Fitoterapici e antibiotici naturali: prospettive di utilizzo in acquacoltura

Marco Galeotti1, Emilio Tibaldi1, José Malvisi2

1Dipartimento di Scienze Animali - Facoltà di Medicina Veterinaria - Università di Udine2Dipartimento di Patologia, Diagnostica e Clinica Veterinaria - Facoltà di Medicina Veterinaria – Università di

Perugia

Firenze, 4 marzo 2010

Negli ultimi anni in acquacoltura vengono avanzati nuovi approcci alla gestione delle problematiche sanitarie, proponendo l’impiego di sostanze naturali, quali gli immunostimolanti (probiotici) e i principi attivi estratti dalle piante.

stimolazione del sistema immunitario delle specie ittiche allevate → maggiore resistenza alle malattie

1) introduzione di norme comunitarie più severe per l’uso di farmaci veterinari (Regolamento CE n. 2377/1990 e n. 726/2004)2) riduzione uso di antibiotici, causa dello sviluppo di patogeni resistenti3) riduzione impatto ambientale, dovuto all’impiego di chemoterapici4) riduzione accumulo di residui chimici nel pesce →minor rischio per il consumatore

Definizioni - 1

D.L. n. 219 del 24 aprile 2006 - Attuazione direttive 2001/83/CE e 2003/94/CE riguardantimedicinali per uso umano.

Thymus vulgaris

Origanum vulgare

Ocimum sanctum

Fitoterapico = Ogni medicinale che contiene esclusivamentecome sostanze attive una o più sostanze vegetali o una o piùpreparazioni vegetali, oppure una o più sostanze vegetali in associazione ad una o più preparazioni vegetali.

Sostanze vegetali = Tutte le piante, le parti di piante, le alghe, i funghi, i licheni, interi, a pezzi o tagliati, in forma non trattata, di solito essiccata, ma talvolta ancheallo stato fresco. Sono altresi considerati sostanze vegetali taluni essudati non sottoposti ad un trattamento specifico. Le sostanze vegetali sono definite in modopreciso in base alla parte di pianta utilizzata e alla denominazione botanica secondola denominazione binomiale (genere, specie, varietà e autore).

Preparazioni vegetali = Preparazioni ottenute sottoponendo le sostanze vegetalia trattamenti quali estrazione, distillazione, spremitura, frazionamento, purificazione, concentrazione o fermentazione. In tale definizione rientrano anche sostanzevegetali triturate o polverizzate, tinture, estratti, olii essenziali, succhi ottenuti per spremitura ed essudati lavorati.

Per fitoterapia si intende

“la disciplina medica che utilizza piante medicinali e

derivati nella prevenzione e cura delle malattie,

relativamente alle proprietà farmacologiche dei

costituenti chimici presenti nella pianta, o meglio,

nel preparato utilizzato…” da Firenzuoli F. –

Fitoterapia - Milano: Masson; 2002.

Definizioni - 2

Rosmarinus officinalis

Allium sativum

Salvia officinalis

Pubblicazioni scientifiche riguardantil’uso di piante medicinali in acquacoltura

nel periodo 1995-2010

(n° pubblicazioni scientifiche consultate = 55)

2001-2005

2006-2010

1995-2000

Ripartizione geografica delle ricerche condotte

n° pubblicazioni scientifiche consultate = 55

Egitto

Cina

India

Iran

Turchia

Grecia

UngheriaGermaniaUSA

Israele

Tailandia

Spagna Inghilterra

Giappone

Corea

Bangladesh

Piante medicinali utilizzate sperimentalmentenelle specie ittiche

Angelicae sinensis

Curcuma longaViscum album

Withania somnifera

Spirulina platensis

Rosmarinus officinalis

Astragalus membranaceus

Cynodon dactylon

Ocimum sanctumOriganum sp.

Zingiber officinale

Achyranthes asperaAllium sativum

Azadirachta indica

Phyllanthus niruri

Acalypha indica

Aegle marmelos

aloe

Andrographis paniculata

Artemisia capillaries

Cinnamomum verum

Cnidium officinale

Crataegi fructus

Eclipta alba

Epimedium brevicornum

Ganoderma lucidum

Glycyrrhiza glabra

Lonicera japonica

Magnifera indica

Massa medicata

Mucor circinelloides

Muscari comosum

Myristica fragrans

Origanum minutiflorum

Piper longum

Psidium guajava

Rheum officinale

Scutellaria baicalensis

Silybum marianum

Solanum trilobatum

Tinospora cordifolia

Tridax procumbens

Urtica dioica

n° prove sperimentali eseguite = 101 (descritte in 48 pubblicazioni scientifiche)

Specie ittiche oggetto di sperimentazione

Anguilla japonica

Ictalurus punctatusEpinephelus tauvina

Oreochromis sp.

Pagrus major

Pseudosciaena croceaSebastes schlegeli

Sparus aurata

Dicentrarchus labraxOncorhynchus mykiss

Carassius aurataCatla catla

Diplodus puntazzoCyprinus carpio

Labeo rohita

Myxocyprinus asiaticus

n° pubblicazioni scientifiche consultate = 55

NB. Nella > parte delle prove gli estratti vengono somministrati per via orale.

Yiagnisis M., et al., 2009. Effect of dietary oregano essential oil supplementation on combined infections by pathogenic bacteria-parasites (Sea lice and Copepods) in

European sea bass D. labrax . Atti 14°convegno EAFP, Praga.

Jang S.I. et al., 1995. The effect of glycyrrhizin on rainbow trout (O. mykiss), leukocytes responses. Journal of Fish Diseases, 18 (4), 307-315.

Ulukoy G., et al., 2007. Immunostimulant effects of Muscari comosum miller plant extract in rainbow trout (O. mykiss). Atti 13° Convegno EAFP, Grado (GO).

Effetto delle piante medicinali su parametrizootecnici, ematochimici ed immunologici

Le piante medicinali influenzano i parametri di crescita e la risposta immunitaria aspecifica, inducendo aumento di parametri quali:• proteine del siero• RBC, WBC, Hb, Hct• capacità di fagocitosi dei leucociti• burst ossidativo dei leucociti• attività del lisozima del siero• attività delle perossidasi del siero• attività delle antiproteasi del siero• attività del complemento• espressione di citochine

Se somministrate in associazione a vaccini potenziano la risposta immunitaria specifica, favorendo la produzione di anticorpi.

Eclipta alba

Azadirachta indica

Viscum album

Numero di specie vegetali che risultano efficacinel ridurre la mortalità dei pescidopo infezione con agenti batterici

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

A. hyd

rophila

A. som

bria

E. ict

aluri

S. aga

lactia

e

S. inia

e

V. alg

inolyt

icus

V. ang

uillaru

m

V. har

veyi

V. vul

nificu

s

0

10

20

30

40

50

60

70

A. hydroph

ila

A. salmon

icida

E. ta

rda

F. colum

nare

L. garviea

e

L. raffin

ose

P. dam

selae

P. aerug

inosa

P. ang

uilliseptica

P. fluo

rescen

s

S. agalactiae

S. in

ieae

S. parau

bvris

V. alginolyticus

V. ang

uilla

rum

V. harveyi

V. salmon

icida

V. vulnific

us

Y. ruc

keri

Numero di specie vegetali che hanno attivitàantibatterica in vitro nei confronti di agenti batterici

Attività prevista nell’ambito del progetto “Azione concertata per l’identificazionedi contributi scientifici per lo sviluppo dell’aquacoltura biologica in Italia: aspetti

alimentari e di prevenzione e cura delle malattie” n. 7C 09

Oli essenziali ricavati da piante aromatiche sono statiampiamente impiegati in medicina umana in quanto dotati di attività antibatterica

Esempi: eugenolo dal garofano – allicina dall’ aglio – carvacroloe timolo da origano e timo – vanillina dalla vaniglia

Già condotte indagini sperimentali sull’appetibilità di eugenolo e carvacrolo in orata. Carvacrolo risultato appetibile da parte di questa specie.

Dotato di proprietà antitumorali e antiossidanti. Food and Drug Administration ha consentito il suo impiego nella composizionedi bevande e dolciumi (2-25 ppm).

PIANO SPERIMENTALE

Specie: D. labrax

Fitoterapico: carvacrolo

Somministrazione di dietecontenenti diversi livelli

di carvacrolo per 8 sett. (Univ. Udine)

Valutazione parametrizootecnici

(Univ. Udine e Firenze)

Valutazioni parametridi risposta immunitaria

(Univ. Udine)e stress ossidativo

(Univ. Perugia)

Effetto delle piante medicinalisulla resistenza ai patogeni (batteri)

n° pubblicazioni scientifiche consultate = 34

A. hydrophila

E. ictaluri

V. alginolyticusV. anguillarum

V. harveyi

V. vulnificus A. sombria

S. agalactiaeS. iniae

Dati sperimentali evidenziano che la somministrazione

orale/intraperitoneale può

• ritardare la comparsa di mortalità nel corso di infezioni sperimentali

• ridurre la mortalità cumulativa nel corso di infezioni sperimentali

Antibiotici naturali: i peptidi antimicrobici (AMPs)

Scoperti nei fagociti dei mammiferi alla fine del 1800

Fanno parte della risposta immunitaria innata o aspecifica � prima linea di difesa

Molecole di piccole dimensioni (12-50 a.a.)

Più di 40 molecole già identificate nelle specie ittiche

Localizzate in muco, cute, branchie, rene, fegato, muscolo, ovario, milza, cervello, tratto digerente, cuore, leucociti

Caratteristiche di interesse

Ampio spettro di attivitAmpio spettro di attivitàà contro virus, batteri (contro virus, batteri (Gram+Gram+ e e --), ), funghi e protozoi funghi e protozoi -- Attivi a quantitAttivi a quantitàà micromolarimicromolari

Uccidono rapidamente (99,9% dei batteri trattati in 20 Uccidono rapidamente (99,9% dei batteri trattati in 20 minuti) e manifestano sinergie con gli antibiotici minuti) e manifestano sinergie con gli antibiotici convenzionaliconvenzionali

Efficaci contro famiglie di batteri resistenti agli antibioticiEfficaci contro famiglie di batteri resistenti agli antibiotici

Non consentono la selezione di mutanti resistentiNon consentono la selezione di mutanti resistenti

Legano le endotossine riducendo la possibile comparsa Legano le endotossine riducendo la possibile comparsa di shock setticodi shock settico

Esempi di peptidi antimicrobici isolatidai pesci ed agenti eziologici sensibili

-Danio rerioHEPCIDIN

-Salmo salarHEPCIDIN

-Pseudopleuronectes americanusHEPCIDIN

Streptococcus iniae

Escherichia coli

Lactococcus garvie

Aeromonas salmonicida

Bacillus subtilis

Vibrio anguillarum

Vibrio harveyi

Vibrio vulnificus

Pagrus majorCHRYSOPHSIN-1, -2, -3

Escherichia coli

Planococcus citreus

Yersinia ruckeri

Pseudomonas spp.

Cyprinus carpioAPOLIPOPROTEI

NS A-I E A-II

Aeromonas hydrophila

Pseudomonas fluorescens

Staphylococcus aureus

Micrococcus luteus

Cyprinus carpio31 kda peptides

27 kda peptides

Agente eziologico sensibileSpecie da cui è stata

isolataSostanza

Aeromonas salmonicidaSalmonella typhimurium

Candida albicansPseudopleuronectes americanus

PLEUROCIDIN

Vibrio anguillarum (in vivo)Aeromonas salmonicida

Escherichia coliPleuronectes americanusPLEUROCIDIN

Channel catfish virusM. chrysosps x M. saxatilisPISCIDIN-1N, -1H, -2, -3

Amyloodinium ocellatumCryptocaryon irritans

PercoideiPISCIDIN

Gram +Gram -

Fam. MoronidaeFam. Scianidae

PISCIDIN

-M. chrysosps x M. saxatilisHEPCIDIN

Streptococcus iniaePhotobacterium damselae piscicida

Lactococcus garvieaeStaphylococcus aureus

Escherichia coli

Paralichtys olivaceusHEPCIDIN

Agente eziologico sensibileSpecie da cui è stata

isolataSostanza

Esempi di peptidi estratti da altri organismi ed utilizzati contro patogeni dei pesci

Sintesi di laboratorio(DNA ricombinante)

Sintesi di laboratorio(DNA ricombinante)

Oryzias latipestransgenico (in vivo)

Linea cellulare di salmone CHSE-214 transgenica

Sistema di sintesi

Channel Catfish virusRana pipiens

Rana catesbeiana

DERMASEPTIN-1TEMPORIN AMAGAININ-I, -IIPGLA

Vibrio anguillarum (in vivo)Aeromonas salmonicida

Hyalophora cecropiaBaco da seta

CEME (CECROPIN -MELLITIN)

Psudomonas fluorescensVibrio anguillarum

Hyalophora cecropiaBaco da setaCECROPIN

Aeromonas hydrophilaPsudomonas fluorescens

Vibrio anguillarum

Hyalophora cecropiaBaco da seta

CECROPIN BCECROPIN P1

Agente eziologico sensibile

Specie da cui èstata isolata

Sostanza

AMPs studiati in specie ittichedi interesse nazionale

Escherichia coli trattato con un peptide cationico (in basso)

Escherichia coli trattato con un peptide cationico (in basso)

AttivitAttivitàà antibatterica doseantibatterica dose--dipendente di tre peptidi dipendente di tre peptidi sintetici del tipo sintetici del tipo hepcidinhepcidin ((HironoHirono et alet al., 2005)., 2005)

Vantaggi e svantaggi legati all’impiegodegli AMPs

• sostanze di origine naturale a ridotto impatto ambientale

• ampio spettro di azione edefficacia a basse concentrazioni

• limitano fenomeni di antibioticoresistenza

• nuovi “markers” di stress e malattia

• sintesi in vitro risultalaboriosa e prevede alticosti

• limitatà stabilità dellemolecole in acqua

È ipotizzabile un impiego dei peptidi antimicrobici in acquacoltura?

A. Le molecole prodotte dai pesci (o da altri organismi) possonoessere identificate e sequenziate, quindi sintetizzate in vitro. Talipeptidi di sintesi troverebbero impiego come presidi terapeuticianche in acquacoltura;

B. Selezione di stocks che sovra-esprimano tali molecole �maggior resistenza alle infezioni

C. Impiego quali indicatori precoci di stress o eventi infettivi in allevamento mediante dosaggio in campioni biologici (muco e tessuto)

Unità coinvolte nel progetto “Azione concertata per l’identificazione di contributi scientifici per lo sviluppo

dell’aquacoltura biologica in Italia: aspetti alimentari e di prevenzione e cura delle malattie” n. 7C 09

Marco Galeotti, Donatella Volpatti, Chiara BulfonSezione di Biologia e Patologia Animale - Dipartimento di Scienze Animali

Università di Udinemarco.galeotti@uniud.it – donatella.volpatti@uniud.it

Emilio Tibaldi, Francesca TulliSezione di Acquacoltura - Dipartimento di Scienze Animali

Università di Udine

José Malvisi, Alessandra Di Salvo, Luca AvelliniDipartimento di Patologia, Diagnostica e Clinica Veterinaria

Università di Perugia

GRAZIE PER L’ATTENZIONE