Alcuni citometri a flusso utilizzano laser a semiconduttori (633 nm) e coloranti fluorescenti per acidi nucleici che separano i leucociti utilizzando i segnali di:

Forward Scatter (FSc)Side Fluorescence (SFl)Side Scatter (SSc);

Leucocytes

• Lymphocytes

• Monocytes/Macrophages

• Granulocytes:

Neutrophils

Eosinophils

Basophils

I leucociti vengono anche differenziati sulla base della maggiore o minore quantità di mieloperosidasi (MPO) contenuta nei granuli citoplasmatici. Il sangue viene diluito, le emazie lisate e i leucociti colorati per la (MPO).

Granulociti ed eosinofili = massima quantità di MPOMonociti = quantità medio -piccola di MPOLinfociti e Blasti = piccola quantità di MPO

I GB: entrano in una cella di flusso in cui per ciascuna cellula vengono determinate le proprietà bi-dimensionali di dispersione e di assorbimento della luce.

Le cellule colorate assorbono più luce e la disperdono con un angolo diverso rispetto alle cellule non colorate. Il risultato finale e' un citogramma leucocitario bi-dimensionale.

LINEE GUIDA F. LEUCOCITARIA

La refertazione delle popolazioni leucocitarie deve essere espressa in numero assoluto. La quantificazione percentuale, che da sola

può fornire informazioni equivoche, può talvolta integrare efficacemente il numero assoluto; pertanto, la doppia refertazione

mantiene un valore informativo.

Lymphocytes• 1.5 - 3.5 x 109/l• Count varies with

age• Adaptive immune

response• T cells – cell

mediated immunity• B cells – antibody

mediated immunity NK cells

Linfocitosi

• Linfociti ≥4500 cellule/l negli adulti

• Linfociti ≥9000 cellule/l nei bambini fino ai 10 anni

• Infezioni virali, tubercolosi ,brucellosi e tifo• Infezione da Bordetella pertussis• Linfomi

Linfocitopenia

• Linfociti1500 cellule/l negli adulti• Linfociti 3000 cellule/l nei bambini

• Immunodeficit congeniti ed acquisiti• Stress da aumentata increzione di glucocorticoidi• Aplasia midollare• Alcune forme di LLA• Immunosoppressione da farmaci

Monocytes

0.2 – 0.8 x 109/l

• Antigen presentation• Cytokine production• Phagocytosis

Monocitosi

• Monociti ≥ 800 cellule/l

• Tubercolosi• Endocarditi batteriche acute• Brucellosi• Malaria• Morbo di Chron• Sarcoidosi• LES ed artrite reumatoide• Linfoma di Hodgkin

Monocitopenia

• Monociti 150 cel/l

• Stress da glucocorticoidi• Aplasia midollare• Leucemia a cellule capellute• Farmaci immunosoppressivi

Neutrophils

• 2.5 - 7.5 x 109/l• Large reserve pool

• 3-5 lobes• Granular cytoplasm• Transient in blood• Major phagocytic role• Bacterial killing

Neutrofilia

• Neutrofilia ≥7500cellule/L

• Infezioni batteriche – germi piogeni (ma anche fungine, parassitarie ed alcune virali)

• Flogosi immuni e non immuni (ustioni ,emorragie,tumori

metastatici, infarto,embolia polmonare)

• Stress, Adrenalina e Glucocorticoidi

• Sindromi mieloproliferative ( Leucemia mieloide cronica,mielodisplasia e policitemia vera)

• Farmaci (glucocorticoidi)

Neutropenia

• Neutropenia grave:neutrofili500 cellule/l• Neutropenia moderata: 500-1000 cellule/ l• Neutropenia lieve:1000-2000 cellule/ l

• Neutropenia da farmaci (immunosoppressori e antiblastici)• Aplasia midollare, leucemie e linfomi• Neutropenia isoimmune neonatale (aumentata distruzione da IgG

materne verso Antigeni paterni)• Neutropenia autoimmune (LES)• Neutropenia da aumentata marginazione (setticemia da Gram -,

malaria, tifo, rickettiosi)• Neutropenia da sequestro splenico (cirrosi)

HypersegmentationHypersegmentation

• Shift to the right• More mature cells

kept on• Infective and

inflammatory sites• Severe burns• TB, post chemo,

pregnancy

““Shift to the left”Shift to the left”

Eosinophils

• 0.2 - 0.8 x 109/l• Bilobed nucleus

Red granules

Weakly phagocytic• Anti-parasitic action• Modulation of

hypersensitivity and allergic reactions

Eosinofilia

• Eosinofili ≥800 cellule/l

• Allergie• Infestazioni da metazoi• Farmaci• Malattie autoimmuni sistemiche• Neoplasie• Sindromi ipereosinofile

Eosinopenia

• Eosinofili 70 cellule/l

• Aumentata increzione di glucocorticoidi

• Infezioni batteriche acute

Basophils

• 0.1 - 0.2 x 109/l• Bilobed nucleus• Large black granules

• Inflammatory response

• Hypersensitivity /allergy

Basofilia

• Basofili ≥ 20 cellule/ l

• Ipersensibilità immediata• Colite ulcerosa• Leucemia mieloide cronica (basofila)• Policitemia vera

BasopeniaBasopenia

• Stress

• Infection

• Steroids

• Cushing’s syndrome

Platelets

• Fragments of cytoplasm from BM megakaryocyte

• Major role in coagulation

Platelets 2

• Lifespan in peripheral blood 7-10 days

• Range 150-400x 109/l

METODI USATI PER IL CONTEGGIO AUTOMATICO DELLE PIASTRINE

CITOFLUORIMETRICO

IMPEDENZOMETRICO

– ELETTRO OTTICO

Conta Ottica PLTo Conta ad impedenza PLTi

Conta piastrinica

Piastrine : Istogramma volumetrico

PL = soglia inferiore, PU = soglia superiore, PDW = platelet distribution width (larghezza della curva tagliata al 20%), P-LCR = platelet –large cell ratio (percentuale di grandi piastrine). MPC = Mean PLT Contenent (misura della concentrazione complessiva dei componenti interni delle piastrine)

Metodo impedenziomet

rico

MPV• Più alto negli uomini• Correlazione inversa non lineare fra MPV e

N.ro PLT

• Aumenta in corso di: Diminuisce in corso di:

Diabete mellito Leucemia Acuta IMA An. Megaloblastica Arteriopatie Periferiche Malattie mieloproliferative Pre-eclampsia Splenectomia

PDW

• Indica l'anisocitosi piastrinica.Aumenta in corso di:• An. Megaloblastica• An. Aplastica• AREB• LMC• In presenza di crioglobuline e paraproteine

MPC

E' misura della concentrazione complessiva dei componenti interni delle piastrine, fornisce indicazioni su:

• Morfologia, Attivazione, Screening. Di conseguenza utile per:

• monitoraggio terapie antiaggreganti• monitoraggio terapie antinfiammatorie

Quantitative Abnormalities 1• Thrombocytopenia - Decreased count• <100 x 109/l - Increasing risk of bleeding in major

surgery• <50 x 109/l - Increasing risk of bleeding for CID and

surgery• <10-20 x 109/l - Increasing risk of spontaneous

bleeding

• Causes• Immune • BM infiltration, chemotherapy etc• Inherited defects

Quantitative abnormalities 2

• Thrombocytosis - Increased count

• > 450 x 109/l

• Reactive eg infection inflammation

• Chronic bleeding

• Haematological malignancy

INTERFERENZA NELLA CONTA PIASTRINICA

•Frammenti eritrocitari

•Frammenti di globuli bianchi

•Parassiti, batteri

•Ombre eritrocitarie

•Piastrine giganti

•Aggregati piastrinici

•Effetto da anticoagulante

•Frammenti eritrocitari

•Frammenti di globuli bianchi

•Parassiti, batteri

•Ombre eritrocitarie

•Piastrine giganti

•Aggregati piastrinici

•Effetto da anticoagulante

Cause più comuni di conta piastrinica erronea nel paziente ematologico

AGGREGATI PIASTRINICI CAUSA FREQUENTE DI CONTA SOTTOSTIMATA

Sono epressione dell’agglutinazione piastrinica in vitro da parte di autoanticorpi

Gli AUTOANTICORPI EDTA – DIPENDENTI interagiscono con antigeni criptici della glicoproteina II b, smascherati dalla chelazione del calcio da parte dell’EDTA

•IgG EDTA- e temperatura – dipendenti•Crioagglutinine EDTA – dipendenti•IgG EDTA- dipendenti e temperatura – indipendenti

Qualitative defects

• Count may be normal/low/high

• May be no apparent abnormality on film

• May show changes eg size, appearance etc

• Functionality is variably affected

• May be inherited or acquired