Budapesti Mőszaki és Gazdaságtudományi Egyetem

FÁJDALOMCSILLAPÍTÓ HATÁSÚ NR2B

ALTÍPUSSZELEKTÍV NMDA ANTAGONISTÁK KUTATÁSA

PhD ÉRTEKEZÉS

Borza István

Témavezetı:

Dr. Domány György

Richter Gedeon Nyrt. Gyógyszerkémiai Kutatólaboratórium I

Konzulens:

Dr. Keglevich György

BME Vegyészmérnöki Kar, Szerves Kémia és Technológia Tanszék

Budapest, 2010

1

Nyilatkozat

Alulírott Borza István kijelentem, hogy ezt a doktori értekezést saját magam készítettem meg

nem engedett segítség nélkül, és csak a megadott forrásokat használtam fel. Minden olyan

részt, amelyet szó szerint vagy azonos értelemben, de átfogalmazva más forrásból átvettem,

egyértelmően a forrás megadásával megjelöltem.

Budapest, 2010

……………………

Borza István

2

TARTALOMJEGYZÉK

RÖVIDÍTÉSEK

1. BEVEZETÉS, CÉLKITŐZÉS .........................................................................................6

2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS.............................................................................................8

2.1. A fájdalom érzékelése ....................................................................................................8 2.1.1. Fájdalomtípusok és mechanizmusok ........................................................................................... 8 2.1.2. A fájdalom vázlatos élettana ...................................................................................................... 10

2.1.2.1. A fájdalominger útvonala ................................................................................................... 10 2.1.2.2. Kapuzárásos fájdalom kontroll (wind up).......................................................................... 12 2.1.2.3. Centrális fájdalom kontroll (analgetikus leszálló pályarendszer)...................................... 13

2.1.3. Receptorok, ioncsatornák és mediátorok a gerincvelı hátsó szarvában ................................... 14

2.2. Glutaminsav receptorok .............................................................................................. 15 2.2.1. Nem-NMDA glutaminsav receptorok és élettani jelentıségük ................................................. 15 2.2.2. NMDA receptorok élettani jelentısége ..................................................................................... 17 2.2.3. NMDA receptorok felépítése és mőködése................................................................................ 18 2.2.4. Az NMDA receptorok expressziója........................................................................................... 20

2.3. Az NMDA receptorok mint terápiás célpontok.......................................................... 20 2.3.1. Glicin antagonisták .................................................................................................................... 21 2.3.2. Glutaminsav antagonisták (kompetitív NMDA receptor antagonisták) ................................... 22 2.3.3. NMDA csatorna blokkolók (nem kompetitív NMDA receptor antagonisták).......................... 22 2.3.4. NR2B szelektív NMDA antagonisták........................................................................................ 23

2.3.4.1. Ifenprodil típusú NR2B szelektív NMDA antagonisták ................................................... 23 2.3.4.2. Nem ifenprodil típusú NR2B szelektív NMDA antagonisták ........................................... 35

3. KÍSÉRLETI MODELLEK, VIZSGÁLATI MÓDSZEREK ........................................ 40

3.1. Farmakológiai szőrırendszer...................................................................................... 40

3.2. In vitro vizsgálatok....................................................................................................... 42 3.2.1. Kötıdési tesztek......................................................................................................................... 42 3.2.2. Funkcionális tesztek .................................................................................................................. 42

3.2.2.1. Funkcionális teszt primer neokortikális tenyészeten.......................................................... 42 3.2.2.2. Funkcionális teszt NR1a/NR2B és NR1/NR2A alegység összetételő rekombináns NMDA receptorokon ...................................................................................................................... 43

3.3. In vivo tesztek............................................................................................................... 44 3.3.1. Egér formalin teszt ..................................................................................................................... 44 3.3.2. Neuropátiás fájdalom Seltzer modellje (antihiperalgézia) ........................................................ 44 3.3.3. Neuropátiás fájdalom CCI (chronic constriction injury) modellje (antiallodínia).................... 44 3.3.4. Diabéteszes neuropátia modell ................................................................................................... 45

3.4. Nemkívánatos mellékhatásokra utaló tesztek............................................................. 45 3.4.1. Irwin teszt................................................................................................................................... 45 3.4.2. Spontán lokomotoros aktivitás mérése rágcsálókon.................................................................. 45 3.4.3. Rotarod teszt .............................................................................................................................. 45 3.4.4. QT-megnyúlás ............................................................................................................................ 46

4. SAJÁT EREDMÉNYEK................................................................................................ 47

4.1. Fahéjsavamidok ........................................................................................................... 50 4.1.1. Tiraminszármazékok ................................................................................................................. 51 4.1.2. Oktopaminszármazékok ............................................................................................................ 52 4.1.3. Fahéjsavamidok elıállítása ........................................................................................................ 55

3

4.2. Indol-2-karbonsav-származékok................................................................................. 57 4.2.1. Hidroxilcsoport helyzete az indolgyőrőn ................................................................................... 58 4.2.2. Az X-csoport természete ............................................................................................................ 60 4.2.3. A piperidingyőrő szubsztituensének helyzete........................................................................... 60 4.2.4. Az Y összekötı lánc helyzete ..................................................................................................... 61 4.2.5. A Z-csoport természete és helyzete ........................................................................................... 61 4.2.6. Indol-2-karbonsav-származékok elıállítása ............................................................................. 62

4.3. Benzimidazol-2-karbonsav-származékok ................................................................... 65 4.3.1. Az indol pirrolrészének helyettesítése más karbo-, illetve heterociklusokkal .......................... 65 4.3.2. Benzimidazol-2-karboxamidok optimalizációja ....................................................................... 66 4.3.3. Benzimidazol-2-karbonsav-származékok elıállítása ................................................................ 67 4.3.4. Indol- és benzimidazol-származékok in vivo aktivitása ............................................................ 70

4.4. Oxálsavdiamidok ......................................................................................................... 71 4.4.1. Eredmények, szerkezet-hatás összefüggések............................................................................. 71 4.4.2. Oxálsavszármazékok elıállítása................................................................................................ 76

4.5. Kinurénsav amidszármazékok .................................................................................... 78 4.5.1. Eredmények, szerkezet-hatás összefüggések............................................................................. 78 4.5.2. Kinurénsav amidszármazékainak elıállítása ........................................................................... 82

4.6. Benzoil-karbamid-származékok.................................................................................. 83 4.6.1. Eredmények, szerkezet-hatás összefüggések............................................................................. 83 4.6.2. Benzoil-karbamid-származékok elıállítása .............................................................................. 88

4.7. Indol-2-karboxamidin-származék............................................................................... 89 4.7.1. Eredmények, szerkezet-hatás összefüggések............................................................................. 89 4.7. 2. Indol-2-karboxamidin-származékok elıállítása........................................................................ 93

4.8. Benzilidén-piperidin-származékok.............................................................................. 94 4.8.1. Eredmények, szerkezet-hatás összefüggések az indol- és benzimidazol- ...................................... származékok körében .......................................................................................................................... 95 4.8.2. Indol- és benzimidazol-származékok elıállítása ....................................................................... 98 4.8.3. Eredmények, szerkezet-hatás összefüggések az oxálsavdiamidok körében.............................. 98 4.8.4. Oxálsavdiamidok elıállítása..................................................................................................... 100

5. A PROJEKT BEFEJEZÉSE.......................................................................................101

6. ÖSSZEFOGLALÁS.....................................................................................................102

7. TÉZISEK .....................................................................................................................109

8. MOLEKULALISTA....................................................................................................111

9. IRODALOMJEGYZÉK..............................................................................................118

10. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS......................................................................................126

4

RÖVIDÍTÉSEK

Ac acetil

BA biohasznosulás (Bioavailability)

Bn benzil

cAMP ciklikus adenozin-monofoszfát

CC test patkány hipokampális neuronok primer tenyészetében meghatározott

glutaminsav-indukált sejthalál gátlás

CFA komplett Freund adjuváns (Complete Freund's Adjuvant)

CGRP kalcitonin gén-rokon peptid (Calcitonin gene related peptide)

COX ciklooxigenáz

CYP citokróm P450

DAU dopamin felvétel

DEAD dietil-aza-dikarboxilát

DIC diizopropil-karbodiimid

DIPEA diizopropil-etil-amin

DMAP 4-dimetil-amino-piridin

DRG hátsó gyöki ganglionsejtek (Dorsal root ganglion)

ED effektív dózis

GABA γ-amino-vajsav

HBTU 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametilurónium-hexafluorofoszfát

hERG Kv11.1 káliumcsatorna (Human Ether-à-go-go Related Gene)

HPCD hidroxipropil-β-ciklodextrin

HTS nagy áteresztı-képességő szőrés (High-throughput Screening)

i.p. intraperitoneális

IP3 inozitol-trifoszfát

i.v. intravénás

IVM FM% in vitro metabolizmus, becsült maximális felszívódás

LMA lokomotoros aktivitás

LTP hosszú távú aktiváció kialakulása (Long-term potentiation)

mCPBA meta-klór-perbenzoesav

MCP-1 monocita kemoattraktáns protein-1 (Monocyte chemotactic protein-1)

MED minimum effektív dózis

Mez mezil

5

mGluR metabotróp glutaminsav receptor

NCS N-klór-szukcinimid

N.D. nincs meghatározva (not determined)

NK-1 neurokinin 1 receptor

NMDA N-metil-D-aszparaginsav

NOS nitrogén-monoxid szintáz

PCP 1-(1-fenil-ciklohexil)piperidin

PK farmakokinetika

p.o. per os, szájon át

QT a szív elektromos ciklusának a Q hullám elejétıl a T hullám végéig tartó

idıintervalluma

SAR szerkezet-hatás összefüggés (Structure-activity relationship)

s.c. szubkután, bır alá

t. termelés

TFA trifluorecetsav

Toz tozil

6

1. BEVEZETÉS, CÉLKITŐZÉS

Bár a fájdalomcsillapítás a legısibb orvosi feladatok közé tartozik, a krónikus és neurogén

fájdalmak a mai napig megoldatlan terápiás problémát jelentenek. Neuropátiás fájdalom az

idegrendszer tartós sérülése vagy mőködéscsökkenése, például baleseti sérülés, mőtét,

kemoterápia és különbözı betegségek (AIDS, szklerózis multiplex, artritisz, cukorbetegség)

következtében alakulhat ki.1 Tünetei a körülményektıl függıen különbözıek lehetnek, de

leggyakrabban allodíniában (fájdalmatlan inger által kiváltott fájdalom) és hiperalgéziában

(felfokozódott fájdalomérzékenység) nyilvánulnak meg. A fájdalom krónikussá válásában

fıleg a perifériás idegek és a gerincvelı, ritkábban agyi területek is érintettek. Kezelésében a

közismert fájdalomcsillapító gyógyszerek hatása elégtelen, ennek ellenére a neuropátiás

fájdalomban szenvedık többségénél még mindig ezeket a szereket alkalmazzák. A

gyógyszeres és egyéb terápiák a krónikus neurogén fájdalomban szenvedı betegek felének

csillapítják csak a fájdalmát, ezért égetı szükség van új, hatékony gyógyszerekre.2 Az a tény,

hogy hagyományos analgetikumokra ez a fájdalomforma alig reagál, más terápiás területek

(antidepresszánsok, antiepileptikumok) meglévı gyógyszereinek „off label” alkalmazásához

vezetett. Késıbb ezek közül a leghatásosabbakat törzskönyvezték az új indikációra, ennek

ellenére a triciklusos antidepresszánsok és az arany standardnak tekintett gabapentin és

pregabalin a betegek nagy részénél gyenge hatékonyságot mutatnak.3 Az elmúlt néhány

évtizedben bebizonyosodott, hogy a glutaminsav receptorok fontos szerepet töltenek be a

perifériás szövetek és idegek sérüléseivel kapcsolatos fájdalomérzékelésben.3-5 A glutaminsav

a központi idegrendszer fı serkentı neurotranszmittere, számos metabotróp és három

ionotróp receptort aktivál (NMDA, AMPA és kainsav). Az ionotróp glutaminsav receptorok

serkentı szinaptikus jelátvitelt közvetítenek a központi idegrendszerben. Normális, nociceptív

fájdalom esetén a gerincvelı hátsó szarvában az afferens idegekbıl érkezı serkentı jelet

elsısorban a gyors aktivációra és deszenzibilizációra képes AMPA és kainsav receptorok

közvetítik. A hosszabb ideig tartó, intenzívebb, fájdalmas ingerek akkumulálódó, elnyújtott,

lassan depolarizáló szinaptikus potenciált alakítanak ki. Ezeket a krónikus és neuropátiás

fájdalomra jellemzı ingereket a lassabban reagáló NMDA receptor-ioncsatornák közvetítik.

Az idegi sérülés helyén neuroma, egy hiperérzékeny struktúra keletkezik, mely intenzív

fájdalom bemenetet ad a gerincvelı hátsó szarvába. Az ottlévı idegek a megnövekedett

bemenet miatt túlérzékeny állapotba kerülnek, csökken az ingerküszöbük, a nem fájdalmas

ingereket is fájdalomként továbbítják (allodínia), illetve a fájdalmas ingereket abnormálisan

felerısítik (hiperalgézia). Ezt a gerincvelıben jelentkezı hiperérzékeny állapotot ( „wind-up”)

7

már 1966-ban leírták.6 Az NMDA antagonisták lehetséges szerepének felvetését a neuropátiás

fájdalom enyhítésében 1987-re tehetjük amikor kimutatták, hogy NMDA antagonisták

gátolják a „wind-upot”.7, 8 Ezután számos in vivo modellben sikerült igazolni, hogy az NMDA

receptor antagonisták hatékonyan csillapítják mind a neurogén9, 10, mind a gyulladásos

fájdalmat11. Az NMDA antagonista hatás mellett egyéb receptoriális aktivitással is

rendelkezı, forgalomban lévı gyógyszerekkel szerzett klinikai tapasztalatok is megerısítik

használhatóságukat fájdalomcsillapításban, Parkinson- és Alzheimer-kórban (pl. ketamin12-14,

dextrometorfán15, memantin16). Ezek a vegyületek nem kompetitív antagonisták, az

ioncsatorna belsejében lévı csatornát blokkoló kötıhelyhez, az ún. fenciklidin kötıhelyhez

kapcsolódva fejtik ki hatásukat. Hatékony terápiás használatukat elsısorban az NMDA

receptor által mediált szinapszisokat túlzottan blokkoló hatásuk gátolta. Ennek ellenére a

kutatások elsı szakaszában népszerő célpont volt a fenciklidin kötıhely de az újonnan

elıállított antagonisták fejlesztése is abbamaradt tipikus mellékhatásaik (pszichotomimetikus,

szedatív, memóriarontó) miatt.17

Jelentıs elırelépést jelentettek az NR2B alegység altípusra szelektív antagonisták

megjelenése, melyek mentesek ezektıl a mellékhatásoktól. Elsıként egy forgalomban lévı

vérnyomáscsökkentıt, az ifenprodilt azonosítottak NR2B szelektív NMDA antagonista hatású

vegyületként. Az ifenprodil és analogonjai (pl. az eliprodil) vegyes profilú anyagok,

alkalmazásukat olyan mellékhatások korlátozták melyek nem függnek össze az NMDA

hatásmechanizmussal. Idıközben számos NR2B szelektív NMDA antagonista vegyületet

írtak le és védtek szabadalmi bejelentésekben, melyeket fıleg neuroprotektív területen

vizsgáltak. Késıbb merült fel fájdalomcsillapításra való felhasználásuknak a lehetısége, és

mivel mellékhatásaik egyéb receptoriális aktivitásuknak köszönhetı, okkal remélhettük, hogy

egy tiszta profilú, szelektív vegyület mellékhatásmentesen csillapíthatja a neuropátiás

fájdalmat. A kielégítetlen gyógyászati igényt és a hatásmechanizmus újdonságát mérlegelve,

Társaságunk a Richter Gedeon Gyógyszervegyészeti Gyár 1999-ben NR2B szelektív NMDA

antagonista hatásmechanizmuson alapuló új fájdalomcsillapító kutatási projekt elindítása

mellett döntött. Terápiás célunk egy orálisan adható fájdalomcsillapító volt, krónikus és

neurogén fájdalmak enyhítésére. Ennek érdekében ifenprodil típusu, NR2B szelektív

antagonista hatású molekulák elıállítását és tesztelését határoztuk el. Mivel abban az idıben a

receptor szerkezete nem volt teljesen felderítve és egy nagy áteresztıképességő biológiai

szőrésnek sem volt meg a feltétele, kémiai munkánkat a versenytársak ismert anyagainak a

szerkezetére alapoztuk.

8

2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS

2.1. A fájdalom érzékelése

2.1.1. Fájdalomtípusok és mechanizmusok

A Nemzetközi Fájdalom Társaság (IASP) definíciója szerint a fájdalom: „ Kellemetlen érzéki

és emócionális élmény, amely valódi vagy lehetséges szövetkárosodással jár, vagy ehhez

hasonló panaszokat okoz. A fájdalom mindig szubjektív és emiatt mindig érzelmi töltése is

van”. A fájdalom funkcióját mind a mai napig Hippokratész fogalmazta meg a legtalálóbban:

„A fájdalom a szervezet házırzı kutyája”. Vagyis a fájdalom egy olyan életfontosságú

biológiai jelzırendszer, mely egyrészt segít az ártalmas ingerek elkerülésében , másrészt jelzi

a szervek, szövetek károsodását vagy megbetegedését. A fájdalom komplex fogalom, testi,

lelki, értelmi, szociális és spirituális összetevıi vannak.18 A fájdalomnak kórtani alapon

három típusa különíthetı el: nociceptív, gyulladásos és neuropátiás fájdalom (1. ábra).1 A

nociceptív fájdalom sérülést követıen többnyire akutan alakul ki. Biológiailag hasznos védı

szerepet ellátó fiziológiai jelenség. Figyelmeztet a kialakult vagy fenyegetı vázizomrendszeri

és zsigeri szövetkárosodásra, a károsodás elhárítását célzó magatartást, illetve reflexeket vált

ki. Az okozott fájdalom általában jól kezelhetı hagyományos fájdalomcsillapító szerekkel. Az

1.a. ábra egy normál, fiziológiás állapotú fájdalomérzékelést illusztrál. Alacsony intenzitású

inger, pl. érintés, alacsony küszöbértékő afferenseket (Aβ) aktivál fájdalom nélküli,

ártalmatlan érzetet keltve. Egy nagy intenzitású, fájdalmat elıidézı ártalmas inger pl. hı (az

ábrán tő), magasküszöbértékő (C és Aδ) afferenseket aktivál. A gyulladásos fájdalmat

perifériás szöveti sérülés, trauma, fertızés, mőtéti beavatkozás, égés okozta gyulladás vagy

gyulladásos betegségek , pl. artritisz váltanak ki. A gyulladt, károsodott szövetben számos

fájdalomkeltı mediátor válhat szabaddá: szerotonin, ATP, monoaminok, citokinek, kininek,

kemokinek, prosztaglandinok és növekedési faktorok. Ezek a mediátor anyagok különbözı

intracelluláris jelátalakító folyamatokon keresztül aktiválják, érzékenyítik a helyi nociceptív

mechanizmusokat. Például a prosztaglandin E2 (PGE2) aktiválja az EP prosztanoid receptort

amely aktiválja a protein kináz A-t (PKA), kiváltva ezzel a tetrodotoxin (TTX) rezisztens Na-

csatorna foszforilálódását, mely kizárólag a primer fájdalomérzı idegekben (afferens

nociceptorok) expresszálódik.

9

1. ábra. Normál, gyulladásos és neuropátiás fájdalom érzékelésének folyamata.1

Az 1.b. ábra olyan perifériás szövetkárosodást vagy gyulladást követı fájdalomérzékelési

folyamatokat mutat be, ahol ártalmas és nem ártalmas ingerekre is abnormális válasz

indukálódik. A periféria érzékennyé válik, csökken a magas ingerküszöbő (C és Aδ) rostok

ingerküszöbe, fájdalmas ingerek abnormálisan megnövekedett fájdalmérzetet okoznak a

sérülés, gyulladás helyén (primer hiperalgézia). Az érzékenyített területekrıl induló

nociceptív rostok képesek érzékenyíteni a közeli intakt területek nociceptorait is, így a

hiperalgézia ezeket a területeket is érinti (szekunder hiperalgézia). Az érzékennyé vált

nociceptorokból induló, felerısödött C-rost impulzus hiperérzékennyé teszi a gerincvelı és az

agy fájdalmat közvetítı és érzékelı területeit (centrális szenzitizáció). Ennek eredményeként

az alacsony küszöbértékő Aβ rostok is fájdalomérzést váltanak ki, nem fájdalmas inger (az

ábrán tollpihe) is fájdalmat okoz (allodínia).

A neuropátiás fájdalom az idegrendszer primer károsodása, vagy mőködészavara által

kiváltott vagy fenntartott fájdalom. A neuropátiás fájdalomnak nincs védı szerepe. Gyakran

válik krónkussá, a betegek értelmetlen szenvedését okozó fájdalommá. A neuropátiás

fájdalom kiváltásában toxikus, vaszkuláris, traumás, gyulladásos, tumoros, metabolikus és

iatrogén tényezık egyaránt szerepet játszhatnak. Az idegsérülés helyén keletkezı neurómákon

és a vele kapcsolatban lévı hátsó gyöki ganglionsejteken (DRG) rendellenes kisülések

keletkeznek, a sérülés helyén égı fájdalom jelentkezik (1.c. ábra). A megnövekedett

10

impulzusáram a gerincvelı hiperexcitibilitását és centrális szenzitizálását eredményezi

aminek következtében hiperalgézia és allodínia alakul ki.1

A különbözı humán fájdalomformák az akut, gyulladásos és neurológiai fájdalomtípusok

valamelyikébe besorolhatók, bár sok esetben a fájdalomnak gyulladásos és neuropátiás

komponense is van egyszerre (2. ábra).

akut fájdalom perzisztens/gyulladásos fájdalom

krónikus/neuropátiás fájdalom

neuropátiás fájdalom

-vénás szúrás/ tő okozta fájdalom -égés -posztoperatív azonnali fájdalom -poszttraumás azonnali fájdalom -akut betegségek (hasnyálmirigy gyulladás, infarktus, stb.) -alhasi fájdalom

-artritisz -posztoperatív fájdalom -irritábilis bél szindróma -viszcerális fájdalom -égési fájdalom -traumás szövetkárosodás -migrén -derékfájdalom -endometriózis -diszmenorrea -urológiai fájdalom

-oszteoartritisz -derékfájás (isiász, lumbágó) -fibromialgia -rákos csontfájdalom

perifériás neuropátia -posztherpeszes neuralgia -toxikus neuropátia -fokális traumás neuropátia -fantom és csonk fájdalom centrális neuropátiák -iszkémiás cerebrovaszkuláris sérülés (stroke) -szklerózis multiplex okozta fájdalom -gerincvelı sérülés -Parkinzon kór -amiotrópiás laterális szklerózis vegyes neuropátiák -diabéteszes neuropátiák -szimpatikus rendszer által fenntartott fájdalom

2. ábra. Humán fájdalomtípusok.

2.1.2. A fájdalom vázlatos élettana

2.1.2.1. A fájdalominger útvonala

A fájdalmat érzékelı receptoroktól az inger döntıen a gerincvelıben futó afferens rostokon

keresztül jut a központi idegrendszerbe, ahol kialakul a fájdalomérzet (3. ábra).19 A központi

idegrendszer válaszreakcióját az efferens rostok közvetítik. A fájdalomérzı receptorok,

másnéven nociceptorok az agyszövet kivételével mindenütt jelen vannak. A nociceptorokat

elsıdlegesen hı, mechanikai és kémiai ingerek aktiválják. Az inger hatására megváltozik a

receptor extracelluláris részének konformációja, ennek következtében az érzıidegsejt

kationcsatornája megnyílik. Generátorpotenciál képzıdik, amelynek amplitúdója a behatás

erısségétıl függ. Ha a generátorpotenciál eléri a közeli Na+ csatorna küszöbét, akkor

tovaterjedı akciós potenciál keletkezik. Külsı hı, mechanikai és kémiai ingerek mellett

vannak olyan szövetkárosodáskor felszabaduló molekulák („gyulladásos leves”: hisztamin,

szerotonin, bradikinin, stb.) amelyek önmagukban is kiváltják a nociceptor ingerületét, sıt

jelentıs ingerküszöb fölötti stimulust idézhetnek elı. Míg más felszabaduló faktorok

(leukotriének, prosztaglandinok, substance-P, CGRP, NO, stb) csak érzékenyítik a nociceptív

11

idegvégzıdéseket, csökkentik a receptor ingerküszöbét, fokozott fájdalomérzetet,

hiperalgéziát idézve elı.

3. ábra. Fájdalom „szupersztráda”: felszálló és leszálló fájdalompályák. A perifériáról induló fájdalomjelek a

hátsó gyöki ganglionsejteken (DRG) keresztül a gerincvelı hátsó szarvában lévı szinapszisokba jutnak, majd

tovább folytatják útjukat a központi idegrendszer magasabb régiói felé. A felszálló és leszálló pályák

kulcsszerkezetei összegyőjtik és módosítják ezeket a jeleket. Az ingertovábbítás különbözı helyein sárga

háttérrel ki vannak emelve azok a mediátorok és gyógyszercélpontok amelyek fontos szerepet játszanak a

fájdalom folyamatában.19

Az akciós potenciált különbözı rostok közvetítik a központi idegrendszer felé. A rostokat

átmérıjük és vezetési sebességük alapján több csoportba sorolják. A viszonylag vastag és

nagy vezetési sebességő Aα és Aβ rostok a fájdalmat nem okozó ingereket továbbítják, a

fájdalmas stimulusokat a legvékonyabb és legkisebb vezetési sebességő velıhüvelyes Aδ és

DRG

12

velıtlen C rostok szállítják a gerincvelıbe, illetve a trigeminus érzı magvába. Az Aδ rostok

az azonnal fellépı, éles, szúró jellegő fájdalmat közvetítik, míg a C rostok a fájdalom

második fázisából eredı, lassú, de tartós, égetı jellegő ingert szállítják.20 A nociceptív

afferensek többsége a gerincvelı hátsó szarvába fut be, ahol három fı idegcsoporttal, serkentı

és gátló interneuronokkal és projekciós neuronokkal szinaptizálnak. A gerincvelı hátsó

szarvának mind a hat rétege tartalmazza ezeket a fájdalomingert továbbító, nociceptív

struktúrákat. A projekciós neuronok a bejövı szenzoros információkat agyi központokba

szállítják. A serkentı interneuronok a projekciós neuronok felé közvetítik a szenzoros

információkat. Az inhibitorikus interneuronok a bejövı szenzoros információkat

szabályozzák. A projekciós neuronok lehetnek nociceptív specifikusak, amelyek csak az Aδ

és C rostoktól kapnak ingereket és lehetnek széles-dinamikus sávú idegek, melyek mind a

fájdalmat közvetítı Aδ és C rostoktól, mind pedig a fájdalmatlan ingereket továbbító Aα és

Aβ rostoktól kaphatnak információt. A fájdalomérzetet perifériás (spinális) és centrális

(supraspinális) mechanizmusok szabályozzák. Mindkét gátló mechanizmusban a hátsó szarvi

gátló interneuronok játszanak kulcsszerepet.20

2.1.2.2. Kapuzárásos fájdalom kontroll (wind up)

Miközben a C típusú rostok a fájdalmas ingereket, az Aα és Aβ rostok a fájdalmatlan

ingereket a projekciós neuronok felé továbbítják, ugyanazzal a projekciós neuronnal

kapcsolatban lévı gátló interneuronhoz is csatlakoznak (4. ábra) Az így létrejövı kör

szabályozza perifériásan a fájdalomérzetet. A C rostok gátló neurotranszmittereket, az Aα és

Aβ rostok serkentı neurotranszmittereket bocsájtanak ki az inhibíciós interneuronok felé.

A B 4. ábra. A fájdalominger spinális gátlása: A kapu nyitása, B kapu zárása.21

A perifériás idegsérülések miatt felszabaduló mediátorok (bradikinin, szerotonin, hisztamin,

prosztaglandin, acetilkolin, substance-P stb.) a környezı niciceptorokat direkt aktivációval

vagy az ingerlési küszöb csökkentésével hiperérzékennyé teszik. A nociceptorok állandó

ingerlésének következtében a C rostok folyamatosan tüzelnek. Ennek hatására a C rostokból

13

felszabaduló gátló transzmitterek blokkolják a gátló interneuronokat, a projekciós neuron

felszabadul a gátlás alól és a fájdalomérzés akadálytalanul továbbítódik (kapu nyitása) (4.A

ábra). Ha ugyanakkor más, fıleg mechanoreceptorokból származó ingerület érkezik a hátsó

szarvba, az Aα és Aβ rostok hatása érvényesül: a felszabaduló serkentı neurotranszmitterek

(fıként glutaminsav) serkentik a gátló interneuronokat, amik így gátolják a projekciós

neuronokat (gátlás gátlása), csökkentve vagy megszüntetve a továbbítandó fájdalom

ingerületét (kapu zárása) (4.A ábra).20

A kapu nyitásakor a C rostok végzıdésein a projekciós neuronok irányába ugyanakkor

serkentı transzmitter, glutaminsav szabadul fel, aminek hatására gyors excitatorikus

posztszinaptikus potenciál jön létre a projekciós neuronokon. Posztszinaptikusan a

glutaminsavat a projekciós neuronokon elhelyezkedı AMPA, kainsav és NMDA receptorok

fogadják. Az AMPA és kainsav receptorok gyors és éles fájdalmat, az NMDA receptorok

elhúzódó fájdalmat közvetítenek. (Lassú excitatorikus posztszinaptikus potenciált létrehozó

neurotranszmitterek is felszabadulnak, legismertebb közülük a substance-P és a CGRP.) A

perifériás idegsérülés miatt folyamatosan tüzelı C rostok végzıdésein felszabaduló

nagymennyiségő glutaminsav hatására a projekciós neuronokon lévı AMPA és kainsav

receptorok háttérbe szorulnak és az NMDA receptorok tartós aktivitása alakul ki. Az NMDA

receptorok által folyamatosan aktivált projekciós neuronok ráadásul szelektíven toxikusak

lehetnek az inhibíciós interneuronokra, így a leírt szabályozó körben az inhibíciós

interneuronok kiiktatásával megszünhet a fájdalominger negatív szabályozása. Az íly módon

progresszíven fokozódó fájdalominger következménye az agyi struktúrák szenzitizációja, az

allodínia és a hiperalgézia megjelenése.22 A folyamatban számos egyéb receptor (prosztanoid,

kemokin, COX, NOS, stb.) és mechanizmus is részt vesz, az NMDA receptornak azonban

központi szerepe van a centrális szenzitizáció kialakításában.

2.1.2.3. Centrális fájdalom kontroll (analgetikus leszálló pályarendszer)20

A dorzális szarv öt Rexed laminájából öt különféle idegpálya továbbítja a fájdalomingerületet

a felsıbb agyi struktúrákhoz. Ezek a pályák az agy különféle területein végzıdnek, amelyek a

fájdalom ingerre eltérı válaszokat adnak. A talamuszban történik a fájdalom lokalizálása, a

limbikus kéregben történik a fájdalom affektív feldolgozása (emlékezés a fájdalomra, a

fájdalom tolerálása). A nyúltvelı noredrenerg sejtjeiben végzıdı idegpályák a központi

noradrenerg rendszert aktiválják, a hipotalamuszban végzıdık endokrin választ váltanak ki.

14

Az ötödik pályának a fájdalom központi gátlásában van szerepe. A felszálló pálya a hátsó

szarvból közvetlenül a középagy substancia grisea centralisába fut, ahol enkefalin, dinorfin, β-

endorfin és szerotonin tartalmú idegsejtek foglalnak helyet. Az innen visszainduló, a

nyúltvelın keresztülmenı és a hátsó szarvi gátló interneuronokig leszálló pályák vesznek

részt a fájdalom supraspinális gátlásában. A fájdalom centrális gátlása végeredményben

ugyanazokon a hátsó szarvi gátló interneuronokon valósul meg, mint a perifériás

fájdalomcsillapítás. A leszálló rendszer pályája két irányba fut (5. ábra). Az enkefalintartalmú

rostok leszállnak a nyúltvelıbe, ahol

GABAerg interneuronokon végzıdnek,

gátolják azok (gátló)mőködését. A

GABA sejtek a ventrális nyúltvelı

szerotonin, subtance-P és thyreotrop-

releasing hormon tartalmú sejteire

fejtenek ki tónikus gátlást. Fájdalom

esetén a középagyban felszabaduló

enkefalin gátolja a GABA sejteket,

melyeknek gátló hatása alól felszabaduló

5HT-SP-TRH neuronok serkentı hatást

továbbítanak a hátsó szarv enkefalin tartalmú gátló interneuronjaihoz, melyek gátolják a

fájdalomingert felfelé továbbító hátsó szarvi projekciós neuronokat. A leszálló rendszer másik

pályáján dinorfin tartalmú rostok szállnak le a nyúltvelıbe, ahol noradrenerg sejtekbe

végzıdnek. A noradrenerg sejtek axonjai kapcsolatba kerülnek a hátsó szarv gátló

interneuronjaival, aktiválják azokat, gátolva a projekciós neuronok fájdalomtovábbító

képességét.

2.1.3. Receptorok, ioncsatornák és mediátorok a gerincvelı hátsó szarvában

A 6. ábrán a gerincvelı hátsó szarvában megvalósuló perifériás és centrális

fájdalomszabályozás fıbb receptoriális és molekuláris történései láthatók. A nociceptív

afferensek végzıdésein fájdalom inger hatására nagymennyiségő glutaminsav és substance-P

szabadul fel. Ezeket a mediátorokat a posztszinaptikus projekciós neuronok megfelelı

glutaminsav illetve NK-1 receptorai fogadják. Az ábrán látható módon a felszálló pálya

GABAerg és glicinerg inhibíciós interneuronjai, valamint a leszálló pálya noradrenerg

neuronjai képesek a fájdalomingert gátolni. A fent leírt folyamatokat kiegészíti, hogy az

idegrendszer immunrendszerének legfontosabb eleme, a mikroglia különbözı gyulladásos

5. ábra: A fájdalominger supraspinális gátlása Dy=dinorfin-; és ENK=enkefalin-tartalmú idegsejtek a substantia grisea centralisban (SGC); NE=noradrenalin; 5HT-SP-TRH=szerotonin-substanceP-thyreotrop releasing hormon-tartalmú idegsejtek a nyúltvelõ rostroventrális részében

15

mediátorokat, citokineket, kemokineket bocsát ki, melyek szintén jelentıs szerepet játszanak

a fájdalom kialakulásában. Perifériás idegsérülés és gyulladás aktiválja a gerincvelı hátsó

szarvában lévı mikrogliát, aminek hatására vegyes, gyulladásos-neuropátiás fájdalom alakul

ki. Az egyik legfontosabb kemokin az MCP-1 csak a sérült idegben segíti elı az akciós

potenciál kialakulását, ráadásul képes gátolni a GABA neuronok gátló szignáljait.23 Ily

módon a centrális szenzitibilitás kialakulásában az idegsejtek és a mikroglia közötti MCP-1

mediált párbeszéd is közrejátszik.

6. ábra. Serkentı és gátló ideghálózatok receptoriális kapcsolatai a gerincvelı hátsó szarvában.

2.2. Glutaminsav receptorok

2.2.1. Nem-NMDA glutaminsav receptorok és élettani jelentıségük

A központi idegrendszer fı serkentı transzmittere a glutaminsav, receptorai minden agyi és

gerincvelıi neuronon megtalálhatók.17 Két fı típusát különböztetjük meg, metabotróp és

ionotróp receptorokat. A metabotróp receptorok aktivitásukat G fehérjéken keresztül fejtik ki,

16

családjuk három csoportból áll. Az I. csoport (mGluR1, mGluR5) ingerlése a foszfolipáz C-

IP3 jelátviteli utat aktiválja. Az endoplazmatikus retikulum Ca2+ csatornáinak nyitásával

növelik a citoszol Ca2+ koncentrációját. A II. (mGluR2, 3) és III. csoport (mGluR4, 6, 7, 8) tagjai

az adenil cikláz enzim gátlásával csökkentik a cAMP szintézisét. A három altípusba sorolható

ionotróp glutaminsav receptorokat erıs exogén agonistáik alapján nevezték el : NMDA (N-

metil-D-aszparaginsav), kainsav és AMPA (alfa-amino-3-hidroxi-5-metil-izoxazolpropion-

sav). Minhárom receptor glutaminsav receptor és ioncsatorna is egyben (7. ábra).

7. ábra. Glutaminsav receptorok osztályozása filogenetikai fa alapján.25

Szerkezetük közös jellemzıje, hogy négy alegységbıl felépőlı hetero-tetramerek. Az egyes

alegységek három transzmembrán régiót és egy a membránon teljesen át nem menı, a citoszol

felé vissza-kanyarodó régiót tartalmaznak. Nélkülözhetetlenek a szinaptikus plaszticitásban,

több posztszinap-tikus membrán szinaptikus transz-missziójában. Az AMPA receptoroknak

négy altípusát különböz-tetik meg (GluR1-4). Az aktivált AMPA receptorok K+, Na+, kisebb

mértékben Ca2+ ionokra permeábilisak. A GluR2 alegység tartalmú receptorok Ca2+ ionokra

nem permeábilisak, így védve a sejteket a túlzott Ca2+ ion beáramlásból adódó

citotoxicitástól.24 Az AMPA receptorok gyors szinaptikus ingerületátvitelt tesznek lehetıvé.

17

Aktivációjuk és deaktivációjuk gyors és rövid idejő (< 1msec). Tartós agonista jelenlét a

receptor deszenzitizációját okozhatja.26 A kainsav receptorok fıként K+ és Na+ ionokra

permeábilisak, Ca2+ ionokra kevésbé. Ioncsatornájának nyitása és zárása az AMPA

receptoréhoz hasonlóan gyors és rövid idejő. A kainsav receptorok kis affinitású GluR5-7 és

nagy affinitású KA1-2 alegységekbıl épülhetnek fel. Elıbbiek elsısorban a dominsav exogén

agonistára specifikusabbak, míg az utóbbiak a kainsavra. Az AMPA receptorral ellentétben

kevésbé a szinaptikus jelátvitelért, mint inkább a szinaptikus plaszticitásért felelısek. Fıleg

preszinaptikusan fordulnak elı, neurotranszmitterek kibocsátását szabályozzák.27

2.2.2. NMDA receptorok élettani jelentısége28

Az NMDA receptor a központi idegrendszer leggyakoribb glutaminsavfüggı ioncsatornája.

Számos neurológiai betegségben szerepet játszik, ezért intenzíven kutatott, jól jellemzett

terápiás célpont.

Az NMDA receptor, két olyan fontos, a többi ionotróp glutaminsav receptortól eltérı

sajátsággal rendelkezik melyek alapvetıen meghatározzák farmakológiai és funkcionális

tulajdonságait. Az NMDA receptor-ioncsatorna aktivációja az agonista glutaminsavra

lassabban következik be, mivel az ioncsatorna a nyugalmi membránpotenciálon Mg2+ ionok

által blokkolt. Depolarizáció hatására ez a feszültségfüggı blokád megszőnik az ioncsatorna

maximális aktivitását eredményezve.29 Fontos tulajdonsága, hogy különösen nagy

áteresztıképességő Ca2+ ionokra, így a legjobb Ca2+ vezetıképességgel rendelkezik. A

csatorna nyitvatartási idıtartama is nagy, akár több száz msec is lehet. E tulajdonságai miatt

az NMDA receptorok fiziológiás körülmények között fontos szerepet játszanak a szinaptikus

plaszticitás jelenségeiben (idegsejtek migrációja, túlélése, szinaptikus kapcsolatok kialakítása,

fenntartása) és a szinaptikus jelátvitel tartós serkentésében (LTP), melyek fontos elemei a

tanulás és a hosszútávú memória mechanizmusának.30 Az NMDA receptoroknak patológiás

állapotokban is kulcsszerepet tulajdonítanak. Különbözı neurodegeneratív betegségek

mechanizmusának végsı közös eleme a glutamáterg rendszer kóros túlmőködése. Akut

rendellenességek pl. stroke, agyi, gerincvelıi iszkémia vagy epilepsziás roham során az

idegsejtek környezetében a glutaminsav koncentrációja megnı, ami elsısorban az NMDA

receptorok hiperaktivitását váltja ki. Az idegsejtekbe a receptor-ioncsatornán keresztül túlzott

mértékben beáramló Ca2+ ionok az idegsejtek károsodásához és pusztulásához vezetı

biokémiai folyamatokat indítanak be.31 Krónikus betegségek, pl. Parkinson kór, Alzheimer

kór, skizofrénia, krónikus fájdalom esetén is hasonló excitotoxikus állapotok alakulhatnak ki,

18

ezért az NMDA receptorok a neuroprotekció mellett ezen betegségek kiemelkedı molekuláris

célpontjaivá is váltak.

2.2.3. NMDA receptorok felépítése és mőködése

Az N-metil-D-aszparaginsav receptor heteromer alegységekbıl álló tetramer felépítéső

receptor. Kutatásunk kezdetekor még két fajta alegységet azonosítottak, az NR1 és NR2

alegységeket. Késıbb számoltak be az NR3 alegység létezésérıl.31 Az NR1 alegységnek egy

gén által kódolt egy izoformája létezik. Az alegységnek 3 exon eltérı expressziója révén 8

splice variánsa (1-4a, 1-4b) lehetséges, leggyakoribb ezek közül az 1a. Az NR2 alegységnek

négy különbözı gén által kódolt altípusa NR2A, NR2B, NR2C, NR2D van (8. ábra).25 Az

emlısök központi idegrendszerében lévı NMDA receptorban az NR1 alegység mellett

legalább az egyik NR2 alegység altípusnak jelen kell lennie, hogy a receptor mőködıképes

legyen.32

8. ábra. Az NMDA receptor NR1/NR2B heterotetramer formája a módosító kötıhelyekkel.28

Mindegyik alegység három hidrofób transzmembrán régióból (I, III, IV) és a membránban a

citoszol felé hajtőkanyarszerően visszakanyarodó régióból (II) áll. Az ioncsatorna pórusát ez

utóbbi (II) szegmens alkotja. A fehérje extracelluláris N-terminálisán többféle specifikus

affinitással rendelkezı kötıhely, míg az intracelluláris C-terminálisán a receptor

mőködésének sejten belüli szabályozásában résztvevı foszforilációs helyek találhatók. Az

ioncsatorna pórusa Mg2+ ion által blokkolt, depolarizálódás hatására ez a tónikus blokk

megszőnik. A receptor aktiválódásához még két ko-agonista, a glicin és a glutaminsav

19

egyidejő kötése is szükséges, ekkor az ioncsatorna Na+, K+, és Ca2+ ionokra permeábilis lesz.

Az NR1NR2 összetételő receptorokban glicin kötıhelye az NR1 alegység N terminálisán, míg

a ko-agonista glutaminsav kötıhelye az NR2 alegységek N-terminális részén helyezkednek el.

Az agonista kötıhelyeken kívül az NR2 alegységek több allosztérikus modulátor és

antagonista kötıhelyet is tartalmaznak. A különbözı NR2 alegységösszetételő receptorok

eltérı érzékenységgel és farmakológiai profillal viszonyulnak a különféle modulátorokhoz. A

Zn2+ ionok az N terminálison lévı kötıhelyükhöz kapcsolódva feszültségfüggetlen módon az

NR2A tartalmú receptorokat antagonizálják. Nagyobb koncentrációban feszültségfüggı

mechanizmus szerint az ioncsatorna Mg2+ kötıhelyéhez kapcsolódva már az NR2B tartalmú

receptorokat is gátolja. Feszültségfüggetlen módon befolyásolja a receptor mőködését a

környezetében lévı pH és redoxpotenciál is. A pH bázikus irányba történı kismértékő

eltolása vagy redukáló hatású környezet a receptor aktivitását fokozza míg, a pH kismértékő

savas irányban történı eltolása vagy oxidáló hatású környezet a receptor aktivitását gátolja.33

Endogén poliaminok, pl. a spermin és spermidin az NR2B és NR2A alegységeken lévı

poliamin kötıhelyhez kapcsolódva alacsony koncentrációban, feszültségfüggetlen

mechanizmussal fokozzák a receptorok aktivitását. NR2B alegységtartalmú receptorok

esetében az endogén és exogén poliaminok a csatorna nyitvatartási frekvenciájának

növelésével serkentik a receptor mőködését. NR2A alegységtartalmú receptoroknál a

poliaminok közvetve, a glicin affinitásának növelésével fokozzák a receptor aktivitását. Míg

magasabb koncentrációban vélhetıen az ioncsatorna Mg2+ kötıhelyéhez kapcsolódva

feszültségfüggı módon mindkét alegységtartalmú receptor mőködését antagonizálják.25 Az

1980-as évek végén fedezték fel, hogy az amúgy neuroprotektív és értágító hatású alfa-

adrenerg antagonista ifenprodil sperminszenzitiv módon blokkolja az NMDA receptort, így

vélhetıen kapcsolódik a poliamin kötıhelyhez. Késıbb igazolták, hogy az ifenprodil nem a

poliamin kötıhelyhez, hanem tıle független helyhez, az NR2B alegységen megtaláható, róla

ifenprodil kötıhelynek nevezett aktív helyhez kapcsolódik. Az ifenprodil kötıhely

allosztérikus kölcsönhatásban áll a poliamin kötıhellyel és a glicin kötıhellyel.34 A nyitott

ioncsatorna belsejében lévı csatornablokkoló helyhez használatfüggı módon („use-

dependence”, azaz gátló hatásuk az agonista koncentrációjának növekedésével fokozódik)

nemkompetitív antagonisták kötıdhetnek. Ezt az aktív helyet a hozzá nagy affinitással kötıdı

1-(1-fenil-ciklohexil)piperidinrıl PCP-kötıhelynek nevezzük. A PCP kötıhelyhez kis

affinitású vegyületek (pl. a memantin) is kapcsolódnak. Az újonnan felfedezett NR3

alegységnek két altípusa ismert az NR3A, és NR3B. Az NR1/NR3A és NR1/NR3B

receptorokra jellemzı, hogy glutaminsavra érzéketlenek, glicin hatására aktiválódnak.

20

Csökkentik az ioncsatorna vezetıképességét, a Ca2+ ionokat nem engedik át és a Mg2+ ionok

sem blokkolják a csatorna pórusát. A csatorna nem kompetitív antagonistái (MK-801,

memantin) nem gátolják a receptor mőködését.35 A glicin mindkét alegységhez kötıdik, az

NR3A alegységhez azonban nagyságrendekkel nagyobb affinitással vonzódik, mint az NR1

alegységhez. Ezért NR3 nagy affinitású glicin kötıhelyet és NR1 kis-affinitású glicin

kötıhelyet különböztünk meg. Az NR3A alegységtartalmú receptorok farmakológiai

jelentısége még kevéssé ismert, de tekintve a glicin hozzá való kötıdésének szelektivitását

egy NR3A szelektív kompetitív antagonista vagy allosztérikus inhibitor terápiásan értékes

lehet.28

2.2.4. Az NMDA receptorok expressziója

Az NMDA receptor alegységek térben és idıben eltérı génexpressziós mintázatot mutatnak.

In situ hibridizációs technikával bizonyították, hogy rágcsálók agyában leggyakrabban az

NR1 alegység fordul elı.36 NR2 alegységek közül az NR2A altípus expresszálódik a

legnagyobb mértékben, fıként az agykéregben, hippokampuszban, a kisagy kérgében és a

szaglószervi gumókban fordul elı. NR2B alegység leginkább az agykéregben, kisebb

mértékben a köztiagyban és az agytörzsben figyelhetı meg. NR2C alegység elsısorban a

kisagykéreg szemcsesejtjeiben expresszálódik, az NR2D alegység a köztiagy és az agytörzs

régiójában figyelhetı meg.30

Az egyedfejlıdés során az egyes alegységek idıbeli megjelenése jelentısen eltér. Míg az NR1

alegység folyamatosan jelen van, az NR2 alegységek expressziója folyamatosan változik.

Patkány embrionális agyban fıként az NR2B kisebb részben NR2D alegység van jelen.

NR2B alegység az egész agyban kifejezıdik, NR2D alegység csak a köztiagyban és az

agykéregben található meg. Embrionális stádiumban NR2A és NR2C alegység nem

expresszálódik, születés után jelennek meg különbözı agyterületeken. Az alegységek

expressziójának idıbeli változása és agyi régiók szerinti megoszlása az alegységek különbözı

funkciójára utalnak.

2.3. Az NMDA receptorok mint terápiás célpontok

A 2.1.1. fejezetben leírt betegségek neuropátiás fájdalomkomponensének patomechanizmusa

az NMDA receptorok kóros túlmőködésével hozhatók összefüggésbe, ezért a receptor

mőködését gátló anyagok alkalmazásával valószínőleg csökkenthetık, megállíthatók a fenti

kórfolyamatok. Az NMDA receptorok blokkolásának lehetséges célpontjai a 2.2.3. fejezetben

számbavett valamennyi kötıhely:

21

- agonista kötıhelyek: glicin, glutaminsav

- ioncsatorna pórusa

- allosztérikus modulátor régiók (poliamin kötıhely, ifenprodil kötıhely, Zn2+ kötıhely, pH

és redox érzékeny régió)

A felsorolt kötıhelyek terápiás felhasználhatósága eltérı, ezért csak a gyógyszerkutatás által

ígéretesnek tartott célpontokat és azok gátló szereit ismertetem.28

2.3.1. Glicin antagonisták

Az NR1NR2 összetételő receptorokban a glicin kötıhely az NR1 alegységen helyezkedik el,

de a glicin és a glicin agonisták receptorhoz való affinitását az NR2 alegységek is

befolyásolják. A glicin és glicin agonisták legkevésbé az NR2A, leginkább az NR2B

alegységet tartalmazó receptorokhoz kötıdnek. Így a glicin antagonisták is az NR2B

alegységet tartalmazó receptorokon fejtik ki leginkább gátló hatásukat. A glicin kötıhely

egyetlen ismert endogén antagonistája a triptofán egyik metabolikus terméke, a kinurénsav.

Neuroprotektív hatása és a fájdalomcsillapításban betöltött szerepe közismert, hatástartama

gyors kiürülése miatt azonban rövid. A triptofán két különbözı metabolikus úton, két

ellentétes hatású anyaggá, kinurénsavvá és az NMDA agonista kvinolinsavvá alakul.37 A

kutatások elsı idıszakában a kompetitív lebomlási útvonal enziminhibitorokkal való

gátlásával próbálták növelni az endogén kinurénsav koncentrációját. Az elképzelés nem

váltotta be a hozzá főzött reményeket, exogén antagonisták hatékonyabbnak bizonyultak. Elsı

képviselıjük az 5,7-diklór-kinurénsav volt (DCKA). A Glaxo egy 4,6-diklórindol-2-

karbonsav-származékot (GV-150526A), a CoCensys a Novartissal együttmőködve egy 6,7-

diklór-kinoxalin-származékot (ACEA-1021) fejlesztett neuroprotektív indikációval, de a

klinikai vizsgálatok III. fázisában megbuktak. A sikeres állatkísérletes eredmények ellenére

emberben a placebóval összehasonlítva nem voltak kellıképpen hatásosak.

N

O

O

OH

HN

O

O

OH

Cl

ClH H

N

O

OHCl

Cl

O

NH

N

N O

O

NO2

Cl

Cl

H

HN

O

O

OH

OH

kinurénsav kvinolinsav DCKA GV-150526A ACEA-1021

22

Több nagy gyógyszergyár is bekapcsolódott a glicin antagonisták kutatásába de egy idı után

valamennyien abbahagyták a hasonló vegyületek fejlesztését.

2.3.2. Glutaminsav antagonisták (kompetitív NMDA receptor antagonisták)

Az NR2 alegység glutaminsav kötıhelyén ható kompetitív antagonisták szerkezete a

glutatminsavból vezethetı le. A glutaminsav távolabbi karboxil csoportját foszfonsav csoport

helyettesíti. A molekulák a glutaminsavtól általában néhány metiléncsoporttal hosszabbak (D-

AP5). Merevebb szerkezető származékokkal nagyobb aktivitást és szelektivitást értek el. A

legelırehaladottabb munka a Novartis selfotel és az SDZ-EAA-494 jelő vegyületével folyt,

stroke és traumás agysérülés indikációval klinikai vizsgálatokat is folytattak.

O

OH

P

O

OH

OH

H2N

O

OH

P

O

OH

OH

NH

N

O

OHN

P

O

OH

OH

HO

OH

O

H2N

HO

glutaminsav D-AP5 selfotel SDZ-EAA-494

2.3.3. NMDA csatorna blokkolók (nem kompetitív NMDA receptor antagonisták)

Az NMDA csatorna blokkolók nem kompetitív antagonisták, nem a glutaminsav

kötıhelyéhez kapcsolódnak. A nyitott csatornában használatfüggı módon (use dependence)

alakít ki blokádot. Kis és nagy affinitású képviselıiket különböztetjük meg. A kis-közepes

affinitású vegyületek (pl. ketamin, dextrometorfan, memantin) gyors blokkoló kinetiájuknak

és erıs feszültségfüggésüknek köszönhetıen általában jobb terápiás mutatókkal rendelkeznek

mint a nagy affinitású, ám lassú kinetikájú csatorna blokkolók (pl. PCP, MK-801, aptiganel).

A kis affinitású, gyors kinetikával rendelkezı vegyületek egy fiziológiai aktiváció átmenete

alatt gyorsan elhagyják az ioncsatornát millimoláris szinaptikus glutaminsav koncentráció

mellett is, míg patológiás körülmények között, már a mikromoláris glutaminsav koncentráció

hatására kialakuló folyamatos aktivációt is blokkolják.

NH2

H3C CH3

N

CH3O

CH3

H

Cl

HN

O

CH3

ketamin dextrometorfan memantin

23

N

CH3

NHN N

NH

CH3

CH3H

PCP (+)-MK-801 aptiganel

2.3.4. NR2B szelektív NMDA antagonisták

2.3.4.1. Ifenprodil típusú NR2B szelektív NMDA antagonisták38

Az elsıként azonosított NR2B altípus szelektív NMDA anatagonista hatású molekula az

ifenprodil volt. Az ifenprodil (4-[2-(4-benzil-piperidin-1-il)-1-hidroxi-propil]-fenol) tartarát

sója piacon lévı vérnyomáscsökkentık hatóanyaga (Cerocral, Dilvax, Vadilex).39 Az 1973-

ban forgalomba kerülı ifenprodilt α-1 adrenoceptor antagonista hatása alapján fejlesztették a

Synthelabo kutatói.40 Késıbb kiderült, hogy vegyes profilú, számos receptor és ioncsatorna,

többek között az NMDA receptor mőködését is gátolja.41 Nem sokkal ezután kimutatták, hogy

az ifenprodil nem kompetitív, NR2B altípus szelektív antagonistája az NMDA receptornak.42

Az ezen a területen megindult kutatásokban leggyakrabban az ifenprodilt választották

kiindulópontként, aminek eredményeként számos hatásos, hozzá hasonló farmakofórral

rendelkezı molekulát és vegyületcsaládot fedeztek fel.43-45 A Pfizer kutatói megvizsgálták a

két aszimmetriacentrumot tartalmazó ifenprodil sztereoizomer formáinak eltérı aktivitását.46

Az α-1 adrenerg affinitás meghatározásához a standard [3H]-prazozin kötıdési tesztet

használták. Az NMDA antagonizmust egy funkcionális teszt eredményével jellemezték,

melynek során glutaminsav-indukált sejthalál gátlásának mértékét határozták meg patkány

hipokampális neuronok primer tenyészetében (CC). Az eredmények azt mutatták, hogy a (+)-

treo-ifenprodil hatásosabb a CC tesztben, mint a (+)-eritro-ifenprodil, ugyanakkor kisebb az

α-1 adrenoceptorhoz való affinitása.

HO

OH

CH3

N

HO

OH

CH3

N

(+)-eritro-ifenprodil (+)-treo-ifenprodil CC-IC50: 263 nM CC-IC50: 55 nM α-1-IC50: 100 nM α-1-IC50: 843 nM

A (+)-eritro-ifenprodilt kivéve izolálták és megvizsgálták az egyes diasztereomereket is. Azt

találták, hogy a legnagyobb NMDA antagonista hatása a (-)-treo-ifenprodilnak van, amely α-

24

1 receptorokhoz képest kb. ötvenszeres szelektivitással rendelkezik (CC-IC50: 13,3 nM; α-1-

IC50: 629 nM). Az ifenprodilból kiinduló kutatások alapvetı törekvése az NMDA antagonista

hatás erısítése mellett az α-1 receptorokhoz való affinitás csökkentése volt. Érdekes módon

ezt az elvet, miszerint a több támadáspontú szereket szelektívvé lehet tenni, többek között

úgy, hogy a fıhatás kitervezésével egy mellékhatást erısítünk fel új fıhatásnak, csak a

közelmúltban fogalmazták meg mint lehetséges stratégiát (selective optimization of side

activities = SOSA).47 Szerkezet-hatás összefüggések (SAR) felderítése céljából a Pfizer

kutatói ifenprodilszármazékokat állítottak elı. Az ifenprodilon véghezvitt módosításaik

gyengébb NMDA antagonistákat eredményeztek, ráadásul az NMDA és az α-1 receptorokon

való aktivitáskülönbség sem javult a (-)-treo-ifenprodilhoz képest. A baloldali benzolgyőrő

hidroxilcsoportjának hiánya (1) jelentısen csökkentette mindkét teszten az aktivitást, míg a

piperidingyőrő 4-es helyzetében lévı benzilcsoport elhagyása mindkét receptoriális hatás

teljes eltőnésével járt (2). A 3-as vegyület eredményei jelzik, hogy bár az alkil összekötı

láncnak jelentıs szerepe van, a rajta lévı benzil-helyzető hidroxilcsoport jelenléte nem

elengedhetetlen egyik hatás szempontjából sem.

OH

CH3

N

HO

OH

CH3

N

HOCH3

N

1 2 3 CC-IC50: 3700 nM CC-IC50: >10000 nM CC-IC50: 153 nM α-1-IC50: 3400 nM α-1-IC50: >10000 nM α-1-IC50: 130 nM

A Synthélabo Recherche kutatói az ifenprodil sztereoizomerek NMDA receptor

alegységszelektivitását vizsgálták. Az egyes antipódok inhibíciós képességét NR1a/NR2A és

NR1a/NR2B alegységeket tartalmazó rekombináns NMDA receptorokat expresszáló Xenopus

oocytában határozták meg patch-clamp technikával.48 Méréseik szerint mind a négy

sztereoizomer jóval hatásosabb antagonistája az NR1a/NR2B alegységet tartalmazó

receptornak (IC50: < 0,8 µM), mint az NR1a/NR2A receptornak (IC50: > 100 µM). Az

NR1a/NR2B receptoron a (+) eritro- és (-)-treo-ifenprodil (IC50: 0,21 µM és 0,22 µM)

négyszer potensebb volt mint a (-)-eritro- és (+)-treo-ifenprodil (IC50: 0,81 µM és 0,76 µM).

Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az ifenprodil sztereoizomerjei bár kismértékő, de

szignifikáns sztereoszelektivitási különbséget mutatnak az NR1a/NR2B receptorokon.

25

A Pfízer egy további módosítása igen értékes szerkezet-hatás összefüggésre derített fényt.49

Felfedezték, hogy a piperidin 4-es helyzetében lévı hidroxilcsoport az α-1 adrenoceptor

affinitást megszünteti, az NMDA aktivitást azonban nem befolyásolja (4).

OH

CH3

N

OH

HO 4

CC-IC50: 58 nM α-1-IC50: >10000 nM

A piperidingyőrő négyes helyzete és a jobboldali benzolgyőrő közötti alkil lánc hosszának a

változtatásása (mind a rövidítése (5), mind a hosszabbítása (6)) növelte mindkét receptorhoz

való affinitást. További hosszabbítás kevésbé aktív vegyületeket eredményezett. Optimális

szelektivitás az 5-ös vegyület esetében figyelhetı meg.

OH

CH3

N

OH

HO

OH

CH3

N

OH

HO 5 6

CC-IC50: 10,2 nM CC-IC50: 1,3 nM α-1-IC50: 5700 nM α-1-IC50: 137 nM

Ennek két sztereoizomerje közül jobb szelektivitása alapján a balra forgató sztereoizomert

CP-101,606 (traxoprodil) néven, mint centrális és perifériás neuropátiás fájdalom

csillapítására alkalmas anyagot klinikai vizsgálatok céljából kiválasztották.50

OH

CH3

N

OH

HO

(1S,2S)

CP-101,606

CC-IC50: 11 nM α-1-IC50: 19520 nM

A piperidin négyes helyzetében lévı benzolgyőrő szubsztitúciója (F, Cl, Me) nem növelte

jelentısen az aktivitást. A baloldali benzolgyőrő és az alkillánc metilcsoportjának

oxigénatommal történı összekapcsolása krománszármazékokat eredményez. Ezzel a

módosítással eltőnt az adrenerg receptorhoz való affinitás. Az ily módon merevített szerkezet

leghatásosabb képviselıjének (7, balraforgató enantiomer) hatása és szelektivitása

összemérhetı a CP-101,606 vegyületével.51

26

OH

N

OH

HO O

F

7

CC-IC50: 58 nM

Az eddigi adatok alapján a következıképpen összegezhetık az ifenprodil típusú NMDA

antagonisták farmakofór jellemzıi: két benzolgyőrőt egy meghatározott hosszúságú lánc köt

össze. Az egyik benzolgyőrőn egy hidroxilcsoport jelenléte szükséges. Bár az összekötı lánc

szubsztituenseit és azok sztereokémiáját részletesen vizsgálták, egyértelmő következtetés nem

vonható le az eredményekbıl.

A Merck KGaA kutatói kiemelt vegyületük (8, EMD 95885) és az ifenprodil összehasonlító

receptor kötıdési adatait tették közzé egyik tanulmányukban.52 Patkány cortexben

radioligandként [3H]-ifenprodilt használva 8 vegyület nagyobb affinitással kötıdött az

ifenprodil kötıhelyhez (IC50: 3,9 nM), mint maga az ifenprodil (IC50: 23,3 nM).

O

NO

O

NF

H

8

Mint késıbb kiderült ez a vegyület fontos mérföldkı volt az ifenprodil farmakofór

fejlıdésében. Megmutatta, hogy nem szükséges királis szénatom jelenléte az összekötı

láncban. A vegyületnek gyenge az affinitása az α-1 adrenoceptorhoz (IC50: 332 nM).38

Ráadásul az eddig alkalmazott fenolos hidroxilcsoportot sikerült helyettesíteni a

metabolikusan stabilabb, hasonlóan hidrogénkötés donor tulajdonságú NH-csoportot

tartalmazó benzoxazolinon győrővel. Ez a vegyület olyan 1-szubsztituált benzil-piperidin

NR2B altípusszelektív NMDA antagonisták prototípusává vált, ahol egy hidrogénkötés

donorcsoportot tartalmazó benzolgyőrő három atom hosszúságú láncon keresztül kapcsolódik

a piperidin nitrogénjéhez .

Az F. Hoffmann-La Roche Ltd. kutatói szintén sok energiát fektettek az ifenprodil típusú

farmakofór fejlesztésébe. Egyik elsı vezérmolekulájuk az ifenprodil homológ 9 (Ro 25-6981,

((1R,2S)-3-(4-benzil-piperidin-1-il)-1-(4-hidroxi-fenil)-2-metil-1-propanol), számos in vitro

és in vivo tesztben jobbnak bizonyult az ifenprodilnál.53 Racém formájának triciált analogonja

az NR2B szelektív NMDA antagonisták azonosítására szolgáló kötıdési teszt leggyakrabban

alkalmazott radioligandja lett.54

27

HO

N

OH

CH3

9

Hasonló aktivitást mutat 10-es számú kiemelt vegyületük (Ro 8-4304). A molekula

hosszúsága megegyezik 9 hosszúságával, de a baloldali benzolgyőrő és a piperidin nitrogénje

között lévı lánc egy oxigén atommal hosszabb, kompenzálva a piperidin 4-es helyzete és a

jobboldali benzolgyőrő közötti metiléncsoport elhagyását. Hasonló affinitással rendelkezik az

NR2B tartalmú NMDA receptorokhoz, mint az ifenprodil, de gyorsabb on/off kinetika

jellemzi.55

O

NH2

O N

F

OH

10

A 9-es vegyület in vitro aktivitása az ifenprodiléhoz hasonló, azonban in vivo

kardiovaszkuláris mellékhatás jelentkezik, amely szignifikáns α-1 adrenoceptor antagonista

hatásával (Ki: 0,18 µM [3H]-prazozin kötıdési tesztben56) állhat összefüggésben. Az NMDA

és az α-1 aktivitás szétválasztását célul kitőzı optimalizálási programjuk kiindulási pontja 9

vezérmolekula volt.57 Kitartó munkájuk eredménye a 11-es vegyület, melynek NR2B

receptorhoz való affinitása nem javult ugyan számottevıen a 9-es vegyülethez képest (Ki: 4,9

nM szemben a 5,6 nM értékkel a [3H]-Ro 25-6981 kötıdési tesztben54), az α-1

adrenoceptorhoz való affinitása azonban jelentısen lecsökkent (Ki: 7,30 µM). A két aktivitás

közötti különbség íly módon történı növelése ebben az esetben is a piperidin 4-es helyzetében

lévı hidroxilcsoport jelenlétével magyarázható.

HO

NCH3

OH

OH

11

További módosítások vezettek a 12 (Ro 63-1908) vegyülethez, melyet kisebb NR2B és α-1

aktivitásbeli különbséget jellemez (IC50: 10 nM a [3H]-Ro 25-6981, és IC50: 3,5 µM a [3H]-

prazozin kötıdési tesztben), de egyéb tulajdonságai miatt részletes in vitro és in vivo

28

vizsgálatoknak vetették alá.58, 59 Sajnos ez a vegyület hatásosan blokkolja a hERG kálium-

csatornát (EC50: 0,6 µM), mely fontos szerepet játszik a szív akciós potenciál repolarizációs

fázisában. Blokkolása QT megnyúlást és szívritmuszavart okoz.60

Az éteres O helyettesítése SO2-csoporttal, továbbá a OH-csoport áthelyezése a piperidin 4-es

helyzetébıl a hármas helyzetbe egy aktívabb és szelektívebb NMDA antagonistát, a 13

vegyületet eredményezte, mely még inkább elkülönítette az NMDA (14 nM) és a hERG (24

µM) aktivitást.61

HO

ON

CH3

OH

HO

SN

CH3O O

OH

12 13

Az ifenprodil típusú farmakofór modell fejlıdéséhez különösen értékes módon járultak hozzá

az University of Oregon, a CoCensys Inc. és a Parke-Davis Pharm. Res. együttmőködı

kutatói. Bebizonyították, hogy a piperidingyőrő és az alkil lánc szubsztitúciója nem feltétele

sem a receptorhoz való kötıdés mértékének, sem a szelektivitásnak. Emellett ık írták le az

elsı farmakofór modellt. Az ifenprodilból és tercier helyett szekunder amint tartalmazó

analogonjából, a nylidrinbıl kiindulva állapították meg a hatás szempontjából kritikus

részeket (9. ábra). Klónozott patkány NMDA receptor alegységek bináris kombinációit

(NR1a-NR2A, NR1a-NR2B, NR1a-NR2C) expresszáló Xenopus oocytákban vizsgálták az

aktivitást és a szelektivitást.62 Az alkoholos hidroxilcsoportok és a metilcsoportok elhagyása

(14, 15) az IC50 értékek nagyságrendi megváltozását nem eredményezték, jelezve, hogy a lánc

szubsztituálása nem alapvetı követelmény. A 15 származék fenolos hidroxilcsoportjának

elhagyása az ifenprodiltól tízszer gyengébben ható molekulát eredményezett. További

egyszerősítéseket hajtottak végre a molekulákon annak érdekében, hogy meghatározzák mely

elemek szükségesek a hatás szempontjából. Elıállították a piperidingyőrő 3. és 4. szénatomja

közötti kötés felbontásával levezethetı molekulát (17). A győrő felnyitása csak kis mértékben

csökkentette az aktivitást, vagyis a konformációs kényszer megszüntetése nem zárja ki a

szelektív NR2B antagonista hatást. Legaktívabb származékok a szekunder aminok voltak. A

nitrogén atom és a receptor közötti elektrosztatikus kölcsönhatás nagyon fontos, oxigén atom

beépítése a nitrogén helyére (14 → 16) mintegy negyvenszeres aktivitáscsökkenést

eredményezett. Különbözı hosszúságú szénlánc beépítésével változtatták az aromás győrők

és a nitrogén közötti távolságot.

29

OH

OH

CH3

N

OH

OH

CH3

HN

nylidrinIC50: 0,18 µM IC50: 0,11 µM

ifenprodil

OH

HN

OH

N

IC50: 0,20 µMIC50: 0,096 µM

OH

O

IC50: 3,7 µM

OH

N

IC50: 0,008 µM

OH

HN

14 15

16 17

18

IC50: 0,30 µM

Co 101677

OH

OH

CH3

N

OH

OH

CH3

HN

nylidrinIC50: 0,18 µM IC50: 0,11 µM

ifenprodil

OH

HN

OH

N

IC50: 0,20 µMIC50: 0,096 µM

OH

O

IC50: 3,7 µM

OH

N

IC50: 0,008 µM

OH

HN

14 15

16 17

18

IC50: 0,30 µM

Co 101677

9. ábra. NR2B altípusszelektív szubsztituált aminok szerkezet-hatás összefüggései. Mindezek a változtatások olyan, tovább már nem egyszerősíthetı molekulát (18)

eredményeztek, melyrıl közvetlenül le lehet olvasni a farmakofór modell tulajdonságait, a

receptorral való kölcsönhatás minimális követelményeit (10. ábra).

10. ábra. A receptor aktív centrumának az inhibitor kötıdése szempontjából fontos, feltételezett tulajdonságai.61

30

Ezek szerint kellı nagyságú NR2B aktivitást és szelektivitást el lehet érni fenilalkil

csoportokkal helyettesített szekunder aminokkal. Az aromás győrők feltételezhetıen a

receptor egy-egy hidrofób zsebébe illeszkednek, míg a nitrogén elektrosztatikus

kölcsönhatásba lép a receptor megfelelı részével. A fenolos hidroxilcsoport jelenléte az egyik

aromás győrőn esszenciális a hatás szempontjából, vélhetıen hidrogénhidas kötéssel

kapcsolódik a receptor megfelelı részéhez. A fenolos hidroxilcsoport oxigénje és az A győrő

para-helyzető szénatomja közötti optimális távolság 17,5 Å, ami 3 Å-mel rövidebb az

ifenprodil esetében számított értéknél. Ezen belül az oxigén és nitrogén távolsága 7,8 Å.

Az egyszerősítések irányába haladó, egyfajta optimalizáció volt ez a tanulmány, melynek

szerkezet-hatás összefüggései a maximális hatás minimális követelményeit leíró farmakofór

modellt határozták meg. Az optimalizáció mindemellett az abban az idıben a leghatásosabb

NR2B szelektív NMDA antagonista hatású anyagot is szolgáltatta (18). A vegyületcsaládot

szabadalmi bejelentésben nem védték, aminek vélhetıen az volt az oka, hogy bár az NMDA

receptoron szelektíven fejti ki hatását, több más receptoron és ioncsatornán is aktív lehet.

Méréseink szerint a 18 bisz-arilalkil-származék az α-1 és az 5HT2A receptorokon is hat. Ez is

megerısíti azt az általános felfogást, miszerint egy merevebb, kevesebb konformerrel

rendelkezı struktúra specifikusabban viselkedik biológiai rendszerekben.

Ennek a minimalista struktúrának a merevített változatai (19, 20) is hasonlóan aktívak.63

N

HO HO

N

19 20

NR2B-IC50: 17 nM NR2B-IC50: 22 nM

A szerkezet további merevítése (21 és 22) az aktivitás kismértékő csökkenését

eredményezte.64

H

HO

NN HO N

N

H

21 22

NR2B-IC50: 87 nM NR2B-IC50: 50 nM

Bár az University of Oregon, a CoCensys Inc. és a Parke-Davis Pharm. Res. kutatóinak közös

tanulmánya jelentıs elırelépés volt a farmakofór modell fejlıdésében, megfelelıen szelektív,

31

fejleszthetı molekulákat nem eredményezett. Annak ellenére, hogy a modell a 4-benzil-

piperidinnek nem tulajdonít különös jelentıséget, csak mint a benzolgyőrő és a nitrogén

közötti megfelelı távolságot biztosító szerkezetként értékeli, új NR2B szelektív NMDA

antagonisták elıállításakor a 4-benzil-piperidinek a továbbiakban is kedvenc építıelemek

maradtak. Érdekes megjegyezni, hogy a Roche által felfedezett és Ro 63-1908 számon

fejlesztett 12-es számú vegyületet a CoCensys/Parke-Davis kutatói szintén azonosították,

ráadásul védelmére hét hónappal korábban tettek szabadalmi bejelentést (Co 101244/PD

174494).65 Ebben leírják, hogy a kívánt elınyös tulajdonságok az összekötı láncban lévı

sztereocentrumok nélkül is elérhetık.

A 23-as molekulából (Co 101071) kiindulva alternatív hidrogénkötés donor tulajdonságú

csoportokkal, benzimidazolonokkal és hidantoinokkal próbálkoztak.66 Mindkét származék

esetében megvizsgálták a különbözı hosszúságú összekötı láncot tartalmazó homológok

aktivitását. Optimális lánchosszúságú képviselıik alapján elmondható, hogy a

benzimidazolon (24) képes helyettesíteni a fenolt, míg hidantoin (25) nem. Ez újabb

bizonyíték arra, hogy az NR2B receptor aktivitáshoz az aromás győrőre és a hidrogénkötés

donorra is szükség van.

HO

ON

23

NR2B-IC50: 25 nM

N N

NOH

N

NOH

O

N

24 25

NR2B-IC50: 95 nM NR2B-IC50: 1000 nM

Másik közleményükben tioéterekbıl kiinduló hasonló kísérleteikrıl adnak számot.67

Néhány heterociklus és kondenzált heterobiciklus mellett a 27 aminotriazol-származék is

aktívabbnak bizonyult a kiinduló 26 fenolszármazéknál.

HHO

SN

SN

NN

NH2N

26 27

NR2B-IC50: 100 nM NR2B-IC50: 35 nM

A CoCensys Inc. és a Warner-Lambert együttmőködésében elıállított 28-as számú

vegyületben (CI-1041, besonprodil, (+)-6-[2-[4-(4-fluorbenzil)piperidin-1-il]etilszulfinil]-

32

benzoxazol-2(3H)-on) a 8-as számú rokonvegyülethez hasonlóan a benzoxazolon játsza a

fenol szerepét.68

H

SN

O

FO

NO

28

NR2B-IC50: 6,6 nM Kísérleteket végeztek a piperidin és a baloldali benzolgyőrő közötti lánc acetiléncsoporttal

történı merevítésével. A 29-es számú, viszonylag gyenge aktivitású NR2B szelektív

antagonistát egy vegyülettár in vitro szkrínelésekor találták.69

N

29

NR2B-IC50: 4,7 µM

Ahogy várható volt, a baloldali benzolgyőrő kiegészítése hidrogénkötés donor tulajdonságú

csoporttal aktívabb vegyületeket eredményezett. A legaktívabb származékok a 4-hidroxi 30 és

31 analogonok voltak. Sajnos ez a vegyületcsalád az α-1 adrenoceptorok és a dopamin D2

receptorokhoz is affinitást mutatott. A rövidebb, három atom hosszúságú összekötı láncot

tartalmazó 31 származékban válik szét leginkább a fıhatás a mellékhatástól.

N

HOHO

N

30 31

NR2B-IC50: 0,17 µM NR2B-IC50: 0,10 µM α-1-IC50: 0,58 µM; D2-IC50: 0,29 µM α-1-IC50: 1,5 µM; D2-IC50: 1,7 µM

Fenolos hidroxilcsoport helyett heterociklusos fenol bioizosztérek alkalmazásával próbálták

növelni a metabolikus stabilitást.70 A heterobiciklusos származékok közül a benzimidazolinon

(32) volt a legaktívabb, ugyanakkor szelektív és orálisan felszívódó vegyület.

33

H N

N

NO

H 32

NR2B-IC50: 0,0053 µM α-1-IC50: 0,5 µM; D2-IC50: 2,6 µM

A vegyületcsalád további optimalizációja során az NR2B receptorhoz való affinitást [3H]-ifenprodil radioligand kötıdési tesztben határozták meg natív patkány agyat felhasználva.71

H N

N

NO

F

N

N

N

NO

F

H H

H

33 34

IC50: 3 nM IC50: 2 nM

A nagy affinitással és NR2B szelektivitással rendelkezı 33-as vegyület hatékonynak

mutatkozott Parkinson-kór és neuropátiás fájdalom modellekben. A molekula további

módosítása hasonlóan potens vegyületeket eredményezett (pl. 34).

Az University of Oregon, CoCensys, Parke-Davis közös kutatócsoportja azt a további értékes

megfigyelést tette, hogy a bázikus nitrogén jelenléte nem feltétele az NMDA receptor

antagonizmusnak. N-(2-feniletil)-fahéjsavamidokat állítottak elı melyeket NMDA

antagonistaként teszteltek Xenopus oocytában minhárom altípusra (NR1a/2A-C). A 35-ös

vegyület potens és NR2B szelektív antagonistának bizonyult.72

H

HO

N

O

Cl

35

NR2B-IC50: 170 nM

A vegyületcsalád optimalizációja során még aktívabb analogonokat is találtak, például a 36 és

37 vegyületeket.73

HN

O

HO

N

O

HO 36 37

NR2B-IC50: 77 nM NR2B-IC50: 120 nM

Funkcionális tesztben a 36-os vegyület az ifenprodilnál (IC50: 110 nM) potensebbnek

mutatkozott, a (+)-5 (CP-101,606) vegyülettel (IC50: 73 nM) azonos aktivitással bírt. A 37-es

34

vegyület az ifenprodil fejlıdésének új szintjét képviseli. Benzil-piperidin három atom

hosszúságú láncon keresztül kapcsolódik egy fenol négyes helyzetéhez olymódon, hogy a

molekulában lévı nitrogén nem bázikus. A jelentısége ennek a fejleménynek abból a

megfigyelésbıl ered, hogy a bázikus nitrogént tartalmazó természetes ligandumok (pl.

adrenalin, dopamin, szerotonin stb.) receptorai a bázikus nitrogént tartalmazó vegyületeket

részesítik elınyben. A bázikus nitrogén jelenléte sok esetben elıfeltétele a jó affinitásnak

ezekhez a mellékhatásokért felelıs receptorokhoz, vagyis a farmakofór modelljük tartalmazza

a bázikus nitrogént. Ebbıl az következik, hogy ha egy NR2B aktív vegyületcsalád nem

tartalmaz bázikus nitrogént, nagy valószínőséggel kevesebb mellékhatással fog rendelkezni,

mint a bázikus nitrogént tartalmazók.

A Merck Research Laboratories kutatói szintén állítottak elı ifenprodil farmakofórral

rendelkezı molekulákat, eredményeiknek azonban csak egy részét közölték. Vegyülettárukat

tesztelve egy benzimidazol származékot (38) azonosítottak.74 Másik vezérmolekulájukat (39)

egy száztagú benzimidazol könyvtárból azonosították. Egyik molekula sem tartalmaz

hidrogénkötés donorcsoportot a terminális benzolgyőrőkön. Az optimalizáció során a

baloldali benzolgyőrőt kiegészítették hidrogénkötés donorcsoporttal. A vegyületeket NR2B

szelektív kötıdési tesztben és sejt alapú Ca2+ influxot meghatározó funkcionális tesztben75

mérve mindkét vegyületcsaládban nagyon potens képviselıkhöz jutottak.

H

N

NN

N

N

O

H 38 39 NR2B kötıdés Ki: 420 nM; Ca2+-IC50: 710 nM NR2B kötıdés Ki: 260 nM; Ca2+-IC50: 200 nM hERG-IP: 1400 nM; α-1-IC50: 2800 nM hERG-IP: 2000 nM; α-1-IC50: 4200 nM

A legaktívabbak a 40 és 41-es vegyületek voltak, melyek ráadásul jó szelektivitással

rendelkeztek az NMDA receptor NR2A, NR2C és NR2D altípusával, a hERG csatorna

aktivitással és az α-1 adrenerg kötıdéssel szemben. A 41-es vegyület kiválóan aktív volt a

karragén-indukált mechanikai hiperalgézia tesztben patkányban és jó farmakokinetikai

tulajdonságokkal bírt kutyában.

N

NN

HO

F

N

N

ONS

CH3

O O

H

H

H 40 41 NR2B kötıdés Ki: 0,85 nM; Ca2+-IC50: 9,7 nM NR2B kötıdés Ki: 0,68 nM; Ca2+-IC50: 0,72 nM hERG-IP: 2900 nM; α-1-IC50: 730 nM hERG-IP: 120 nM; α-1-IC50: 4000 nM

35

Azt a jelenséget, miszerint a bázikus nitrogén nem feltétele az altípusszelektív NMDA

receptor antagonisták hatásosságának a Merck & Co. Inc. is vizsgálta. A egyik szabadalmi

bejelentésükben 42 és 43 jellemzı példákkal N-benziloxikarbonil-piperidin-származékokat

védenek.76 Biológiai adatokat nem közölnek, saját méréseink szerint77 ezek a vegyületek

hatásos NR2B receptor antagonisták.

H

O

N

N

O

OHO

O

N

N

O

ONO

H

H

42 43 NR2B-IC50: 4,8 nM NR2B-IC50: 6,0 nM

Az irodalom áttekintésével az a következtetés vonható le, hogy az elmúlt tíz évben több

kutatóegység is óriási erıfeszítéseket tett annak érdekében, hogy az ifenprodilt olyan NR2B

altípusszelektív NMDA receptor antagonistává alakítsák, mely más receptorokhoz nem

kötıdik számottevıen. Tanulmányaik alapján a következı megállapítások tehetık az

ifenprodil farmakofór modellt illetıen:

A leghatásosabb szerkezetek két terminális benzolgyőrőt tartalmaznak, melyek közül az egyik

egy metabolikusan stabil hidrogénkötés donorcsoportot visel. A két benzolgyőrőt elınyösen

bázikus csoportot nem tartalmazó, különbözı hosszúságú és heteroatom-tartalmú lánc köti

össze. Ez az összekötı lánc nem egyszerően távtartó, hanem fontos szerepet tölt be a

receptorral való kölcsönhatásban.

Az elmúlt idıszakban számos, az ifenprodil farmakofór modellbe illeszkedı in vitro és in vivo

aktív, orálisan is hatásos, biztonságos vegyület állítottak elı, melyek közül a közeljövıben új

gyógyszer forgalombahozatalát is remélhetjük.

2.3.4.2. Nem ifenprodil típusú NR2B szelektív NMDA antagonisták

Az elmúlt években több, az ifenprodil farmakofór modellbe nem illeszkedı molekulatípust is

azonosítottak. A legtöbb adatot velük kapcsolatban szőkszavú szabadalmi bejelentésekben

tették közzé. Részletes szerkezet-hatás összefüggések ismerete nélkül nehéz egy közös

farmakofór modellt felállítani, ennek ellenére néhány egyedi kivételtıl (pl. fehérjék)

eltekintve több hasonló szerkezeti elem is felfedezhetı ezekben a molekulákban. Nem

tartalmaznak hidrogénkötés donorcsoportot és a legtöbb esetben hiányzik belılük az

ifenprodil típusú NR2B szelektív NMDA antagonistákra korábban jellemzı bázikus nitrogén.

Meglehetısen kompakt molekulák, általában két terminális arilcsoportot tartalmaznak,

36

melyeket egy sokszor győrőbe zárt, merev, rövid lánc köt össze. A legszembetőnıbb közös

szerkezeti elem az amidincsoport, az összes molekula leírható 44 általános képlettel.

N R4

R3N

R2

R1

44

Az elsı NR2B szelektív NMDA antagonista hatású amidin-típusú vegyületcsaládot a Merck

Sharp & Dohme kutatói azonosították. Új vegyületek tesztelése során az E-N1-

(benzil)fahéjsav-amidin (45) jelentıs affinitást mutatott az NR2B-tartalmú receptorokhoz.78

Mivel ez a molekula az ifenprodil farmakofór modelltıl eltérı szerkezető, ezért az NR2B

szelektív NMDA antagonista hatású vegyületek új típusú, reménykeltı jelöltje lehet. Ez a

felismerés egy új gyógyszerkémiai programot indított el a Mercknél. A vegyületcsalád

optimalizációja során legaktívabbnak a 2-metoxi-benzil-származék (46) adódott.

N

NH

HN

NH O

H

45 46 NR2B kötıdés Ki: 9 nM NR2B kötıdés Ki: 0,7 nM

Mivel a molekula sztiril szerkezeti része potenciális Michael akceptor, rögtön megindult az

ezt a lehetıséget kizáró rokon szerkezetek keresése. Így találtak rá a benzil-benzamidin

vegyületcsaládra, amelynek szubsztituálatlan képviselıje (47) hatástalan volt, megfelelıen

helyettesített benzolgyőrőkkel viszont aktív származékokat sikerült elıállítaniuk.79 A

vegyületek aktivitását [3H]-ifenprodil-kötıdési tesztben és teljes sejtes patch-clamp technikán

alapuló funkcionális esszében határozták meg. Funkcionális tesztben leghatásosabb a

benzilcsoport 2-es helyzetében szintén metoxicsoporttal szubsztituált 48 származék volt.

H HN

NH

N

NH O

CF3O

47 48 NR2B kötıdés Ki > 15000 nM NR2B kötıdés Ki: 5,7 nM NR2B funkcionális teszt IC50 : 4,1 nM

A vegyületcsalád aktív tagjai általában jó orális farmakokinetikával rendelkeztek, és a

karragén-indukált hiperalgézia tesztben rágcsálókban hatásosak, ugyanakkor a nemszelektív

NMDA antagonistákra jellemzı lokomotoros mellékhatástól mentesek voltak. A

37

farmakokinetikai paraméterek különösen szubsztituensfüggı jellemzıknek bizonyultak. A

kötıdési teszten legaktívabb 49 származék klóratomjait metilcsoportra cserélve (50) a felezési

idı kevesebb mint negyedére, a biohasznosulás a töredékére csökkent. Ugyanakkor az 51

vegyület trifluormetil-csoportja szokatlan módon 100 %-os biohasznosulást kölcsönzött a

nagyon poláris amidincsoportot tartalmazó molekulának is. A közölt adatok ismét

rávilágítanak arra, hogy a biohasznosulásnak (BA) milyen fontos szerepe van a jó in vivo

hatás elérésében. A funkcionális tesztben közepes hatékonyságú (IC50 : 24 nM), 68 %

biohasznosulást elérı 49 származék a karragén-indukált hiperalgézia tesztben is közepes

hatású (ED50: 16 mg/kg). Az in vitro aktívabb (IC50 : 4,2 nM) de alig felszívódó (BA : 4%) 50

in vivo hatástalan. Míg az in vitro fele olyan aktív 51 a teljes felszívódásának köszönhetıen

kiváló in vivo aktivitással rendelkezik.

H HN

NH

CF3O

Cl

Cl

N

NH CF3

CF3O

HN

NH

CF3O

CH3

CH3 49 50 51 NR2B Ki: 0,6 nM; IC50 : 24 nM NR2B Ki: 1,2 nM; IC50 : 4,2 nM NR2B Ki: 72 nM; IC50 : 47 nM BA: 68 %; T1/2 : 420 perc, BA: 4 %; T1/2 : 92 perc, BA: 100 %; T1/2 : 147 perc ED50: 16 mg/kg ED50: >30 mg/kg ED50: 5,5 mg/kg

Hamarosan a Hoffmann La Roche is jelentkezett egy az amidin szerkezeti elemet rejtetten

tartalmazó molekulacsaláddal. 52 triazolszármazékuk a [3H]-Ro 25-6981 kötıdési tesztben

kiváló affinitást mutatott.80 A vegyületcsaládot jobban megvizsgálva derült ki, hogy a triazol

összekötı elem különbözı heterociklusokkal, pl. piridazinnal (53) vagy imidazollal (54) való

helyettesítése is aktív molekulákat eredményez.81, 82

N

N

N

N

Cl

CH3

H2N

O H3C

NN

N

NH2 NN

N N

Cl

CH3

CH3

H

52 53 54 NR2B kötıdés IC50 : 8,3 nM NR2B kötıdés IC50 : 7 nM NR2B kötıdés IC50 : 1 nM

ON

NHN

ON

NHN

55 56

NR2B kötıdés Ki: 60 nM NR2B kötıdés Ki: 7,5 nM

38

Kiemelkedı in vitro aktivitásaik ellenére a vegyületeket nem fejlesztették tovább.

A Roche kutatói egy [3H]-Ro 25-6981 kötıdési teszten alapuló HTS vizsgálat során egy

NR2B aktív imidazolin származékot azonosítottak (55).83 A vegyületcsalád optimalizálásakor

az egyik kritikus paraméternek a molekulák pKa értékét feltételezve a bázicitást jelentısen

befolyásoló szerkezeti módosításokat is végrehajtottak. Megfigyeléseik alapján fontos, hogy a

vegyület fiziológiai pH-n protonálódjon, ugyanakkor a túlzott bázicitás sem elınyös. A

legaktívabb 56 származék pKa értéke (9,9) az optimálishoz közeli lehet, mind a bázicitás

csökkentése, mind a növelése kevésbé aktív vegyületeket eredményezett. 56 egy

antikonvulzív tulajdonságot vizsgáló egér audiogén roham modellben, i.p. adagolást követıen

elfogadható agyi penetrációt mutatott. Valószínő, hogy egy kedvezı pKa érték nemcsak a

receptorral való kölcsönhatás szempontjából fontos, de befolyásolhatja a sejtmembránokon,

így az vér-agy gáton való átjutást is.

A Roche vegyülettárának [3H]-Ro 25-6981 kötıdési teszt alapú HTS szőrésekor egy 4-

aminokinolin származékot (57) is NR2B szelektív NMDA antagonistaként azonosítottak.84

H H

N

N OH

OH

N

N

N

OH

57 58

NR2B kötıdés Ki: 260 nM NR2B kötıdés Ki: 3,5 nM

A vegyületcsalád optimalizálása során megállapították, hogy a 4-es helyzető aminocsoporthoz

képest vicinális helyzetben legalább egy hidrogénkötés donorcsoport jelenléte szükséges.

Elınyös, ha a C2 helyzetben lévı lipofil aromás győrő nem közvetlenül kapcsolódik a

kinolingyőrőhöz. Valamennyi aktív származék protonálódik fiziológiás pH-n (pKa > 8,4),

valószínősítve, hogy ez a bioaktív forma. A leghatásosabb származékban a kinolingyőrő 2-es

helyzető szénatomja egy 3,4-dihidro-1H-izokinolin nitrogénatomjához kapcsolódik (58). A

vegyület egér audiogén roham modellben i.p. adagolás mellett in vivo is hatékonynak

bizonyult (ED50<12 mg/kg).84,85 A kinolinszármazékok α1 és muszkarin M1 receptorral

szemben mutatott jelentıs affinitása miatt az optimalizációt tovább folytatták. Kinolingyőrő

helyett piridint alkalmazva az NR2B aktivitás megtartása mellett sikerült jelentıs mértékben

növelni az ezekkel a receptorokkal szembeni szelektivitást. Az NR2B receptorokhoz közel

azonos affinitással rendelkezik az 59 4-aminopiridin, a 60 2-aminopiridin, és a mindkét

aminocsoporton szubsztituált 61 származék is.86-88

39

N N

NH2

N

N

NH2

N N

NOH

H

59 60 61 NR2B kötıdés IC50 : 8 nM NR2B kötıdés IC50 : 4 nM NR2B kötıdés IC50 : 4 nM

Többek között a mi, késıbb ismertetett, hasonló vegyületek körében elért eredményeinkre

hivatkozva a Merck kutatói folytatták az amidin típusú molekulákkal korábban megkezdett

munkájukat. Öt, hat és héttagú ciklikus benzamidineket állítottak elı, melyek közül NR2B

aktivitással csak az öttagúak rendelkeztek.89 Korábbi 48 benzamidin-származékuk szerkezetét

kétféleképpen merevítették. Az amidincsoport szubsztituálatlan nitrogénje és a benzilcsoport

alifás szénatomja közzé beépített metiléncsoport 4,5-dihidro-1H-imidazol származékokat

eredményezett. A vegyületcsalád leghatásosabb, egy klóratommal is szubsztituált

származékának (62) az aktivitása elmarad a 48 anyavegyület aktivitásától. A benzamidin

szubsztituált nitrogénje és orto-helyzető szénatomja közé egy metiléncsoport beépítésével

levezethetı izoindolin-1-imin (63) az anyavegyületnél hatásosabbnak bizonyult.

HN

NH OCH3

CF3O CF3O

N

NH OCH3

CF3O

N

N

Cl

CH3O

H

62 48 63 NR2B kötıdés Ki: 75 nM NR2B kötıdés Ki: 5,7 nM NR2B kötıdés Ki: 3,6 nM

A vegyület viszonylag gyenge farmakokinetikai sajátságokkal bír: 5 % biohasznosulás, 2 óra

plazma féléletidı, 215 nM cmax. Orálisan aktív, a karragén-indukált hiperalgézia tesztben

meghatározott ED50 értéke 20 mg/kg. Ennél a dózisnál 50 %-os hiperalgézia válasz

csökkenést eredményezett a kontrollhoz képest.

A Merck ezeken kívül több 64 reprezentatív molekulával jellemezhetı iminopirimidin

származékot védett szabadalmi bejelentésben.90

N N

NH

64

40

3. KÍSÉRLETI MODELLEK, VIZSGÁLATI MÓDSZEREK

3.1 Farmakológiai szőrırendszer

Az elıállított vegyületek biológiai hatását gondosan összeválogatott, egymásra épülı

tesztsorozatban vizsgáltuk. Ez a kaszkádszerően felépített farmakológiai szőrırendszer négy

jól elkülönülı részbıl állt. Egyik lépcsıbıl a következıbe csak az elıre felállított

kritériumoknak megfelelı vegyületek juthattak át. A projekt négy éves idıtartama alatt a

kaszkádrendszer számos pontját megváltoztattuk. Menet közben új módszereket fejlesztettünk

ki, az egyes teszteket átrangsoroltuk, legtöbbször a szelekciós kritériumokat módosítottuk.

Eredményeinket, lehetıségeinket és a szők keresztmetszeteket figyelembe véve szigorítottuk,

vagy lazítottuk a továbbjutás feltételeit. Az 11. ábrán tesztrendszerünk egy jellemzı állapotát

mutatom be.

NMDA antagonizmus

1. lépcsı IC50 < 25 nM

In vitro metabolizmus

Szelektivitás >100

4. lépcsı

Farmakokinetika (PK) orális biohasznosulás (BA) (patkány)

Orális hatás neuropátiás fájdalom modellben ED50

QT megnyúlás nyúl szíven

BA > 20% 3. lépcsı

2. lépcsı >100 x szelektivitás, stabilitás (FM > 70 %)

Orális ED50 < 5 mg/kg

Egér formalin teszt Egyszeri 10 mg/kg dózis, Inh > 60 % →ED50

Irwin teszt egérben – minimális effektív dózis (MED) p.o.

Mellékhatást, szelektivitást feltérképezı tesztek

α, 5ΗΤ2Α, NR2A, DAfelvétel Met.stab. patkány és humán mikroszómán (Fm % > 70)

Fluorometriás [Ca2+] meghatározás

Egér lokomotoros aktivitás (LMA) MED p.o.

MED/ ED50 > 10

Patány lokomotoros aktivitás (LMA)

Nincs effektus az ED50 - nél

Nincs effektus 1 µM-nál

Fı hatások: Seltzer modell (antihiperalgézia) Gyulladásos fájdalom modell Termális hiperalgézia Ismételt adás Elektrofiziológiás wind up

Biztonság/fejleszthetıség Irwin teszt patkányban CYP2D6 metabolizmus Kognitív teszt Toxicitás Kardiovaszkuláris mellékhatások

Rotarod teszt P450 enzim indukció NR2B szelektivitás AMES teszt

11. ábra. Az NR2B szelektív NMDA antagonisták projekt farmakológiai tesztrendszere

41

Az 1. lépcsıben a hatékony NMDA antagonistákat válogattuk ki, egy, a kortikális neuron

tenyészeteken az NMDA intracelluláris Ca2+-szintet növelı hatásának antagonizmusa alapján

mőködı funkcionális teszt segítségével. E teszt eredménye elsı közelítésben a kémiai munka

megfelelı és gyors visszacsatolásának bizonyult. Hatásos vegyületek esetében a

legvalószínőbb mellékhatások feltérképezése céljából α1 és 5HT2A receptor kötıdési

teszteket, a szelektivitás alátámasztása céljából további funkcionális teszteket végeztünk

NR1a/NR2B és NR1/NR2A alegység összetételő rekombináns NMDA receptorokon, illetve

egy további kötıdési tesztet melyben egy NR2B szelektív referenciavegyület tríciált

változatát (3H-Ro 256981 ) használtuk fel radioligandként.

Az 1. lépcsı része volt még az in vitro metabolizmus, melynek során a hatásos vegyületek

metabolikus stabilitását patkány és humán mikroszómán mértük. Az in vitro kellıen

hatékony, szelektív és metabolikusan stabil vegyületekkel a kaszkád 2. lépcsıjében

megkezdıdtek az in vivo vizsgálatok. A fájdalomcsillapító fıhatást egér formalin tesztben

határoztuk meg, míg a lehetséges CNS mellékhatásokat Irwin teszt és egér lokomotoros

aktivitást (LMA) mérı teszt alapján próbáltuk meg feltérképezni. Ha a mellékhatásokra és a

fıhatásra jellemzı dózisok közötti különbség, vagyis a terápiás ablak, illetve a kettı

hányadosa a terápiás index kellıen nagy (MED/ED50>10) és a vegyület kielégítı

fájdalomcsillapító hatással rendelkezett, akkor a 3. lépcsıbe került. Ebben a fázisban a

továbbjutott vegyületekrıl részletes farmakokinetikai és farmakodinámiás jellemzés készült.

Az ADME tulajdonságokat leíró farmakokinetikai jellemzık, a kiürülés, féléletidı,

megoszlási térfogat, cmax, biohasznosulás, agyi penetráció közül a biohasznosulás (BA)

szelekciós tényezı volt. A hatékonyságot CCI neuropátiás fájdalommodellben, míg a

mellékhatást patkány lokomotoros aktivitást (LMA) mérı modellben vizsgáltuk tovább. A

CNS mellékhatásokat jelzı LMA méréseket a szív arritmiájával kapcsolatba hozható QT

megnyúlás mérésével egészítettük ki. Ebben a fázisban kerül sor az adásmódok

összehasonlítására. Rosszul felszívódó vagy a first-pass metabolizmuson lebomló vegyületek

sok esetben nem mutatnak per os hatékonyságot, de más adásmóddal (i.v., s.c., i.p.) még

hatékonyak lehetnek. A rosszul oldódó és felszívódó vegyületek biohasznosulását, ezáltal in

vivo hatékonyságát különbözı komplexképzık és oldószerek segítségével, vagy a hatóanyag

mikronizálásával több esetben jelentısen sikerült javítani. Az utolsó lépcsıben még több a fı

hatást és a lehetséges mellékhatásokat feltáró vizsgálatnak vetettük alá az ide kerülı

vegyületeket. Bár új molekulákat elsısorban az in vitro eredmények alapján terveztünk, a

kaszkád elsı három lépcsıjének teszteredményei is hatással voltak a kémiai munkára. A

tervezett molekulák szerkezeti, fiziko-kémiai paraméterein (oldékonyság, PAMPA, clogP, pK

42

predikciók) keresztül eredményesen tudtuk befolyásolni a felszívódást, biohasznosulást, agyi

penetrációt, ezeken keresztül pedig az orális hatékonyságot. Gyógyszerkémiai szabályokat

alkalmazva több esetben pozitívan alakítottuk a metabolikus stabilitást. A 4. lépcsı sem

teljesen fekete doboz, a benne lévı tesztekre vonatkozóan is alkalmazhatunk racionális

megfontolásokat, különbözı predikciós módszereket. Ebben a fázisban fontoltuk meg a

prodrug startégia lehetıségét. Túl sok paraméterre azonban nem lehet optimalizálni így a 4.

lépcsı teszteredményei már csak rangsorolják az idáig jutott vegyületeket. A fıhatás,

biztonság és fejleszthetıség szempontjait alaposan mérlegelve közülük választottuk ki a

továbbfejlesztésre alkalmas jelölteket. Mivel a kémiai tervezımunkát az 1. lépcsı

meghatározó in vitro vizsgálatai mellett a következı két lépcsı in vivo teszteredményei is

befolyásolták, és dolgozatomban a szerkezet-hatás összefüggések elemzésekor felhasználom

ezeket az erdményeket, röviden ismertetem az elsı három lépcsı tesztjeit. A kaszkád

felépítése és a kritériumrendszer az 11. ábrán kísérhetı figyelemmel.

3.2. In vitro vizsgálatok

3.2.1. Kötıdési tesztek

Az NMDA antagonisták mellékhatásaiért elsısorban az α1 és az 5-HT2A receptorok felelısek,

ezért már korai szakaszban fontos, hogy ismerjük a vegyületek affinitását ezekhez a

receptorokhoz. Az α1 kötıdési tesztben56 [3H]-prazozint, az 5-HT2A kötıdési tesztben91 [3H]-

ketanszerint használtunk radioligandként.

A funkcionális tesztadatok mellett elsısorban QSAR módszerek kiindulási adataként egy

NR2B kötıdési tesztre54 is szükségünk volt. Méréseink során radioligandként egy nagy NR2B

szelektivitással rendelkezı triciummal jelzett referenciavegyületet, a [3H]-Ro 256981-et

alkalmaztuk.

3.2.2. Funkcionális tesztek

3.2.2.1. Funkcionális teszt primer neokortikális tenyészeten

Az elıállított új vegyületek NMDA antagonista hatását a következı, intracelluláris Ca2+

koncentráció mérésen alapuló funkcionális tesztben vizsgáltuk.76 Az NMDA receptorok az

agonista NMDA alkalmazását követıen ingerült állapotba kerülve Ca2+-ra permeábilisak.

Funkcionális tesztünkben a vegyületeknek az NMDA által kiváltott intracelluláris Ca2+-

koncentráció emelkedésre gyakorolt gátló hatását határoztuk meg fluoreszcenciás Ca2+

méréssel.

43

A méréshez 17 napos Charles River-patkány embriókból származó, standard 96-lyukú

szövettenyésztı lemezekre szélesztett primer neokortikális tenyészeteket használtunk. Mivel a

patkány és az ember NMDA receptorainak nagyon nagy a szekvencia hasonlósága (99, 95, 97

% az NR1, NR2A illetıleg az NR2B alegységek esetén), farmakológiai érzékenységükben

nagyon kicsi a különbség, ha van egyáltalán. Ezért azok az eredmények, amelyeket patkány

NMDA receptorokon kaptunk, reményeink szerint jól extrapolálhatók az emberre is.

Mérés elıtt a sejteket feltöltöttük Fluo-4 fluoreszcens Ca2+ indikátorral, majd a tesztelendı

vegyületeket végül NMDA-t adagoltunk a sejtekhez. A Ca2+ koncentráció mérését egy plate

reader fluoriméter készülékkel végeztük.

A vegyület gátló hatását különbözı koncentrációknál a kalcium felszabadulás csökkenésének

mérésével határoztuk meg. Egy konkrét koncentrációnál a vegyület gátló hatását a kontrol

NMDA válasz gátlás százalékában fejezzük ki. Ezt az értéket elosztva az ifenprodil esetében

mért százalékos gátlással egy relatív értékhez jutunk. A vegyület 0,1 µM koncentrációnál

meghatározott gátló hatását osztottuk a 10 µM ifenprodil gátló hatásával. Tanulmányomban a

receptor gátlását a közvetlenül mérhetı abszolút százalékos adat helyett ezzel a relatív

értékkel jellemzem (Inh %). A tesztrendszerben adott százalékos érték felett IC50 értéket is

meghatároztunk, így a hatásosabb vegyületeket IC50 értékkel jellemzem. Az idegsejtek

NMDA receptor alegység összetétele a születést követı fejlıdés során változik. Hasonló

változás figyelhetı meg neuronális sejttenyészetekben.92 Az irodalmi adatok, és saját

immunocitokémiai vizsgálataink szerint a 4 - 7 napig in vitro tenyészetben tartott neuronok

túlnyomórészt NR2B alegységet expresszálnak az NR1 mellett. Így az NMDA antagonizmus

ilyen sejteken végzett funkcionális tesztje elsısorban az NR2B alegység tartalmú

receptorokon való hatást mutatja.

3.2.2.2. Funkcionális teszt NR1a/NR2B és NR1/NR2A alegység összetételő rekombináns

NMDA receptorokon

Bár az elızı megfontolások alapján a natív idegsejteken meghatározott funkcionális teszt

elsısorban az NR2B alegység tartalmú receptorok gátlását fejezi ki, a vegyületek egyértelmő

jellemzése miatt a mérést NR1a/NR2B alegység összetételő NMDA receptorokat stabilan

expresszáló sejtvonalakon is végrehajtottuk. A Ca2+ koncentráció fent leírt fluoreszcenciás

meghatározását patkány NR1a és NR2B NMDA receptor alegység kombinációt stabilan

expresszáló HEK293 sejteken hajtottuk végre. Vegyületeink NR2B szelektív hatásának

alátámasztására a mérést NR1/NR2A alegység összetételő rekombináns NMDA receptorokat

stabilan expresszáló sejtvonalakon is végrehajtottuk.

44

3.3. In vivo tesztek

3.3.1. Egér formalin teszt

Egerek hátsó lábába injektált higított formalin kétfázisú, fájdalommal kapcsolatos viselkedést

vált ki, amely a sérült láb nyalakodási/harapdálási idejével mérhetı. Az elsı fázis az azonnal

jelentkezı nociceptív válasz. A második fázis az azon fájdalommal kapcsolatos események,

amelyek a formalin injektálását követıen 15-60 percen belül jelentkeznek. Az NMDA

receptorok a formalin injektálásra adott válasz második fázisában játszanak szerepet, és ez a

viselkedési válasz az NMDA receptorok gátlására érzékeny.93 Ezért mi a formalin teszt

második - “ hiperalgéziás” - fázisát használtuk, hogy a vegyületek in vivo hatékonyságát

jellemezzük. A válasz második fázisának gátlása a kémiailag indukált állandó fájdalommal

szembeni analgetikus hatás mértékének tekinthetı.94 A vizsgálandó vegyületeket orálisan

adagoltuk 15 perccel a formalin injektálás elıtt. Az injektált láb nyalásával és harapdálásával

töltött idıt mértük a formalin injektálástól számított 20-25. percben. Az eredményeket az

azonos napon megfigyelt kontrollcsoportban mért nyalakodási idıkhöz viszonyítva %-os

gátlásban fejeztük ki, hatásos vegyületek esetén ED50 értéket határoztunk meg.

3.3.2. Neuropátiás fájdalom Seltzer modellje (antihiperalgézia)

Egerek egyik oldali nervus ischiadicusát az állat combján részlegesen kipreparáltuk és

szorosan elkötöttük szilikonos varróanyaggal, majd a sebet lezártuk. Ez az ideglekötés a láb

spontán fájdalmát és mechanonociceptív küszöbének csökkenését idézi elı.95 A kialakuló

mechanikai hiperalgézia mértékét egy analgeziméterrel határoztuk meg és grammban fejeztük

ki. Az állatok lábát egyenletesen fokozódó erıhatásnak tettük ki. A fájdalomküszöb

elérésekor az állat kirántja a lábát a mőszerbıl, így a fájdalomküszöb grammban kifejezhetı.

ED50 érték helyett egy minimális effektív dózist (MED) állapítottunk meg ahol a vegyület

statisztikailag szignifikánsan visszafordítja a hiperalgéziát.

3.3.3. Neuropátiás fájdalom CCI (chronic constriction injury) modellje (antiallodínia)

Az idegsérülés hatását ebben a modellben a jobboldali ülıidegnek egy kettéhasított polietilén

csıbe való zárásával modelleztük. Az operációt követı 30. napon stabil allodínia alakul ki,

amely még két hónapig fennáll. A fájdalom küszöbértékét a hátsó láb Von Frey

filamentumokkal való érintésével határoztuk meg. A fájdalom küszöbértékének annak a Von

Frey szálnak a grammokban kifejezett értékét tekintettük, ahol az állat a lábát visszahúzta a

45

fájdalom miatt (láb-visszahúzási küszöbérték). A mért értéket a hatóanyag helyett csak

vivıanyaggal kezelt kontrollcsoport adataihoz viszonyítottuk.

3.3.4. Diabéteszes neuropátia modell

Patkányokban sztreptozotocin egyszeri adásával két hét alatt diabéteszt idéztünk elı. További

hat hét alatt diabéteszes neuropátia alakult ki. A láb-visszahúzási küszöbértéket Von Frey

filamentumokkal való mechanikus ingerléssel határoztuk meg. A mért értéket a hatóanyag

helyett csak vivıanyaggal kezelt kontrollcsoport adataihoz viszonyítottuk.

3.4 Nemkívánatos mellékhatásokra utaló tesztek

3.4.1. Irwin teszt

A központi idegrendszerre ható szerek gyors szőrésre alkalmas aktivitásvizsgálat, amely az

állatok spontán magatartásváltozásáról (pl. szedáció, excitáció, sztereotípia, agresszivitás,

motoros inkoordináció, izomtónus, stb) ad kvalitatív jellegő felvilágosítást. Az egyes állatokat

minden egyes tesztben vizuálisan megfigyeltük, és a tesztben mutatott reakcióját ( pl.

önápolás, hangadás, remegés, görcsök, passzivitás, fájdalomreakció, ingerlékenység stb.)

pontokkal osztályoztuk, a kapott pontokat összehasonlítottuk a kontroll azonos tesztben

mutatott pontjaival. A teszt eredményeként minimális effektív dózis (MED) került

meghatározásra.

3.4.2. Spontán lokomotoros aktivitás mérése rágcsálókon

A spontán lokomotoros aktivitást egy, a mozgási aktivitást fotocella sorral automatikusan

detektáló készülékben vizsgáltuk. Harminc perccel a tesztvegyület vagy a vivıanyag orális

adagolása után az állatok horizontális és vertikális mozgását határoztuk meg a fénysugár

megszakítások számaként egy órán keresztül 15 perces intervallumokban.

A mérést a horizontális aktivitás adatainak kontrollcsoporthoz (vivı anyaggal kezelt)

viszonyított százalékos változása jellemzi. Egy vegyület akkor lokomotoros stimuláló hatású,

ha 50 %-nál nagyobb emelkedést váltott ki a fénysugár megszakításokban. Vagyis,

definíciószerően a lokomotoros aktivitás mentes (LMAfree) dózisok 50 %-nál kisebb

emelkedést mutattak.

3.4.3. Rotarod teszt

A rotarod teszt széleskörben használt egyszerő módszer a vegyületek motoros

mellékhatásának detektálására. A teszt során a rágcsálót forgó rúdra állítottuk, ezzel motoros

46

aktivitásra kényszerítettük. A forgó rúdon való tartózkodási idı arányos az állat

egyensúlyozási, koordinációs képességével. A meghatározott ED50 érték a vizsgált

vegyületnek ezekre a képességekre, motoros funkciókra gyakorolt hatását jellemzi.

3.4.4. QT-megnyúlás

A kísérlet során azt vizsgáltuk, hogy izolált nyúlszíven vagy érzéstelenített kutyában

i.v.adagolt tesztvegyület meghosszabbítja-e az EKG-görbe QT tartamát. QT megnyúlás esetén

fatális kamrai tachycardia, ún. torsades de pointes típusú ritmuszavar jelentkezhet. A Q

hullám a kamrai depolarizációt (gyors Na+ beáramlás), a T hullám a repolarizációt tükrözi. A

repolarizáció több ionáram egymás utáni vagy egyidejő mőködésének az eredménye,

legnagyobb részét a human Ether-à-go-go Related Gene (hERG) gén által kódolt K+

ioncsatornán keresztüláramló kifelé irányúló késıi egyenirányító K+ áram határozza meg. Így

sok esetben a QT megnyúlás arányos a vegyület hERG K+ csatornára gyakorolt gátló

hatásával. A QT megnyúlását msec-ban vagy a kontrollhoz viszonyítva, százalékosan adják

meg.

47

4. SAJÁT EREDMÉNYEK

Az NR2B projekt indulásakor ifenprodil típusú molekulák elıállítását határoztuk el. Mivel

abban az idıben cégünknél még nem voltak meg a feltételei egy nagy áteresztıképességő

biológiai szőrésnek, kémiai munkánkat a versenytársak ismert molekuláira alapoztuk, és a

mai szakirodalomban lead-hoppingnak nevezett módszer segítségével reméltünk új, hatásos

szerkezeteket találni. A lead-hopping vagy scaffold-hopping során egy hatásos molekulából

kiindulva hasonló aktivitású, de eltérı szerkezető molekulát azonosítunk. Ma már különféle

számítógépes technikák generálnak ezen az elven új szerkezeteket.

A dolgozatomban feldolgozott, általunk azonosított NR2B aktivitással rendelkezı

vegyületcsaládok fejlıdését, logikai kapcsolatát, a vegyületcsaládokat jellemzı molekulák

alapján a 12. ábrán foglalom össze. Kémiai munkánk kiindulópontja az egyik versenytárs a

CoCensys abban az idıben legújabb eredménye, a 35-ös számú fahéjsavamid volt. A

molekula az akkor már jól ismert farmakofor modellt azzal az új elemmel egészítette ki, hogy

nem szükséges bázikus nitrogén jelenléte az NR2B aktivitás eléréséhez. Feltételezésünk

szerint a mellékhatások döntı részéért éppen az ifenprodil analogonokban lévı bázikus

nitrogén a felelıs. A 35 fahéjsavamid amin komponensének elınyös cseréjével egy aktívabb

származékhoz jutottam (69). Közben az University of Oregon, a CoCensys és a Parke Davis

közös kutatócsoportja újabb közleményben számolt be a fahéjsavamidok körében végzett

további munkájáról. Megfigyelték, hogy a klóratom és a hidroxilcsoport helyzetének

felcserélése szintén hatásos molekulát (65) eredményezett. Ennek alapján a szerzık azt a

következtetést vonták le, hogy a molekulák a receptorzsebbel minkét orientációból képesek

kapcsolatot létesíteni. A 4-hidroxi-fahéjsavamid (65) amidkomponensét 4-benzil-piperidinre

cserélve egy közel háromszor aktívabb molekulához jutottak (37). Korábban az ifenprodil

analogonok szekunder amin része kizárólag 4-es helyzetben szubsztituált piperidinek voltak.

Elhatároztam, hogy felderítem, milyen szekunder aminok eredményeznek még hatásos

fahéjsavamidokat. Másik célom a fenolos hidroxilcsoport cseréje vélhetıen metabolikusan

stabilabb csoportra. A két célkitőzést kombinatorikus kémia eszközökkel, a molekula két

részének egyidejő szerkezeti változtatásával próbáltam egyszerre elérni. A megtervezett

vegyülettár létrehozásához elıször a fenolos hidroxilcsoporttal izosztér, heterociklusokkal

kondenzált fahéjsavakat állítottam elı, melyekben a hidrogénkötés donor szerepet egy NH-

csoport tölti be. A fahéjsavakkal, szilárd fázishoz kötött kapcsolószer segítségével, válogatott

szekunder aminokat acileztem. A fahéjsavamidok körében végzett kombinatorikus kémiai

tanulmány eredményeként a 37 anyavegyülethez képest négyszer aktívabb molekulához

48

jutottam (81). Munkánkban alapvetı fordulatot a fahéjsavszerkezet merevítésére tett

erıfeszítéseink sikere hozott. A fahéjsav α-szénatomjának összekötése az orto-helyzető

aromás szénatommal egy hétszer aktívabb molekulához, a 82 indol-2-karboxamid-

származékhoz vezetett. A 82 vezérmolekula optimalizációja számos hasonlóan aktív

molekulát eredményezett. A molekula összes pontján megvizsgáltam a lehetséges szerkezeti

módosítások hatását. Legeredményesebb változtatás az indol 3-as helyzetében lévı CH-

csoportnak nitrogénatomra történı cseréje volt (142). Az ilymódon levezethetı benzimidazol-

2-karboxamidok általában tízszer aktívabbak voltak a megfelelı indol-2-karboxamidoknál.

Mind az indol, mind a benzimidazol-származékok körében számos in vivo is hatásos vegyület

található. Az indolgyőrő bıvítésével egy szintén aktív vegyületcsaládot, a

kinurénsavamidokat azonosítottuk (230). Az indol és benzimidazol-2-karboxamidok körében

megismert szerkezet-hatás összefüggések a kinurénsavamidok gyors optimalizációját tették

lehetıvé. A projekt igazi sikerét az indolgyőrő felnyitásával levezethetı oxálsavdiamidok

(183) hozták meg. Az in vivo leghatásosabb molekulák közülük kerültek ki. A vegyületcsalád

tagjait hatás-mellékhatás szempontjából egymással összehasonlítva a 185-ös vegyületet

választottuk ki klinikai vizsgálatok céljából. Az oxalilcsoport eredményességét követıen

elhatároztam, hogy más háromtagú összekötı láncot is megvizsgálok. Számos,

gyógyszerszerő molekulát eredményezı háromtagú lánccal kötöttem össze a baloldali aromás

győrőt a piperidin nitrogénjével. Ezek közül legaktívabb vegyületcsaládnak a benzoil-

karbamidok bizonyultak (274). Dolgozatomban az egyes vegyületcsaládokat, a molekulák

egymásra épülését, logikai kapcsolatát érzékeltetve, felfedezésük idırendjében mutatom be.

Így a benzilidén-piperidin-származékokat az utolsó fejezetben ismertetem, annak ellenére,

hogy szerkezetük alapján az ifenprodil típusú molekulákat leíró korábbi fejezetekhez

kapcsolódnak szorosan. Elınyös tulajdonságaikat a projekt végén ismertük fel. A korábban

elıállított leghatásosabb molekulák szekunder amin része valamennyi esetben szubsztituált 4-

benzil-piperidin volt. Ezek benzilidén-piperidin megfelelıi (312, 321) hasonlóan aktívnak

bizonyultak, ráadásul jóval nagyobb terápiás ablakkal rendelkeztek. Az indol- és

benzimidazol-2-karbonsavak benzilidén-piperidinekkel képezett amidjait hagyományos

módon, míg az oxálsavdiamidokat oldatfázisú parallel szintézissel állítottam elı. A nem

ifenprodil típusú molekulák kutatását egy korábbi Merck közleményt követıen indítottuk el,

melyben NR2B receptoron ható amidinekrıl számoltak be (46, 48) 119 (13. ábra). A Merck

kutatóinak eredményeit felhasználva, korábbi tapasztalatom alapján új típusú,

gyógyszerszerőbb szerkezetet, indol-2-karboxamidineket terveztem (299). A vegyületeket

kombinatorikus kémia segítségével állítottam elı.

49

O

N

Cl

OH

H

O

N

HO

Cl

H

O

N

HO 35 (Co 101526) 65 37 NR2B-IC50 : 319 nM (irodalmi: 170 nM) NR2B-IC50 : 385 nM (irodalmi: 330 nM) NR2B-IC50: 131 nM (irodalmi: 120 nM)

O

N

Cl

OH

OHH

N

O

N HO

H

O

NO

NO

H 69 82 81 NR2B-IC50: 130 nM NR2B-IC50: 18 nM NR2B-IC50: 28 nM

N

N

O

N HO

H

N

O

N

O

HO

H HN

N

HO

O

O

N N

HO

OO

H

142 230 183 274 NR2B-IC50: 2,2 nM NR2B-IC50: 9,1 nM NR2B-IC50: 11 nM NR2B-IC50: 24 nM

H

N

N

O

N HO

HN

N

O

O

O

NO

F

H

H

HN

N

O

O

O

NO

312 185 (radiprodil) 321 NR2B-IC50: 3,3 nM NR2B-IC50: 4 nM NR2B-IC50: 21 nM

12. ábra. Ifenprodil típusú NR2B szelektív NMDA antagonista hatású vezérmolekulák fejlıdése.

50

H

Cl

N

NH2

N

CH3O

OCH3

HN

NH OCH3

H HN

NH OCH3

CF3O

Merck

Richter

299 46 (Merck) 48 NR2B-IC50: 5,4 nM NR2B-Ki: 0,7 nM (irod. adat) NR2B- Ki: 5,7 nM (irod. adat) NR2B-IC50: 4,2 nM (saját mérés)

4.1. Fahéjsavamidok

Kutatásunk elején az ismert NR2B altípusszelektív NMDA antagonisták, mint az ifenprodil,

CP-101,606 (traxoprodil), Ro-25-6981 (9) bázikus nitrogént tartalmazó 1,4-diszubsztituált

piperidin-származékok voltak.

HO

N

OH

CH3

OH

CH3

N

OH

HO

(1S,2S)

ifenprodil CP-101,606

HO

N

OH

CH3

(9)

Ro-25-6981

A központi idegrendszer számos receptorának endogén ligandja és a velük szerkezetileg

rokon, természetes eredető feniletil-amin-származékok szintén tartalmaznak bázikus

nitrogént:

Y

NH

WV

Z

X

X Y V Z W

tiramin H OH H H H

oktopamin H OH OH H H

dopamin OH OH H H H

efedrin H H OH CH3 CH3

norefedrin H H OH CH3 H

adrenalin OH OH OH H CH3

noradrenalin OH OH OH H H

13. ábra. Nem ifenprodil típusú NR2B szelektív NMDA antagonista hatású vegyületek kutatása.

51

Ezekkel az aminokkal további szerkezeti hasonlóság is megfigyelhetı. Közös elem a 4-

hidroxi-feniletil-amin rész is, bár az NMDA antagonisták körében az etil lánc hosszabb is

lehet egy metiléncsoporttal (9), vagy egy heteroatommal (12). A szerkezeti hasonlóság

eredményeként ezek a vegyületek nemcsak az NMDA receptorhoz kötıdnek, hanem pl. az α-

1 adrenerg és a szerotonin receptorokhoz. A feniletil szerkezeti elem mellett a biogén aminok

bázikus nitrogénjének alapvetı szerepe van a receptorukhoz való kötıdésben. Munkánk

kezdetekor tették közzé az University of Oregon, a CoCensys és a Parke-Davis

kutatócsoportjai közös munkájukban azt a megfigyelést, miszerint a bázikus nitrogén jelenléte

nem feltétele az NMDA receptor antagonizmusnak. Az általuk elıállított 35-ös N-(2-

feniletil)fahéjsavamid-származék hatásos és NR2B szelektív NMDA antagonistának

bizonyult.72 Más receptorokhoz mutatott affinitásáról az irodalom nem közölt adatokat,

feltételeztük azonban, hogy ez a bázikus nitrogént nem tartalmazó molekula nem, vagy jóval

kisebb mértékben kötıdik a biogén aminok receptoraihoz. Hipotézisünk igazolása céljából

megvizsgáltuk a 35-ös fahéjsavszármazékot. Natív NMDA receptorokon végzett funkcionális

teszt 319 nM-os IC50 értéke hasonló moláris hatékonyságot mutatott az irodalmi

rekombináns NR2B receptorokon mért 170 nM-os értékkel. Sejtésünknek megfelelıen a

vegyület egyáltalán nem kötıdött az α-1 adrenerg és a szerotonin 5HT2a receptorokhoz. Az

eredményeken felbuzdulva újabb fahéjsavamid-származékokat és analogonokat terveztünk és

állítottunk elı további szerkezet-hatás összefüggések felderítése érdekében. Az elıállított

vegyületek biológiai aktivitását elsısorban NR2B receptorokat expresszáló natív idegsejteket

felhasználó funkcionális esszében határoztuk meg, melynek során az NMDA által kiváltott

intracelluláris Ca2+ szint növekedésének gátlását mértük.

4.1.1. Tiraminszármazékok

Kémiai munkám kiindulópontja a CoCensys 35-ös számú molekulája. Ahogy az ifenprodil

esetében, úgy a 35 fahéjsavszármazéknál is egy fenolos hidroxilcsoport szubsztituálja 4-es

helyzetben az egyik benzolgyőrőt. Az University of Oregon, a CoCensys, Inc. és a Parke-

Davis Pharm. Res. kutatói közös tanulmányukban72 szerkezet-hatás összefüggésben elemezték

a molekulát. A fenolos hidroxilcsoport para helyzetbıl meta helyzetbe történı áthelyezése egy

nagyságrenddel csökkentette az aktivitást, míg elhagyása a hatás teljes elvesztésével járt. A

klóratom és a hidroxilcsoport helyzetének felcserélésével közel azonos hatsú molekulákhoz

jutottak (35, 65). A fahéjsavamid mindkét végének hidroxilcsoporttal történı helyettesítése a

hatás jelentıs csökkenésével járt (NR2B-IC50 : 21 µM).

52

N

HOO

Cl

H

N

OCl

OH

H

35 (Co 101526) 65 NR2B-IC50 : 319 nM (irodalmi: 170 nM) NR2B-IC50 : 385 nM (irodalmi: 330 nM)

Saját méréseink nem mutatták az irodalomban közölt meggyızı különbséget, a továbbiakban

új molekulák tervezésekor azért az aktívabb, 35 molekula szerkezetét részesítettem elınyben.

A molekula baloldali részét változatlanul hagyva, 4-hidroxi-feniletil-amin, triviális nevén

tiraminszármazékokat állítottam elı. Fahéjsavamid helyett vele azonos hosszúságú,

heteroatomot is tartalmazó amid- (66) illetve karbamidszármazék (67) teljesen hatástalannak

bizonyult.

N

HO

O

O

Cl

H

N

HO

N

O

Cl

H H

66 67

A tiramin etilén láncának egy oxigén atommal való meghosszabbítása (68) szintén a hatás

elvesztésével járt.

HO

ON

O

Cl

H

68 NR2B-IC50 : 3520 nM

4.1.2. Oktopaminszármazékok

A 35 vegyület tiramin részének 1-(4-hidroxi-fenil)-1-hidroxi-etil-aminnal (triviális nevén

oktopaminnal) való kicserélése az anyavegyületnél kétszer hatékonyabb vegyületet

eredményezett (69). Az α1 és 5-HT2A receptorokhoz nem mutatott affinitást. Ez volt az elsı

hatást javító változtatás az anyavegyületen, ezért további alapvetı szerkezetmódosításokkal

járó, új molekulák elıállítása mellett a 69 molekula optimalizációját határoztuk el (1.

táblázat).

53

1. táblázat. Oktopaminszármazékok flourimetriás módszerrel meghatározott NMDA antagonista hatása patkány kortikális sejteken.

N

HOO

XOH

H

vegyület

X

NMDA-kiváltott ∆∆∆∆[Ca2+]i

a

inhibíció (%)b IC50 (nM)

69 4-Cl 130 nM

70 4-H 1220 nM

71 4-F 978 nM

72 4-CH3O 513 nM

73 4-OH 10,1 %

a NMDA-kiváltott intracelluláris Ca2+ koncentrációváltozás. b Inhibíció (%) a vegyület 0,1 µM koncentrációjánál meghatározva.

A fahéjsav klór szubsztituense valószínőleg optimális, más csoportokra való kicserélése (70,

71, 72) ugyanis a hatás nagymértékő csökkenésével járt. Hidroxilcsoportok egyidejő jelenléte

a két benzolgyőrőn (73) az oktopaminszármazékok körében is az aktivitás teljes elvesztését

eredményezte. Egy fenolos hidroxilcsoport jelenléte mindenképpen szükséges, hiánya (74) a

hatás elvesztését vonta maga után.

N

O

ClOH

H

74 NR2B-inhibíció: 31,3 %

A 69-es molekula optimalizálása során merész lépésnek tőnt más hidroxilcsoportot is

tartalmazó természetes feniletil-amin felhasználása oktopamin analogonok elıállítása

céljából, de bízva munkahipotézisünkben, miszerint a biogén aminok acilezésüket követıen

elvesztik természetes receptoraik iránti affinitásukat, a hozzáférhetı 4-hidroxi-feniletil-

aminokat rendre acileztem 4-klór-fahéjsavval. A 4-hidroxi-norefedrinbıl (75), szinefrinbıl

(76), adrenalinból (77) és a tirozin metilészterébıl (78) képzett 4-klór-fahéjsavamidok

azonban hatástalannak bizonyultak.

54

N

HOO

ClOH

CH3

H

N

O

ClOH CH3

HO 75 76

NR2B-IC50 : 516 nM NR2B-inhibíció.: 68,5 %

N

O

ClOH CH3

HO

HO

N

HOO

Cl

CH3O O

H

77 78

NR2B-IC50 : 4880 nM NR2B-IC50 : 8860 nM

A 69 anyavegyület benzil-helyzető hidroxilcsoportjának oxidációja ketocsoporttá (79) az

aktivitás kismértékő javulását, míg a nagyobb térkitöltéső triazolcsoporttal való kicserélése

(80) az aktivitás jelentıs csökkenését eredményezte.

N

HOO

ClO

H

N

O

ClN

HO

NN

H

79 80

NR2B-IC50 : 105 nM NR2B-IC50 : 443 nM

A projekt elsı évében (1999) közel 250 vegyületet szintetizáltunk és teszteltünk. A

bevezetıben leírt stratégiánk alapján elsısorban bázikus nitrogént nem tartalmazó

molekulákat terveztünk. Kisebb mértékben azért a hagyományos ifenprodil struktúrából

kiinduló kutatást is folytattunk. Kutatásunk elejét jellemzı merész próbálkozásaink, bár nem

eredményeztek az irodalomban leírt fahéjsavszármazéknál hatásosabb molekulát, a tanulási

folyamatunk fontos részévé váltak. Egy év elteltével véglegesen elvetettük a bázikus nitrogént

tartalmazó ifenprodil-analogonok szintézisét. A CoCensys cég újtípusú, hatásos

molekulájából (35) kiindulva, szerkezetét módosítva, egy aktívabb vegyületcsaládhoz,

oktopaminszármazékokhoz jutottunk. Ekkor számolt be újra az University of Oregon, a

CoCensys és a Parke-Davis közös kutatócsoportja a fahéjsavamidok körében végzett

munkájuk legfrissebb eredményeirıl.73 Közleményükben részletesen bemutatták 35

vezérmolekulájuk optimalizációját. Az egyik leghatékonyabb molekulának bizonyúló 37

piperidinszármazékuk termékenyítıleg hatott munkánkra.

55

O

N

HO 37 NR2B-IC50: 131 nM (irodalmi: 120 nM)

Elhatároztuk, hogy feltérképezzük, milyen, az NR2B szelektív NMDA antagonisták körében

közkedvelt piperidinektıl eltérı szekunder aminnal képezett fahéjsavamid mutat még kellı

hatékonyságot.

4.1.3. Fahéjsavamidok elıállítása

Néhány fahéjsavszármazék hagyományos módon történı elıállítása után a kombinatorikus

megközelítés mellett döntöttünk. Idıközben ugyanis felmerült a fenolos hidroxilcsoport

metabolikusan stabilabb csoportra történı cseréjének szükségessége is. Így a kombinatorikus

kémia alkalmazhatóságának feltétele, a minimum két diverzitási pont, adott volt a molekulán

(14. ábra). Egyik változó a szekunder amin komponens, másik variálási lehetıség a fenolos

hidroxilcsoport helyett, hozzá hasonlóan hidrogénkötés donor sajátságú, NH-elemet

tartalmazó különféle csoportok, heterociklusok alkalmazása. Ennek érdekében elıször tíz

ilyen, vélhetıen metabolikusan stabilabb szerkezeti részt, többnyire benzolgyőrővel

kondenzált heterociklust tartalmazó fahéjsavat szintetizáltam (15. ábra). A fahéjsavakat a

megfelelı aldehidbıl kiindulva Knoevenagel-szintézissel állítottam elı. A fahéjsavakkal 24

piperidin és piperazinszármazékot acileztem a peptidkémiában használatos pentafluorfenolos

kapcsolási módszer szilárd fázisra adaptált megfelelıjével. A fahéjsavból elıször Argonaut

PS-TFP gyanta fenol funkciójával aktív észtert képeztem diizopropil karbodiimid

segítségével, majd szőrés, mosás után az aktív észterrel 0,9 ekvivalens szekunder amint

acileztem dimetilformamidban. A gyanta kiszőrése után a reakcióelegyben csak a termék

maradt. Ha az amin sósavsóként volt hozzáférhetı, a reakcióelegyhez adott, gyantához kötött

trimetil-amin hidrokarbonáttal szabadítottam fel a bázist. 24 győrős szekunder amint

acileztem ílymódon (16. ábra). A célmolekulák harmadát sikerült izolálni, a kiindulási

fahéjsav és a termékek rendkívül rossz oldékonysága miatt. A rosszul oldódó fahéjsavakból

nem képzıdött aktív észter, míg a rosszul oldódó termékek a gyantával együtt kiszőrésre

kerültek.

56

AB

C

O AB

C

O

OHCOOH

COOH

piperidin+

CH2 N C

O

F F

F F

O C

O

CH CH C

BA

H

HNR1

R2HN

R1

R2 HCl

,N(CH3)3x

HCO3 O

N

R2

R1A

BC

0,1 mmol

0,09 mmol

piridin

DMF, 5 óra szobahõfokon

3 óra reflux

CH2 N C

O

F F

F F

OHH

Argonaut PS-TFP 1,1 mmol/g

DIC, DMAP

DMF, DCM , 5 óra szobahõfokon

14. ábra. Fahéjsavamidok szilárd fázisú, kombinatorikus kémiai elıállítása .

O

N O

O

OH

H

O

OHO

NOH

O

N O

O

OHH

O

NO

O

OH

H

O

N S

O

OH

H

O

N

O

OH S

H

N

N O

O

OH

H

H

HN Ac

O

OH

HNMez

O

OH

N O

O

OH

H

15. ábra. Fahéjsavamidok szilárd fázisú, kombinatorikus kémiai elıállításához felhasznált fahéjsavak.

57

CH2 N NH

CH2 NH

CH2 NHF

CH2 NHCH3

CH2 NHCl

CH2 NH

CH2 NHCH3O

CH2

NH

CH3O

CH2

HN

CH3O

NH

HO

Cl

NH

N NH

OCH3

NBr NH

NCH3 NH

CH3

CH2 CH2 NHF

O NHCl

N NH

F3C

H

CH2 N NHH

NCl NH

CH3

CH2 O NH

CH CH CH2 NH

N

NNH

H

NNH

H

N NH

16. ábra. Fahéjsavamidok szilárd fázisú, kombinatorikus kémiai elıállításához felhasznált szekunder aminok.

A biológiailag tesztelt 74 vegyület közül a benzoxazolonnal kondenzált fahéjsavval acilezett

4-benzil-piperidin-származék (81) bizonyult a leghatásosabbnak.

HO

O

N

O

NO

NO

H 37 81 NR2B-IC50: 131 nM NR2B-IC50: 28 nM

4.2. Indol-2-karbonsav-származékok

Kutatásunk elsı idıszakára az útkeresés volt jellemzı. A CoCensys elsı publikációi után a fı

csapásirányt a bázikus nitrogént nem tartalmazó, savamid jellegő vegyületek irányában

határoztuk meg. A fahéjsavamidok körében végzett munkám utólag egy tanulási folyamatként

fogható fel. Kisebb-nagyobb lépésekkel próbáltam tágítani az addig ismert farmakofór modell

szők kereteit. A fenolos hidroxilcsoport helyett metabolikusan stabilabb hidrogénkötés donor

58

tulajdonságú csoportokkal szubsztituáltam az aromás győrőt. Az NR2B szelektív NMDA

antagonistákra addig kizárólag jellemzı 4-fenil-piperidin és 4-benzil-piperidin szekunder

aminkomponens helyett más aminokat is felhasználtam. Törekedtem a fahéjsav sztiril

részének eliminálására, mivel biológiai rendszerekben potenciálisan elektrofil támadás

célpontja lehet. Módosításaimmal nem sikerült kellıképpen eltávolodni a CoCensys 35 és 37

számú fahéjsavamidjaitól. Az elsı hatásos molekulát eredményezı jelentıs változtatás aztán

alapvetıen új irányt szabott munkánknak. Feltételeztük, hogy egy újabb hidrogénkötés donor

tulajdonságú csoporttal történı merevítéssel növelhetjük az aktivitást. A fahéjsav α

szénatomja és a benzolgyőrő közé beépített nitrogén 6-hidroxi-2-indolkarboxamid-

származékot eredményezett (82) mely hétszer hatásosabb volt 37 anyavegyületnél.

N

O

N HO

H 1

2

34

5

67

W

V XN

QZ

Y

82 NR2B-IC50: 18 nM A

Vezérmolekulánknak a 82 indol-2-karboxamidot választottuk és elhatároztuk, hogy a

molekulát optimalizáljuk, származékok képzésével feltárjuk, milyen kapcsolat van a biológiai

aktivitás és az A általános képleten jelölt, következı szerkezeti változtatások között:

Hidroxilcsoport helyzete a benzolgyőrőn (4.2.1.).

Az X-csoport természete (4.2.2.).

A piperidingyőrő szubsztituensének a helyzete (4.2.3.).

Az Y összekötı lánc helyzete (4.2.4.).

A Z-csoport természete és helyzete (4.2.5.).

Az indol pirrolrészének lehetséges helyettesítése más karbo- ill. heterociklusokkal (4.2.6.).

Vezérmolekulánkat a farmakológiai szőrırendszerünk 1. lépcsıjében lévı funkcionális

NMDA teszt alapján optimalizáltuk. Már a molekulák tervezésekor figyelemmel voltunk a

szabadalmaztathatóságra. Az optimalizálás során az in vitro aktivitás növelése mellett a

gyógyszerszerőség (Lipinsky szabályok, stb.) és az ADME tulajdonságok (logP, oldhatóság,

stb.) javítására is törekedtünk.

4.2.1. Hidroxilcsoport helyzete az indolgyőrőn

Elsıként az indolgyőrő hidroxiszubsztituensének szerepét tanulmányoztam. Azt vizsgáltam,

hogy a hidroxilcsoport helyének és számának változtatása hogyan befolyásolja a biológiai

aktivitást. Az eredmények a 2. táblázatban azt mutatják, hogy a 82 vegyület 5- és 4-hidroxi-

59

analogonjai (83 és 84) hasonló aktivitással rendelkeznek, míg a 7-hidroxi-analogonnak (85)

kisebb az aktivitása. Ez azt jelzi, hogy valószínőleg egynél több hidrogénkötés akceptor

csoport van a receptor megfelelı helyein. Feltételezésünket megerısíti az a megfigyelés,

miszerint a 4,6-dihidroxi-származéknak (86) nagyobb az aktivitása a monohidroxi-

származékoktól, a vegyület azonos hatású volt a legaktívabb referenciavegyülettel a

besonprodillal (28) (3.táblázat). A 85 vegyület hatásának a csökkenése a 82-84 vegyületekhez

képest, valamint a 87 vegyület kisebb aktivitása a 86-os vegyülethez képest a 7-es helyzető

hidroxilcsoport gyenge kölcsönhatását tükrözi a receptorral. Ennek oka valószínőleg az, hogy

ez a hidroxilcsoport nem a receptorral, hanem az indol NH-csoportjával létesít

intramolekuláris hidrogénkötést.

2. táblázat. Hidroxilcsoportok helyének és számának hatása a biológiai aktivitásra, funkcionális és kötıdési tesztadatok alapján.

NN

O

Q

H

vegyület

Q

NMDA-kiváltott ∆ [Ca2+]i

a

IC50 ± S.E.M. (nM)

n

[3H]Ro-25,6981 kötıdés

IC50 ± S.E.M. (nM)

n

82 6-OH 18 ± 4 13 12±2 4

83 5-OH 25 ± 8 3 31±10 3

84 4-OH 16 ± 2 8 18±5 4

85 7-OH 165 ± 30 4 380±141 3

86 4,6-di-OH 6,5 ± 0,7 3 6±1 3

87 5,7-di-OH 31 ± 3 3 106±19 3 aNMDA-kiváltott intracelluláris Ca2+ koncentrációváltozás patkány kortikális sejteken meghatározva.

3. táblázat. Referenciavegyületek in vitro biológiai adatai.

aNMDA-kiváltott intracelluláris Ca2+ koncentrációváltozás patkány kortikális sejteken meghatározva.

referenciavegyületek NMDA-kiváltott

∆∆∆∆[Ca2+]ia

IC50 ± S.E.M. (nM)

n

[3H]Ro-25,6981 kötıdés

IC50 ± S.E.M. (nM)

n

CP-101,606 41 ± 5 7 7 ± 1 6

28 (besonprodil) 6,6 ± 1,2 3 4 ± 1 3

9 (Ro-256981) 159 ± 29 3 6 ± 1 3

37 131 ± 10 2 196 ± 43 3

60

4.2.2. Az X-csoport természete

Megvizsgáltam a 82 molekula karbonsavamid funkciójának szerepét. Cseréje

karbonsavamidinre aktívabb analogont (88) eredményezett, míg a CO-csoport cseréje CH2-

vagy SO2-csoportra (89 és 90) a hatás elvesztésével járt (4. táblázat).

4. táblázat. A 82 molekula különbözı X-csoportot tartalmazó származékainak funkcionális és kötıdési tesztadatai.

N XN

HOH

vegyület

X

NMDA-kiváltott ∆ [Ca2+]i

a

IC50 ± S.E.M. (nM)

n

[3H]Ro-25,6981 kötıdés

IC50 (nM)

n

88 C=NH 8,5 ± 1,7 5 10 2

89 CH2 1158 ± 231 3 N.D. -

90 SO2 > 8000 1 N.D. - aNMDA-kiváltott intracelluláris Ca2+ koncentrációváltozás patkány kortikális sejteken meghatározva.

4.2.3. A piperidingyőrő szubsztituensének helyzete

A benzilcsoport piperidingyőrőn való helyzetének szerepét a 4-metoxi-benzil-származékok

esetében tanulmányoztam (91-93). Ebben az esetben mind a 3-as (92) mind a 2-es helyzet

(93) szubsztitúciója a hatás alapvetı csökkenésével járt (5. táblázat).

5. táblázat. A 82 molekula piperidingyőrőjén lévı benzilcsoport helyzetének in vitro biológiai hatása funkcionális és kötıdési tesztadatok alapján.

.

N

O

N HO

OMe

23

4

H

vegyület

szubsztitúció

NMDA-kiváltott ∆ [Ca2+]i

a

IC50 ± S.E.M. (nM)

n

[3H]Ro-25,6981 kötıdés

IC50 (nM)

n

91 4-(4-MeO)Bn 80 ± 14 3 17 2

92 3-(4-MeO)Bn 2206 ± 406 7 N.D. -

93 2-(4-MeO)Bn > 8000 ± 2 2 N.D. - aNMDA-kiváltott intracelluláris Ca2+ koncentrációváltozás patkány kortikális sejteken meghatározva.

61

4.2.4. Az Y összekötı lánc helyzete

A 82 molekula másik érzékeny pontja a terminális benzolgyőrőt és a piperidingyőrő 4-es

helyzető szénatomját összekötı lánc. A metiléncsoport elhagyása (94) és egy

metiléncsoporttal való megnyújtása (95) kevésbé aktív vegyületeket eredményezett. A hatás

hasonló csökkenése figyelhetı meg, amikor a CH2-csoportot CO-, CHOH- vagy NH-

csoportra cseréljük (99-101). Meglepı módon a benziloxi-piperidin- és a fenoximetil-

piperidin-származékok aktivitása (97 és 98) közelebb áll a 82 vegyület aktivitásához, mint a

geometriailag hozzá hasonlóbb 95 feniletil-piperidin-származékéhoz (6.táblázat). Ez egy

nyilvánvalóan új példája a Friedman paradoxonnak.96

6. táblázat. A 82 molekula különbözı Y-csoportot tartalmazó származékainak in vitro biológiai hatása funkcionális és kötıdési tesztadatok alapján.

N

O

N

Y

HOH

vegyület

Y

NMDA-kiváltott ∆[Ca2+]i

a

IC50 ± S.E.M. (nM)

n

[3H]Ro-25,6981 kötıdés

IC50 (nM)

n

94 - > 8000 ± 2 2 N.D. -

95 CH2CH2 875 ± 187 5 359 ± 93 3

96 O 107 ± 27 3 89 2

97 OCH2 16 ± 3 9 47 ± 4 3

98 CH2O 36 ± 6 7 19 ± 2 3

99 CO 744 ± 131 4 N.D. -

100 CHOH 111 ± 23 4 60 2

101 NH 348 ± 75 6 1084 2 aNMDA-kiváltott intracelluláris Ca2+ koncentrációváltozás patkány kortikális sejteken meghatározva.

4.2.5. A Z-csoport természete és helyzete

A 82 molekula benzil-piperidin részének benzolgyőréjét helyettesítı csoportok minıségének

és helyzetének aktivitásra gyakorolt hatását a 7. táblázatban foglalom össze. Az elıállított

néhány származék (102-105) kisebb aktivitással rendelkezik a kiindulási 82 anyavegyülethez

képest.

62

7. táblázat. A 82 molekula különbözı Z-csoportot tartalmazó származékainak in vitro biológiai hatása funkcionális és kötıdési tesztadatok alapján.

HN

O

N HO

Z

23

4

vegyület

Z

NMDA-kiváltott ∆ [Ca2+]i

a

IC50 ± S.E.M. (nM)

n

[3H]Ro-25,6981 kötıdés

IC50 (nM)

n

102 4-F 90 ± 15 6 12 ± 3 3

103 4-Me 208 ± 34 3 28 2

104 2-MeO 249 ± 55 3 N.D. -

105 3-F 38 ± 8 6 31 1 aNMDA-kiváltott intracelluláris Ca2+ koncentrációváltozás patkány kortikális sejteken meghatározva.

4.2.6. Indol-2-karbonsav-származékok elıállítása

A 82-85, 91-105 monohidroxiszármazékokat a megfelelı indol-2-karbonsavakból (106-109)

és piperidinszármazékokból állítottam elı egy ma már gyakori amid kapcsolási reakciót

felhasználva.97 A kapcsolási reakcióban karbonsavból 2-(1H-benztriazol-1-il)-1,1,3,3-

tetrametilurónium-hexafluorofoszfáttal (HBTU) és trietil-aminnal képzett aktív észter szerepel

acilezı ágensként (17. ábra).

+

HN

O

OHQ

YZ

i

106 Q = 6-OH107 Q = 5-OH108 Q = 4-OH109 Q = 7-OH

82, 91-105 Q = 6-OH (t.82: 71 %)83 Q = 5-OH (t.: 31 %)84 Q = 4-OH (t.: 90 %)85 Q = 7-OH (t.: 25 %)

HN

YZ

O

N

HN

Q

17. ábra. Monohidroxiszármazékok elıállítása. Reagensek és reakciókörülmények: (i) HBTU, Et3N, DMF, 0°C - szobahımérséklet, 16 óra.

A kereskedelmi forgalomban nem lévı és az irodalomban sem ismertetett indol-2-

karbonsavak egy részének metilésztereit (114, 115) Hemetsberger-Knittel szerint állítottam

elı.98 A 86 és 87 dihidroxiszármazékokhoz a megfelelı dibenziloxiszármazékok (116 és 117)

katalitikus hidrogenolízisével jutottam (18. ábra).

63

(t.: 38 %)(t.: 70 %)

(t.: 63 %)(t.: 27 %)

CHO

N3

O

OCH3

N

O

OCH3Q Q Q

N

O

NQ

110 Q = 2,4-di-BnO

111 Q = 3,5-di-BnO

i ii iii, iv

H

H

116 Q = 4,6-di-BnO

86 Q = 4,6-di-OH

117 Q = 5,7-di-BnO

87 Q = 5,7-di-OH

v

114 Q = 4,6-di-BnO

115 Q = 5,7-di-BnO

112 Q = 2,4-di-BnO 113 Q = 3,5-di-BnO

v

(t.: 43 %)

(t.: 60 %)

(t.: 21 %)

18. ábra. Dihidroxiszármazékok elıállítása. Reagensek és reakciókörülmények: (i) metil-azidoacetát, NaOMe, MeOH, 0°C, 4 óra (ii) forralás xilolban; (iii) KOSi(CH3)3, THF, reflux, 1 óra; (iv) 4-benzil-piperidin, HBTU, Et3N, DMF, 0°C - szobahımérséklet, 16 óra; (v) H2, 10 % Pd/C, MeOH, szobahımérséklet.

A 88 amidint 6-benziloxi-1H-indol-2-karbonsavból (118) kiindulva nitrilen (119) keresztül

Pinner reakcióban99 alakítottam ki (19. ábra).

(t.: 57 %)

HN

O

OHBnO

HN CNBnO N

NHO

NH

118 119 88

i, ii iii, iv

H

(t.: 4,5 %) 19. ábra. 88 karbonsavamidin elıállítása. Reagensek és reakciókörülmények: (i) 1. SOCl2, CHCl3, reflux, 1 óra; 2. NH3; (ii) POCl3 CHCl3, reflux, 2 óra; (iii) HCl, MeOH, 5 óra; (iv) 4-benzil-piperidin.

A 89 vegyületet 82 karbonsavamid lítium-alumíniumhidrides redukciójával állítottam elı (20.

ábra).

HNHO

N

OHNHO

N

82 89

i

(t.: 15 %)

HNHO

N

OHNHO

N

82 89

i

(t.: 15 %) 20. ábra. 89 származék elıállítása. Reagensek és reakciókörülmények: (i) LiAlH4, THF, szobahımérséklet, 1óra.

90 szulfonamid elıállításakor 6-benziloxi-1H-indolból (120) indultam ki. Többlépéses

reakciót egy edényben végrehajtva alakítottam ki 121 szulfonsav-kloridot. Az amidképzés

után a benzil védıcsoport hidrogenolízissel történı eltávolítása eredményezte 90

célvegyületet (21. ábra).

64

(ti.: 99 %) (tii+iii.:17 %)

HNBnO

H HN SHO

N

O O

i, ii iii, iv

120 121 90

N SBnOCl

O O

(tiv.:12 %)

21. ábra. 90 származék elıállítása. Reagensek és reakciókörülmények: (i) t-Boc2O, DMAP, CH2Cl2, szobahımérséklet, 2óra; (ii) 1. n-BuLi, SO2, THF, -70°C - szobahımérséklet; 2. NCS, CH2Cl2, 5°C; (iii) 4-benzil-piperidin, szobahımérséklet, 24 óra; (iv) H2, 10 % Pd/C, MeOH, szobahımérséklet.

A szintézisek során felhasznált piperidinszármazékok kereskedelmi forgalomban

beszerezhetıek vagy az irodalomból ismert eljárás szerint elıállíthatók. 4-fenoxi-

piperidineket 4-klór-piridinbıl és fenolokból képzett 4-fenoxi-piridin-származékok két

lépésben történı telítésével állítottam elı (22. ábra).100

HN

O

Y

(i) (ii)OH

Y N

Cl

+N

O

YN

O

YBr

N

O

Y

(iv)

124 tY = H.:79 % 125 tY = H.:99 %

126 tY = H.:69 % 127 tY = H.:99 %

122 123

(iii)

22. ábra . 4-fenoxi-piperidinek elıállítása. Reagensek és reakciókörülmények: (i) kat. 1-(4-piridil)piridinium- klorid hidroklorid, 220 oC, 6 óra; (ii) benzil-bromid, dietil éter, 20 oC, 48 óra; (iii) NaBH4, EtOH; (iv) H2, 10% Pd/C, MeOH, szobahımérséklet.

Fenoximetil-piperidineket etil-izonipekotátból kiindulva ismert módszer alapján állítottam elı

(23. ábra).101 A nitrogén védése után az észtercsoportot litium-alumíniumhidriddel a

megfelelı alkohollá redukáltam. Az alkoholból metánszulfonil-kloriddal mezilátot képeztem,

mellyel ekvivalens nátrium-hidroxiddal deprotonált fenolokat O-alkileztem. A Boc

védıcsoportot sósavas etilacetáttal távolítottam el.

129 ti.: 94 %, tii.: 78 %, t iii.: 93 %

N

O

Y

Boc

(i) (ii) (iv)(iii)

HN

O

Y

N

COOEt

(v)

N

OMez

Boc

131 Y = F : tiv, v.: 78 %H

128 130

23. ábra. 4-fenoximetil-piperidinek elıllítása. Reagensek és reakciókörülmények: (i) Boc2O, EtOAc, 22 óra, 0 oC - szobahımérséklet; (ii) LiAlH4, THF, 0 oC - szobahımérséklet; (iii) MezCl, Et3N, CH2Cl2, 0 oC – szobahımérséklet; (iv) szubsztituált fenolok, NaOH, DMF, 2 óra reflux; (v) 1. 10% HCl/EtOAc, 18 óra, 2. NaHCO3.

65

4-benziloxi-piperidineket N-Boc-4-piperidinol102 O-benzilezésével állítottam elı (24. ábra.).

(i)

N

OH

BocN

O

Y

BocHN

O

Y

(ii)

133 (Y = H : t.: 58 %) 134 (Y = H : t.: 36 %)132

24. ábra. 4-benziloxi-piperidinek elıállítása. Reagensek és reakciókörülmények: (i) NaH, DMF, benzilkloridok, 2 óra, szobahımérséklet; (ii) 1. 30% TFA - CH2Cl2, 1 óra szobahımérséklet, 2. NaHCO3.

4-benzoil-piperidint egy új, eddig nem publikált eljárással állítottam elı. Nitrogénen nem

védett etil-izonipekotátot Grignard reakcióban ekvivalens fenil-magnézium-bromiddal

reagáltatva jó termeléssel 4-benzoil-piperidint eredményezett. A piperidin nitrogénjének Boc-

csoporttal történı védelme után a karbonilcsoport nátrium-borohidrides redukciójával, majd a

védıcsoport eltávolításával a megfelelı alkoholhoz jutottam (25. ábra).

135 ( t.: 70 %) 136 ( tii, iii, iv.: 54 %)

(i)

N

O

OEt (ii) (iii) (iv)

H H N

O

H N

OH

128 25. ábra. 4-benzoil-piperidin elıállítása és redukciója. Reagensek és reakciókörülmények: (i) PhMgBr, THF, 1óra reflux; (ii) Boc2O, Et3N, dioxán-víz, 18 óra, szobahımérséklet; (iii) NaBH4, MeOH, 18 óra, szobahımérséklet; (iv) ) 1. 10% HCl/EtOAc, 18 óra, 2. NaHCO3.

2-, 3- és 4-(szubsztituált-benzil)piperidineket egy új és hatékony eljárás szerint állították elı

mőegyetemi partnereink.103

4.3. Benzimidazol-2-karbonsav-származékok

4.3.1. Az indol pirrolrészének helyettesítése más karbo-, illetve heterociklusokkal

A továbbiak során a 82 molekula NH-csoportjának fontosságát mértük fel. Az N-Me analogon

(137) inaktív volt. Kutatótársaimmal benztiazol, benzofurán és benztiofén analogonokat

állítottunk elı. A megfelelı benzofurán (138) és benztiazol (139) származékoknak szintén

gyenge volt az aktivitásuk. Az 5-hidroxi-benzofurán izomer (141) és az 5-hidroxi-benztiofén-

származék (140) hasonlóan inaktívnak bizonyultak. Az eredmények azt jelzik, hogy a 82

vegyület NH-csoportjának fontos szerepe van a receptorral való kölcsönhatásban. Ezt a

megfigyelést támasztja alá az a tény, hogy a 142 benzimidazol-2-karboxamid szintén hatásos

66

vegyület. Egy nitrogénatom beépítése a 82 molekulába kilencszeres aktivitásnövekedéssel az

egyik leghatásosabb NR2B szelektív NMDA antagonistát eredményezte (142) (8. táblázat).

8. táblázat. Az indol pirrolrészének helyettesítése különbözı V- és W-csoportokkal.

W

V

O

N HO

45

67

vegyület

szubsztituens

V

W

NMDA-kiváltott ∆∆∆∆[Ca2+]i

a

IC50 ± S.E.M. (nM)

n

[3H]Ro-25,6981 kötıdés

IC50 (nM)

n

137 6-OH NMe CH 5773 ± 958 4 N.D. -

138 6-OH O CH 6920 ± 1280 4 >10000 1

139 6-OH S N 2597 ± 369 3 N.D. -

140 5-OH S CH 5613 ± 1066 5 >10000 1

141 5-OH O CH 1901 ± 295 5 >10000 1

142 5(6)-OH NH N 2,2 ± 0,4 7 4 2 aNMDA-kiváltott intracelluláris Ca2+ koncentrációváltozás patkány kortikális sejteken meghatározva. 142 benzimidazol-származékot, mivel funkcionális teszteredménye csaknem egy

nagyságrenddel jobb volt mint a 82 anyavegyületé, új vezérmolekulává választottuk és

megkezdtük a molekula optimalizálását.

4.3.2. Benzimidazol-2-karboxamidok optimalizációja

A benzimidazol és indolgyőrők szerkezeti hasonlósága miatt remélhettük, hogy a molekula

többi részére érvényesek lesznek az indolszármazékoknál megfigyelt szerkezet-hatás

összefüggések. Néhány benzimidazol analogon elıállítása és tesztelése után feltételezésünk

igazolódott, a két heterociklus az NR2B receptoron bioizosztér párként viselkedik, ráadásul a

legtöbb esetben érvényesült a 142 és 82 vegyületpárnál megfigyelhetı egy nagyságrendbeli in

vitro aktivitásbeli különbség a benzimidazol-származékok javára. Ezek után elsısorban a

hatásos indolszármazékok benzimidazol megfelelıjét állítottam elı, jelentısen lecsökkentve

az optimalizáció idejét. Az elıállított és tesztelt vegyületek közül néhányat a 9. táblázatban

mutatok be. A 4(7)-hidroxi-izomer (143) azonos hatású a 142 vezérmolekulával. Az OH-

csoport cseréje NH2-csoporttal kevésbé aktív analogont eredményezett (144). A megfelelı

mezilamino-származék (145) egy kicsit hatásosabb a 142 anyavegyületnél. A 142

molekulában az OH helyettesítése egy a benzimidazollal kondenzált oxazolinongyőrő NH-

67

csoportjával (146 és 147) kevésbé aktív vegyületekhez vezetett. Érdekes módon az Y- és Z-

csoportok módosításának (148-153) nem volt alapvetıen hatása a vegyületek aktivitására.

9. táblázat. Benzimidazol-2-karboxamidok in vitro biológiai adatai.

H

N

N

O

N

Y

Q Z

45

67

vegyület

Q

Y

Z

NMDA-kiváltott ∆∆∆∆[Ca2+]i

a

IC50 ± S.E.M. (nM)

n

[3H]Ro-25,6981 kötıdés

IC50 (nM)

n

143 4(7)-OH CH2 H 3,0 ± 0,4 4 10 ± 4 3

144 5(6)-NH2 CH2 H 40 ± 10 3 143 2

145 5(6)-MezNH CH2 H 1,3 ± 0,2 4 3 2

146

O

N O

H

5,6(6,5)-

CH2 H 193 ± 42 11 N.D. -

147 O

NH O

4,5(6,7)-

CH2 H 328 ± 70 3 N.D. -

148 5(6)-OH CH2 4-F 1,2 ± 0,3 5 4 2

149 5(6)-OH CH2 3-Me 2,4 ± 0,5 6 5 2

150 5(6)-OH CH2 3-MeO 2,5 ± 0,6 3 3 1

151 5(6)-OH O 4-Me 1,1 ± 0,2 4 3 2

152 5(6)-OH O 4-Cl 1,7 ± 0,4 6 14 2

153 5(6)-OH O 4-F 2,9 ± 0,6 3 6 2 aNMDA-kiváltott intracelluláris Ca2+ koncentrációváltozás patkány kortikális sejteken meghatározva.

4.3.3. Benzimidazol-2-karbonsav-származékok elıállítása

A 162, 138, 139, 163, 141 és 164 vegyületeket a megfelelı heterobiciklusos karbonsavakból

(155, 156, 158, 159, 160 és 161) és 4-benzil-piperidinbıl állítottam elı HBTU kapcsolószert

felhasználva. A termékek egy részét továbbalakítottam. 137 és 140 hidroxiszármazékok

kialakítása érdekében 162 vegyületet debenzileztem, 163 metoxiszármazékot demetileztem. A

145 5(6)-mezilamino-származékot 164 5(6)-nitro-1H-benzimidazol-2-karboxamidból 144

5(6)-amino-származékon keresztül állítottam elı (26. ábra).

68

(t.: 40 %)

V

W

O

NR2

V

W

O

OR3R2

HN HBTU, Et3N, DMF

V1= NH

V1= MeN

V1= O

V1= S

V1= S

V1= S

V1= O

V1= NH

i, ii 154 R2 = 6-BnO

155 R2 = 6-BnO

156 R2 = 6-OH

157 R2 = 6-MeO

158 R2 = 6-OH

159 R2 = 5-MeO

160 R2 = 5-OH

161 R2 = 5,(6)-NO2

W1= CH

W1= CH

W1= CH

W1= N

W1= N

W1= CH

W1= CH

W1= N

R3 = Me

R3 = H

R3 = H

R3 = H

R3 = H

R3 = H

R3 = H

R3 = H

iii, iv, v

vi

viii

162 R2 = 6-BnO

137 R2 = 6-OH

138 R2 = 6-OH

139 R2 = 6-OH

163 R2 = 5-MeO

140 R2 = 5-OH

141 R2 = 5-OH

164 R2 = 5,(6)-NO2

144 R2 = 5,(6)-NH2

145 R2 = 5,(6)-MezNH

V1= MeN

V1= MeN

V1= O

V1= S

V1= S

V1= S

V1= O

V1= NH

V1= NH

V1= NH

W1= CH

W1= CH

W1= CH

W1= N

W1= CH

W1= CH

W1= CH

W1= N

W1= N

W1= N

iv

vii

(t.: 45 %)

(t.: 55 %)

(t.: 51 %)

(t.: 58 %)

(t.: 94 %)

(t.: 49 %)

(t.: 46 %)

(t.: 40 %)

(t.: 54 %)

(t.: 51 %)

(t.: 23 %)

26. ábra. Reagensek és reakciókörülmények: (i) MeI, KOtBu, DMF, szobahımérséklet, 24 óra; (ii) KOSi(CH3)3, THF, reflux, 1 óra; (iii) SOCl2, MeOH, 0°C - szobahımérséklet, 10 óra; (iv) BBr3, CH2Cl2, -15°C - szobahımérséklet, 10 óra; (v) KOH, MeOH, reflux 1 óra; (vi) 33 % HBr-AcOH, 10 perc; (vii) H2, 10 % Pd/C, MeOH, szobahımérséklet; (viii) MezCl, piridin, CH2Cl2, szobahımérséklet, 5 óra.

5(6)-hidroxi-1H-benzimidazol- és 4(7)-hidroxi-benzimidazol-2-karbonsavakat (173 és 174)

irodalmi elızmények alapján mőegyetemi partnereink által kidolgozott eljárás szerint

állítottam elı (27. ábra).104

142, 148-153

NO2

NH2

NO2

NH

CO C

O

OEt

NH2

NH

CO C

O

NHnBu

HN

N

O

NHnBuR1 R1 R1R1

v

HN

N

O

OH

HN

Y

Z

, HBTU, Et3N

HN

N

O

N

Y

ZR1 R1

165 R1 = 4-MeO

166 R1 = 3-BnO

171 R1 = 5(6)-MeO

172 R1 = 4(7)-OH

173 R1 = 5(6)-OH

174 R1 = 4(7)-OH

i ii, iii iv

167 R1 = 4-MeO

168 R1 = 3-BnO

169 R1 = 4-MeO

170 R1 = 3-OH

R1 = 5 (6)-OH

R1 = 4 (7)-OH

(t.: 96 %)

(t.: 20 %)

(t.: 83 %)

(t.: 80 %)

(t.: 69 %)

(t.: 84 %)

(t.: 76 %)

(t.: 73 %)

(t.: 28 - 57 %)

(t.: 28 %)143 27. ábra. Reagensek és reakciókörülmények: (i) ClCOCOOEt, Et3N, CH2Cl2, 0°C - szobahımérséklet; (ii) nBuNH2, toluol, szobahımérséklet, 10 óra; (iii) H2, 10 % Pd/C, MeOH, szobahımérséklet; (iv) 240°C, 10 perc (v) 48 % HBr, reflux, 48 óra.

69

Az piperidinszármazékokat 173 és 174 savakkal acilezve 142, 143 és 148-153 hidroxi-

benzimidazol-2-karboxamidokhoz jutottam. A kapcsolási reakcióban HBTU-t alkalmaztam

(27. ábra). 146 heterociklusos karbonsavamidot a 25. ábrán bemutatott benzimidazol-

szintézishez hasonló módon állítottam elı 178 anilinszármazékból és 176 savkloridból. Ez

utóbbiakat 6-aminobenzoxazolinonból (177) és 4-benzil-piperidinbıl (175) alakítottam ki (28.

ábra).

(t.: 92 %)

(t.: 78 %)

(t.: 46 %) (t.: 5,7 %)

HN NCl

O

O

v

i, ii, iii

iv

vi, viiN

OO

NO2

N N

O

O

H

HN

N

O

N

N

OO

H

H

175 176

177 178

179 146

N

OO

NH2

HN

OO

NO2

NH2

H

28. ábra. Reagensek és reakciókörülmények: (i) ClCOCOOEt, DIPEA, CH2Cl2, 0°C; (ii) 1.KOH, MeOH, szobahımérséklet; 2. HCl; (iii) SOCl2, reflux, 2 óra; (iv) NaNO3, TFA, szobahımérséklet; (v) CHCl3, Et3N, szobahımérséklet; (vi) H2, 10 % Pd/C, MeOH, szobahımérséklet; (vii) 240°C, 10 perc.

147 heterociklusos karbonsavamid elıállításakor 5(6)-hidroxi-1H-benzimidazol-2-

karbonsavból (173) indultam ki. A 4(7) helyzetben történı nitrálás és 4-benzil-piperidinnel

való kapcsolás 182 karbonsavamidot eredményezte. A nitrocsoport redukcióját követı

karbonildiimidazolos győrőzárás vezetett a kívánt végtermékhez (29. ábra).

(t.: 68 %) (t.: 65 %)

(t.: 54 %) (t.: 93 %)

i ii iii

173 180 181

iv

182 147

HN

N

O

OH

HO

HN

N

OH

NO2

HO

OHN

N

O

N

NO2

HO

HN

N

O

N

NH2

HO

HN

N

O

N

NHO

O

29. ábra. Reagensek és reakciókörülmények: (i) NaNO3, TFA, szobahımérséklet; (ii) 4-benzil-piperidin, HBTU, Et3N, DMF; (iii) H2, 10 % Pd/C, THF, szobahımérséklet; (iv) 1,1’-karbonildiimidazol, THF, szobahımérséklet.

70

4.3.4. Indol- és benzimidazol-származékok in vivo aktivitása

Indol-2-karboxamidok közül az in vitro kevésbé aktív 102 (IC50: 90 nM), benzimidazol-2-

karboxamidok közül a szubsztituálatlan 142 származék rendelkezett kiemelkedı

farmakokinetikai tulajdonságokkal és in vivo aktivitással (10. táblázat).

10. táblázat. Kiemelkedıen hatásos indol-és benzimidazol-származékok farmakokinetikai, metabolikus

stabilitási és egér formalin neuropátiás fájdalomteszt adatai.

Rövidítések: i.v.T1/2: intravénás féléletidı; IVM FM%: in vitro metabolizmus, becsült maximális felszívódás; µS: mikroszóma *: ED50 értéket nem határoztunk meg, ha a gátlás 20 mg/kg, p.o. dózisban 50%-nál kisebb volt.

Féléletidejük (T1/2) és biohasznosulásuk (BA) a referenciavegyületekkel összehasonlítva

kielégítı. Metabolikusan stabil vegyületek (FM). Egér formalin neuropátiás fájdalomteszten

per os aktívak. 102 a mechanikai allodíniát per os 10 mg/kg dózisban hasonló mértékben

fordította vissza, mint a CP-101606 referenciavegyület, Seltzer hiperalgézia modellben is

hatékony (MED = 5 mg/kg i.p.). 142 a mechanikai allodíniát i.p. 10 mg/kg dózisban teljesen

visszafordította, per os azonban sokkal kevésbé hatásos. Gyulladásos hiperalgézia modellben

a 102, míg termális allodínia modellben a 142 hatásosabb. Mindkét vegyület továbbjutott a

tesztrendszerünk negyedik szakaszába, ahol a toxikológiai vizsgálatok is eredményesen

zárultak. Ennek ellenére a molekulák nem kerültek fejlesztésre, idıközben ugyanis további

szerkezetmódosítással egy új, ígéretes vezérmolekulához jutottunk.

Az indol és benzimidazol-származékok körében elért eredményeinket szabadalmi

bejelentésben105 védtük és három közleményben106-108 ismertettük.

IVM FM%

vegyület i.v. T1/2

[óra]

BA

% humán µS

patkány µS

egér formalin teszt p.o. ED50 [mg/kg]

102 1,4 27 99 92 19

142 0,78 32 88 94 6

referenciavegyületek

CI-1041 (28) 1,1 67 - - 5,3

Co-101244 (12) 0,5 4,5 - - > 20 *

CP-101,606 0,3 2,4 - - >20 *

71

4.4. Oxálsavdiamidok

4.4.1. Eredmények, szerkezet-hatás összefüggések

Eddigi kutatásunk során N-acilezett 4-benzil-piperidin-származékokkal, indol és

benzimidazol-2-karboxamidokkal sikerült bizonyítanunk hipotézisünk helyességét, miszerint

bázikus nitrogén jelenléte nem alapfeltétele az aktivitásnak. Megállapítottuk továbbá, hogy az

indol és benzimidazolgyőrő szubsztituálatlan NH-csoportja fontos a hatás szempontjából. Új

szerkezetek tervezésekor olyan módosításokat hajtottunk végre, amelyek nem érintik ezeket a

farmakofór jellemzıket. Egyik ilyen szerkezeti módosítás eredménye az 183 oxálsavdiamid-

származék lett, mely kétszer olyan hatásos volt, mint a 83 indolszármazék, mind a natív

patkány idegsejteken mért funkcionális, mind a kötıdési teszten.

HN

N

HO

O

O

HN

N

HO

O 83 183

NR2B-IC50: 25 nM NR2B-IC50: 11 nM [3H]Ro-25,6981-IC50: 31 nM [3H]Ro-25,6981-IC50: 16 nM

Elhatároztuk, hogy a fenolos hidroxilcsoportot, kedvezıtlen metabolikus tulajdonságai miatt

legalább egy NH-csoportot tartalmazó kondenzált heterociklussal helyettesítjük, ezzel pótolva

a hidroxilcsoport hidrogénkötés donor sajátságát. Célunk volt továbbá a piperidin 4-es

helyzetét a jobboldali benzolgyőrővel összekötı lánc és a benzolgyőrő szubsztitúciójának

optimalizálása. Reprezentatív oxamidszármazékok (183-188), valamint a

referenciavegyületek biológiai adatait az 11. táblázat tartalmazza. Az elıállított vegyületek

biológiai aktivitását [3H]Ro-25,6981 kötıdési tesztben és a rekombináns NR1/NR2B

receptorokat expresszáló sejteket felhasználó funkcionális esszében határoztuk meg, melynek

során az NMDA által kiváltott intracelluláris Ca2+ szint növekedésének gátlását mértük.

Szelektivitásukat az NR1/NR2A alegységeket tartalmazó NMDA rceptorokhoz képest

ugyanebben a funkcionális esszében határoztuk meg, rekombináns NR1/NR2A receptorokat

expresszáló sejteket használva. In vivo analgetikus hatást a hosszantartó fájdalmat modellezı

egér formalin tesztben mértük.

72

11. táblázat. Referenciavegyületek és néhány reprezentatív oxálsavdiamid-származék (183-188) kötıdési és funkcionális tesztjeinek eredményei valamint in vivo aktivitási adatai.

H

N

X

YN

O

O

Q

a Átlagértékek ± szórás. A kísérletek száma [3H]Ro-25,6981 kötıdési teszt esetében 3-4, NR1/NR2B funkcionális teszt esetében 4-5, NR1/NR2A esetében 1-2. b NMDA-kiváltott intracelluláris Ca2+ koncentrációváltozás rekombináns NR1/NR2B receptorokat expresszáló sejteken meghatározva. c Inhibíció (%) a vegyület 15 µM koncentrációjánál meghatározva. d Klinikai fejlesztésre kiemelt vegyület. A fenolos hidroxilcsoport helyére a versenytársak által is alkalmazott heterociklusokat

beépítve rendkívől aktív és szelektív benzoxazolon (184, 185), benzimidazolon (186),

benztiazolon- (187) és indanon- (188) származékokat sikerült elıállítani. Ezek a vegyületek in

vitro és in vivo is felülmúlják az anyavegyületek (83, 183) és a referenciavegyületek

aktivitását. A sikereken felbuzdulva folytattuk az oxálsavdiamidok körében végzett kémiai

munkát, hiszen egyrészt a tesztrenszerben elırehaladva számos vizsgálatnál elbukhattak még

ezek az igen aktív vegyületek is, másrészt közepes farmakokinetikai paramétereik javításától

vegyület

Q

X

Y oldé-

konyság [µg/ml]

[3H]Ro-25,6981 kötıdésa

IC50 (nM)

NMDA-kiváltott

∆∆∆∆[Ca2+]ia,b

IC50 (nM)

NR1/NR2Aa inhibícióc

(%)

egér formalin teszt, p.o.

ED50 (mg/kg)

83

156 31±10 42±13 18 1,4

183 HO

CH2 H - 16±2 31±6 20 9,4

184 O

N O

H

CH2 H 13 8±2 3±1 9 0,9

185d O

N O

H

CH2 F 15,2 6±1 4±1 5 7,7

186 N

N O

H

H CH2 H 12 4±1 6±1 -1 14

187 S

N O

H

CH2 H 26,5 17±4 9±2 17 0,4

188 N O

H

CH2 CH3 23,3 54±6 15±2 7 0,5

Ro-25,6981 (9) 6±1 57±5 1 p.o. inaktív 5,1 (i.p.)

Co-101,244 (12) 4±1 5±1 -8,7 p.o. inaktív 5,9 (i.p.)

EMD 95885 (8) 8±1 48 0,1 3,7

CP-101,606

7±1 30±4 2,5 >20 (s.c és p.o.)

CI-1041(28)

4±1 8±1 21,0 2,4

73

in vivo még hatásosabb származékokat reméltünk. Iparjogvédelmi szempontból is kívánatos

volt minél többféle származék elıállítása.

A vegyületcsalád kutatásába bekapcsolódva két irányba indultam el. Egyik kitőzött célom a

versenytársak által még nem alkalmazott, egyéb területen is ritkán elıforduló, de azért

gyógyszerszerő heterociklusokkal kondenzált anilinek, majd ezekbıl oxálsavdiamidok

elıállítása volt. Másik célom az indolszármazékoknál szerzett pozitív tapasztalatok alapján a

4-benzil-piperidin helyett olyan analogonok elıállítása amelyben a piperidint és a

benzolgyőrőt összekötı lánc oxigént vagy kenet tartalmaz. Elsıként ez utóbbi területen elért

eredményeimet foglalom össze. Mivel a leghatásosabb molekulák általában benzoxazolon

győrőrendszert tartalmaznak, ezért a 12. táblázatban csak a benzoxazolon-származékok natív

idegsejteken mért funkcionális teszteredményeit mutatom be.

12. táblázat : A piperidin 4-es helyzetében oxigén- és kéntartalmú összekötı láncot tartalmazó benzoxazolon- származékok (189-199) NMDA antagonista hatása patkány kortikális sejteken.

H

HR1

NR2N

O

O

O

NO

vegyület 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199

R1

NR2

N

O

Cl

N

S

N

SO

O

N

O

N

O

F

N

S

N

SO

O

N

O

N

O

N

SO

N

S O

NMDA-kiváltott ∆∆∆∆[Ca2+]i

a inhib. %b IC50 (nM)

7 3,9 85 11 9 9,9 11,7 % 26 12 220 25,7 %

a NMDA-kiváltott intracelluláris Ca2+ koncentrációváltozás. b Inhibíció (%) a vegyület 0,1 µM koncentrációjánál meghatározva.

Érdekes módon az oxigéntartalmú összekötı lánc hosszára az aktivitás nem igazán érzékeny.

A lánc egy-egy metiléncsoporttal történı hosszabbítása az aktivitás kismértékő csökkenését

idézi csak elı (189, 192, 197). A háromtagú összekötı lánc esetében már az oxigén láncon

belül elfoglalt helyzete is meghatározó. A 197, melyben az oxigénatom a piperidinhez

közelebb van, kétszer aktívabb mint a 196. A kénanalogonok hasonlóan aktívak, metabolikus

stabilitásuk azonban nem kielégítı, (190 humán mikroszóma 50 %, patkány mikroszóma 58

%; 194 humán mikroszóma 87 %, patkány mikroszóma 64 %). A kén oxidációjával az

aktivitás nagymértékben lecsökken (198, 191, 199, 195).

74

Számos oxigén és kéntartalmú összekötılánccal rendelkezı molekula továbbjutott az elsı in

vitro szőrıteszteken. A kaszkád második tesztrendszerében a legfontosabb szelekciós

kritérium a biohasznosulás és az egér formalin teszt elfogadható eredménye. Innen a harmadik

tesztrendszerbe csak a 193 jutott tovább.

Egér formalin tesztben ED50 értéke 1,4 mg/kg. Gyenge, 7 %-os biohasznosulását

hidroxipropil-ciklodextrinnel (HPCD) képzett komplexe révén sikerült 20 %-ra megemelni.

Ezt a formulációt alkalmazva egér neuropátiás modellben 0,25 mg/kg dózisban 60,2 %-os

választ váltott ki. Bennett-Xie patkány mechanikai allodíniás modellben hasonló nagyságú

választ (54%) csak 16 mg/kg dózisban sikerült elérni. Diabéteszes neuropátiás

fájdalomtesztben is hatásos, 8 mg/kg dózisban 46 % a válasz. 193 a gyulladásos

fájdalommodellekben a leghatékonyabb. Patkány gyulladásos artritisz modellben 0,2 mg/kg

dózisban hatásos. A komplett Freund adjuvánssal (CFA) indukált gyulladásos egér

fájdalomtesztben kialakúló allodíniát pedig már 0,1 mg/kg dózisban teljes mértékben gátolta.

Neuropátiás fájdalomtesztben tolerancia nem alakult ki. A vegyület jelentısebb, nagy

kockázatú mellékhatásoktól mentes. Nem gátolja a hERG csatornákat, nincs

kardiovaszkuláris mellékhatása. A CYP enzimekkel végzett vizsgálatok is eredményesen

zárultak. Ames teszt alapján nem mutagén. A Morris vízlabirintus tesztben nincs hatása a

tanulási folyamatokra. Terápiás dózisban a lokomotoros aktivitást nem növelte. Patkány

toxikológiai vizsgálatban 150 mg/kg/nap dózist is jól toleráltak az állatok. A reménykeltı

képet azonban néhány kedvezıtlen tulajdonság árnyalta. Ismételt adáskor kismértékben

csökkent az expozíció és az analgetikus dózishoz közel szedatív típusú mellékhatások

jelentkeztek. A vegyület inkább a gyulladásos fájdalmat csillapítja mint a célúl kitőzött

neuropátiás fájdalmat. Ellene szólt a kis biohasznosulási értéke is, emiatt HPCD komplexre

vagy valamilyen hatásos formulációra minden bizonnyal a humán alkalmazás során is

szükség lenne. Végül a vegyület nem került továbbfejlesztésre.

Az oxálsavdiamidok körében végzett munkám másik célkitőzése új kondenzált heterociklusok

alkalmazása a molekula baloldali részén. Ennek érdekében elıször a farmakofór modellbe

illeszkedı anilineket kellett elıállítani. Mivel a vegyületcsaládra jellemzı viszonylag gyenge

biohasznosulás oka a rossz oldékonyságból eredı elégtelen felszívódás, ezért új vegyületek

tervezésekor elsısorban az oldékonyság növelésére törekedtem, bár iparjogvédelmi

szempontból, a vegyületkör minél teljesebb lefedése érdekében bármilyen, a megfelelı

pozícióban NH-csoportot tartalmazó heterociklussal kondenzált anilinszármazék elıállítása

kívánatos volt. Az oldékonyság és ezen keresztül a többi ADME paraméter érdemi javulását

75

leginkább a molekula ezen részének megfelelı változtatásától remélhettük. Eredményeimet a

13. táblázatban foglalom össze.

Legrosszabb oldékonysággal éppen az igen hatásos benzimidazolon-származékok

rendelkeztek (186, 11. táblázat). A két hidrogénkötés donor NH-csoport egyikének

metilezésével (200) sikerült a kristályrács energia csökkentésén keresztül az oldékonyságot

növelni, az aktivitás azonban a 186 anyavegyülethez képest egy nagyságrendet romlott. Az

oxigén bázikus jelleget kölcsönzı aminocsoporttal (207) való helyettesítésével szintén javult

az oldékonyság, a receptorhoz való affinitás azonban csökkent. Az indanon- (188) és

benzoxazolon- (184) származékok karbonilcsoportjának szulfocsoportra történı cseréje az

oldékonyság várt mértékő növelése mellett az aktivitás drasztikus mértékő csökkenéséhez

(201), illetve teljes hatástalansághoz (208) vezetett. A még jó oldékonysággal rendelkezı 206

is hatástalan. Anyavegyületeiknél jóval gyengébb a 184 benzoxazolon-származék

benzoxazoltion analogonja (203) és a 186 benzimidazolon-származékból levezethetı

trifluormetil-csoportot tartalmazó molekula (204) is.

13. táblázat. Különbözı, NH-tartalmú heterociklusokkal kondenzált anilinszármazékok (200-208)

NMDA antagonista hatása patkány kortikális sejteken.

H

NN

O

O

Q

a NMDA-kiváltott intracelluláris Ca2+ koncentrációváltozás. b Inhibíció (%) a vegyület 0,1 µM koncentrációjánál meghatározva. c Kinetikai oldékonyság pH=7,4-en és szobahımérsékleten meghatározva.

Annak ellenére, hogy az oxazol és az imidazolgyőrők egy metiléncsoporttal történı

bıvítésével levezethetı heterociklusokat tartalmazó származékok (205, 206) in vitro

eredményei nem érik el az anyavegyületek (184, 186) megfelelı értékeit, 205 in vivo igen

hatásosnak bizonyult. Egér formalinos fájdalomtesztben elért ED50 < 0,1 mg/kg a

legalacsonyabb a projektben meghatározott értékek között. A gyógyszerkémiai gyakorlatban

vegyület 200 201 202 203 204 205 206 207 208

Q NN

O

CH3H

HS

N

O O H

N

N O

ON

S

H

NN

CF3

H

O

N

O

H

N

N

O

H

H NN

NH2

H

H O

SN

O O

Oldékonyságc [µg/ml] 135 >200 71.3 12,7 3,5 5,4 - >200 >200

NMDA-kiváltott ∆∆∆∆[Ca2+]ia

inhibíció %b; IC50 (nM) 42 99 15,2 % 88 48,1 % 29 62 % 99 4 %

76

nem példanélküli eredmény, miszerint egy vegyület in vivo aktivitása jóval nagyobb, mint az

a mért in vitro adatok alapján várható lenne, arra figyelmeztet, hogy az elsıdleges szőrésre

használt in vitro adatokat csak kellı körültekintéssel, több adat összevetésével szabad a

vegyületek kiválasztására használni. Sajnos 205 analgetikus hatása nem volt dózisarányos,

ezért nem került továbbfejlesztésre.

4.4.2. Oxálsavszármazékok elıállítása

A 189 – 197 és 200 – 206 vegyületeket a 30. ábrán látható módon állítottam elı. A

piperidineket trietil-amin jelenlétében etil-oxalil-kloriddal acileztem. Az észtercsoportot

lúgosan hidrolizáltam, majd a sósavval felszabadított karbonsavval (210) HBTU kapcsolószer

segítségével az anilineket acileztem (30. ábra).

H

H

209 210 189 - 197, 200 - 206

N

X

YN

X

YHO

O

O

(i) (ii)

N

X

YN

O

O

Q

190 iii 198194 199iii

30. ábra. Oxálsavdiamidok elıállítása. Reagensek és reakciókörülmények: (i) (1) ClCOCOOEt, Et3N, CHCl3, 10oC, 2 óra; (2) KOH, EtOH/H2O, szobahımérséklet, 2óra; (3) 6N HCl, 10oC, 2 óra; (ii) anilinek, HBTU, Et3N, DMF, szobahımérséklet, 18 óra; (iii) H2O2, ecetsav, szobahımérséklet, 18 óra.

A 198 és 199 szulfoxidszármazékokat a megfelelı tiovegyületek (190 és 194)

hidrogénperoxidos oxidációjával állítottam elı ecetsavban, szobahımérsékleten.

A 207 2-amino-benzimidazol-származékhoz a 30. ábra szerint elıállított 1-es helyzetben Boc-

csoporttal védett származék védıcsoportjának savas eltávolításával jutottam. A 208

származékot 2-amino-5-nitrofenolból kiindulva öt lépésen keresztül a 31. ábrának

megfelelıen alakítottam ki.

NO2

H2N

HO NN

O

ONS

O

O

O

H

H

iii, iv,v

208 (ti.: 34 %) (tii.: 87 %) (tiii.: 66 %) (tiv.: 46 %) (tv.: 40 %)

213211

NO2

HN

HO

Toz

NH2

HN

HO

Toz

i ii

212

31. ábra. 208 elıállítása. Reagensek és reakciókörülmények: (i) TozCl, CaCO3, CH3CN, reflux, 8 óra; (ii)

H2, 10 % Pd/C, CH3OH - THF, szobahımérséklet, 6 óra; (iii) (4-benzil-piperidin-1-il)-oxo-ecetsav, HBTU, Et3N, DMF, szobahımérséklet, 6 óra; (iv) SO2Cl2 CH2Cl2, Et3N, -78°C – szobahımérséklet; (v) NaN3, víz – CH3CN szobahımérséklet, 12 óra.

4-feniltiometil-piperidint (216) tiofenol N-Boc-4-meziloximetil-piperidinnel (129) történı S-

alkilezésével állítottam elı. A kén meta-klór-perbenzoesavval történı oxidációjával a

megfelelı szulfonszármazékhoz (217) jutottam (32. ábra).

77

(ti.: 95 %)

N

X

Boc

(i)

HN

X

N

OMez

Boc

(iii)

SO

O

216 X = S

217 X =

(ii)S

O

O

214 X = S

215 X =

(tiii.: 99 %)

(tii, iii.: 87 %)

129

32. ábra. 4-feniltiometil-piperidin és oxidált származékának elıllítása. Reagensek és reakciókörülmények: (i) NaH, szubsztituált tiofenolok, DMF, 3 óra szobahımérséklet; (ii) mCPBA, 1 óra szobahımérséklet; (iii) 1. 10% HCl/EtOAc, 18 óra, 2. NaHCO3.

4-feniltio-piperidint (220) N-Boc-4-piperidinolból (132) kiindulva ismert eljárás szerint

állítottam elı.109 A kén meta-klórperbenzoesavval történı oxidációjával a megfelelı

szulfonszármazékhoz jutottam (221) (33. ábra).

(ti, iii.: 69 %)

(ti - iii.: 95 %)

N

X

Boc

(i)

N

OH

Boc

(iii)

HN

X

(ii)S

O

O

218 X = S

219 X =

132

SO

O

220 X = S

221 X =

33. ábra. 4-feniltio-piperidin és oxidált származékának elıllítása. Reagensek és reakciókörülmények: (i) (nBu)3P, PhSSPh, THF, 6 óra reflux; (ii) mCPBA, 1 óra szobahımérséklet; (iii) 1. 10% HCl/EtOAc, 18 óra, 2. NaHCO3. 4-Benziloximetil-piperidint (224) N-Boc-4-hidroxi-metil-piperidin (222) O-benzilezésével

(34. ábra), míg 4-fenoxietil-piperidint (227) fenol N-Boc-4-meziloxietil-piperidinnel történı

alkilezésével állítottam elı (35. ábra).

(i)

NBoc

OH (ii)

NBoc

O

HN

O

(t.: 38 %) (t.: 67 %)222 223 224

34. ábra. 4-benziloximetil-piperidin elıllítása. Reagensek és reakciókörülmények: (i) NaH, DMF, benzil- bromid, 6 óra szobahımérséklet (ii) 1. 10% HCl/EtOAc, 18 óra, 2. NaHCO3.

(t.: 83 %) (t.: 77 %)225 226 227

(i)

NBoc

OH(iii)

NBoc

O

HN

O(ii)

35. ábra. 4-fenoxietil-piperidin elıllítása. Reagensek és reakciókörülmények: (i) CH3SO2Cl, Et3N, CH2Cl2, 18 óra szobahımérséklet; (ii) fenol, K2CO3, DMF 5 óra reflux; (iii) 1. 10% HCl/EtOAc, 18 óra, 2. NaHCO3. Eredményeinket szabadalmi bejelentésben110 védtük és egy közleményben111 ismertettük.

78

4.5. Kinurénsav amidszármazékok

4.5.1. Eredmények, szerkezet-hatás összefüggések

Miután a fahéjsavszerkezetet sikeresen transzformáltuk merevebb indol- és benzimidazol

győrőrendszerré, elhatároztuk, hogy megvizsgáljuk az ezekkel rokon, hasonlóan merev

szerkezetek NR2B aktivitását. Az indol és benzimidazol heterociklusos részének egy

karbonilcsoport beépítésével történı hipotetikus győrőbıvítésével 1-H-kinolin-4-on és 1H-

kinazolin-4-on analogonokhoz jutunk:

X

N

O

N

W

Z

Y

H

X

N

O

N

W

O

ZH

Y

82 X = CH, Y = 6-OH 83 X = CH, Y = 5-OH 142 X = N, Y = 5,(6)-OH

Ténylegesen elıállítva ezeket a szerkezeteket elsısorban a 1-H-kinolin-4-on

savszármazékának, a kinurénsavnak piperidinekkel alkotott amidjai voltak a hatásosak. A

vegyületcsaládot az indol és benzimidazol-származékok körében szerzett tapasztalatok

alapján rövid idı alatt, mindössze két tucat vegyület elıállításával sikerült optimalizálni.

Az elıállított vegyületek biológiai aktivitását natív patkány idegsejteket és rekombináns

NR1/NR2B receptorokat expresszáló sejteket felhasználó funkcionális esszében is

meghatároztuk. Ha a vegyület az NMDA receptorcsaládon belül csak az NR2B altípust

gátolja, és az NMDA-n kívül más receptoron keresztül nem befolyásolja az intracelluláris

Ca2+ koncentrációt, úgy a két teszt eredményeinek jó egyezést kell mutatniuk.

Szelektivitásukat az NR2A alegységeket tartalmazó NMDA rceptorokhoz képest ugyanebben

a funkcionális esszében határoztuk meg, rekombináns NR1/NR2A receptorokat expresszáló

sejteket felhasználva. In vivo analgetikus hatást a hosszantartó fájdalmat modellezı egér

formalin tesztben mértük. Szerkezet-hatás összefüggéseket reprezentáló molekulák

funkcionális esszé eredményeit az 14. táblázatban válogattam össze. A natív patkány

kortikális sejteken és a rekombináns NR1a/NR2B receptorokat expresszáló sejteken

végrehajtott funkcionális esszé eredményei, ha számszerően nem is, de nagyságrendileg jó

egyezést mutatnak. Bár hasonló szerkezet-hatás összefüggés olvasható ki mindkét teszt

eredményeibıl, következtetéseimet a leggyorsabban rendelkezésünkre álló natív patkány

kortikális sejteken mért adatok alapján vonom le. Rekombináns NR1a/NR2B és NR1/NR2A

receptorokat expresszáló sejteken csak az elsı szőrın aktív vegyületeket mértük. A csoport

leghatásosabb képviselıje egy 6-hidroxi-kinurénsav-származék, a 236.

79

A 6-hidroxi-származékok többsége közel azonos mértékő, kiváló aktivitással rendelkezik,

függetlenül a piperidingyőrő szubsztitúciójától. Bár nem vizsgáltam a szubsztituensek eléggé

széles körét, úgy tőnik, hogy nincs jelentıs elektronikus vagy sztérikus hatásuk az affinitásra.

A hidroxilcsoport áthelyezése az 1H-kinolin-4-on váz 6-os helyzetébıl a 7-esbe (229) a hatás

drámai csökkenését eredményezte, ellentétben az indolszármazékokkal, ahol az ennek

megfelelı 5- és 6-hidroxi-származékok azonos hatásúak.

14. táblázat. A vegyületek flourimetriás módszerrel meghatározott NMDA antagonista hatása patkány kortikális sejteken és NR1a/NR2B vagy NR1/NR2A alegységeket expresszáló sejteken.

X

N

O

N

Y

R7

R6

O

ZH

vegyület

R6

R7

X

Y

Z

NMDA-kiváltott ∆[Ca2+]i

a,b

inhibíció (%)c IC50 (nM)

n NR1a/NR2Bd

IC50 (nM) NR1/NR2Ad

inhibíció % at 15 µM

228 H H CH CH2 H 4,5 % 1 - -

229 H OH CH CH2 H 27,9 % 1 - -

230 OH H CH CH2 H 9,1 ± 0, 8 5 3,7 7,0

231 OH H CH CH2 F 8,7 ± 1,0 3 4,0 -0,9

232 OH H CH CH2 Cl 9,1 ± 0,58 3 1,9 -5,1

233 OH H CH CH2 CH3 11,0 ± 0,8 3 3,8 -2,4

234 OH H CH O H 49,6 ± 9,9 4 28,0 0,2

235 OH H CH O Cl 7,1 ± 0,8 3 5,1 5,1

236 OH H CH O CH3 6,2 ± 0,78 3 3,3 -3,5

237 AcNH H CH CH2 H 2,6 % 3 - -

238 -HN-C(O)-O- CH CH2 H 21,7 ± 2,8 3 5,6 -2,1

239 OH H NH CH2 H 317 ± 8 6 - -

eritro ifenprodil 470 ± 51 9

treo ifenprodil 162 ± 15 7

83 25 ± 8 3

82 18 ± 4 13

142 2,2 ± 0,4 7 a Átlagértékek ± szórás (± S.E.M. A kísérletek száma (n). b NMDA-kiváltott intracelluláris Ca2+ koncentrációváltozás. c Inhibíció (%) a vegyület 0,1 µM koncentrációjánál meghatározva. d A kísérletek száma NR1a/NR2B esetében 2-3, NR1/NR2A esetében 1.

80

A hidroxilcsoport eltávolítása (228) – a várakozásnak megfelelıen – teljesen inaktívvá teszi a

molekulát. A fenolos hidroxilcsoport NH tartalmú lánccal vagy heterociklusos győrővel

történı cseréjétıl a korábbi tapasztalatoknak megfelelıen lassabb metabolizmust reméltünk.

A hidroxilcsoport helyett acetilamino-csoport alkalmazása (237) a hatás teljes elvesztésével

járt, míg heterociklussal való cserét (238) a hatás jól tolerálta. Összeségében az indolgyőrő

bıvítésével levezethetı 6-hidroxi-kinurénsavamid-származékok két-háromszoros

hatásnövekedést eredményeztek az indolanalogonokhoz képest. A benzimidazolgyőrő

bıvítése kinazolinszármazékká nem volt ilyen eredményes módosítás. 239 1H-kinazolin-4-

on- származék IC50 értéke a benzimidazol anyavegyületénél két nagyságrenddel nagyobb. Az

in vitro és in vivo leghatékonyabb vegyületek oldékonyságát, szelektivitási és in vitro

metabolikus stabilitási adatait, valamint az egér formalin fájdalomteszt ED50 értékeit a 15.

táblázatban foglalom össze.

15. táblázat. Oldékonyság, α1, 5HT2A és [3H]-dopamin kötıdési tesztek a lehetséges mellékhatások monitorozására, in vitro metabolikus stabilitás és egér formalin neuropátiás fájdalomteszt adatok.

Rövidítések: I %: gátlás százaléka a vegyület megadott koncentrációjánál ; DAU: dopamin felvétel; IVM FM%: in vitro metabolizmus, becsült maximális felszívódás, µS: mikroszóma * ED50 értéket nem határoztunk meg, ha a gátlás 20 mg/kg, p.o. dózisban 50%-nál kisebb volt. ** Kinetikai oldékonyság pH=7,4-en és szobahımérsékleten meghatározva.

IVM FM%

vegyület

oldékonyság [µM]

α1 kötıdés

I % (1 µM)

5HT2A kötıdés

I % (1 µM)

DAU

IC50 [µM]

hum. µS

pat. µS

egér formalin teszt, p.o.

ED50 [mg/kg]

230 362 4 11 1,7 99 99 >20 *

231 505 0 5 5,2 99 99 9,5

232 341 3 31 0,8 79 84 >20 *

233 282 2 27 3,6 99 85 >20 *

235 40 6 45 8,3 79 91 >20 *

236 51 3 66 12 97 90 8,2

238 57 0 45 6,3 38 64 >20 *

referencia-vegyületek

CI-1041 (28) 16 39 15,5 - - 5,3

Co-101244 (12) 20 62 10,8 - - > 20 *

EMD 95885 (8) 57 75 0,98 - - 5,9

CP-101,606 2 41 - - - >20 *

Ro-256981 (9) 58 41 4,4 - - >20 *

81

A 6-hidroxi-kinurénsav benzilpiperidinekkel alkotott származékai (230-233) rendkívül

oldékonyak, míg a fenoxipiperidinekkel alkotott származékok (235, 236) és a heterociklust

tartalmazó 238 oldékonysága az elıbbiekétıl egy nagyságrenddel roszabbak. A nem szelektív

NMDA antagonisták mellékhatásaiért leginkább felelıssé tehetı α1 receptorokhoz egyáltalán

nem kötıdnek és az 5-HT2A receptorokhoz sem mutatnak nagy affinitást. A dopamin felvételt

(DAU) azonban viszonylag nagymértékben gátolják. In vitro metabolizmusuk mértékét

humán és patkány mikroszómán meghatározva a 238 heterociklust tartalmazó származék

kivételével metabolikusan stabil vegyületek. In vivo, egér formalin tesztben leghatásosabb

származék az in vitro is legaktívabb 236. A vegyület szelektív, nem kötıdik az NR1/NR2A,

az α1 és 5HT2A receptorokhoz. A dopamin felvételt (DAU) is ez gátolja a legkevésbé.

Összefoglalva, hatásos indol és benzimidazol-származékokból kiindulva az NR2B

altípusszelektív NMDA receptor antagonisták új osztályát, kinurénsav-származékokat

azonosítottam. A vegyületcsalád in vitro legaktívabb tagja a 236, egyben in vivo is a

leghatásosabb. A vegyület további fejlesztését gyenge farmakokinetikai jellemzıi, 158ng/ml

cmax és 0,8 óra plazma féléletidı, de legfıképpen 8 %-os biohasznosulási adata hiúsította meg.

Emellett az idegrendszeri mellékhatásokat jelzı Irwin tesztben már 30 mg/kg dózisnál

detektálható tünetek jelentkeztek. Ezt a számot elosztva a formalin tesztben mért 8,2 mg/kg

ED50 értékkel, négynél kisebb, kockázatosnak ítélhetı terápiás index adódik.

82

4.5.2. Kinurénsav amidszármazékainak elıállítása

228-238 vegyületeket szubsztituált kinurénsav és piperidinszármazékok reakciójával

állítottam elı a szokásos HBTU-t felhasználó kapcsolási eljárás szerint (36. ábra).7

(t.: 60 %)

HN

O

O

OCH3

HNH2

COOCH3

COOCH3N

O

OCH3

O

OCH3+

HN

O

O

OH

R R R

R

i

HN

O

O

N

Y

Z

R

ii

iii, iv

v, vi viii

vii

R = 4-NO2

N

OO

H

6,7-

R =

R =

H249

252

254

R = 253 6-AcNH

N

OO

H

6,7-

R =

R =

H255

261

R = 260 6-AcNHN

OO

H

6,7-

R =

R =

H228

238

R = 237 6-AcNH

R = 3-BnO,R = 4-NO2 N

OO

H

4,5-

R =

R =

H240241a242

243 R = 4-NO2N

OO

H

4,5-

R =

R =

H244

247

248

R = 4-BnO241b R = 3-BnO245 R = 4-BnO246

R = 7-BnO250

R = 6-BnO 251

R = 7-BnO256

R = 6-BnO 258 R = 7-OH257

R = 6-OH 259

R = 7-OH 229

R = 6-OH230-236

vii

(t.: 62 %)

(t.: 88 %)

(t.: 73 %)

(t.: 76 %)

(t.: 91 %)(t.: 32 %)

(t.: 77 %)

(t.: 87 %)

(t.: 99 %)

(t.: 70 %)

(t.: 99 %)(t.: 83 %)

(t.: 99 %)

(t.: 99 %)

(t.: 57 %)

(t.: 32 - 57 %)

(t.: 52 %)

(t.: 55 %)

(t.: 42 %)

36. ábra. Kinurénsav amidszármazékainak elıállítása. Reagensek és reakciókörülmények: (i) MeOH, reflux, 2 óra; (ii) Dowtherm, 240 °C,10 perc; (iii) H2, 10 % Pd/C, MeOH, szobahımérséklet; (iv) Ac2O, reflux; (v) NaOH, MeOH, H2O, szobahımérséklet; (vi) HCl; vii) H2, 10 % Pd/C, MeOH, szobahımérséklet; (viii) piperidinek, HBTU, Et3N, DMF, szobahımérséklet. A kinurénsav intermediereket anilinszármazékokból kiindulva módosított Conrad-Limpach

módszer alapján szintetizáltam.112 253 acetilamino-szubsztituált kinurénsav észtert a

nitroszármazék (252) katalitikus redukciójával képzıdött amino intermedier acetilezésével

állítottam elı. Az észterek alkalikus hidrolízisével szubsztituált kinurénsavakhoz jutottam.

Hidroxiszubsztituált kinurénsavakat O-benzilszármazékuk katalitikus hidrogenolízisével

állítottam elı.

A kinazolinszármazék (239) szintézisekor a kereskedelmi forgalomban beszerezhetı 4-

hidroxi-antranilsavból (262) indultam ki és a 37. ábrának megfelelıen folytattam. 265

antranilamidot hat lépésben a szokásos reakciókkal állítottam elı. A kinazolingyőrőt 266

oxálsavdiamid termális kondenzációjával alakítottam ki. A végtermékekhez az O-benzil

védıcsoport katalitikus hidrogenolízisével jutottam.

83

HO

NH2

C

O

OH HO

N

C

O

OCH3

AcH

BnO

NH2

C

O

OCH3

BnO

NH2

C

O

NH2 BnO

N

C

O

NH2

C

O

C

O

NH

N

NHO

O

O

N

H

i, ii

v, vi vii

viii

iii,iv

262 263 264

265 266

239

(t.: 70 %) (t.: 88 %)

(t.: 12 %)

(t.: 21 %) 37. ábra: Kinazolinszármazék (239) elıállítása. Reagensek és reakciókörülmények: (i) SOCl2, MeOH, -20°C - szobahımérséklet; (ii) 1. Ac2O, 50°C; 2. Na2CO3 aq, szobahımérséklet; (iii) benzil-bromid, K2CO3, aceton, reflux, 4 óra; (iv) HCl, MeOH, reflux, 1 óra; (v) 1. 10 % NaOH, MeOH, reflux, 1 óra; 2. HCl; (vi) SOCl2, CHCl3, 1csepp DMF, reflux, 2 óra; 2. NH3, víz, 0°C; (vii) (4-benzil-piperidin-1-il)- oxo-ecetsav, HBTU, Et3N, DMF; (viii) 1. 250°C, 1,5 óra; 2. H2, 10 % Pd/C, THF, szobahımérséklet. Eredményeinket szabadalmi bejelentésben113 védtük és egy közleményben114 ismertettük.

4.6. Benzoil-karbamid-származékok

4.6.1. Eredmények, szerkezet-hatás összefüggések

A fahéjsavamidok, indol- és benzimidazol-2-karboxamidok és az oxálsavdiamidok körében

végzett kutatásunk alapján a következı megállapítások tehetık az ifenprodil farmakofór

modellt illetıen. A leghatásosabb szerkezetek két terminális benzolgyőrőt tartalmaznak,

melyek közül az egyik egy metabolikusan stabil hidrogénkötés donorcsoportot visel. A két

benzolgyőrőt elınyösen bázikus csoportot nem tartalmazó, különbözı hosszúságú és

heteroatomtaralmú lánc köti össze. Kémiai munkánk kiinduló pontja az University of Oregon,

a CoCensys és a Parke-Davis 37-es fahéjsavamid-származéka volt. A fahéjsav α szénatomja

és a benzolgyőrő közé beépített nitrogén indol-2-karboxamid-származékot eredményezett

(82), mely hétszer hatásosabb volt 37 anyavegyületnél. Az indol-2-karboxamid

pirrolgyőrőjének újbóli képzeletbeli felnyitásával és az így képzıdött metiléncsoport oxigénre

való cseréjével levezethetı oxálsavszármazék (183) kétszer aktívabb volt in vitro a 82 indol-

2-karboxamidnál. Bár ezek az intuitív szerkezeti módosítások eredményesnek bizonyultak, a

rendelkezésünkre álló kémiai tér teljesebb körő feltérképezéséhez, újabb hatásos

84

vegyületcsaládok azonosításához a következı analitikus megközelítésre volt szükség. A

tervezett új vegyületekben a farmakofór modell legbiztosabb elemeit, a hidrogénkötés

donorcsoportot tartalmazó benzolgyőrőt és a leggyakrabban elıforduló 4-benzil-piperidint

állandónak hagytam, csak az ezeket összekötı, a leghatásosabb molekulákra jellemzı

háromtagú láncot változtattam. A hidrogénkötés donor praktikus okokból vagy

hidroxilcsoport vagy benzolgyőrővel kondenzált oxazolon volt, attól függıen, hogy melyik

származékot lehetett egyszerőbben, gyorsabban elıállítani. A hidrogénkötés donorcsoporthoz

képest para-helyzető aromás szénatomot a 4-benzil-piperidin nitrogénjével számos stabilnak

és gyógyszerszerőnek tőnı háromtagú lánccal kötöttem össze. Az elıállított vegyületek

patkány kortikális sejteken meghatározott funkcionális tesztjének eredményeit a képletek alatt

tüntetem fel (38. ábra).

AB

CN

HO

N

O

HN

S

O O O

HO

O

O

O

O

OOH

N

O O

H

26832 %

269100 nM

267511 nM

N

O

O

18311 nM

O

37 131 nM

H

273-2,8 %

27424 nM

272461 nM

271354 nM

270 366 nM

38. ábra. 4-hidroxi-benzol és 4-benzil-piperidin nitrogénjét összekötı háromtagú A-B-C összekötı láncok.

Az összekötı lánc nem egyszerően távtartó, hanem fontos szerepet tölt be a receptorral való

kölcsönhatásban. Ezt támasztja alá az a megfigyelés, miszerint a lánc elemei, ahogy azt a

példák is mutatják, nem kombinálhatók szabadon. Vizsgálatunk etalonja a CoCensys

fahéjsavamidja (37) és a kutatócsoportunk oxálsavdiamid vezérmolekulája (183). A fahéjsav-

amid (37) kettıs kötésének telítése (268) a hatás elvesztésével járt. A savamid jelleg

megszüntetésével (269) a hatás kismértékben javult de nem közelítette meg az oxálsavdiamid

vezérmolekuláét. A 267, 270, 271 és 272 három atom hosszúságú acilszármazékok gyenge in

vitro aktivitást mutattak, míg a 273 szulfamidszármazék teljesen inaktív volt. A 274 benzoil-

karbamid-származékot viszont optimalizálásra alkalmasnak találtuk. Fenol helyett 3,4-

benzoxazolont tartalmazó modellvegyületek esetében is hasonló eredményre jutottam (39.

ábra). Az oxálsavdiamid anyavegyület (184) aktivitását egyik származék sem közelítette meg,

85

a korábban optimalizált fahéjsavamid-származékunk (81) teszteredményét azonban három

molekula is (275, 279, 281). A 147 oxálsavdiamid kén tartalmú megfelelıje (275) tizenötször

kevésbé hatásos az anyavegyületnél (184). Szerkezete alapvetıen nem különbözik tıle,

drasztikus hatásnövekedést az optimalizációjától nem várhatunk, ezért több kéntartalmú

származékot nem állítottam elı. A 279 szerkezete már jelentısen eltér az oxálsavdiamid

anyavegyületekétıl. Tartalmaz azonban egy bázikus nitrogént, amit el szerettünk volna

kerülni. Ily módon a 3,4-benzoxazolont tartalmazó modellvegyületek funkcionális

teszteredményei alapján is a benzoil-karbamid-származék (281) bizonyult optimalizációra

alkalmas molekulának. Újabb származékok képzése elıtt a két benzoil karbamidot (274 és

281) további biológiai vizsgálatoknak vetettük alá. Meglepı módon a heterociklussal

kondenzált benzoil-karbamid-származék (281) hatása az anyavegyületekéhez képest nem volt

olyan meggyızı, mint a hidroxianalogon (274) esetében.

HN

O AB

CN

O

H

184 2,4 nM

275 38 nM

81 28 nM

N

O

CH3H

N

NH

OH

N

NOH

OH

N

O

CH3

N

NH

H

N

O

O

HN

S

O

HO

N

OO

H

277 1800 nM

278 345 nM

276 395 nM

280 162 nM

281 59 nM

279 39 nM

39. ábra. 3,4-benzoxazolont és 4-benzil-piperidin nitrogénjét összekötı különbözı háromtagú láncok hatása a vegyületek funkcionális tesztjeinek eredményére.

A kielégítı in vitro aktivitás és a szerkezeti újdonság miatt további származékok képzését

határoztam el. Az eddig kutatott vegyületcsaládoktól eltérıen a hidroxiszármazék hatásosabb

volt a 3,4-benzoxazolon analogonnál, ezért elsısorban hidroxiszármazékokat állítottam elı. A

benzoil-karbamidok biológiai aktivitását mindhárom funkcionális esszében meghatároztuk. E

három funkcionális esszé eredményeit, szerkezet-hatás összefüggéseket is reprezentáló

molekulák esetében, valamint a referenciavegyületek NR1a/NR2B és NR1/NR2A

alegységeket expresszáló sejteken meghatározott aktivitását a 16. táblázatban foglaltam

össze.

86

16. táblázat. Benzoil-karbamid-származékok NMDA antagonista aktivitása natív patkány kortikális sejteken, valamint NR1a/NR2B és NR1/NR2A alegységeket expresszáló sejteken fluorometriás módszerrel meghatározva.

H

C

O

NC

N

Y

O

X Z

vegyület

X

Y

Z

NMDA-kiváltott ∆ [Ca2+]ia,b

inhibíció (%)c IC50 (nM)

NR1a/NR2Bd IC50 (nM)

NR1/NR2Ad inhibíció %

at 15 µM

282 4-OH CH2 Cl 14 5,3 1,8

283 4-OH CH2 4-CH3 13 6,2 8,7

284 4-OH CH2 4-OCH3 16 7,6 -5,7

285 4-OH CH2 4-CF3 37 8,3 19,7

286 4-OH CH2 F 23 19,3 4,9

274 4-OH CH2 H 24 28,0 2,6

287 4-OH CH2 3-OCH3 46 58,9 -0,9

288 4-OH CH2CH2 4-CH3 42 14,3 11,4

289 4-OH CH2S H 35 59,1 -2,9

referenciavegyületek

CI-1041 (28) 8,4 21,0

Co-101244 (12) 4,8 -8,7

EMD 95885 (8) 48 0,1

CP 101,606 30 2,5

Ro 25.6981 (9) 57 1,0

eritro ifenprodil 459 -2,7

MK-801 43 IC50=386 nM a A kísérletek száma natív patkány kortikális sejteken 4-6 b NMDA-kiváltott intracelluláris Ca2+ koncentrációváltozás. c Inhibíció (%) a vegyület 0,1 µM koncentrációjánál meghatározva. d A kísérletek száma NR1a/NR2B esetében 2, NR1/NR2A esetében 1.

Bár következtetéseimet az NR1a/NR2B receptorokat expresszáló sejteken meghatározott

adatok alapján vonom le, a nagyfokú NR2B szelektivitásnak köszönhetıen a leírt

összefüggések a natív patkány kortikális sejteken mért adatok alapján is helytállóak. A

fenilgyőrő 4-es helyzetének különféle szubsztitúciója nem befolyásolja alapvetıen az

aktivitást, elektronküldı (283, 284) és elektronszívó (282, 285) csoportok is kiváló hatású,

szelektív vegyületeket eredményeznek. A 4-fluorfenil (286) és fenil (274) származékok

ezekhez képest 3 - 4-szeres NR1a/NR2B aktivitáscsökkenést mutatnak. Az aktivitási sorrend

87

arra utal, hogy a nagyobb affinitás elérésében a hidrofób kölcsönhatásnak nagyobb szerepe

lehet, mint az elektronikus faktoroknak. A metoxicsoport 3-as helyzetbe történı áthelyezése

(287) a hatás egyértelmő csökkenését vonta maga után. Az Y összekötı lánc 283 molekula

esetében egy metiléncsoporttal (288), 174 molekula esetében egy kén atommal (289) történı

meghosszabbításával az aktivitás a felére csökkent. Az összes vegyület magas NR1a/NR2B

szelektivitást mutat, az NR1/NR2A receptorokon inaktívak.

A leghatásosabb benzoil-karbamid-származékok elérik a legaktívabb referenciavegyületek

megfelelı in vitro értékeit, a klinikai fázisba került CP-101,606 hatását pedig többszörösen

felülmúlják. In vivo analgetikus hatást a hosszantartó fájdalmat modellezı egér formalin

tesztben mértük (17. táblázat). Leghatásosabb, orálisan is felszívódó származék a szubsztituá-

latlan 274 analogon, jelezve, hogy a benzoil-karbamidok nem csak in vitro aktivitásban és

szelektivitásban de in vivo aktivitásban is összemérhetıek a referenciavegyületekkel.

17. táblázat. Egér formalin neuropátiás fájdalomteszt adatok.

vegyület ED50 (mg/kg p.o. vagy jelezve)

274 1,6

286 27

referenciavegyületek

CI-1041 (28) 2,4

Co-101244 (12) >20* (5,9 mg/kg i.p.)

EMD 95885 (8) 3,7

CP-101,606 >20*

Ro-256981 (9) >20* (5,1 mg/kg i.p.)

*: ED50 értéket nem lettek meghatározva, ha a gátlás kevesebb mint 50 % 20 mg/kg, p.o..

A 274 vegyület egér formalin tesztben kiváló hatással rendelkezett, ráadásul a projekt

vegyületei közül egyedülálló módon nem növelte a lokomotoros aktivitást (15 mg/kg dózisig

nincs effektus). Jó oldékonysága (44 µg/ml) és metabolikus stabilitása (95 % humán

mikroszóma) ellenére a molekula nem szívódott fel kellı mértékben, biohasznosulása csak 11

%. A többi farmakokinetikai paramétere sem kielégítı: alacsony cmax (652 ng/ml) és féléletidı

(0,6 óra), ugyanakkor magas kiürülés (31,7 ml/perc/kg) jellemzi. Egér neuropátiás fájdalom

modellben nem mutat antiallodíniás hatást. Ennek oka valószínőleg a kismértékő felszívódás

mellett a gyenge agyi penetráció. Ez lehet az oka a lokomotoros aktivitást nem befolyásoló

mellékhatás-mentességének is. A vegyület nem került továbbfejlesztésre.

88

4.6.2. Benzoil-karbamid-származékok elıállítása

A tervezett vegyülettár minél gyorsabb létrehozása érdekében szilárd fázisú parallel reakciók

kivitelezése mellett döntöttem. A gyorsaság mellett célszerő is volt ez a megközelítés, mivel a

kiindulási 4-hidroxi-benzoesavamidot a fenolos hidroxilcsoporton keresztül könnyen szilárd

fázisú gyantához lehetett kötni. Megközelítıleg 50 vegyületet állítottam elı ily módon (40.

ábra). A 4-hidroxi-benzamidot (290) Mitsunobu körülmények között Wang gyantához

kötöttem, majd a benzamidot (291) oxalil-kloriddal benzoil-izocianáttá (292) alakítottam.115 A

benzoil-karbamid-származékokat a benzoil-izocianát (292) és különbözı piperidinek addícós

reakciójában állítottam elı. Végül a 4-hidroxi-benzoil-karbamid célvegyületeket TFA 10 %

diklórmetános oldatával hasítottam le a gyantáról.

H

290

OH

CO NH2

iii, ivC

O

NC

N

X

O

HO

i iiY

O

CO NH2

O

CO NCO

291 292 274, 282-289 (t.: 5-10 %) 40. ábra. 4-hidroxi-benzoil-karbamid-származékok elıállítása szilárd fázison. Reagensek és reakciókörülmé- nyek: (i) Wang gyanta, Ph3P, DEAD, THF, 0°C - szobahımérséklet, 24 óra; (ii) ClCOCOCl, 1,2-diklóretán, 75°C, 0,5 óra; (iii) piperidinszármazékok, 1,2-diklóretán, DIEA, szobahımérséklet, 1 óra; (iv) 10 % TFA - CH2Cl2, 2 óra, szobahımérséklet.

A bepárlási maradék oszlopkromatográfiás tisztítását követıen a termék azonosságát és

tisztaságát HPLC-MS módszerrel határoztuk meg. A hatásos vegyületeket újraszintetizáltuk,

szerkezetüket igazoltuk (IR,1-H NMR, HRMS). Az újraszintézist 4-benziloxi-benzamidból

kiindulva a szilárd fázisú eljárással analogon módon végeztem el.

Iparjogvédelmi szempontból a szintézisutat az irodalomban elıforduló másik gyakori benzoil-

izocianát elıállítási módszerrel is kidolgoztam (41. ábra).116 4-benziloxi-benzoesavból

tionilkloriddal savkloridot állítottam elı, majd a savkloridból nátrium-cianáttal ón-tetraklorid

jelenlétében izocianátot képeztem. A végtermékeket a megfelelı benziloxiszármazékok

katalitikus hidrogenolízisével, hidrogénezésre érzékeny csoportok jelenléte esetén

hidrogénbromidos hasításával állítottam elı.

89

293 294 274, 282-289

H

BnO

C

O

OH i, ii

BnO

C

O

NCO iii, iv

HO

C

O

NC

N

R2

R1

O

(t.: 56 %)(t.: 38 %)

41. ábra. 4-hidroxi-benzoil-karbamid-származékok elıállítása. Reagensek és reakciókörülmények: (i) SOCl2, reflux, 3 óra; (ii) NaOCN, SnCl4, acetonitril, benzol, reflux, 3 óra; (iii) szekunder amin, szobahımérséklet, 1óra; (iv) H2, 10 % Pd/C, MeOH, szobahımérséklet vagy 33 % HBr/ecetsav, 1 óra, szobahımérséklet.

Eredményeinket szabadalmi bejelentésben117 védtük és egy közleményben118 ismertettük.

4.7. Indol-2-karboxamidin-származék

4.7.1. Eredmények, szerkezet-hatás összefüggések

A Merck Sharp & Dohme kutatói új vegyületek tesztelése során az E-N1-(benzil)fahéjsav-

amidint (45) az NR2B-tartalmú receptorokhoz erısen kötıdı molekulaként azonosították.119

A molekula teljesen új szerkezet, eltér az ifenprodil farmakofór modelltıl, hiányzik belıle a

fenolos hidroxilcsoport és a benzil-piperidin, ezért reménykeltı jelöltként egy új

gyógyszerkémiai programot iniciált a Mercknél. Az optimalizáció során az egyik legaktívabb

származéknak a 2-metoxi-benzil-származék (46) adódott.

N

NH

HN

NH O

H

45 46

NR2B-Ki: 9 nM (irod. adat) NR2B-Ki: 0,7 nM (irod. adat) NR2B-IC50: 4,2 nM (saját mérés)

Gyógyszerszerőbb származékokat keresve találtak rá a benzil-benzamidin vegyületcsaládra,

amelynek szubsztituálatlan képviselıje (47) hatástalan volt, megfelelıen helyettesített

benzolgyőrőkkel viszont aktív származékokat sikerült elıállítaniuk.79 Az egyik leghatásosabb

képviselı a benzilcsoport 2-es helyzetében szintén metoxicsoporttal szubsztituált (48). A

vegyületcsalád aktív tagjai jó orális farmakokinetikával rendelkeztek és a karragén-indukált

hiperalgézia tesztben rágcsálókban hatásosak, ugyanakkor a nemszelektív NMDA

antagonistákra jellemzı lokomotoros mellékhatástól mentesek voltak.

90

H HN

NH

N

NH O

CF3O

47 48 Ki > 15000 nM (irod. adat) Ki = 5,7 nM (irod. adat)

Kutatásunk elején a Cocensys fahéjsavamid (37) sztirol részének merevítésével jutottunk

az elsı vezérmolekulánkhoz, a (82) indol-2-karboxamid-származékhoz.

HN

O

N HOHO

O

N

37 82 NR2B-IC50: 131 nM NR2B-IC50: 28 nM

Feltételezésem, miszerint ez a transzformáció az amidinek esetében is sikeres lesz, helyesnek

bizonyult. Indol-2-karboxamidineket (295-309) állítottam elı, melyek hatásosan gátolták az

NR2B receptorokat. A vegyületcsalád optimalizációját megkönnyítették a Merck

közleményei119, 79. E eredményeiket felhasználva határoztam meg az elıállítandó molekulák

szubsztituenseit.

Az elıállított vegyületek biológiai aktivitását funkcionális esszében határoztuk meg, melynek

során az NMDA által kiváltott intracelluláris Ca2+ szint növekedésének gátlását mértük

patkány kortikális sejteken. Szelektivitásukat az NR2A alegységeket tartalmazó NMDA

rceptorokhoz képest ugyanebben a funkcionális esszében határoztuk meg, rekombináns

NR1/NR2A receptorokat expresszáló sejteket felhasználva. Az in vivo analgetikus hatást a

hosszantartó fájdalmat modellezı egér formalin tesztben mértük. A szerkezet-hatás

összefüggéseket reprezentáló molekulák funkcionális esszé eredményeit a 18. táblázatban

válogattam össze.

A benzilcsoport szubsztitúciója azt mutatja, hogy a hatás nem viseli el a 3-as és a 4-es

helyzetek helyettesítését. A 3-metoxi (307) és 4-metoxi (308) analogonok teljesen

hatástalanok a funkcionális teszten. A 2-metoxi-származék (295) azonban igen aktív, míg más

csoportok ebben a pozícióban (305, 306) kevésbé hatásos molekulákat eredményeznek. A 2-

es és 6-os helyzetben metoxicsoportokkal diszubsztituált származékok aktivitása hasonló

(300, 302), vagy nagyobb (299, 301) a monoszubsztituált analogonokhoz (296, 298 és 295,

297) képest. Más diszubsztitúció (303 és 304) gyengébb vegyületeket eredményezett.

91

18. táblázat. Indol-2-karboxamidin-származékok flourimetriás módszerrel meghatározott NMDA antagonista hatása patkány kortikális sejteken.

H

HCl

N

NH2

NR

1R

2

vegyület R1 R2 k’d

NMDA-kiváltott ∆∆∆∆[Ca2+]i

a,b

inhibíció (%)c

IC50 (nM)

n

295 H 2-OCH3

5,23 35 ± 5 5

296 5-MeO 2-OCH3

5,56 19 ± 3 3

297 5-F 2-OCH3

5,63 33 ± 6 3

298 5-Cl 2-OCH3

6,55 64 ± 12 3

299 H 2,6-(OCH3)2 3,67 5,4 ± 0,8 3

300 5-MeO 2,6-(OCH3)2 3,61 26 ± 5 5

301 5-F 2,6-(OCH3)2 3,80 17 ± 3 3

302 5-Cl 2,6-(OCH3)2 3,90 69 ± 13 4

303 H 2,6-di-F 3,52 143 ± 27 4

304 H 3,5-di-Cl 3,91 159 ± 17 3

305 H 2-CH3 3,73 170 ± 34 4

306 H 2-F 3,54 232 ± 36 3

307 H 3-OCH3 2,61 57,0 % 2

308 H 4-OCH3 2,58 10,5 % 1

309 H H 2,46 32,8 % 1

Referenciavegyületek

eritro ifenprodil

470 ± 51 9

37 131 ± 10 2

82 18 ± 4 13

46 6,6 ± 1,1 3 a Az értékek az átlagot és a szórást (± S.E.M) képviselik. A kísérletek száma (n). b NMDA-kiváltott intracelluláris Ca2+ koncentrációváltozás. c Inhibíció (%) a vegyület 0,1 µM koncentrációjánál meghatározva. d HPLC-MS kapacitás faktora.

Valószínőleg azért vezet hatásos vegyületekhez az orto-szubsztitúció és méginkább a nagyobb

kiterjedéső 2,6-diszubsztitució, mivel az orto-szubsztitúció képes az aromás B győrőt

kifordítani a benzamidincsoport síkjából. A 2-metoxi R2 csoportot konstansként tartva az

92

indolgyőrő szubsztitúciójának jelentıs hatása figyelhetı meg az affinitásra. Az aktivitás az R1

szubsztituens elektron küldı sajátságától függ, az 5-klórtól kiindulva az 5-fluoron át az 5-

metoxicsoportig nı. Leghatásosabb vegyület az indolrészen nem szubsztituált, 2,6-

dimetoxibenzil-származék (299). A nem szubsztituált analogon (309) inaktív, ami azt jelzi,

hogy önmagában a váz nem elég az aktivitás eléréséhez. Az in vitro és in vivo leghatékonyabb

vegyületek oldékonyságát, szelektivitási és in vitro metabolikus stabilitási adatait a 19.

táblázatban, az egér formalin fájdalomteszt ED50 értékeit a 20. táblázatban foglalom össze.

19. táblázat. Oldékonyság, α1, 5HT2A és [3H]-dopamin kötıdési tesztek a lehetséges mellékhatások monitorozására, NR1/NR2A szelektivitási adatok, in vitro metabolikus stabilitás és egér formalin neuropátiás fájdalomteszt adatok.

Rövidítések: I %: gátlás százaléka a vegyület megadott koncentrációjánál; DAU: dopamin felvétel; IVM FM%:

in vitro metabolizmus, becsült maximális felszívódás; µS: mikroszóma; Old.: kinetikai oldékonyság pH=7,4-en

és szobahımérsékleten meghatározva.

Az indol-2-karboxamidinek a projekt legoldékonyabb vegyületei. A nem tiszta profilú NR2B

szelektív NMDA antagonisták mellékhatásaiért leginkább felelıssé tehetı α1 és 5-HT2A

receptorokhoz nem mutatnak affinitást, ellenben a dopamin felvételt (DAU) viszonylag

nagymértékben gátolják. A humán és patkány mikroszómán mért in vitro metabolikus

stabilitási értékek jelentıs eltérése ellenére, a relevánsabb humán adatok alapján

metabolikusan stabil vegyületek. Bár a csoport metabolikusan legkevésbé stabil képviselıje

éppen az in vivo, egér formalin fájdalomteszten leghatékonyabb 295 származék. Ebben a

tesztben az 295 vegyület jó közepes hatást mutatott, ED50 értéke a legjobb

referenciavegyületek értékének alig háromszorosa, míg a többi NR2B szelektív

referenciavegyület nem hatékony.

IVM FM%

vegyület

R1

R2

Old. [µM]

α1 kötıdés

I % (1 µM)

5HT2A kötıdés

I % (1 µM)

DAU IC50 [µM]

NR1/NR2A I %

(15 µM) humán µS

patkány µS

295 H 2-OCH3

200 40 10 2.5 - 68 93

297 5-F 2-OCH3

599 16 18 31 - 99 67

299 H 2,6-(OCH3)2 578 39 48 1,2 32,1 99 61

301 5-F 2,6-(OCH3)2

550 42 47 0,8 - 99 68

93

20. táblázat. Egér formalin neuropátiás fájdalomteszt adatok.

*: ED50 értéket nem határoztunk meg, ha a gátlás 20 mg/kg, p.o. dózisban 50%-nál kisebb volt. Összefoglalva, új indol-2-karboxamidin-származékokat állítottam elı, amelyek hatásos és

NR2B szelektív antagonistái az NMDA receptornak. A vegyületcsalád körében végzett

vizsgálatainkból az a következtetés vonható le, hogy az ilyen típusú vegyületek aktivitása az

aromás győrők szubsztituenseinek karakterétıl és helyzetétıl szokatlanul nagymértékben

függ. A legjobb orális hatása egér formalin tesztben az 295 vegyületnek volt. Eredményeinket

szabadalmi bejelentésben120 védtük és egy közleményben121 ismertettük. Az általam, a Roche

és a Merck kutatói által elıállított aciklusos és ciklusos amidinek in vitro igen aktív és NR2B

szelektív, in vivo a referenciavegyületekhez képest elfogadható hatású vegyületek, az újabb

generációs leghatásosabb ifenprodilszerő anyagokkal szemben azonban nem állják ki az

összehasonlítás próbáját, sem farmakodinámiai, sem farmakokinetikai szempontból.

4.7. 2. Indol-2-karboxamidin-származékok elıállítása

Az indol 2-es helyzetében korábban még senki sem alakított ki amidincsoportot A tervezett

vegyületeket oldatfázisú parallel szintézissel állítottam elı (42. ábra).

310

HN

O

OHR1

N CN

R1i, ii, iii iv, v, vi

Cl

N

NH2

NR1

R2

H H

H

ti, ii.: 90 - 99 %; tiii.: 41- 84 % tiv.: 82 - 99 %; tv, vi.:3 - 59 %

311 295-309

42. ábra. Indol-2-karboxamidin-származékok elıállítása. Reagensek és reakciókörülmények: (i) SOCl2, CHCl3, reflux 2 óra; (ii) NH4OH; (iii) POCl3, CHCl3, reflux 2 óra; (iv) HCl, EtOH, szobahımérséklet, 2 óra; (v) benzilaminok, szobahımérséklet, 6 óra; (vi) HCl.

vegyület R1 R2

egér formalin teszt, p.o. ED50 [mg/kg]

295 H 2-OCH3

15

297 5-F 2-OCH3

>20*

299 H 2,6-(OCH3)2 >20*

301 5-F 2,6-(OCH3)2

-

referenciavegyületek

CI-1041 (28) 5,3

Co-101244 (12) >20* (5,9 mg/kg i.p.)

EMD 95885 (8) 5,9

CP-101,606 >20*

Ro-256981(9) >20* (5,1 mg/kg i.p.)

94

Közel 200 tagú vegyülettárat hoztam létre nemszubsztituált és 5-szubsztituált-indol-2-

karbonsavnitrilekbıl kiindulva benzilaminokkal, Pinner szintézisen keresztül. Az indol-2-

karbonsavnitrileket a kereskedelmi forgalomból beszerezhetı indol-2-karbonsavakból

állítottam elı a szokásos eljárásokkal. A nitrileket Pinner reakcióban alakítottam a megfelelı

imidátokká8. Ezeket benzilaminokkal reagáltatva jutottam az amidin végtermékekhez. A

nyerstermék oszlopkromatográfiás tisztítását követıen a termék azonosságát valamint

tisztaságát HPLC-MS módszerrel határoztuk meg, és k' értékkel (tisztaság-kapacitás faktor)

jellemeztük. A k' faktorokat a következı képlet szerint határoztuk meg: k' = (tR - t0) / t0

ahol k’= kapacitás faktor, tR = retenciós idı és t0 = az eluens retenciós ideje.

A hatásos vegyületeket újraszintetizáltuk, szerkezetüket igazoltuk (IR,1H-NMR, HRMS).

4.8. Benzilidén-piperidin-származékok

Az NR2B szelektív NMDA antagonisták várhatóan csak kis mértékben, vagy egyáltalán nem

rendelkeznek azokkal a mellékhatásokkal, amelyek a nem szelektív NMDA antagonistákra

jellemzıek. A nem szelektív NMDA antagonista fenciklidin és ketamin pszichotomimetikus

hatásokat, hallucinációt, rosszullétet, katatóniát, amnéziát idéznek elı. Ezek a komoly

mellékhatások gátolják gyógyszerként való használatukat. Az ebbe a csoportba tartozó

vegyületek állatoknál is viselkedési rendellenességeket okoznak, például erısen stimulálják a

motoros aktivitást, amnéziát és csökkent motoros koordinációt váltanak ki. NR2B altípus

szelektív antagonistáknál kevés humán vizsgálat áll rendelkezésre, így ennek hiányában az

állatokban tapasztalt mellékhatásokat tekintjük meghatározónak. Az NR2B szelektív

vegyületek a nem szelektív NMDA antagonistákra jellemzı komoly mellékhatásokat nem

mutatják, állat viselkedés tanulmányokban azonban a legtöbbnél lokomotoros aktivitást

fokozó hatást figyeltek meg. A referenciavegyületek közül az Ro 25-6981-nél tapasztaltak

ilyen hatást122, a CP-101,606 vegyületnél még nagyobb dózisokben sem123. Az irodalom

alapján a CP-101,606 jelő vegyület az egyetlen NR2B szelektív antagonista, mely nem

rendelkezik mozgást stimuláló hatással. Mivel a CP-101,606 jelő vegyület gyenge orális

hatékonysággal rendelkezik és a közölt adatok alapján embereknek csak intravénásan

adagolták, valamint polimorf CYP2D6 mediált metabolizmusa van124, nagy szükség van egy

új NR2B szelektív antagonistára, mely kevés mellékhatással (magas terápiás index) és jó

orális hatékonysággal (biológiai hasznosíthatóság) rendelkezik és terápiás célokra, fıleg orális

kezelésekre, jól fejleszthetı. Munkánk során azt tapasztaltuk, hogy ha az eddig általunk

azonosított hatásos szerkezetekben a benzil-piperidin részt benzilidén-piperidinre cseréljük

szintén hatásos NR2B szelektív NMDA antagonistákhoz jutunk, amelyek in vivo

95

fájdalomcsillapító hatással rendelkeznek, hasonlóan a telített benzil-piperidin analogonokhoz.

Ráadásul míg az utóbbi molekulák analgetikus dózisukban kisebb-nagyobb mértékben

fokozták a lokomotoros aktivitást, addig a benzilidén-piperidin-származékok nem

rendelkeznek mozgást stimuláló hatással a hatékony dózis legalább 6-szoros mennyiségénél

sem. Ezen tulajdonságuk miatt terápiásan kedvezıbbek, mint az alacsonyabb terápiás index-

szel rendelkezı NR2B szelektív NMDA antagonisták. Benzilidén-piperidin analogonokat a

leghatásosabb vegyületcsaládokban, az indol, benzimidazol és oxálsavdiamidok körében

állítottam elı.

4.8.1. Eredmények, szerkezet-hatás összefüggések az indol- és benzimidazol-

származékok körében

Az NR2B és rekombináns NR1/NR2A receptorokat expresszáló sejteken meghatározott

funkcionális esszék eredményeit a 21. táblázatban foglaltam össze. Az 5(6)-hidroxi-

benzimidazol-2-karbonsav 4-benzilidén-piperidinnel képezett amidja (312) az in vitro

funkcionális tesztben ugyanolyan hatásos, mint a korábban elıállított telített analogonja. Bár

a 4-fluor-származék (314) IC50 értéke egy nagyságrenddel nagyobb a telített változatétól, még

így is igen aktív vegyület.

21. táblázat. A benzimidazol- és indolszármazékok flourimetriás módszerrel meghatározott NMDA antagonista hatása patkány kortikális sejteken és NR1/NR2A transzfektált sejteken.

H

Y

N

O

N HO X

a Zárójelben a telített analogon száma. b NMDA-kiváltott intracelluláris Ca2+ koncentrációváltozás. c Zárójelben a telített analogon IC50 értéke.

vegyületa

Y

X

NMDA-kiváltott ∆∆∆∆ [Ca2+]i

b

IC50 (nM) c

NR1/NR2A I % (15 µM)

312 (142) N H

3,3 (2,2) 33%

313 N CH3

28 34%

314 (148) N F

11 (1,2) <30%

315 N Cl

21 <30%.

316 N CH3O 10 52%

317 (82) CH H 77 (18) <30%

96

A metoxi-, klór- és metilcsoporttal helyettesített származékok (316, 315, 313) is kellı

hatékonyságot mutattak ezen a teszten. A 6-hidroxi-indol-2-karbonsav 4-benzilidén-

piperidinnel képezett amidja (317) négyszer kevésbé aktív, mint a telített (82) analogon.

Szelektivitásuk az NR2A alegységeket tartalmazó NMDA receptorokhoz képest kielégítı.

Affinitásuk az NR2A receptorokhoz szokatlanul nagy. Bár a 316 származék 52 %-os gátlása

NR2A transzfektált sejteken a projektben mért legmagasabb hasonló érték, a szelektivitás

még így is kb. 100. A benzilidén-piperidin-származékok a többi NR2B szelektív NMDA

anatagonista vegyületcsalád közül azzal tőnnek ki, hogy az in vivo analgetikus tesztekben

meghatározott hatékony dózisai a leginkább elkülönülnek azoktól a dózisoktól, ahol már

mellékhatások figyelhetık meg. A farmakon biztonságosságát a két dózis hányadosával az ún.

terápiás index-szel jellemzzük. Minél nagyobb ez az érték, a szer annál inkább biztonságos, a

dozírozási lehetıségek nem lesznek szők korlátok közé szorítva. A vegyületek in vivo

analgetikus hatását a tesztrendszerünknek megfelelıen elıször egér formalin tesztben mértük,

a többi analgetikus modellt csak a tesztrendszer következı szintjein alkalmaztuk. Az elsı

CNS mellékhatást jelzı teszt a lokomotoros aktivitás (LMA) mérése, így a terápiás ablakot

elıször e két teszt alapján határozhatjuk meg. Egy vegyületet akkor tekintettünk lokomotor

stimuláló hatásúnak, ha 50 %-nál nagyobb emelkedést váltott ki a mozgékonyságban. Vagyis,

definíciószerően a lokomotoros aktivitás mentes (LMAfree) dózisok 50 %-nál kisebb

emelkedést mutattak. A terápiás indexet a LMAfree és a formalin teszt ED50 értékének

hányadosaként értelmezhetjük.

A 22. táblázatban két jellemzı benzilidén-piperidin (312, 317) valamint azok telített

analogonjainak analgetikus és lokomotoros aktivitás tesztben meghatározott eredményeit

tüntettem fel. Referenciavegyületek hasonló értékeit a 23. táblázat tartalmazza. Látható, hogy

míg a telített analogonok esetében nincs különbség az analgetikus dózis és a lokomotoros

aktivitást stimuláló dózis között, addig a benzilidén-piperidin-származékok nem okoznak

hiperaktivitást az analgetikus dózisok 6-szorosában sem. Ennyire különbözı hatásprofil nem

volt várható ilyen látszólag minimális szerkezeti módosítás esetén. A referenciavegyületek

közül a nem szelektív NMDA receptor antagonista MK-801 erısen növeli a lokomotoros

aktivitást a farmakológiailag hatékony dózis tartományban (23. táblázat). A szelektív NR2B

antagonista vegyületek közül a CI-1041 jelő referencia vegyület esetében sincs nagy

különbség a hatékony dózis és a lokomotoros aktivitást fokozó dózis között. A CP-101,606 és

az Ro-256981 az egér formalin tesztben nem volt hatásos.

97

22. táblázat. Benzimidazol- és indol-2-karboxamidok körében a benzilidén-piperidin-származékok és telített analogonjainak jellemzése formalin tesztben és lokomotoros aktivitás (LMA) tesztben. Terápiás indexek (TI) számolása.

benzilidén-piperidinek

LMA vegyület

egér formalin teszt, p.o.

ED50 mg/kg dózis mg/kg %-os

növekedés

TI

LMAmentes/ED50

15 27 312 2,6

30 63 5,8

3,75 0

7,5 55 317 0,43

15 69

8,7

benzil-piperidinek

LMA vegyület

egér formalin teszt, p.o.

ED50 mg/kg dózis mg/kg

%-os növekedés

TI

LMAmentes/ED50

142 1,6 1,875 80 < 1,2

82 1,7 1,875 90 < 1,1

23. táblázat. NMDA antagonista referencia vegyületek, a nem szelektív NMDA antagonista MK-801 és szelektív NR2B antagonista CI-1041 jellemzése formalin tesztben és lokomotoros aktivitás (LMA) tesztben. Terápiás indexek (TI) számolása.

LMA

vegyület

egér formalin teszt, p.o.

ED50 mg/kg dózis mg/kg %-os növekedés

TI

LMAmentes/ED50

0,1 114 MK-801 0,15

0,3 217 <1

CI-1041 2,4 10 137 <4

Ro 25-6981 >20*

CP-101,606 >20*

* CP-101,606 és Ro-256981 20 mg/kg dózisban csak 38 %-os illetve 12 %-os gátlást mutatott a formalin

tesztben.

Eredményeinket szabadalmi bejelentésben125 védtük.

98

4.8.2. Indol- és benzimidazol-származékok elıállítása A 312-316 és 317 vegyületeket a megfelelı indol- és benzimidazol-2-karbonsavakból (106 és

173) és 4-benzilidén-piperidinekbıl (318) állítottam elı HBTU kapcsolószer segítségével (43.

ábra).

Y

N

O

N HO X

Y

N

O

OH HO

i+

312-316 Y = N (t.:19 - 41 %) 317 Y = CH (t.: 65 %)

173 Y = N 106 Y = CH

H H

HNX

318

43. ábra. A 312-316 és 317 vegyületek elıállítása. Reagensek és reakciókörülmények: (i) HBTU, Et3N, DMF, szobahımérséklet, 16 óra.

A nitrogénen benzilcsoporttal védett 4-benzilidén-piperidineket (318) 1-benzil-piperidin-4-

onból kiindulva Horner-Wadsworth-Emmons reakcióval állítottam elı (44. ábra). A

kereskedelmi forgalomban nem hozzáférhetı szubsztituált benzilfoszfonát reagensekhez

Arbuzov-reakcióval a megfelelı benzil-halogenid és trietil-foszfit hevítésével jutottam. A

piperidin benzil-védıcsoportjának 1-klóretil-kloroformáttal történı eltávolításával a termék

sósavsóként, tisztán és jó termeléssel izolálható volt. A kettıskötés a piperidingyőrőhöz

képest 100 %-ban exo-helyzető, míg benzil helyett Boc-védıcsoport alkalmazásakor a

védıcsoport sósavas eltávolítása exociklusos és endociklusos termékek 5 : 1 arányú keverékét

eredményezte. A benzil védıcsoporttal kialakított 4-benzilidén-piperidinben és

származékaiban a kettıskötés exo helyzete már stabil, savak, lúgok hatására sem változik. 4-

benzilidén-piperidin-származékok az irodalomban nem voltak ismert vegyületek. Benzil-

piperidinek szintézisekor alkalmazták ugyan a Horner-Wadsworth-Emmons reakciót, de a

telítetlen terméket senki sem izolálta, azonnali hidrogénezéssel a telített származékot nyerték

ki.

N

O

NX H

N

HX

i iiCl

(tx = H.: 70 %)319 320 318 44. ábra. 4-benzilidén-piperidinek elıllítása. Reagensek és reakciókörülmények: (i) dietil-benzilfoszfonátok, NaH, DMF, 0-20oC, 2óra (ii) (1) 1-klóretil-kloroformát, diklóretán, 0-10oC 1 óra, reflux 1 óra; (2) metanol, reflux 1 óra.

4.8.3. Eredmények, szerkezet-hatás összefüggések az oxálsavdiamidok körében

Az oxálsavdiamid vegyületcsalád benzil-piperidin szerkezeti részének benzilidén-piperidinre

való cseréje a terápiás index még nagyobb mérvő emelkedését eredményezte. In vitro

99

aktivitásuk a legtöbb estben elmarad a telített analogonokhoz képest in vivo aktivitásuk

azonban lényegesen nem változott. A lokomotoros aktivitást jelentısen emelı dózis viszont

jóval nagyobb, így a számított terápiás index is ezzel arányosan nı (24. táblázat).

24. táblázat. Oxálsavdiamidok körében a benzilidén-piperidin-származékok és telített analogonjainak

jellemzése formalin tesztben és lokomotoros aktivitás (LMA) tesztben. Terápiás indexek (TI)

számolása.

NN

O

O

QX

H

a NMDA-kiváltott intracelluláris Ca2+ koncentrációváltozás.

Az 321 benzilidén-piperidin-származék a vegyületcsalád egyik leghatásosabb vegyülete. A

terápiás dózisban a lokomotoros aktivitást nem növelte. Egyéb CNS mellékhatásokat jelzı

tesztekben, PCP és CCI modellben, rotarod tesztben sem mutat aktivitást. A Morris

vízlabirintus tesztben nincs hatása a tanulási folyamatokra. Ames teszt alapján nem mutagén.

Nem gátolja a hERG csatornákat, nincs kardiovaszkuláris mellékhatása. Patkány toxikológiai

vizsgálatban 150 mg/kg/nap dózist is jól toleráltak az állatok, a kutya toxigológia is

biztonságos profilt mutatott.

benzilidén-piperidinek

LMA

vegyület Q X NMDA-kiváltott

∆∆∆∆ [Ca2+]ia

IC50 (nM)

egér formalin teszt, p.o

ED50 mg/kg dózis mg/kg

%-os növekedés

TI LMAmentes

/ED50

60 35 321

N

OO

N

H

H H

21 1,3

120 69 46

322 N

O

N

H

H CH3

90 0,94 60 13 >64

benzil-piperidinek

LMA

vegyület Q X NMDA-kiváltott

∆∆∆∆ [Ca2+]ia

IC50 (nM)

egér formalin teszt, p.o

ED50 mg/kg dózis mg/kg

%-os növekedés

TI LMAmentes

/ED50

1 34 184

N

OO

N

H

H H

2,4 0,85

3 62 < 1,2

3,75 72 188

NO

N

H

H CH3

11 0,48

7,5 141 <8

100

Seltzer féle egér neuropátiás modellben 2 mg/kg dózisban 50,2 %-os választ váltott ki. A

karragén-indukált hiperalgézia tesztben patkányokban hatásos, akut és krónikus modellben

egyaránt. A vegyület magas terápiás indexe lehetıvé teszi, hogy a viszonylag gyenge 20 %-os

biohasznosulását egy nagyobb dózis kompenzálja. Magasabb dózisban azonban enyhe

tolerancia alakult ki. Eredményeinket szabadalmi bejelentésben126 védtük.

4.8.4. Oxálsavdiamidok elıállítása

A telítetlen oxálsavdiamidok kialakításakor a telített analogonoknál bevált reakcióutat

alkalmaztam. Elıször a benzilidén-piperidineket acileztem etil-oxalil-kloriddal. Majd az

észtercsoport hidrolízését követıen az oxálsav másik karboxilcsoportjával anilineket

acileztem. (45. ábra). A tervezett vegyületeket oldatfázisú parallel szintézissel állítottam elı

10, a telített analogonoknál bevált anilin és 5 szubsztituált benzilidén-piperidin

felhasználásával (46. ábra). A nagyobb mennyiségben elıállított oxálsav-félamiddal

párhuzamosan acileztem a 10 anilint. A nyerstermékek oszlopkromatográfiás tisztítását

követıen a termék azonosságát és tisztaságát HPLC-MS módszerrel határoztuk meg. A

hatásos vegyületeket újraszintetizáltuk, szerkezetüket igazoltuk (IR,1-H NMR, HRMS).

318 323 321, 322

H

i

HON

O

O

X NN

O

O

QX

iiN

XH

(tX = H.: 88 %) (t321.: 65 %) 45. ábra. Oxálsavdiamidok elıállítása. Reagensek és reakciókörülmények: (i) (1) ClCOCOOEt, Et3N, CHCl3, 10 - 20oC, 1 óra; (2) NaOH, EtOH/H2O, szobahımérséklet, 1 óra; (3) 1 N HCl; (ii) QNH2, HBTU, Et3N, DMF, szobahımérséklet, 18 óra.

N

NO

NH2

CH3

HN

NO

NH2

H

HNH2O

NOH H

NH2

NAcN

OO

NH2

H

N

SO

NH2

HO

NO

NH2H

H

NH2

NMezN

OS

NH2

HN

O

NH2

H

HN

X

X : H, CH3, F, Cl, CH3O

46. ábra. Telítetlen oxálsavdiamidok parallel szintézise során felhasznált 10 anilin és 5 benzilidén-piperidin származék.

101

5. A PROJEKT BEFEJEZÉSE

Az NR2B receptor antagonista hatású vegyületek kutatása nyolc éven át tartott (1998-2006).

Ezen idı alatt 2805 molekulát állítottunk elı és vizsgáltak meg farmakológus kollégáink. A

vegyületek döntı részét az elsı 4-5 évben szintetizáltuk, 1527-et hagyományos módon, 1278-

at a kombinatorikus kémia eszközeivel. Eközben 8 alapszabadalmi bejelentést nyújtottunk

be. A 47. ábrán a versenytársak szabadalmi bejelentéseit is összefoglaltam. 1989-tıl 2008-ig

88 bejelentést tettek a felsorolt gyógyszergyárak. Ebbıl 40-et a legintenzívebb idıszaknak

tekinthetı 1999 és 2001 között nyújtottak be. A terület kutatásába 1998-ban, a versenytársak

maximális aktivitásakor kapcsolódtunk be. A viszonylag kései indulás miatti hátrányunkat az

addigra felhalmozott tudásnak köszönhetıen hamar behoztuk. Elsı szabadalmi

bejelentésünket már 2000-ben benyújtottuk az indol és benzimidazol-2-karboxamidok

védelmére. A következı évben az oxálsavdiamid-származékokat védtük. 2004-ben egyszerre

hat szabadalmi bejelentést nyújtottunk be, az ismertetett vegyületcsaládok oltalmát kérve. Ezt

követıen a versenytársak szabadalmi aktivitása is megszőnt. Cégünk kutatási vezetése 2001

december 19-én döntött a 185-ös számú (RGH-896, radiprodil) oxálsavdiamid-származék

klinikai fejlésztését illetıen. Ezt követıen backup és follow-up kutatást végeztünk. A számos

in vitro aktív származék közül, valamennyi ismertetett vegyületcsaládban sikerült azonosítani

orálisan is felszívódó, in vivo hatékony vegyületeket.

Cég/év ‘89 ‘90 ‘91 ‘92 ‘93 ‘94 ‘95 ‘96 ‘97 ‘98 ‘99 ‘00 ‘01 ‘02 ‘03 ‘04 ’05 ‘06 ‘07 ‘08 Searle 1 Pfizer 4 1 2 3 1 1 1 2 Warner-L. 1 5 5 CoCensys 6 1 Pharmacia 1 Roche 1 4 1 1 4 4 3 1 Merck KGaA 1 2 2 1 2 Synthelabo 1 1 Merck& Co. 2 9 2 3 1 3 Alcon 1 Richter 1 1 6 Vertex 1 Shionogi 1 1

47. ábra. NR2B szelektív NMDA antagonista hatású vegyületek védelmére benyújtott alapszabadalmi bejelentések.

102

6. ÖSSZEFOGLALÁS

Doktori munkámban a Richter Gedeon Vegyészeti Gyárban folytatott NR2B szelektív NMDA

antagonisták körében végzett kutatás gyógyszerkémiai vonatkozásait mutatom be. Az NMDA

receptor az ionotróp glutaminsav receptorok egyik típusa. NR1 és NR2 alegységekbıl épül

fel, melyek közül az utóbbinak négy (A-D) altípusa ismert. Az NMDA antagonisták

alkalmazhatósága számos területen felmerült és kísérletes bizonyítást nyert neuroprotekció,

fájdalomcsillapítás, görcsgátlás, Parkinson modellek, drog- és alkohol-függıség esetén. A

tisztán NMDA antagonista hatású vegyületek fejlesztése tipikus mellékhatásaik miatt

(pszichotomimetikus, szedatív, memóriarontó) abbamaradtak. Az NR2B alegység altípusra

szelektív antagonisták mentesnek bizonyultak ezektıl a mellékhatásoktól. A krónikus és

neurogén fájdalmak csillapítása megoldatlan terápiás probléma. Társaságunk a kielégítetlen

gyógyászati igényt és a hatásmechanizmus újdonságát mérlegelve, 1999-ben döntött az NR2B

szelektív NMDA antagonista hatásmechanizmuson alapuló új fájdalomcsillapító kutatási

projekt elindításáról. Terápiás célunk egy orálisan adható fájdalomcsillapító volt krónikus és

neurogén fájdalmak enyhítésére. Ennek érdekében ifenprodil típusu, NR2B szelektív

antagonista hatású molekulák elıállítását és tesztelését határoztuk el. Egy az irodalomból

ismert közepes hatású molekulából kiindulva több, számos szerkezeti módosításra lehetıséget

adó, hatásos vegyületcsaládot azonosítottunk. Az egyes vegyületcsaládok vezérmolekuláit a

klasszikus gyógyszerkémia szabályainak megfelelıen optimalizáltuk. Az in vitro és in vivo

biológiai vizsgálati módszerek egymásra épülı rendszert, ún. szkrínkaszkádot alkottak. Új

molekulák tervezésekor elsısorban egy NMDA funkcionális teszt adatait vettük figyelembe.

Az elıállított molekulákat a farmakofor modellünk fejlıdését leginkább tükrözı idırendi

sorrend alapján mutatom be. Saját kutatásunk és a versenytársak reprezentatív eredményeit

47. ábrán egy idıskálán állítom párhuzamba. Az elsıként azonosított NR2B altípus szelektív

NMDA anatagonista hatású molekula az ifenprodil volt. Az ifenprodil azonban vegyes profilú

anyag, számos receptor és ioncsatorna mőködését is gátolja. Az eredetileg α-1 adrenoceptor

antagonista hatása alapján vérnyomáscsökkentésre kifejlesztett ifenprodilról késıbb mutatták

ki, hogy nem kompetitív antagonistája az NR2B altípust tartalmazó NMDA receptornak. Az

ezen a területen megindult kutatásokban leggyakrabban az ifenprodilt választották

kiindulópontként, aminek eredményeként számos hatásos, hozzá hasonló farmakoforral

rendelkezı molekulát és vegyületcsaládot fedeztek fel.

103

HO

OH

CH3

N

ifenprodil

Hosszú idın keresztül az ifenprodilhoz hasonlóan bázikus nitrogént is tartalmazó farmakofor

modell alapján folyt a vegyületek elıállítása. A kilencvenes évek elején társaságunknál is

nagyszámú ifenprodil analogon készült in vivo CNS vizsgálatok céljából. 1998-ban jelent meg

az irodalomban az a megfigyelés, miszerint a bázikus nitrogén nem alapfeltétele a szelektív

NMDA receptor antagonizmusnak. Az University of Oregon, a CoCensys és a Parke Davis

közös kutatócsoportja egy fahéjsavamidot (35) azonosított hatásos és szelektív NR2B

antagonistaként. Kémiai munkánk kiindulópontjaként választottuk ezt a vegyületet mivel

feltételezésünk szerint a mellékhatások döntı részéért éppen az ifenprodil analogonokban

lévı bázikus nitrogén a felelıs. A 35 fahéjsavamid aminkomponensének elınyös cseréjével

egy aktívabb származékhoz jutottam (69).

O

N

Cl

OH

H

O

N

Cl

OH

OHH

35 69

Közben az University of Oregon, a CoCensys és a Parke Davis közös kutatócsoportja egy

újabb közleményben további megfigyelésekrıl számolt be. Többek között leírták, hogy a

klóratom és a hidroxilcsoport helyzetének felcserélése szintén hatásos molekulát (65)

eredményezett, vagyis mindkét orientációjú molekula képes kötıdni a receptorhoz. A 4-

hidroxi-fahéjsavamid (65) 4-klór-feniletil-amin amidkomponensét 4-benzil-piperidinre

cserélve egy közel háromszor aktívabb molekulához jutottak (37).

O

N

HO

Cl

H

N

O

HO

65 37 Felismerve a bázikus nitrogént nem tartalmazó molekulák vélhetı elınyeit, kémiai

munkánkat erre a megfigyelésre alapoztuk, és sokáig egyedül a versenytársak közül savamid

típusú vegyületeket állítottunk elı. Az ifenprodilszerő anyagokat leíró farmakofor modell

esszenciális és a változtatásokat jobban toleráló részeinek megismerése után igazoltuk

104

feltételezésünket, miszerint a fahéjsav szerkezeti rész merevítésével még hatásosabb

molekulákhoz juthatunk. A fahéjsav α-szénatomjának és benzolgyőrőjének összekötése a

protondonor sajátságú NH-csoporttal egy hatszor hatásosabb vegyülethez a 6-hidroxi-indol-2-

karboxamidhoz (82) vezetett.

N

O

N HO

H 1

2

34

5

67

W

V XN

QZ

Y

82 A Az indolszármazékok optimalizációja során az összes lehetséges ponton megvizsgáltuk a

gyógyszerszerő molekulákat eredményezı változtatások biológiai hatását (A).

Tanulmányoztuk miként befolyásolja az aktivitást a hidroxilcsoportok száma és pozíciója.

Vizsgáltuk az indolgyőrő 1-es és 3-as helyzetének helyettesíthetıségét, a karbonilcsoport

szerepét. A farmakofor modell legkonzervatívabb részének a piperidingyőrő bizonyult, más

aminra való lecserélése a hatás elvesztésével járt. Változtattuk a piperidingyőrőn a

benzilcsoport helyét, az aromás rész szubsztituenseit, a piperidin 4-es helyzető szénatomja és

a jobboldali aromásgyőrőt összekötı láncot. A fahéjsav merevítésével levezethetı

indolszármazékok kedvezı farmakológiai eredménye után más heterobiciklusokat is

megvizsgáltunk. Az indolváznak a vele potenciálisan izoszter benzimidazol győrőrendszerrel

való helyettesítése még aktívabb származékot (142) eredményezett. A benzimidazol-

származékokat az indolszármazékok körében nyert tapasztalatok alapján optimalizáltuk.

N

N

O

N HO

H

142 Az indol- és benzimidazol-2-karboxamidokat védı szabadalmi bejelentésünk benyújtása után

egy évvel, egy Merck szabadalmi bejelentés nyilvánossá válásakor derült ki, hogy a Merck

kutatói velünk egyidıben szintén benzimidazol-származékokat vizsgáltak. Bár

példavegyületeikben a győrő kettes helyzető szénatomját karbonil helyett alkillánc köti össze

a piperidin nitrogénjével, a fél évvel hamarabb benyújtott bejelentésükben megfogalmazott túl

általános képlet rontotta a mi vegyületeink újdonságát. További iparjogvédelmi lépésekre nem

volt szükség, ugyanis idıközben egy még aktívabb vegyületcsaládot azonosítottunk. Az indol

pirrolrészének képzeletbeli győrőfelnyitásával egy új hatásos szerkezethez, oxálsavdiamidhoz

jutottunk (183). Sikeres stratégiát dolgoztunk ki a metabolikusan instabil fenolos

105

hidroxilcsoport helyettesítésére. A fenol molekularész lecserélése protondonor sajátságú NH-

csoportot tartalmazó heterobiciklusokra az ADME tulajdonságok mellett a hatás javulását is

eredményezte. A molekula optimalizálását követıen a legelınyösebb tulajdonságokkal

rendelkezı 185-ös származékot (RGH-896, radiprodil) választottuk ki klinikai vizsgálatok

céljából.

HN

N

HO

O

O

HN

N

O

O

O

NO

F

H

183 185 (RGH-896, radiprodil) Az indolgyőrő pirrolrészének egy karbonilcsoporttal történı képzeletbeli győrőbıvítésével

levezethetı kinurénsavszármazék (230) szintén hatásos molekula. A 230 vezérmolekulát az

indol- és benzimidazol-2-karboxamidok körében nyert tapasztalatok alapján rövid idın belül,

egy tucat származék képzésével sikerült optimalizálni.

N

O

N

O

HO

H

230 Az oxálsavdiamidok eredményességét követıen tíz olyan háromtagú láncot vizsgáltam meg

mellyel összekötve a baloldali aromásgyőrőt és a piperidin nitrogénjét, gyógyszerszerő

molekulához jutunk (B). Ezek közül legaktívabbnak egy benzoil-karbamid-származék

bizonyult (274). A molekula optimalizációját oldatfázisú kombinatorikus kémiai szintézissel

oldottam meg.

N

O

N

HO

O

H

AB

CN

HO

B 274 A nem ifenprodil típusú molekulák kutatását egy korábbi Merck közleményt követıen

indítottuk el 2003-ban, melyben NR2B receptoron ható amidinekrıl számoltak be (46, 48)119,

79. Szabadalmi védelmükrıl már, 1999-ben és 2000-ben gondoskodtak. A Merck kutatóinak

eredményeit felhasználva, korábbi tapasztalatom alapján új típusú, gyógyszerszerőbb

106

szerkezetet, indol-2-karboxamidineket (299) terveztem. A vegyületeket kombinatorikus

kémia módszerével állítottam elı.

H

Cl

N

NH2

N

CH3O

OCH3

HN

NH OCH3

H HN

NH OCH3

CF3O

Merck

Richter

299 46 (Merck) 48 Az utolsó fejezetben 4-benzilidén-piperidin-származékokat ismertetek. A korábban elıállított

hatásos molekulák többsége 4-benzil-piperidin-származék volt. Ezek benzilidén-piperidin

megfelelıi azon túlmenıen, hogy hasonló affinitással kötıdnek az NR2B receptorokhoz, még

egy elınyös tulajdonsággal rendelkeznek. A vizsgált mellékhatásokkal kapcsolatban, különös

tekintettel a lokomotoros aktivitás fokozására, jóval nagyobb a terápiás ablakuk. Ez a hatás

kiváltképpen a benzimidazol (312) és az oxálsavdiamid-származékok (321) esetében

figyelhetı meg.

H

N

N

O

N HO

H

HN

N

O

O

O

NO

312 321 Az indol- és benzimidazol-2-karbonsavak benzilidén-piperidinekkel képezett amidjait

hagyományos módon, míg az oxálsavdiamidokat oldatfázisú parallel szintézissel állítottam

elı.

Kutatómunkánk több preklinikai vizsgálatokig jutó ígéretes anyagot eredményezett, melyek

közül egy (RGH-896, radiprodil) klinikai vizsgálatokra került.

Munkánk eredményeirıl eddig 8 szabadalmi bejelentésben és 9 gyógyszerkémiai tárgyú

cikkben számoltunk be.

107

69

1966

1982

1989

1991

1993

1996

1997

1998

N

HO

OH

CH3

N

HO

F

OH

N

CH3HO

OH

OH

OH

CH3HO

N

O

HO

N

OH

CH3

O

N

HO

O

N

Cl

OH

OHH

NR2B kutatás indulása

Nagyszámú ifenprodil analóg in vivo CNS vizsgálatokra

NS

O

N

OO

F

H

O

N

Cl

OH

H

N

O

N

OO

F

H

Richter Gedeon Versenytársak

ifenprodilSynthelabo

eliprodilSynthelabo

traxoprodil, CP-101606Pfizer

9, Ro 25.6981Hoffmann La Roche

NR2B altípus meghatározása, ifenprodilmint NR2B szelektív anyag Molecular Pharmacology 1993; 851-859

8, EMD-95885Merck

12, Co101,244Warner Lambert

28, bezonprodil, CI-1041CoCensys

35,Co 101526CoCensys

N

OHY

X

37

1998.08.

elõá

llítá

s id

eje

szab

adal

maz

tatá

sid

eje

47. ábra. A Richter Gedeon és a versenytársak kiemelt NR2B szelektív NMDA antagonista hatású reprezentatív vegyületei az idı tükrében.

108

1999

2000

Richter Gedeon Versenytársak

12HoffmannLa Roche

1999.10.

2001

1999.11.

2003

2004

2003.07.

2002.11.

2002.04.

2001.01.

2000.07.

Pfizer

elõá

llítá

s id

eje

szab

adal

maz

tatá

sid

eje

N

O

NHO

H

2002

O

HO

N

OH

CH3OH

38 analógMerck82

N

N

O

NHO

H

142

HN

O

N

N

OO

OH

184

46Merck

HO

O

N

N O

O

H 42Merck

H

H

N

N

OO

O

NO

O

HO

O

N N

NH

H

NO

OH

N

OH

N

OEt

H

Merck

Pfizer

HN

O

N

N

OO

OH

321

N

O

N

HO

O

H274

HN

O

N

O

HO

230

HN

NH

N

CH3O

OCH3

H299

N

NH

CF3O

CF3

H

H

N N

NOH

61HoffmannLa Roche

51Merck

N

N

NN

H

N

NH

I

H

109

7. TÉZISEK

1. Felismerve a bázikus nitrogént nem tartalmazó molekulák vélhetı elınyeit egy, az

irodalomból ismert közepes hatású, ám nem bázikus nitrogént tartalmazó savamid típusú

molekulából kiindulva, in vitro aktív, NR2B szelektív NMDA antagonista hatású fahéjsav-

amidokat állítottam elı. Feltevésünk igazolódott, az NR2B szelektív NMDA antagonisták

mellékhatásaiért leginkább felelıssé tehetı α1 és 5-HT2A receptorokhoz a fahéjsavamidok

nem mutatnak affinitást.

2. Az University of Oregon, a CoCensys és a Parke Davis közös kutatócsoportjának a

fahéjsavamidok kutatásában elért eredményeit felhasználva feltérképeztem milyen, az

ifenprodil analogonok körében közkedvelt piperidinektıl eltérı szekunder aminnal képezett

fahéjsavamid mutat még kellı hatékonyságot. A kiválasztott szekunder aminokat,

kombinatorikus kémiai módszerrel több, a fenolos hidroxilcsoporttól metabolikusan stabilabb,

de hasonlóan protondonor csoporttal szubsztituált fahéjsavval acileztem. Ílymódon a

versenytársak és saját korábbi leghatásosabb vegyületeinknél is aktívabb, vélhetıen

metabolikusan stabilabb fahéjsavszármazékot sikerült elıállítanom.

3. Igazoltam feltételezésünket, miszerint a fahéjsav szerkezeti rész merevítése még aktívabb

molekulákat eredményez. A fahéjsav α-szénatomjának és benzolgyőrőjének protondonor

sajátságú NH-csoporttal való összekötésével egy, a fahéjsavamidoktól sokkal aktívabb

vegyületcsaládhoz, 6-hidroxi-indol-2-karboxamidokhoz jutottam. Több képviselıjük, in vivo

is hatásos, megfelnek egy gyógyszerrel szemben támasztott farmakokinetikai és

farmakodinámiai követelményeknek. A vezérmolekula optimalizálása során elıállított

nagyszámú származék szerkezet-hatás összefüggéseit felhasználva igyekeztem teljeskörően

felderíteni a farmakofor modellt, lehetıvé téve újabb hatásos vegyületcsaládok azonosítását,

azok minél hatékonyabb optimalizálását.105, 106, 108

4. A 6-hidroxi-indol-2-karboxamidok indolvázának benzimidazol győrőrendszerrel való

helyettesítésével általánosan egy nagyságrenddel aktívabb származékokat sikerült

elıállítanom. 105, 107, 108

5. A 6-hidroxi-indol-2-karboxamidokban az indol pirrolrészének képzeletbeli győrőfel-

nyitásával egy új hatásos szerkezethez, oxálsavdiamidhoz jutottunk. Sikeres, a fahéjsav-

110

amidok körében már bevált stratégiát dolgoztunk ki a metabolikusan instabil fenolos

hidroxilcsoport helyettesítésére. A fenol molekularész lecserélése protondonor sajátságú NH-

csoportot tartalmazó heterobiciklusokra az ADME tulajdonságok mellett a hatás javulását is

eredményezte.110, 111

6. A 6-hidroxi-indol-2-karboxamidokban az indol pirrolrészének egy karbonilcsoporttal

történı képzeletbeli győrőbıvítésével szintén aktív molekulacsaládhoz,

kinurénsavszármazékokhoz jutottam.113, 114

7. Az oxálsavdiamidok eredményességét követıen analitikus módon megvizsgálva és

változtatva a baloldali aromásgyőrőt és a piperidin nitrogénjét összekötı láncot, in vivo is

hatásos, NR2B szelektív NMDA antagonista hatású benzoil-karbamid-származékokat

azonosítottam.117, 118

8. Az NR2B szelektív NMDA antagonistákra jellemzı 4-benzil-piperidin aminkomponenst

az általunk korábban elıállított hatásos származékokban 4-benzilidén-piperidinre cserélve az

NR2B receptorokhoz hasonló affinitással kötıdı, de sokkal kedvezıbb mellékhatásprofillal

rendelkezı vegyületekhez jutottam. A 4-benzilidén-piperidinek gyógyszerkémiai

alkalmazását az általam kidolgozott elıállítás tette lehetıvé, melynek során a kettıskötés exo

helyzete stabil marad.125, 126

9. A nem ifenprodil típusú molekulák körében végzett munkám során a Merck kutatói által

azonosított E-N1-(benzil)fahéjsavamidint választva kiindulópontnak, felhasználva a korábban

tapasztalt fahéjsav-indol szerkezeti elemek bioizosztériáját, gyógyszerszerőbb szerkezetet,

indol-2-karboxamidineket terveztem. A vegyületeket kombinatorikus kémiai módszerrel

állítottam elı.120, 121

111

8. MOLEKULALISTA

Dolgozatom a Richterben végzett NR2B szelektív NMDA antagonista kutatás egészét átfogja.

A hagyományos módon elıállított vegyületek szerkezetét NMR és MS spektroszkópiával,

tisztaságát (min. 95 %) HPLC módszerrel igazoltuk. A kombinatorikus kémiai módon vagy

parallel reakciókkal elıállított vegyületeket HPLC-MS alapján azonosítottuk (tisztaság min.

85 %), a közülük hatásosnak bizonyúló molekulákat hagyományos módszerrel is elıállítottuk,

szerkezetüket igazoltuk. Munkánk eredményeirıl eddig a következı szabadalmi

bejelentésekben, cikkekben és elıadásokban számoltunk be.

Cikkek:

1./ 38. Borza, I.; Domány, Gy. NR2B Selective NMDA Antagonists: The Evolution of the Ifenprodil-Type Pharmacophore. Curr. Top. In Med. Chem. 2006, 6, 687-695. (IF: 4,40; I: 22)

2./ 106. Borza, I.; Kolok, S.; Gere, A.; Ágai-Csongor, É.; Ágai, B.; Tárkányi, G.; Horváth, Cs.; Barta-Szalai, G.; Bozó, É.; Kiss, Cs.; Bielik, A.; Nagy, J.; Farkas, S.; Domány, Gy. Indole-2-carboxamides as Novel NR2B Selective NMDA Receptor Antagonists. Bioorg. Med. Chem. Letters 2003, 13, 3859-3861. (IF: 2,182; I: 19) 3./ 107. Borza, I.; Kolok, S.;Gere, A.; Nagy, J.; Fodor, L.; Galgóczy, K.; Fetter, J.; Bertha, F.; Ágai, B.; Horváth, Cs.; Farkas, S.; Domány, Gy. Benzimidazole-2-carboxamides as Novel NR2B Selective NMDA Receptor Antagonists. Bioorg. Med. Chem. Lett.

2006, 16, 4638-4640. (IF: 2,538; I: 8) 4./ 108. Borza, I.; Bozó, É.; Barta-Szalai, G.; Kiss, Cs.; Tárkányi , Á.; Demeter Á.; Gáti T.; Háda, V.; Kolok, S.; Gere, A.; Fodor, L.; Nagy, J.; Galgóczy, K.; Magdó, I.; Ágai, B.; Fetter,J.; Bertha, F.; M. Keserő, Gy.; Horváth, Cs.; Farkas, S.; Greiner, I.; Domány, Gy. Selective NR1/2B N-Methyl-D-aspartate Receptor Antagonists among Indole-2-carboxamides and Benzimidazole-2-carboxamides. J. Med. Chem. 2007, 50, 901-914. (IF: 4,895; I: 5) 5./ 111. Barta-Szalai, G.; Borza, I.; Bozó, É.; Kiss, Cs.; Ágai, B.; Proszenyák, Á.; Keserő, Gy. M.; Gere, A.; Kolok, S.; Galgóczy, K.; Horváth, Cs.; Farkas, S.; Domány, Gy. Oxamides as novel NR2B selective NMDA receptor antagonists. Bioorg. Med.

Chem. Letters 2004, 14, 3953-3956. (IF: 2,333; I: 19)

6./ 114. Borza, I.; Kolok, S.; Horváth, Cs.; Farkas, S.; Domány, Gy. New kynurenic acid amides as novel NR2B selective NMDA receptor antagonists. Bioorg. Med. Chem.

Letters 2007, 17, 406-409. (IF: 2,604; I: 2) 7./ 118. Borza, I.; Greiner, I.; Kolok, S.; Galgóczy, K.; Ignácz-Szendrei, Gy.; Horváth, Cs.; Farkas, S.; Gáti, T.; Háda, V.; Domány, Gy. New benzoyl urea derivatives as

112

novel NR2B selective NMDA receptor antagonists. Die Pharmazie 2006 61(9), 799- 800. (IF: 0,606; I: 2) 8./ 121. Borza, I.; Kolok, S.; Ignácz-Szendrei, G.; Greiner, I.; Tárkányi, G.; Galgóczy K.; Horváth, Cs.; Farkas, S.; Domány, Gy. Indole-2-carboxamidines as novel NR2B selective NMDA receptor antagonists. Bioorg. Med. Chem. Letters 2005, 15, 5439- 5441. (IF: 2,478; I: 4) 9./ Wéber, Cs.; Bielik, A.; Demeter, Á.; Borza, I.; Ignácz-Szendrei, G.; Keserő, Gy.;

Greiner, I.; Solid-phase synthesis of 6-hydroxy-2,4-diaminoquinazolines. Tetrahedron 2005, 61, 9375-9380. (IF: 2,61; I: 3)

Szabadalmak: 1./ 105. Borza, I.; Bartáné Szalai, G.; Domány, Gy.; Horváth, Cs.; Farkas, S.; Nagy, J.; Kolok, S. Amide derivatives as NMDA receptor antagonists. WO 2002/34718A1. 2./ 110. Domány, Gy.; Horváth, Cs.; Farkas, S.; Barta-Szalai, G.; Nagy, J.; Kolok, S.; Bozó, É.; Borza, I.; Vágó, I.; Bielik,A.; Ignácz-Szendrei Gy.; Keserő, Gy. M. Piperidine derivatives as NMDA receptor antagonists. WO 2003010159A1. 3./ 113. Borza, I.; Horváth, Cs.; Farkas, S.; Nagy, J.; Kolok, S. Kynurenic acid amide derivatives as NR2B receptor antagonists. WO 2006010967A1. 4./ 117. Borza, I.; Bartáné Szalai, G.; Bozó, É.; Kis, Cs.; Horváth, Cs.; Farkas, S.; Nagy, J.; Kolok, S. New benzoyl urea derivatives. WO 2006010966A1. 5./ 120. Borza, I.; Horváth, Cs.; Farkas, S.; Nagy, J.; Kolok, S. Indole-2-carboxamidine derivatives as NMDA receptor antagonists. WO 2006010965A1. 6./ 125. Borza, I.; Horváth, Cs.; Farkas, S.; Gyertyán, I.; Nagy, J.; Kolok, S.; Galgóczy, K.; Sághy, K. New heterocyclic acid amide derivatives. WO 2006010969A1. 7./ 126. Borza, I.; Horváth, Cs.; Farkas, S.; Gyertyán, I.; Nagy, J.; Kolok, S.; Galgóczy, K.; Sághy, K. New 4-benzylidene-piperidine derivatives. WO 2006010964A1. 8./ Keserő, Gy. M.; Vágó, I.; Farkas, S.; Horváth, Cs.; Bielik, A.; Borza, I.; Wéber, Cs.; Kolok, S. New aryloxy acetic acid amide derivatives. WO 2006010968A1. Elıadások:

1./ Új, NR2B-szelektív NMDA antagonista hatású indol-2-karbonsav-amid és

benzimidazol-2-karbonsav-amid származékok Borza István, Tárkányi Gábor, Demeter Ádám, Kolok Sándor, Bartáné Szalai Gizella, Bozó Éva, Kis Csilla, Ágai Béla, Berta Ferenc, Fetter József, Domány György

2002. Balatonszemes, Heterociklusos Kémiai Munkabizottsági Őlés 2/ Új, NR2B-szelektív NMDA antagonista hatású indol-2-karbonsav-amid és

benzimidazol-2-karbonsav-amid származékok

113

Borza István, Tárkányi Gábor, Demeter Ádám, Kolok Sándor, Bartáné Szalai Gizella, Bozó Éva, Kis Csilla, Ágai Béla, Berta Ferenc, Fetter József, Domány György 2002. Visegrád, Gyógyszerkémiai és Gyógyszertechnológiai Szimpózium

3/ Fenol bioizosztér heterociklusok NR2B szelektív NMDA antagonisták körében

Borza István, Bozó Éva,Tárkányi Gábor, Demeter Ádám, Kolok Sándor, Kis Csilla, Domány György 2003. Eger, Gyógyszerkémiai és Gyógyszertechnológiai Szimpózium

4/ Újabb eredmények a heterobiciklusok körében Borza István 2003. Budapest, Flavonoidkémiai Munkabizottsági Őlés Poszterek: 1./ Indole-2-carboxamides as novel NR2B selective NMDA antagonists

Borza István, Tárkányi Gábor, Demeter Ádám, Kolok Sándor, Bartáné Szalai Gizella, Bozó Éva, Kis Csilla, Ágai Béla, Berta Ferenc, Fetter József, Domány György 2002. Barcelona, XVII th. International Symposium on Medicinal Chemistry

2./ Fenol bioizosztér heterociklusok NR2B szelektív NMDA antagonisták körében

Borza István, Bozó Éva,Tárkányi Gábor, Demeter Ádám, Kolok Sándor, Kis Csilla, Domány György 2003. Hajdúszoboszló, Vegyészkonferencia

3/ Benzimidazole-2-carboxamides as novel NR2B selective NMDA receptor antagonists

György Domány, István Borza, Sándor Kolok, Anikó Gere, Kornél Galgóczy, Ildikó Magdó, József Fetter, Ferenc Bertha, Béla Ágai, Csilla Horváth, Sándor Farkas, György M. Keserő 2006. San Francisco, American Chemical Society 232nd National Meeting and Exposition

4/ CoMSIA Study of Oxamide and Glycineamide-type NR2B Selective NMDA Receptor Antagonists Magdó Ildikó. - Borza István. - Bartáné Szalai Gizella. - Bozó Éva. - Gere Anikó. - Horváth Csilla. - Farkas Sándor. - Domány György. - Keserő György M. Austrian-German-Hungarian-Italian-Polish-Spanish Joint Meeting on Medicinal Chemistry (2005. június 20-23.) (Bécs, Ausztria)

5/ CoMSIA Study of Indole- and Benzimidazole-2-carboxamide-type NR2B Selective

NMDA Receptor Antagonists Magdó Ildikó. - Borza István. - Kolok Sándor. - Gere Anikó. - Horváth Csilla. - Bartáné Szalai Gizella. - Domány György. - Keserő György M. 15th European Symposium on QSAR (Euro-QSAR 2004) (2004. szeptember 5-1) (Isztanbul, Törökország)

6/ Antinociceptive Effect of NR2B Selective NMDA Receptor Antagonists in Chronic

Pain Models, in Comparison with Pregabalin. - 2003 Horváth Csilla. - Farkas Sándor. - Kedves Rita. - Galgóczy Kornél. - Egyed R. - Nagy

114

József, Kolok Sándor. - Borza István. - Domány György. - Szombathelyi Zsolt 23rd European Winter Conference on Brain Research (2003. március 8-15.) (Les Arcs, Franciaország)

7/ Kynurenic Acid Amides as Novel NR2B Selective NMDA Receptor Antagonists

István Borza, Sándor Kolok, Kornél Galgóczy, Csilla Horváth, Sándor Farkas, István Greiner, György Domány

11th Belgian Organic Synthesis Symposium (2008. július-13-18) (Ghent, Belgium)

Dolgozatomban a témában közölt kilenc kémiai tárgyú cikkbıl nyolcat, a benyújtott nyolc

alapszabadalmi bejelentésbıl hetet idézek. A Bioorganic & Medicinal Chemistry Lettersben

megjelentetett cikkekben közöltük a molekulák elıállításának módját, a Journal of Medicinal

Chemistry és a Pharmazie folyóiratokban, valamint a szabadalmi bejelentésekben részletes

receptekkel együtt mutattuk be a vegyületeket. Mivel a dolgozatomban szereplı vegyületek

jelentıs részét leírtuk, terjedelmi okokból a kémiai kísérleti részt a bemutatott molekulák

publikációs listájával helyettesítem.

115

Végtermékek listája, elıfordulásuk közleményekben, szabadalmi bejelentésekben.

vegyületszám vegyületszám a közleményben

Példaszám szabadalmi

bejelentésben

FAHÉJSAVSZÁRMAZÉKOK

65

66

67

68

69

70

71

72

73

74

75

76

77

78

79

80

81

INDOL-2-KARBOXAMIDOK

82 6a108 1105

83 7a108 3105

84 8a108 49105

85 9a108

86 10108 26105

87 11108 42105

88 23108

89 24108

90 25108

91 6b108

92 6c108 43105

93 6d108 33105

94 6e108 7105

95 6f108 6105

96 6g108 9105

97 6h108 4105

vegyületszám vegyületszám a közleményben

példaszám szabadalmi

bejelentésben

98 6i108 29105

99 6j108 19105

100 6k108

101 6l108 5105

102 6m108 12105

103 6n108 40105

104 6o108

105 6p108

137 55108

138 56108

139 57108

140 58108

141 59108

BENZIMIDAZOL-2-KARBOXAMIDOK

142 60a108 100105

143 61a108

144 62108

145 63108

146 64108

147 65108

148 60m108

149 60q108

150 60r108

151 60s108

152 60t108

153 60u108

OXÁLSAVDIAMIDOK

183 2111

184 3d111 8110

185 3e111 3110

186 3b111 7110

187 3g111 61110

188 3i111 101110

189 3f111 31110

190

116

vegyületszám vegyületszám a közleményben

Példaszám szabadalmi

bejelentésben

OXÁLSAVDIAMIDOK

191

192

193

194

195

196

197

198

199

200

201

202

203 32110

204 48110

205 3k111

206

207 39110

208

KINURÉNSAVAMIDOK

228 28

229 29114 12113

230 30a114 2113

231 30b114 1113

232 30c114 4113

233 30d114 3113

234 30e114 10113

235 30f114 7113

236 30g114 8113

237 31114

238 32114 9113

239 38114

BENZOIL-KARBAMIDOK

267

268

269

vegyületszám vegyületszám a közleményben

példaszám szabadalmi

bejelentésben

270

271

272

273

274 9118 1117

275

276

277

278

279

280

281 7117

282 4118 4117

283 5118 3117

284 6118 2117

285 7118 29117

286 8118 5117

287 10118 26117

288 11118 27117

289 12118 28117

INDOL-2-KARBOXAMIDINEK

295 5a121 42120

296 5b121 151120

297 5c121 76120

298 5d121 117120

299 5e121 36120

300 5f121 147120

301 5g121 72120

302 5h121 112120

303 5i121 31120

304 5j121 38120

305 5k121 32120

306 5l121 29120

307 5m121 17120

308 5n121 18120

309 5o121 1120

117

vegyületszám vegyületszám a közleményben

példaszám szabadalmi

bejelentésben

BENZILIDÉN-PIPERIDINEK

312 1125

313 2125

314 3125

315 4125

316 5125

317 6125

321 1126

322 24126

118

9. IRODALOMJEGYZÉK

1. Williams, M.; Kowaluk, E. A.; Arneric, S. P. Emerging Molecular Approaches to Pain

Therapy. J. Med. Chem. 1999, 42, 1481-1500. 2. Int. Assoc. For Study of Pain. 1994. Pain Vol. II. Issue3, Neuregenic Pain: Diagnosis and Treatment. 3. Sindrup, S. H.; Jensen, T. S. Efficacy of pharmacological treatments of neurophtic pain: an update and effect releated to mechanism of drug action. Pain 1999, 83, 389-400. 4. Chizh, B. A.; Headley, P. M. NMDA antagonists and neuropathic pain-multiple drug targets and uses. Cur. Pharm. Des. 2005, 11, 2977-2994. 5. Salter, M.W. Cellular signalling pathways of spinal pain neuroplasticity as targets for analgesic development. Cur. Top. Med. Chem. 2005, 5, 557-567. 6. Mendel, L. M., Physiological properties of unmyelinated fiber projections to the spinal cord. Exp. Neurol. 1966, 16, 316-332. 7. Davies, S. N.; Lodge, D. Evidence for involvement of N-methylaspartate receptors in”windup” of class 2 neurones in the dorsal horn of the rat. Brain Res. 1987, 424, 402- 406. 8. Dickenson, A. H.; Sullivan, A. F. Evidence for a role of the NMDA receptor in the frequency dependent potentiation of deep rat dorsal horn nociceptive neurones following C fibre stimulation. Neuropharmacology 1987, 26, 1235-1238. 9. Kim, Y. I.; Na, H. S., NMDA receptors are important for both mechanical and thermal allodynia from peripheral nerve injury in rats. Neuroreport 1997, 8, 2149-53. 10. Wong, C. S.; Cherng, C. H. Intrathecal administration of excitatory amino acid receptor antagonists or nitric oxide synthase inhibitor reduced automy behavior in rat. Anesth. Analg. 1998, 87, 605-608. 11. Ren, K.; Williams, G. N. The intrathecal administration of excitatory amino acid receptor antagonists selectively attenuated carrageenan-induced behavioral hyperalgesia in rats. Eur. J. Pharmacol. 1992, 219, 235-243. 12. Klepstad, P.; Maurset, A. Evidence of a role for NMDA receptors in pain perception. Eur. J. Pharmacol. 1990, 187, 513-518. 13. Nikolajsen, L.; Hansen, P. O. Oral ketamine treatment of postamputation stump pain. Acta

Anaesthesiol. Scand. 1997, 41, 427-429. 14. Eide, P. K.; Stubhag, A. Continuous subcutaneous administration of the N-methyl-D- aspartate receptor antagonist ketamine in the treatment of post-herpetic neuralgia. Pain 1995, 2, 221-228. 15. Price, D. D.; Mao, J. The N-methyl-D-aspartate receptor antagonist dextromethorphan selectively reduces temporal pain summation in man. Pain 1994, 59, 165-174. 16. Nikolajsen, L.; Gottrup, H.; Kristensen, A. G. D.; Jensen, T. S. Memantine (a N-Methyl- D-Aspartate Receptor Antagonist) in the Treatment of Neuropathic Pain After Amputation or Surgery: A Randomized, Double-Blinded, Cross-Over Study 17. Madsen, U.; Brauner-Osborne, H.; Greenwood, J. R.; Johansen, T. N.; Krogsgaard- Larsen, P.; Liljefors, T.; Nielsen, M.; Frolund, B. GABA and Glutamate Receptor Ligands and Their Therapeutic Potential in CNS Disorders. ed. Shayne Cox Gad, Drug Discovery Handbook, John Wiley & Sons Ltd, Chichester West Sussex, 2005: ch. 18, 797-907. 18. Borbényi, E.; Dank, M. Makó, E. Fájdalomcsillapítás a daganatos betegek kezelésében Magyar Onkológia 2001, 45, 81-88. 19. Kennedy, J. D. Neuropathic Pain: Molecular Complexity Underlies Continuing Unmet Medical Need J. Med. Chem. 2007, 50, 2547-2556. 20. Palkovits, M. Az agy és a fájdalom: az érzékelés és a válasz agypályái és transzmitterei. Orvosi Hetilap 2000, 141, 2231-2239.

119

21.http://cogsci.bme.hu/~ktkuser/KURZUSOK/BMEGT47MN10/DOC/05_fajdalom_latas_be vezeto.pdf 22. Schwartzman, R. J.; Grothusen, J.; Kiefer T. R.; Rohr, P. Arch Neuropathic Central Pain: Epidemiology, Etiology, and Treatment Options. Neurology 2001, 58, 1547-1550. 23. Zhang, J.; Hoffert, C.; Vu, H. K.; Groblewski, T.; Ahmad, S.; O’Donnell, D. Induction of CB2 receptor expression in the rat spinal cord of neuropathic but not inflammatory chronic pain models. Eur.J. Neurosci. 2003, 17, 2750-2754. 24. Kim, D. Y.; Kim, S. H.; Choi, H. B.; Min, C.; Gwag, B. J. High abundance of GluR1 mRNA and reduced Q/R editing of GluR2 mRNA in individual NADPH-diaphorase neurons. Mol. Cell. Neurosci. 2001, 17, 1025–33. 25. Parsons, C. G.; Danysz, W. Quack, G. Glutamate in CNS Disorders as a Target for Drug Development: An Update. Drug news and perspectives 1998, 11, 523-569. 26. Conti, F.; Weinberg, R.J.; Shaping excitation at glutamatergic synapses Trends Neurosci. 1999, 22, 451-458. 27. Huettner, J. E. Kainate receptors and synaptic transmission. Prog. Neurobiol. 2003, 70, 387–407. 28. Paoletti, P.; Neyton, J. NMDA receptor subunits: function and pharmacology. Current

Opinion in Pharmacology 2007, 7, 39-47. 29. Chen, P. E.; Wyllie, D. J. A. Pharmacological insights obtained from structure-function studies of ionotropic glutamate receptors. Br. J. Pharmacol. 2006, 147, 839-853. 30. Michaelis, E. K. Molecular biology of glutamate receptors in the central nervous system and their role in excitotoxicity, oxidative stress and aging. Prog. Neurobiol. 1998, 54, 369-415. 31. Chen, H. S. V.; Lipton, S. A. The chemical biology of clinically tolerated NMDA receptor antagonists. J. Neurochem. 2006, 97, 1611-1626. 32. a, Blahos, J.; Wenthold, R. J. Relationship betwen N-methyl-D-aspartate receptor NR1 splice variants and NR2 subunits. J. Biol. Chem. 1996, 271, 15669-15674. B, Chazot, P.; Coleman, S. K.; Cik, M..; Stephenson, F. A. Molecular characterization of N-methyl-D-aspartate receptors expressed in mammalian cells yields evidence for the coexistence of three subunit types within a discrete receptor molecule. J. Biol. Chem. 1994, 269, 24403-24409. 33. Dingledine, R.; Borges, K.; Bowie, D.; Traynelis, S. F. The glutamate receptor ion channels. Pharmacol. Rev. 1999, 51, 7-61. 34. Kew, J. N. C.; Kemp, J. A. An allosteric interaction between the NMDA receptor polyamine and ifenprodil sites in rat cultured cortical neurones. The Journal of

Physiology, 1998, 512, 17-28. 35. Chatterton, J. E.; Awobuluyi, M.; Premkumar, L. S.; Takahashi, H.; Talantova, M.; Shin, Y.; Cui, J.; Tu, S.; Sevarino, K. A.; Nakanishi, N.; Tong, G.; Lipton, S. A.; Zhang, D. Excitatory glycine receptors containing the NR3 family of NMDA receptor subunits. Nature, 2002, 415, 793-798. 36. a, Monyer, H.; Sprengel, R.; Schoepfer, R.; Herb, A.; Higuchi, M.; Lomeli, H.; Burnashev, N.; Sakmann, B.; Seeburg, P.H. Heteromeric NMDA receptors: molecular and functional distinction of subtypes. Science 1992, 256, 1217-1221. b, Ishii, T.; Moriyoshi, K.; Sugihara, H.; Sakurada, K.; Kadotani, H.; Yokoi, M.; Akazawa, C.; Shigemoto, R.; Mizuno, N.; Masu, M.; Nakanishi, S.; Molecular characterization of the family of the N-methyl-D-aspartate receptor subunits. J. Biol. Chem. 1993, 268, 2836-2843. 37. Kékesi, G.; Horváth, GY. A kinurénsav fájdalomcsillapító hatása. Ideggyógyászati Szemle 2002, 55, 313–322. 38. Borza, I.; Domány, Gy. NR2B Selective NMDA Antagonists: The Evolution of the

120

Ifenprodil-Type Pharmacophore. Curr. Top. In Med. Chem. 2006, 6, 687-695. 39. The Merck Index (Thirteenth Edition) Merck Research Laboratories Division of Merck

& Co., Inc., Whitehouse Station, NJ, 2001, page 878. 40. Carron, C.; Jullien, A.; Bucher, B. Synthesis and Pharmacological Properties of a Series of 2-Piperidino Alkanol Derivatives. Arzneim. Forsch.1971, 21, 1992-1998. 41. Scatton, B.; Carter, C.; Claustre, Y.; L’Heureux, R.; Arbilla, S.; Langer, S. Z.; Gotti, B.; Duverger, D.; MacKenzie, E. T. The Cerebral Anti-ischemic Agents, Ifenprodil and SL- 82.0715, Antagonise the Effects of NMDA. Proceedings of the Xth International Congress of Pharmacology, Sydney, Australia, 1987; Abstract No. 012.064. 42. Williams, K. Ifenprodil Discriminates Subtypes of the N-Methyl-D-aspartate Receptor: Selectivity and Mechanisms at Recombinant Heteromeric Receptors. Mol. Pharm. 1993, 44, 851-859. 43. Chenard, B. L.; Menniti, F. S. Antagoists Selective for NMDA Receptors Containing the NR2B Subunit. Curr. Pharm. Des. 1999, 5, 381-404. 44. Nikam, S. S.; Meltzer, L. NR2B Selective NMDA Receptor Antagonists. Curr. Pharm.

Des. 2002, 8, 845-855. 45. McCauley, J. A. NR2B Subtype-selective NMDA Receptor Antagonists: 2001-2004. Expert Opin. Ther. Patents 2005, 15, 389-407. 46. Chenard, B. L.; Shalaby, I. A.; Koe, B. K.; Ronau, R.T.; Butler, T. W.; Prochniak, M. A.; Schmidt, A. W.; Fox, C. B. Separation of α1 Αdrenergic and N-Methyl-D-aspartate Antagonist Activity in a Series of Ifenprodil Compounds. J. Med. Chem. 1991, 34, 3085- 3090. 47. Wermuth, C. G. Selective Optimization of Side Activities: Another Way for Drug Discovery. J. Med. Chem. 2004, 47, 1-12. 48. Avenet, P.; Léonardon, J.; Besnard, F.; Graham, D.; Frost, J.; Depoortere, H.; Langer, S.

Z.; Scatton, B. Antagonist Porperties of the Stereoisomers of ifenprodil at NR1a/NR2A and NR1a/NR2B subtypes of the NMDA receptor expressed in Xenopus oocytes. Eur. J.

Pharm. 1996, 296, 209-213. 49. Chenard, B. L.; Bordner, J.; Butler, T. W.; Chambers, L. K.; Collins, M. A.; De Costa, D.

L.; Ducat, M. F.; Dumont, M. L.; Fox, C. B.; Mena, E. E.; Menniti, F. S.; Nielsen, J.; Pagnozzi, M. J.; Richter, K. G. E.; Ronau, R. T.; Shalaby, I. A.; Stemple, J. Z.; White, W. F. (1S,2S)-1-(4-Hydroxyphenyl)-2-(4-hydroxy-4-phenylpiperidino)-1-propanol: A Potent New Neuroprotectant Which Blocks N-Methyl-D-aspartate Responses. J. Med. Chem. 1995, 38, 3138-3145.

50. Sang, C. N.; Weaver, J. J.; Jinga, L.; Wouden, J.; Salterelli, M. D. The NR2B subunit- selective NMDA receptor antagonist, CP-101,606, reduces spontaneous pain intensity in patients with central and peripheral neuropathic pain. Program No 814.9 2003 Abstract

Viewer/Itinerary Planner; Society for Neuroscience: Washington, DC, 2003. Online. 51. Butler, T. W.; Blake, J. F.; Bordner, J.; Butler, P.; Chenard, B. L.; Collins, M. A.;

DeCosta, D.; Ducat, M. J.; Eisenhard, M. E.; Menniti, F. S.; Pagnozzi, M. J.; Sands, S. B.; Segelstein, B. E.; Volberg, W.; White, W. F.; Zhao, D. (3R,4S)-3-[4-(4-Fluorophenyl)-4-hydroxypiperidin-1-yl]chroman-4,7-diol: A Conformationally Restricted Analogue of the NR2B Subtype-Selective NMDA Antagonist (1S,2S)-1-(4-Hydroxyphenyl)-2-(4-hydroxy-4-phenylpiperidino)-1-propanol. J. Med. Chem. 1998, 41, 1172-1184.

52. Leibrock, J.; Prücher, H.; Rautenberg, W. EMD 95885, a new eliprodil analogue with higher affinity for the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor. Pharmazie 1997, 52, 479- 480. 53. Fischer, G.; Mutel, V.; Trube, G.; Malherbe, P.; Kew, J. N. C.; Mohacsi, E.; Heitz, M. P.;

121

Kemp, J. A. Ro 25-6981, a Highly Potent and Selective Blocker of N-Methyl-D-aspartate Receptors Containing the NR2B Subunit. Characterization in Vitro. J. Pharmacol. Exp.

Ther. 1997, 283, 1285-1292. 54. Mutel, V.; Buchy, D.; Klingelschmidt, A.; Messer, J.; Bleuel, Z.; Kemp, J. A.; Richards, J.

G. In Vitro Binding Properties in Rat Brain of [3H]-Ro 25-6981, a Potent and Selective Antagonist of NMDA Receptors Containing NR2B Subunits. J. Neurochem. 1998, 70, 2147-2155.

55. Kew, J. N. C.; Trube, G.; Kemp, J.A. State-dependent NMDA receptor antagonism by Ro 8-4304, a novel NR2B selective, non-competitive, voltage-independent antagonist. Brit. J.

Pharmacol. 1998, 123, 463-472. 56. Greengrass P.; Bremmer, R. Binding characteristics of 3H-Prazosin to rat brain α- adrenergic receptors. Eur. J. Pharmacol. 1979, 55, 323-326. 57. Pinard, E.; Alanine, A.; Bourson, A.; Büttelmann, B.; Gill, R.; Heitz, M.-P.; Jaeschke, G.;

Mutel, V.; Trube, G.; Wyler, R. Discovery of (R)-1-[2-Hydroxy-3-(4-hydroxy-phenyl)-propyl]-4-(4-methyl-benzyl)-piperidin-4-ol: a Novel NR1/2B Subtype Selective NMDA Receptor Antagonist. Bioorg. Med. Chem. Letters 2001, 11, 2173-2176.

58. Gill, R.; Alanine, A.; Bourson, B.; Buttelmann, B.; Fischer, G.; Heitz, M.-P.; Kew, J. N. C.; Levet-Trafit, B.; Lorez, H.-P.; Malherbe, P.; Miss, M.-T.; Pinard, E.; Roever, S.; Schmitt, M.; Trube, G.; Wybrecht, R.; Wyler, R.; Kemp, J. A. Pharmacological Characterization of Ro 63-1908 (1-[2-(4-Hydroy-phenoxy)-ethyl]-4-(4-methyl-benzyl)-pipridin-4-ol), a Novel Subtype-Selective N-Methyl-D-aspartate Antagonist. J.

Pharmacol. Exp. Ther. 2002, 302, 940-948. 59. Higgins, G. A.; Ballard, T. M.; Huwyler, J.; Kemp, J. A.; Gill, R. Evaluation of the

NR2B-selective NMDA receptor antagonist Ro 63-1908 on rodent behaviour: evidence for an involvement of NR2B NMDA receptors in response inhibition. Neuropharm. 2003, 44, 324-341.

60. Gill, R.; Lorez, H. P.; Wybrecht, R.; Miss, M.-T.; Bourson, A.; Fischer, G.; Kew, J.; Mutel, V.; Trube, G.; Roever, S.; Heitz, M.-P.; Kemp, J. A. Novel, Activity-dependent NMDA NR2B Subtype Selective Antagonists as Neuroprotective Agents. Abstracts book, XVIth International Symposium on Medicinal Chemistry, Bologna, 2000,: Abst ML-43.

61. Jaeschke, G.; Alanine, A.; Sleight, A. B.; Büttelman, B.; Fischer, H.; Gill, R.; Neidhart, M.-P. H.; Huwyler, J.; Kemp, J. A.; Kansy, M.; Mutel, V.; Pinard, E.; Trube, G.; Wyler, R. Synthesis and Biological Evaluation of β-Aminosulfones as Novel NMDA-NR1/2B Subtype Selective Antagonists. Drugs Fut. 2002, 27(Suppl. A): Abst C76.

62. Tamiz, A. P.; Whittemore, E. R.; Zhou, Z.-L.; Huang, J.-C.; Drewe, J. A.; Chen, J.-C.; Cai, S.-X.; Weber, E.; Woodward, R. M.; Keana, J. F. W. Structure-Activity Relationships for a Series of Bis(phenylalkyl)amines: Potent Subtype-Selective Inhibitors of N-Methyl-D-aspartate Receptors. J. Med. Chem. 1998, 41, 3499-3506.

63. Guzikowski, A. P.; Tamiz, A. P.; Acosta-Burruel, M.; Hong-Bae, S.; Cai, S. X.; Hawkinson, J. E.; Keana, J. F. W.; Kesten, S. R.; Shipp, C. T.; Tran, M.; Whittemore, E. R.; Woodward, R. M.; Wright, J. L.; Zhou, Z.-L. Synthesis of N-Substituted 4-(4-Hydroxy-phenyl)piperidines, 4-(4-Hydroxybenzyl)piperidines, and (+)-3-(4-Hydroxyphenyl)-pyrrolidines: Selective Antagonists at the 1A/2B NMDA Receptor Subtype. J. Med. Chem. 2000, 43, 984-994.

64. Tamiz, A. P.; Whittemore, E. R.; Woodward, R. M.; Upasani, R. B.; Keana, J. F. W. Structure-Activity Relationship for a Series of 2-Substituted 1,2,3,4-Tetrahydro-9H-pyrido[3,4-b]indoles: Potent Subtype-Selective Inhibitors of N-Methyl-D-aspartate (NMDA) Receptors. Bioorg. Med. Chem. Letters 1999, 9, 1619-1624.

65. Zhou, Z.-L.; Cai, S. X.; Whittemore, E. R.; Konkoy, C. S.; Espitia, S. A.; Tran, M.; Rock, D. M.; Coughenour, L. L.; Hawkinson, J. E.; Boxer, P. A.; Bigge, C. F.; Wise, L. D.;

122

Weber, E.; Woodward, R. M.; Keana, J. F. W. 4-Hydroxy-1-[2-(4- hydroxyphenoxy)ethyl]-4-(4-methylbenzyl)piperidine: A Novel, Potent, and Selective NR1/2B NMDA Receptor Antagonist. J. Med. Chem. 1999, 42, 2993-3000.

66. Shelkun, R. M.; Yuen, P., Serpa, K.; Meltzer, L. T.; Wise, L. D. Subtype-Selective N- Methyl-D-aspartate Receptor Antagonists: Benzimidazolone and Hydantoin as Phenol Replacements J. Med. Chem. 2000, 43, 1892-1897.

67. Gregory, T. F.; Wright, J. L.; Wise, L. D.; Meltzer, L. T.; Serpa, K. A.; Konkoy, C. S.; Whittemore, E. R.; Woodward, R. M. Parallel Synthesis of a Series of Subtype-Selective NMDA Receptor Antagonists Bioorg. Med. Chem. Letters 2000, 10, 527-529.

68. Wright, J. L.; Kesten, S. R.; Upasani, R. B.; Lan, N. C. 4-Benzylpiperidinylalkylsulfinyl- substituted heterocycles and their use as subtype-selective NMDA receptor antagonists. PCT Int. Appl. WO 2000/000197-A1, Jan 6, 2000; Chem. Abstr. 2000, 132, 64255.

69. Wright, J. L.; Gregory, T. F.; Bigge, C. F.; Boxer, P. A.; Serpa, K.; Meltzer, L. T.; Wise, L. D.; Cai, S. X.; Hawkinson, J. E.; Konkoy, C. S.; Whittemore, E. R.; Woodward, R. M.; Zhou, Z. L. Subtype-Selective N-Methyl-D-aspartate Receptor Antagonists: Synthesis and Biological Evaluation of 1-(Aralkynyl)-4-benzylpiperidines. J. Med. Chem. 1999, 42, 2469-2477.

70. Wright, J. L.; Gregory, T. F.; Kesten, S. R.; Boxer, P. A.; Serpa, K. A.; Meltzer, L. T.; Wise, L. D. Subtype-Selective N-Methyl-D-aspartate Receptor Antagonists: Synthesis and Biological Evaluation of 1-(Heteroarylalkynyl)-4-benzylpiperidines. J. Med. Chem. 2000, 43, 3408-3419.

71. Kornberg, B. E.; Nikam, S. S.; Wright, J. L.; Kesten, S. R.; Meltzer, L. T.; Coughenour, L.; Barr, B.; Serpa, K. A.; McCormick, J. Subtype selective NMDA receptor antagonists: evaluation of some novel alkynyl analogues. Bioorg. Med. Chem. Letters 2004, 14, 1213- 1216.

72. Tamiz, A. P.; Whittemore, E. R.; Schelkun, R. M.; Yuen, P.-W.; Woodward, R. M.; Cai, S.-X.; Weber, E.; Keana, J. F. W. N-(2-(4-Hydroxyphenyl)ethyl)-4-chlorocinnamide: a Novel Antagonist at the 1A/2B NMDA Receptor Subtype. Bioorg. Med. Chem. Letters

1998, 8, 199-200. 73. Tamiz, A. P.; Cai, S. X.; Zhou, Z.-L.; Yuen, P.-W.; Schelkun, R. M.; Whittemore, E. R.;

Weber, E.; Woodward, R. M.; Keana, J. F. W. Structure-Activity Relationship of N- (Phenyl-alkyl)cinnamides as Novel NR2B Subtype-Selective NMDA Receptor Antagonists. J. Med. Chem. 1999, 42, 3412-3420.

74. McCauley, J. A.; Theberge, C. R.; Romano, J. J.; Billings, S. B.; Anderson, K. D.; Claremon, D. A.; Freidinger, R. M.; Bednar, R. A.; Mosser, S. D.; Gaul, S. L.; Connolly, T. M.; Condra, C. L.; Xia, M. Cunningham, M. E.; Bednar, B.; Stump, G. L.; Lynch, J. J.; Macaulay, A.; Wafford, K. A.; Koblan, K. S.; Liverton, N. J. NR2B-Selective N-Methyl- D-aspartate Antagonists: Synthesis and Evaluation of 5-Substituted Benzimidazoles. J.

Med. Chem. 2004, 47, 2089-2096. 75. McCauley, J. A.; Theberge, C. R.; Liverton, N. J.; Claremon, D. A.; Claiborne, C. F. 2-

Benzyl and 2-Heteroaryl Benzimidazole NMDA/NR2B Antagonists. U.S. Patent 6,316,474 B1, November 13, 2001.

76. Liverton, N. J.; Butcher, J. W.; McIntyre C. J.; Claiborne, C. F.; Claremon, D. A.; McCauley, C. J.; Romano, J. J.; Thompson, W.; Munson, P.M. N-substituted nonaryl- heterocyclo amidyl NMDA/NR2B antagonists. PCT Int. Appl. WO 2002080928-A1, Apr 3, 2001. 77. Nagy, J.; Boros, A.; Dezsı, P.; Kolok, S.; Fodor, L. Inducible expression and

pharmacology of recombinant NMDA receptors, composed of rat NR1a/NR2B subunits. Neurochem. Int. 2003, 43, 19-29.

78. Curtis, N. R.; Diggle, H. J.; Kulagowski, J. J.; London, C.; Grimwood, S.; Hutson, P. H.;

123

Murray, F.; Richards, P.; Macaulay, A.; Wafford, K. A. Bioorg. Med. Chem. Letters

2003, 13, 693-696. 79. Curtis, N. R.; Diggle, H. J.; Kulagowski, J. J.; London, C.; Grimwood, S.; Hutson, P. H.;

Murray, F.; Richards, P.; MaCaulay, A.; Wafford, K. A. Bioorg. Med. Chem. Letters

2003, 13, 697-700. 80. US6265426 (2001) 81. WO03097637 (2003) 82. US6683097 (2004) 83. Alanine, A.; Bourson, A.; Buttelmann, B.; Gill, R.; Heitz, M.-P.; Mutel, V.; Pinard, E.;

Trube, G.; Wyler, R. 1-Benzyloxy-4,5-dihydro-1H-imidazol-2-yl-amines, a novel class of NR1/2B subtype selective NMDA receptor antagonists. Bioorg. Med. Chem. Letters. 2003, 13, 3155-3159.

84. Pinard, E.; Alanine, A.; Bourson, A.; Buttelmann, B.; Heitz, M.-P.; Mutel, R.G.; Trube G.; Wyler R. 4-Aminoquinolines as a novel class of NR1/2B subtype selective NMDA receptor antagonists. Bioorg. Med. Chem. Letters. 2002, 12, 2615-2619. 85. US6440995 (2002) 86. Büttelmann, B.; Alanine, A.; Bourson, A.; Gill, R.; Heitz, M. P.; Mutel, V.; Pinard, E.;

Trube, G.; Wyler, R. 4-(3,4-Dihydro-1H-isoquinolin-2yl)-pyridines and 4-(3,4-Dihydro- 1H-isoquinolin-2-yl)-quinolines as potent NR1/2B subtype selective NMDA receptor antagonists. Bioorg. Med. Chem. Letters. 2003, 13, 1759-1762.

87. Büttelmann, B.; Alanine, A.; Bourson, A.; Gill, R.; Heitz, M. P.; Mutel, V.; Pinard, E.; Trube, G.; Wyler, R. 2-(3,4-Dihydro-1H-isoquinolin-2yl)-pyridines as a novel class of NR1/2B subtype selective NMDA receptor antagonists. Bioorg. Med. Chem. Letters. 2003, 13, 829-832.

88. US6831087 (2004) 89. Nguyen, K. T.; Claiborne, C. F.; McCaulay, J. A.; Libby, B. E.; Claremon, D. A.; Bednar,

R. A.; Mosser, S. D.; Gaul, S. L.; Connolly, T. M.; Condra, C. L.; Bednar, B.; Stump, G. L.; Lynch, J. J.; Koblan, K. S.; Liverton, N. J. Cyclic benzamidines as orally efficacious NR2B-selective NMDA receptor antagonists. Bioorg. Med. Chem. Letters 2007, 17, 3997-4000.

90. US6440976 (2002) 91. Gozlan, H.; Emerit, M. B.; Hall, M. D.; Nielsen M.; Hamon, M. In situ molecular sizes of the various types of 5-HT binding sites in the rat brain Biochem. Pharmacol. 1986, 35, 1891–1897. 92. Li, J. H.; Wang, Y. H.; Wolfe, B. B.; Krueger, K. E.; Corsi, L.; Stocca, G.; Vicini, S. Developmental changes in localization of NMDA receptor subunits in primary cultures of cortical neurons. Eur. J. Neurosci. 1998, 10, 1704-1715. 93. Dickenson, A. and Besson J.-M. (Editors): Chapter 1, pp. 6-7: Animal models of Analgesia; and Chapter 8, pp. 180-183: Mechanism of Central Hypersensitivity: Excitatory Amino Acid Mechanisms and Their Control – In Pharmacology of Pain. Springer-Verlag (Berlin) 1997.]. 94. Hunskaar, S.; Fasmer, O. B.; Hole, K. Formalin Test in Mice, a Useful Technique for Evaluating Mild. Journal of Neuroscience Methods, 1985, 14, 69-76. 95. Seltzer, Z.; Dubner, R.; Shym, Y. A novel behavioral model of neurophaticpain

disorders produced in rats by partial sciatic nerve injury. Pain 1990, 43, 205-218. 96. a, Wermuth, C. G. In The Practice of Medicinal Chemistry, Wermuth, C. G., Ed.; Academic Press : London, San Diego, New York, Boston, Sydney, Tokyo, Toronto, 1996; p 228. b, Friedman, H. L. (1951) Influence of isosteric replacements upon biological activity. In Symposium on Chemical-Biological Correlation. National Research Council Publication,

124

Washington D.C. 97. Nicolaou, K. C.; Ramanjulu, Joshi M.; Natarajan, Swaminathan; Braese, Stefan; Li, Hui; et al. A Suzuki coupling-macrolactamization approach to the AB-COD bicyclic system of vancomycin. Chem. Commun. 1997, 19, 1899-1900. 98. (a) Kondo, K.; Morohoshi, S.; Mitsuhashi, M.; Murakami, Y. Chem. Pharm. Bull. 1999, 47, 1227. (b) Boger, D. L.; Cerbone, L. R.; Yohannes, D. Oxidative Coupling of Methyl 6-Hydroxyindole-2-carboxylate with Primary Amines: Preparation of 2-Substituted Methyl Pyrrolo[2,3-e]benzoxazole-5-carboxylates. J.Org. Chem. 1988, 53, 5163. 99. Doyle, F. P.; Ferrier, W.; Holland, D. O.; Mehta, M. D.; Nayler, J. H. C. Potential Antituberculosis Agents of the Indole Series. J. Chem. Soc. 1956, 78, 2853-2856. 100. Parke Davis; NL 6409825 1965; Chem. Abstr. 1965, 63, 11517d. 101. Lu, T.; Soll, R. M.; Illig, C. R.; Bone, R.; Murphy, L.; Spurlino, J.; Salemme, R. R.; Tomczuk, B. E. Structure-Activity and Crystallogrphic Analysis of a New Class of Non- amide-Based Thrombin Inhibitor. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2000, 10, 79-82. 102. Xue, C. B.; Roderick, J.; Jackson, S.; Rafalski, M.; Rockwell, A.; Mousa, S.; Olson,

R.E.; DeGrado, W. F. Design, Synthesis, and In vitro Activities of Benzamide-Core Glycoprotein IIb/IIIa Antagonists: 2,3-Diaminopropionic Acid Derivatives as Surrogates of Aspartic Acid. Bioorg. Med. Chem. 1997, 5, 693-705. 103. (a) Ágai, B.; Nádor, A.; Proszenyák, Á.; Tárkányi, G.; Faigl, F. A facile synthesis of 3- (substituted benzyl)piperidines. Tetrahedron 2003, 59, 7897-7900. (b) Ágai, B.; Proszenyák, Á.; Tárkányi, G.; Vida, L.; Faigl, F. Convenient, benign and scalable synthesis of 2- and 4-substituted benzylpiperidines. Eur. J. Org. Chem. 2004, 3623-3632. (c) Proszenyák, Á.; Ágai, B.; Hegedős, L.; Faigl, F. Hydrogenation of a 4- benzylpiperidine derivative over supported precious metal catalysts. Applied Catalysis A 2004, 269, 249-253. 104. Crowther, A. F.; Curd, F. H. S.; Davey, D. G.; Stacey, G. J. Synthetic Antimalarials. Dialkylaminoalkylaminoquinoxalines. J. Chem. Soc. 1949, 1260. 105. Borza, I.; Bartáné Szalai, G.; Domány, Gy.; Horváth, Cs.; Farkas, S.; Nagy, J.; Kolok, S. Amide derivatives as NMDA receptor antagonists. WO 2002/34718A1. 106. Borza, I.; Kolok, S.; Gere, A.; Ágai-Csongor, É.; Ágai, B.; Tárkányi, G.; Horváth, Cs.; Barta-Szalai, G.; Bozó, É.; Kiss, Cs.; Bielik, A.; Nagy, J.; Farkas, S.; Domány, Gy. Indole-2-carboxamides as Novel NR2B Selective NMDA Receptor Antagonists Bioorg.

Med. Chem. Letters 2003, 13, 3859-3861. 107. Borza, I.; Kolok, S.; Gere, A.; Nagy, J.; Fodor, L.; Galgóczy, K.; Fetter, J.; Bertha, F.; Ágai, B.; Horváth, Cs.; Farkas, S.; Domány, Gy. Benzimidazole-2-carboxamides as Novel NR2B Selective NMDA Receptor Antagonists.Bioorg. Med. Chem. Lett. 2006, 16, 4638-4640. 108. Borza, I.; Bozó, É.; Barta-Szalai, G.; Kiss, Cs.; Tárkányi , Á.; Demeter Á.; Gáti T.; Háda, V.; Kolok, S.; Gere, A.; Fodor, L.; Nagy, J.; Galgóczy, K.; Magdó, I.; Ágai, B.; Fetter, J.; Bertha, F.; M. Keserő, Gy.; Horváth, Cs.; Farkas, S.; Greiner, I.; Domány, Gy. Selective NR1/2B N-Methyl-D-aspartate Receptor Antagonists among Indole-2- carboxamides and Benzimidazole-2-carboxamides. J. Med. Chem. 2007, 50, 901-914. 109. Gilligan, P. J.; Cain, G. A.; Christos, T. E.; Cook, L.; Drummond, S .; Johnson, A. L.; Kergay, A. A.; McElroy, J. F.; Rohrbach, K. W.; Schmidt, W. K.; Tam, S . W. Novel Piperidine s receptor ligands as potential antipsychotic drugs. J. Med. Chem., v.35, p.4344-4361, 19921. 110. Domány, Gy.; Horváth, Cs.; Farkas, S.; Barta-Szalai, G.; Nagy, J.; Kolok, S.; Bozó, É.; Borza, I.; Vágó, I.; Bielik,A.; Ignácz-Szendrei Gy.; Keserő, Gy. M. Piperidine derivatives as NMDA receptor antagonists. WO 2003010159A1. 111. Barta-Szalai, G.; Borza, I.; Bozó, É.; Kiss, Cs.; Ágai, B.; Proszenyák, Á.; Keserő, Gy.

125

M.; Gere, A.; Kolok, S.; Galgóczy, K.; Horváth, Cs.; Farkas, S.; Domány, Gy. Oxamides As novel NR2B selective NMDA receptor antagonists. Bioorg. Med. Chem. Letters

2004, 14, 3953-3956. 112. Jaen, J. C.; Laborde, E.; Bucsh, R. A.; Caprathe, B. W.; Sorenson, R. J.; Fergus, J.; Spiegel, K.; Marks, J.; Dickerson, M. R.; Davis, R. E. J. Med. Chem. 1995, 38, 4439- 4445. 113. Borza, I.; Horváth, Cs.; Farkas, S.; Nagy, J.; Kolok, S. Kynurenic acid amide derivatives as NR2B receptor antagonists. WO 2006010967A1. 114. Borza, I.; Kolok, S.; Horváth, Cs.; Farkas, S.; Domány, Gy. New kynurenic acid amides as novel NR2B selective NMDA receptor antagonists. Bioorg. Med. Chem. Letters 2007 17, 406-409. 115. Holland G.F. (1979) Heterocyclylcarbonyl derivatives of urea, agents for dissolution of gallstones. US 4,163 784 116. Deng, M. Z.; Caubere, P.; Senet, J. P.; Lecolier, S. Tetrahedron, 1988, 44, 6079 – 6086. 117. Borza, I.; Bartáné Szalai, G.; Bozó, É.; Kis, Cs.; Horváth, Cs.; Farkas, S.; Nagy, J.; Kolok, S. New benzoyl urea derivatives. WO 2006010966A1. 118. Borza, I.; Greiner, I.; Kolok, S.; Galgóczy, K.; Ignácz-Szendrei, Gy.; Horváth, Cs.; Farkas, S.; Gáti, T.; Háda, V.; Domány, Gy. New benzoyl urea derivatives as novel NR2B selective NMDA receptor antagonists. Die Pharmazie 2006 61(9), 799-800. 119. Curtis, N. R.; Diggle, H. J.; Kulagowski, J. J.; London, C.; Grimwood, S.; Hutson, P. H.; Murray, F.; Richards, P.; Macaulay, A.; Wafford, K. A. Bioorg. Med. Chem. Letters

2003, 13, 693-696. 120. Borza, I.; Horváth, Cs.; Farkas, S.; Nagy, J.; Kolok, S. Indole-2-carboxamidine derivatives as NMDA receptor antagonists. WO 2006010965A1. 121. Borza, I.; Kolok, S.; Ignácz-Szendrei, G.; Greiner, I.; Tárkányi, G.; Galgóczy K.; Horváth, Cs.; Farkas, S.; Domány, Gy. Indole-2-carboxamidines as novel NR2B selective NMDA receptor antagonists. Bioorg. Med. Chem. Letters 2005, 15, 5439-5441. 122. Chaperon, F.; Müller, W.; Auberson, Y. P.; Tricklebank, M. D.; Neijt, H. C. N-methyl- D-aspartate receptor antagonists: preferential involvement of the NR2B rather than NR2A subunit. Behavioural Pharmacology 2003, 14, 477-487. 123. Boyce, S.; Wyatt, A.; Webb, J. K.; O'Donnell, R.; Mason, G.; Rigby, M.; Sirinathsinghji, D.; Hill, R.G.; Rupniak, N. M. J. Selective NMDA NR2B antagonists induce antinociception without motor dysfunction: correlation with restricted localisation of NR2B subunit in dorsal horn. Neuropharmacology 1999, 38, 611-623. 124. Johnson, K.; Shah, A.; Jaw-Tsai, S.; Baxter, J.; Prakash, C. Metabolism, Pharmacokinetics, and Excretion of a Highly Selective N-Methyl-d-aspartate Receptor Antagonist, Traxoprodil, in Human Cytochrome P450 2D6 Extensive and Poor Metabolizers. Drug metabolism and disposition 2003, 31, 76-87. 125. Borza, I.; Horváth, Cs.; Farkas, S.; Gyertyán, I.; Nagy, J.; Kolok, S.; Galgóczy, K.; Sághy, K. New heterocyclic acid amide derivatives.WO 2006010969A1. 126. Borza, I.; Horváth, Cs.; Farkas, S.; Gyertyán, I.; Nagy, J.; Kolok, S.; Galgóczy, K.;

Sághy, K. New 4-benzylidene-piperidine derivatives.WO 2006010964A1

126

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

Köszönettel tartozom valamennyi közremőködınek, akikkel együtt fáradhatatlanul

dolgoztunk, segítettük egymást közös célunk elérése érdekében. Külön köszönöm Domány

Györgynek a biztatást, iránymutatást és segítséget a kutatómunkában, a publikációk, valamint

a doktori dolgozat elkészítésében.

Hálás vagyok Bozó Évának, Bartáné Szalai Gizellának és Ignáczné Szendrei Györgyinek a

baráti biztatásért, szakmai tanácsaikért, pótolhatatlan segítségükért.

Köszönöm a családomnak a folyamatos, lelkes támogatást.

KÖZREMŐKÖDİK

KUTATÁSVEZETÉS Szombathelyi Zsolt Greiner István Tihanyi Károly Farkas Sándor PROJEKTVEZETİ Horváth Csilla GYÓGYSZERKÉMIA Domány György Ágainé Csongor Éva Bartáné Szalai Gizella Bielik Attila Borza István Bozó Éva Galambos János Greiner István Kiss Csilla Szentirmay Éva Vágó István Wágner Gábor Wéber Csaba BME Ágai Béla Bertha Ferenc Fetter József Proszenyák Ágnes MOLEKULATERVEZÉS Keserő György Miklós Kovári Zoltán Kósa János Magdó Ildikó SZERKEZETKUTATÁS Demeter Ádám Hegedős Béla Ignáczné Szendrei Györgyi Mák Mariann Szántay Csaba jr. Tárkányi Gábor KÖNYVTÁR Fazekas Andrea

VEGYÉSZTECHNIKUSOK András Judit Bozsokiné Téglás Ildikó Csomontányi Józsefné Csomós Erzsébet Csontosné Brunner Éva Demeter Lászlóné Huszár Lászlóné Jéney Erzsébet Kállayné Sohonyai Anna Mikó Istvánné Molnár Magdolna Stark Istvánné ANALITIKA Demeter Mária Meszlényi Gábor Meszlényiné Sipos Márta Rill Attila Tischler Ferenc NEUROFARMAKOLÓGIA Horváth Csilla Felmérai Laura Házi Zsolt Galgóczy Kornél Kis-Varga Ágnes Kordás Krisztina TOXIKOLÓGIA Hegyi Lászlóné Horváth Irén Karsai Edit Krajcsovicz Zoltán Selényi György Varga Márta ÁLTALÁNOS FARMAKOLÓGIA Dézsi László Hornok Katalin Komlódi Zsolt Makó Éva Orosz Szabolcs

SEJTBIOLÓGIA Dezsı Péter Kolok Sándor Krizsán Ágnes Nagy József Tomic Marianna VISELKEDÉS FARMAKOLÓGIA Gyertyán István Egyed Róbert Kedves Rita Laszy Judit Orosz Szabolcs Sághy Katalin Gál Krisztina IN VITRO METABOLIZMUS Dalmadi Balázs Leibinger János Tihanyi Károly Vastag Mónika Szeberényi Szabolcs MOLEKULÁRIS FARMAKOLÓGIA Gere Anikó Kiss Béla Schmidt Éva Szikra Judit Fazekas Károly FARMAKOKINETIKA Dallos Szvetlana Gémesi Larisza Kapás Margit Nagy Zoltán Trafikánt Gábor Terjéki Etelka ELEKTROFIZIOLÓGIA Fodor László Kocsis Pál Tarnawa István Boros András Kovács Gyula FORMULÁCIÓ Bódis Attila