1

Fitopatología 2007

VIRUS Y VIROIDES FITOPATOGENOS

II

Ing. Agr. Elisa Silvera Pérez

2

Virus y viroides fitopatógenos

w Introducción w Características generalesw Características biológicasw Taxonomía w Desarrollo de la enfermedad w Influencia del ambientew Criterio de manejow Diagnóstico

3

Criterio de manejo

w No se disponen métodos directos de control w Medidas de manejo

indirectas: disminuir fuente de inóculolimitar la dispersión

4

Desarrollo de la enfermedad

Fuente de inóculo

DiseminaciónInoculación

Penetración

Transmisión

Colonización

Síntomas

Material de propagación

Plantas

2

5

Medidas tendientes a reducir inóculo inicial

w Material de propagación sano Semillas:

embrión: Lettuce mosaic potyvirus(LMV); Squash mosaic comovirus (SqMV)(cucurbitáceas). Plantas sanas, producidas en cutivos aisaldos

envolturas: Tomato mosaic tobamovirus (ToMV) (tomate) 72 h, 70ºC /24 h, 80 ºC; Cucumber green mottle mosaic tobamovirus (CGMMV) (pepino) 72 h, 70 ºC

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Medidas tendientes a reducir inóculo inicial

w Material de propagación sano:Multiplicación vegetativa (tubérculos, bulbos, estacas)Termoterapia (agua/aire caliente)Cultivo de meristemas Microinjerto

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Medidas tendientes a reducir inóculo inicial: Termoterapia

w Consiste en la aplicación de altas temperaturas a las plantas completas o partes aisladas:

40 ºC, 7 días - erradicación de Alfalfa mosaic virus(AlMV)

40 ºC, 9 días - erradicación de Cucumber mosaic cucumovirus (CMV)

(Walkey, 1976)

8

Porcentajes de plantas que resultaron negativas al virus Grapevine rootstock stem lesion-associated virus (GRSLaV) mediantepruebas DAS-ELISA según el período de termoterapia (37ºC) y posteriorcultivo in vitro

0 a1080

10Plantas saneadas

0 a10100

10 a1060

80 b1040

10 a1020

0 a100

Negativas (DAS-ELISA) (%)

RepeticionesTratamientos (días)

Camacho, 2005 Universidad de Chile, Faculta de Ciencias Agronómicas

3

9

Medidas tendientes a reducir inóculo inicial: Producción de plantas a partir

de cultivo de meristema

w El proceso de cultivo in vitro incluye varias etapas:a. I. Establecimiento del cultivo aséptico. b. II. Propagación de propágulos sanos (subcultivos). c. III. Enraizamiento de los propágulos obtenidos. d. IV. Transplante a suelo y acondicionamiento a

invernadero

10

Medidas tendientes a reducir inóculo inicial: Cultivos de tejidos in vitro y

termoterapia

Ali, 1997

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Obtención de ajos libres de virus mediante termoterapia y cultivo in vitro. Alicia, B; Muñoz, C.; Escaff, M.INIA, Est. Exp. La Platina, Chile. II Congreso Nacional de Fitopatología, 1993.

Los tipos de ajos blancos y rosados cultivados en Chile se han encontrado afectados por el virus del Enamismo Amarillo de la Cebolla (Onion yellow dwarf potyvirus = OYDV). Con el objeto de producir semilla de ajo libre de virus se efectuaron estudios de termoterapia y de cultivo de meristemas apicales. En un primer experimento, ajos Rosado-INIA fueron sometidos a aire caliente a 30°C por una semana, seguido por 36°C por 2 semanas y luego a 38°C por 3 semanas. Las plantas testigos se mantuvieron a 20°C por todo el período (45 días). A continuación de la termoterapia se efectuó la extracción de los meristemas apicales de alrededor de 0,5 a 0,8 mm de largo, los que se colocaron en medio de cultivo B5 modificado. A los 90 días los explantes se transplantaron a invernadero donde se realizó el Test de ELISA para determinar la condición sanitaria de las plantas tratadas.Con cultivo in vitro se logró un 55 a 70% de plantas sanas y con la combinación de termoterapia y cultivo invitro se obtuvo un 100% de plantas sanas. Los controles resultaron con 100% de infección con OYDV.

12

Eliminar fuentes de inoculo

w Malezasw Cultivos infectados w Plantas espontáneas w Plantas del cultivo

4

13

Medidas tendientes a limitar la dispersión

w Control de los vectoresInsecticidasUso de barrera físicaw Cambio en la fecha de siembra o plantaciónw Aislamiento de las plantacionesw Densidad de plantación w Destrucción de partes aéreas de las plantas

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Control de vectores: insecticida

Gray et al. Insecticidal control of cereal aphids and its impact on the epidemilology of the barley yellow dwarf luteoviruses. Crop Protection 15(8):687-697. 1996

Porcentaje de plántulas de avena tratadas conimidacloprid o sin tratar inoculadas con BYDV-PAV por Rhopalosiphum padi o Sitobion avenae, a los 10 o 24 días después de la emergencia

Incidencia Barley yellow dwarf luteovirus en trigo de invierno en siembra tempranas y tardías

28/10/94

2/5/95

9/9/94 4/10/94

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Control de vectores: barrera de plantas

Hooks & Fereres. Protecting crops from non-persistently aphid-transmitted viruses: A review on the use of barrier plants as a management.Virus Research 120: 1-16. 2006. 16

Control de vectores: Progreso de la infección por CMV en parcelas

protegidas por cultivos barrera

Cultivos barrera (maíz y girasol) en el momento de transplante del pimiento

Avilla et al. Cultivos barreras como método de control de virus no persistente en pimiento. Bol. San. Veg. Plagas, 22: 301-307, 1996

5

17

Control de vectores: Progreso de la infección por CMV en parcelas

protegidas por cultivos barrera

Avilla et al. Cultivos barreras como método de control de virus no persistente en pimiento. Bol. San. Veg. Plagas, 22: 301-307, 1996

18

Número de pulgones capturados a lo largo del tiempo en trampas verdes localizadasen parcelas de pimiento protegido por cultivos barrera. 1995

Avilla et al., 1996Bol. San. Veg. Plagas, 22: 301-307, 1996

19Fuente: Cañedo, 1997

Aislamiento de las plantaciones

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Medidas tendientes a limitar la dispersión: Higiene

w Virus transmisión mecánica o contacto* Tobacco mosaic tobamovirus (TMV); ToMV; Pepper mildmottle tobamovirus (PMMV), suelo con restos de plantas infectadas (Desinfección de suelo con vapor de agua 90 ºC 15 m ToMV)Estructuras de invernaderos, lavado con desinfectanteDesinfección de manos y herramientas de trabajo fosfato sódico y alcohol SqMV cucurbitáceas (Lecoq et al., 1988)Lavar manos con fosfato sódico (3%), jabón y agua. Herramientas desinfección con fosfato sódico (3%), ToMV tomate (Broadbent, 1976)

6

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Protección cruzada

w Se basa en la atenuación o supresión de los síntomas causados por una cepa severa de un virus si la planta ha sido infectada previamente por una cepa atenuada relacionada con la anterior

w Citrus tristeza closterovirus (CTV); ToMV w Limitante

- virulencia de cepas varía entre especies y variedades- posibles efectos sinérgicos del virus protector con otros virus

o patógenos- variabilidad cepa atenuada cepa severa

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Protección cruzada

Firibourg & Fernández-Northcote, 1972Fitopatología 7 (1-2):23-29. 1972

Hoja de Capsicum pendulum var. escabeche inoculada con aislamiento A2 de TMV(1) Mitad inoculada con aislamiento A1 antes de inocular la hoja con A2(2) Mitad sin inocular

(1) (2)

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Resistencia genética y tolerancia

Términos de resistencia relacionado a la producción de síntomas y multiplicación del virus

Walkey, 1991

24

Resistencia genética y tolerancia

w Inmunidad: cebada, Barley yellow mosaic virus(BaYMV) w Resistencia: pepino CMV; lechuga

LMV; morrón PMMV; papa Potato leaf rollluteovirus (PLRV), Potato X potexvirus (PVX), Potato Y potyvirus (PVY); soja Soybean mosaicpotyvirus (SMV); remolacha Beet western yellowluteovirus (BWYV); tomate ToMV, Tomato spotted wilt tospovirus (TSWV); duraznero y ciruelo PPV

7

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Resistencia al vector

w Resistencia a insectosCaracterísticas fenotípicas o fisiológicas de las plantas (exudados pegajosos, pubescencias de las hojas hojas, caract. estructurales del tejido que dificulte acceso del insecto al floema)Plantas de melón: resistencia a CMV por la no preferencia de Aphis gossypii

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Resistencia por ingeniería genética

w Plantas trangénicasPlantas transformadas con secuencias de ac. nucleicos de virus (secuencia de la proteína de la cápsida viral, secuencias relacionadas con la replicasavirales)Resistencia a la infección o atenúan los síntomas de la enfermedadActúa en fases iniciales de la infección, replicación del virus, dispersión en la planta o desarrollo de síntomas

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Resistencia por ingeniería genética: Plantas con secuencias de la proteína de la cápside viral (PC)

w Plantas transformadasAlMV / tabaco, tomate, alfalfa CMV/ tabaco, calabacínPVX / papa, tabacoPVY / papaTMV / tabaco, tomateTSWV / tabaco

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Resistencia por ingeniería genética: Plantas con secuencias de la proteína

de la cápside viral (PC)

w Efectos infección viral Disminución del nº de sitios de infección en hojas inoculadasSíntomas sistémicos demoran o no se manifiestanMenor acumulación de virus en las hojas inoculadas w Mecanismo de resistencia

Bloqueo del ensamblaje del virus infectivo por expresión trangénica PC

8

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Porcentajes de plantas de tomate con síntomas del “virus de la peste negra del tomate” (TSWV) en 6 ambientes de evaluación.Tipos de cultivares evaluados:

R= Resistentes, T = Tolerantes o S = Susceptibles.

< 0,1 %

< 1 %

< 5 %

Adecuado

Adecuado

Temprana

< 15 %< 5 %< 5 %< 5 %Resistente

> 60 %< 10 %< 10 %< 5 %Tolerante

> 90 %> 70 %> 40 %< 5 %Susceptible

Inadecuado o nulo

Adecuado 2 aplicaciones en todo el ciclo

Adecuado2 aplicaciones/ sem. hasta 60 d. post-transplante

AdecuadoControl del vector

Inadecuado o nulo

AdecuadoAdecuadoAdecuadoControl de maleza

Tardía Tardía Tardía TempranaMomento de implantación

Mitidieri.http://www.inta.gov.ar/sanpedro/info/doc/pdf/mmitidieri_mi.pdf.

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Ciclo del Mosaico enanizante del Maíz causado por Maize dwarf mosaic potyvirus (MDMV)

Fuente: Instituto de Fitopatología y Fisiología Vegetal INTA-JICA, 1999

Medidas de manejo:• Usar materiales tolerantes y/o resistente al

virus• Control del sorgo de alepo y malezas dentro

de los cultivos

31

Diagnóstico

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Diagnóstico

w Dificultades: Pequeño tamañoPoca diversidad morfologica Síntomas similares Síntomas variables: n cultivar n condiciones ambientales

9

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Postulados de Koch modificado por Bos (1981)

1. El virus debe encontrarse siempre asociado a la enfermedad

2. Debe ser aislado de la planta enferma (separarlo de otros patógenos, multiplicarlo en un hospedero, purificarlo, determinar sus propiedades intrínsecas)

3. Reproducir los síntomas en planta sana inoculada4. Demostrar que el virus se encuentra en la planta

inoculada y debe ser re-aislado

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Diagnósticow Planta con síntomas w Distribución de los síntomas en la plantaw Distribución de los síntomas en el campow Análisis de otros datos w Transmisión: Ensayos de infectividad/ Forma de

transmisiónw Estudio de inclusiones celularesw Observaciones de partículas virales al microscopio

electrónicow Serologíaw Técnicas moleculares

Consulta

bibliográfica

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Síntomas

36

Foto: Unidad de Fitopatología, FAGRO

Enanismo en planta de papa infectada con PVY

Reducción en el crecimiento

10

37

Mosaico

Mosaico en hojas de tabaco, TMV

Foto: http://www.apsnet.org/education/LessonsPlantPath/Top.html38

Arabescos

Foto: Moreno en Llácer et al. Patología vegetal. 1996

Arabescos y anillos cloróticos en hoja de rosal, Prunus necrotic ringspot ilarvirus (PNRSV)

39

Clorosis localizadas

Foto: Unidad de Fitopatología, FAGRO

Anillos cloróticos en hoja de morrón

40

Necrosis

Foto: Moreno, en Maruchi, Instituto de Investigaciones Tropical

Desecación en tronco de naranjo dulce, Psorosis A

11

41

Necrosis

Anillos necróticos en frutos de tomate, TSWV

Foto: Unidad de Fitopatología, FAGRO

42

Necrosis

Foto: Unidad de Fitopatología, FAGRO

Planta de lechuga con amarillamiento y necrosis foliar, TSWV

43

Deformaciones

(a) Raiz normal (b) raíz con (CVY) Carrot virus Y Foto: Lindrea et al. Research, 100 (1): 89-99. 2004

a

b

Acanaladuras y sobrecimiento en troncos de viníferas, Rupestris stem pitting associated virus (RSPaV)Foto: Barcelos. http://www.cnpuv.embrapa.br/publica/sprod/UvasViniferasRegioesClimaTemperado/virus.htm

44

Distribución de los síntomas en el campo

w Generalizada

Foto: Unidad de Fitopatología, FAGRO

Cultivo en invernáculo con plantas de lechuga afectadas por TSWV

12

45

Distribución de los síntomas en el campo

w Parcial: bordes,fila manchones al azar

Plantas sanas Plantas Enfermas46

Distribución síntomas en el campo

Silva-Vera et al. Agrociencia 35 (4). 2001http://www.colpos.mx/agrocien/Bimestral/2001/jul-ago/art-8.pdf

Esquema de la distribución de plantas infectadascon CTV

47

Ensayos de infectividad

w Misma espéciew Plantas indicadoras: Nicotiana, Solanum,

Chenopodium, Cucumis, Phaseolus, Vicia, Brassica

Sin síntomas

Lesiones locales Lesiones sistémicasFuente: Unidad de Fitopatología, FAGRO

48

Bioensayos con plantas indicadoras

Ortega et al. INCI 32(3) 2007

13

49

Plantas indicadoras de virus y viroides cítricos

Planta Indicadoras

Patógeno Indicador

Tristeza Limón criollo

Psorosis Naranja dulce Hamlin, mandarina común o naranja agria

Petrificación Grapefruit, proveniente de semilla

ExocortisCidra Ethrog Arizona 861-5-1 injertado sobreCitrus volkameriana Gynura aurantiaca, Petunia spp.

Ortega. Método de detección virus y viroides en cítricas. FONAIAP-Divulga, 22. 1986

50

Forma de transmisión

w Mecánica

w Injerto

w Vectores

51

Forma de transmisión: Mecánica

Agrios, 199552

Forma de transmisión:Injerto

Agrios, 1995

14

53

Forma de transmisión: Injerto

Agrios, 1995

54

Estudio de las inclusiones celulares

Inclusiones en forma de “pinwheel” en células de plantas infectadas por un potyvirus, microscópio electrónico

Foto: Gergerich & Dolja, 2006 APSnet

55

Estudio de las inclusiones celulares

Inclusiones granulares de un geminivirus afectando la pared celular de células floemáticasen plantas de tomate, microscopio óptico. (Foto: Villalba) http://web.catie.ac.cr/informacion/RMIP/rmip52/images/galileo4.jpg 56

Observación de partículas virales al microscopio electrónico

w Extractos brutos o parcialmente purificados w Estudio de partículas e inclusiones en secciones

ultrafinas de los tejidos enfermos w Forma y tamaño partícula viral

Limitantes:Concentración baja del virusTejidos infectados con dos o más virus de morfología similar o diferente pero se distribuyen irregularmente (Inmuno-Microscopía electrónica)

15

57

Observación de partículas virales al microscopio electrónico

Partículas virales de un geminivirus (Foto: R. Lastra) http://web.catie.ac.cr/informacion/RMIP/rmip52/nbusta-3.htm

58

Observación de partículas virales al microscopio electrónico

Observación bajo el microscopio electrónico de transmisión de muestras de plantas de cebadas afectadas con síntomas de estrías negras en las hojas. Típica partícula encontrada en plantas infectadas (30.000x). Foto: http://www.scielo.cl/scielo.php?pid=S0365-28072001000300003&script=sci_arttext

59

Observación de partículas virales al microscopio electrónico

Partículas de TSWVFoto: http://biology.anu.edu.au/Groups/MES/vide/refs.htm

60

Serología

Reacción antígeno - anticuerpo

w Inmunodifusón en gel (reacción precipitina)w ELISA (cambio de color de sustrato

degradado por la enzima)w Kits comerciales

16

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Inmunodisfusión en gel

Teste inmuno-difusión con antisuero producido de conejo inmunizado con extracto de plantas con Cowpea severe mosaic comovirus (CSMV) y Papaya lethal yellowing virus (PLYV) A: Antisuero CSMV; B: Antisuero PLYV; Cp: extracto de planta con CSMV; Pl: esxtracto de plantas con PLYV; H: extracto planta sin CSMV y PLYV

62

ELISA (Enzyme-Linked InmunoSorbent Assays)

Representación esquemática de la técnica de DAS-ELISA doble sandwich de anticuerpos para detección indirecta de un virus con anticuerpos monoclonales

Microplaca de la técnica de DAS-ELISA después de la adición del sustrato de la enzima, cavidades con coloración amarilla de la enzima indicando reacción antígeno-anticuerpo y la intensidad la concentración

63

Kit comercial

Fabricante: Loewe Biochemica GmbH

64

Sensibilidad aproximada de diferentes técnicas de detección de virus

Walkey, 1991

17

65

Técnicas moleculares

w Electroforesis w Hibridación de ácido nucleicow Reacción de polimerasa en cadena (PCR)

Trascripción inversa- PCR (RT-PCR)

66

Electroforesis

w Separación de moléculas cuando migran en un campo eléctricow Posición de las bandas depende del tamaño de las

moléculas y la carga a que se trabaja

Partícula entera Proteína del virusÁcido nucleico

67http://www.scielo.br/img/revistas/pab/v40n2/23828f1.jpg

68

Hibridación de ácidos nucleicos

w Dotblotw Squashblot

Esquema de la técnica de hibridaciónFuente: Llácer, 1996

18

69

Hibridación de ácidos nucleicos:Dotblot

Detección de un geminivirus mediante hibridación molecular. Los círculos negros indican la presencia del virus en la muestra analizada. (Foto: Rivas).

http://web.catie.ac.cr/informacion/RMIP/rmip52/nbusta-3.htm

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RT-PCR

Diagrama de RT-PCR usado para la detección de virus y viroides. RNA primero trascripción inversa para ADNc usando oligonucleotídeosiniciadores antisenso, luego inicia amplificación exponencial por multiplos ciclos de PCR usando oligonucleotídeos sense y antisenso

Fuente: Pallás et al. Options Méditerranéennes, Série B/19

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Electroforesis en gel de agarosa del producto obtenido del RT-PCR de muestras de campo para detectar presencia del Hop stunt viroid (HSVd). Linea 1, marcador de PM; Linea 2, muestra de durazno infectado con HSVd; Lineas 3-6, muestras de diferentes árboles apricot. Muestras 3-5 infectadas con HSVd mientras que la 6 está libre del viroide.

Fuente: Pallás et al. Options Méditerranéennes, Série B/19 72

¿Sensibilidad entre las técnicas DAS-ELISA y RT- PCR?

Camacho, 2005 Universidad de Chile, Faculta de Ciencias Agronómicas

19

73

Selección de técnicas

w Detectar un virus conocido en una o muchas plantas

w Diagnóstico de virus: conocido o nuevo

w Tipo de agente (virus o viroide)

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Características de la técnica

w Precisow Reproducible w Sensibilidadw Tiempow Costow Complejidad

75

Selección de técnicas

w Diagnóstico de una enfermedad causada por un nuevo virus

w Diagnóstico de una enfermedad causada por un viroide conocido

w Detección de un virus de material propagativo vegetativo

76

Bibliografía

w Agrios, G.N. Fitopatología. México, Noriega. 1995. w Gepp, V. Virus y viroides fitopatógenos. Dpto. de

Publicaciones de la Facultad de Agronomía, Montevideo, Uruguay. 27 p. 1996.

w Gergerich, R.C.& Dolja, V.V. Introduction to Plant Viruses,the Invisible Foe. The Plant Health Instructor. <http://www.apsnet.org/education/IntroPlantPath/PathogenGroups/plantViruses/default.htm>. 2006.

w ICTVdB, Descriptions. International committee on taxonomy of viruses, <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ICTVdb/ICTVdB/>