de completa obscuridad y sin limitaciones de nutrientes crece indefinidamente
como micelio. Si la limitación de nutrientes se hace presente junto con la
aplicación de luz, se provoca el desarrollo asexual de estructuras
especializadas (conidios). La aplicación de un pulso breve de luz azul
(400-480nm) a una colonia radial induce una esporulación sincronizada la cual
produce un anillo de conidioforos de color verde en el momento el cual la
colonia fue expuesta al pulso de luz (Casas Flores y cols, 2004).
Se ha reportado que Paeclomyces fumosoroseus la luz es determinante para la
conidiación de este hongo, un pulso de luz azul fue suficiente para inducir la
respuesta fotomorfogénica, medida como producción de conidios
(Sánchez-Murillo y cols, 2004).
En Phycomyces blakesleeanus el desarrollo de esporangiosporas es
controlado por la luz azul. La producción de microsporangiosporas es reprimida
por la luz e incrementa el desarrollo de macrosporas, para Metarhizium su
reproducción no presento la formación de estas estructuras especializadas.
(Maier, 2001).
4.2. Efecto de los diferentes tipos de luz en la conidiación de Metarhizium
anisopliae.
Para saber que tipo de luz tiene mayor efecto, se cultivó el hongo bajo
condiciones de luz blanca, azul, verde y roja, con un testigo en completa
obscuridad. El efecto de los diferentes tipos de luz sobre los cultivos se realizó
por el fenotipo visible de las colonias y la producción de conidios a los 14 días
posteriores a la incubación.
Los hongos pluricelulares o mohos forman una serie de filamentos o tubos
rígidos denominados hifas, estas dan al moho un aspecto algodonoso y pueden
ser septados, es decir, presentar tabiques transversales que separan las
células. El conjunto de hifas forman un micelio. Existen dos tipos de micelio:
vegetativo que crece en toda la superficie del sustrato al penetrar en el y fijar el
hongo al sustrato y micelio aéreo o reproductor que produce esporas asexuales
y asexuales (Piña, 2000). En el caso de las colonias obtenidas de M. anisopliae
las colonias fueron planas las cuales crecieron por la superficie del medio.
Para el cultivo en obscuridad (ver figura 4) se obtuvieron colonias planas con
una coloración ligeramente verde del extremo de la colonia y se va
desvaneciendo a color blanco hasta el centro de la colonia con pequeñas gotas
de color anaranjado esparcidas entre las estrías de la misma, bajo estas
condiciones se obtuvieron 1.09 x107 UFC/caja. El crecimiento radial de las
colonias cultivadas en obscuridad fue de 0.025 mm h-1, que fue 9.6% mayor al
de las colonias cultivadas en completa obscuridad (σ ≤ 0.03).
Con luz blanca las colonias se caracterizaron por tener una coloración verde
intenso y uniforme con una producción 1x108 UFC/caja. Con luz azul la
coloración verde es de menor intensidad que el tratamiento con luz blanca, se
observó la formación de pequeñas gotas anaranjadas distribuidas entre la
colonia, con este tratamiento se obtuvo una producción de 1.47x107 UFC/caja.
Para el tratamiento con luz verde se obtuvieron colonias planas, con una
coloración verde y morfología colonial similar al cultivo en obscuridad, con
pequeñas gotas en la superficie y una producción de 1.15x107 UFC/caja.
Finalmente, cuando se utilizó la luz roja, se observó una coloración verdosa en
el extremo de la colonia, similar al tratamiento con el filtro azul y una
producción de 2.23 x107 UFC/caja. En Aspergillus oryzae la luz roja causa
reducción en la conidiacion de este hongo (Hatakeyama y Cols. 2007).
Al cosechar los conidios en tubos de ensaye (Figura 5) se observa una gran
diferencia en la coloración de la suspensión para cada tratamiento siendo el
mas destacado el tratamiento con luz blanca teniendo una intensa coloración
verde obscuro.
OBSCURIDAD LUZ BLANCA LUZ AZUL LUZ VERDE LUZ ROJA
1.09 X107 1 X108 1.47 X107 1.15 X107 2.23 X107
Figura 4. Morfología colonial y producción de conidios en M. anisopliae
cultivado en diferentes condiciones de luz. a) luz azul. b) luz blanca. c) luz azul.
d) luz verde. e) luz roja.
Figura 5. Tubos de ensaye conteniendo esporas de M. anisopliae,
a) completa obscuridad, b) luz blanca, c) luz azul, d) luz verde y e) luz roja.
Figura 6. Viabilidad para los tratamientos con luz color blanca, obscuridad, luz
verde, luz roja y luz azul.
De acuerdo a los resultados obtenidos, la luz tiene un efecto significativo en la
reproducción asexual de Metarhizium anisopliae, con luz blanca se produce un
orden de magnitud mayor de conidios respecto al cultivo en obscuridad. En el
tratamiento con luz verde se obtuvo una producción de conidios similar al de
obscuridad. Mientras que el tratamiento con luz roja muestra 2 veces más
conidios, así mismo el tratamiento con luz azul mostró un incremento del 50 %
más que el cultivo en obscuridad. En otro estudio realizado con Paecilomyces
fumosoroseus la producción máxima de conidios se obtuvo con la luz blanca
seguida por la luz azul, y la producción de conidios con luz verde y roja se da
en varios ordenes de magnitud menores (Sánchez-Murillo y cols, 2004).
En Trichoderma viride cuando es cultivado en completa obscuridad se obtiene
micelio plano y alino (sin color), en agar dextrosa de papa, pero crece
continuamente con esporulación bajo luz blanca (kumagai y Oda, 1969).
Phycomyces al estimulo externo responde de diferentes maneras, la mayor
parte de los hongos responde a la luz de una u otra manera, la luz azul
estimula el desarrollo de macrosporas en el micelio y la acumulación de
B-caroteno inhibe el desarrollo de microsporas la respuesta mas visible se da
con la luz azul (Cerda-Olmedo, 2001).
4.3. Periodo de competencia de respuesta a la luz del hongo
entomopatógeno Metarhizium anisopliae.
Para la determinación del periodo de competencia se realizaron ensayos para
saber el periodo en el cual Metarhizium anisopliae es competente para formar
conidioforos y conidios. En el experimento los pulsos de luz se aplicaron dentro
de una caja para pulsos antes descrita. Los testigos permanecieron en
oscuridad absoluta.
Después de 24 h de cultivo del hongo, las cajas de Petri fueron irradiadas cada
12 h con un pulso de luz de 1 h, después del tratamiento las cajas se cubrieron
nuevamente con papel aluminio. Después de la aplicación de los pulsos se
incubaron hasta completar 10 días de cultivo, luego se cosecharon las esporas
y se realizó la viabilidad de las mismas (ver tabla 2).
Tabla 2. Resultados de conteo directo y viabilidad de conidios.
TratamientosNo. conidios (Neubauder)
Promedio UFC/caja
Luz constante 9,66 x 107 4,31 x107
Pulso a las 24 h 4,75 x106 2,44 x106
Pulso a las 36 h 4,99 x106 2,70 x106
Pulso a las 48 h 4,38 x106 2,26 x106
Pulso a las 60 h 2,39 x106 1,04 x106
Pulso a las 72 h 4,60 x106 2,41 x106
Obscuridad 3,63 x106 2,90 x106
Para el testigo expuesto a completa obscuridad presentó un color amarillo claro
y plano con la formación de micelio blanco con producción de 2.90 x106
UFC/caja mientras que para las colonias con luz constante presento un fenotipo
aplanado con una coloración verde alcanzando una producción de 4.31x107
UFC/caja, la cual fue un orden de magnitud mayor comparado con los otros
tratamientos.
Se observa que M. anisopliae (ver figura 7) tiene muy poca respuesta con
respecto a los pulsos de luz a las de 36 h de cultivo alcanzando un incremento
con 2.70 x106 UFC/caja aun así, es mayor que los tratados a las 24, 48, 60, 72 h;
Sin embargo, el testigo en obscuridad muestra una mayor formación de
conidios con 6.8 % mas conidios con respecto al tratamiento a las 36 h.
Para Trichoderma viride cuando una colonia crece en obscuridad y es
iluminada brevemente con luz azul solo la región cercana al micelio produce
esporas apareciendo la formación de un anillo (Kumagai y Oda, 1969). En el
caso Metarhizium anisopliae no hay formación de anillos cuando se expone a la
luz. Cuando el micelio termina de desarrollarse va produciendo esporas, los
pulsos de luz al parecer tienen muy poco efecto en la reproducción del hongo.
En otro caso en Trichoderma se reportó que hay un periodo de competencia y
que es necesario que el hongo crezca por lo menos 36 h para ser fotosensible
(Sánchez-Murillo y cols, 2004); Sin embargo, la aplicación de los pulsos de luz
en este caso fue desde las 24 h el cual no se ve un efecto notorio para
conidiacion, talvez no es necesario la aplicación de pulsos de luz, simplemente
la iluminación continua es suficiente para su optima conidiacion. En caso del
hongo filamentoso Aspergillus oryzae se encontró que el efecto de luz en la
conidiacion es reprimida por la luz blanca. También la luz roja causa reducción
en la conidiacion (Hatakeyama y cols, 2007).
Figura 7. Viabilidad para esporas de M. anisopliae.
En otro ensayo se observa la diferencia que hay entre la luz constante y
completa obscuridad haciendo viabilidad cada 24 h durante cinco días
Tabla 3. Viabilidad para las cajas en completa obscuridad y luz constante
medida como conidios por caja.
Luz constante Obscuridad
Tiempo (h)
No. conidios (Neubauder)
UFC/cajaNo. conidios (Neubauder)
UFC/caja
72 2,23 x106 2,64 x106 3,10 x105 3,69 x105
96 5,65 x106 3,60 x106 6,13 x105 5,91 x105
120 9,33 x106 8,08 x106 5,30 x105 3,35 x105
144 1,52 x107 1,30 x107 5,75 x105 7,30 x105
168 3,70 x107 3,52 x107 2,31 x106 2,74 x106
Figura 8. Viabilidad para esporas expuestas a luz y a obscuridad
En la gráfica 8. Se muestra como desde las 72 horas hay un incremento en la
producción de conidios lo cual indica que Metarhizium anisopliae es
competente a la producción de conidios desde antes de las 72 h y se muestra
que la luz constante es la mas apropiada para el desarrollo de conidios a
comparación de su incubación en obscuridad. En un caso contrario el hongo
patógeno humano Crytococcus neoformans la luz inhibe su reproducción
(Idnurm y Heitman, 2005)
En Paecilomyces fumosoroseus los conidios requieren un periodo de
crecimiento para adquirir la fotocompetencia. La inducción de la conidiacion
solo se observa cuando el hongo es cultivado en la obscuridad durante el
periodo especifico de 72 a 108 h antes de ser expuestas a estimulo luminoso
(Sánchez-Murillo y cols, 2004).
CONCLUCIONES
► La luz afecta el desarrollo asexual de Metarhizium anisopliae, al cultivar el
hongo en presencia de luz se obtuvo una gran cantidad de conidioforos y
conidios, mientras que en completa obscuridad la producción de conidioforos y
conidios fue escasa.
► El mayor efecto de la luz se observo con la luz blanca.
► Metarhizium anisopliae no presenta un periodo de competencia de
respuesta a la luz, la mayor producción de conidios se obtuvo con luz
constante.
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