アミノ基含有ペプチド化合物を 高効率かつ高感度で...
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アミノ基含有ペプチド化合物を高効率かつ高感度で多重定量する方法
福井大学ライフサイエンス支援センター
准教授 松川 茂
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研究背景血液・尿などの体液や組織・食品中のアミンの定量は健
康維持や食中毒原因の腐敗物排除のために重要である。
また、蔓延する覚醒剤などの薬物の検出にも微量の試料で可能であれば捜査の効率が上がる。
幼若年者の情動障害や老人特有の精神障害などの推移を客観的に捉えて、老人の暮らしの質向上に役立てることが出来る。
この為に、関連する神経伝達アミンや覚醒剤、生理活性アミン、腐敗アミンなどの微量物質の量を高感度に、しかも効率よく定量する方法を提供する。
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OH
NH2 O
O H OH
NH2 O H
O
OH
OH
OH
NH2
OH
OH
O H
NH2
CH 3
CH3
O H
NH
CH3
NH
NH2
O
O H
OH
NH
NH2
NH2 NH2
CH 3
NH
CH3
CH3
NH2
O H
NH2
O
OHCH3
O H
O
OH
O CH3
O H
O
O
CH3
O
N+
CH3
CH3
CH3
NH2
S
O
OH O
チロシン DOPA ドーパミン ノルアドレナリン
アドレナリン
フェネチルアミン アンフェタミン(覚せい剤)
メタアンフェタミン(覚せい剤)
エフェドリン(気管支拡張剤)
トリプトファン セロトニン
グリシングルタミン酸 GABA アセチルコリン タウリン
同位体試薬が検出可能な活性アミンや覚醒剤類
各自1滴の血液で9人分の各種アミン化合物の検出と定量が同時にできる
薬物や麻薬
動物の脳における活性アミンの分布と濃度を3D表示可能
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新技術の基となる研究成果・技術
アミン反応性の新規な化合物Pyを同位体標識して
蛋白質の量的変動を網羅的に解析する方法を確立した。
この試薬を更に活用するために、質量差を13Cの導入で実現し、遂に、質量差1の9種類のPy試薬を完成した。
この質量差1の試薬を低分子アミン化合物と反応してナノLC/MSによりこれまでよりも1000倍高感度検出と定量を可能にした。
5
13C8
13C0 13C113C2
13C5 13C613C7
13C3
13C4
Py0~8の製品
Py0 Py1 Py2 Py3
Py4 Py5 Py6 Py7 Py8
新規合成が完了した質量差1の安定同位体標識試薬のラインアップ
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各種アミン・アミノ酸の測定
1.アミノ酸分析装置による定量(イオン交換樹脂カラム分離後ニンヒドリン発色反応による吸光度定量)。普及、感度が低い、高い信頼性
2.アミン反応性蛍光色素(OPA)と反応後ODSカラムによる分離と蛍光モニターによる定量。 普及、感度向上
3.非誘導体化アミノ酸とアミンのHyperCarbカラムによる分離とMS分析。実験段階
4.イオン化効率の上昇を目指した誘導体化試薬によるアミノ酸のLC/MS分析用誘導体化。 高感度分析可能、今後期待
従来法
以上のどの方法も1分析で1検体中の含有アミノ酸とアミンの
多くの種類を定量する方法我々の新方法は
1分析で多検体(5検体)中のPy試薬反応性のアミンとアミノ酸を定量する方法
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13C8
13C0
13C1
13C2
13C5
13C7
13C3
13C4
(Py0~8)
Py試薬
13C8
13C0
13C2
13C4
13C8
13C6
13C6 13C6
13C4
13C2
13C0+
+
+
+
+
Py誘導体
均等混合
サンプル1
サンプル2
サンプル3
サンプル4
サンプル5
Py試薬
内部標準を等量添加
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13C0
13C0
13C0
Dihydroxybenzylamine(DHBA)
Dopamine(DA)
Noradrenaline(NA)
Py試薬
合成内部標準
測定対象
測定対象
+
+
+
カテコラミン カテコラミンーPy誘導体
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M/z
Δ2
質量スペクトル
Δ2 Δ2
Py-カテコラミンの全イオンクロマトグラム
時間
イオン量
分析開始
260
262
264266258
Py-DHBA
Py-DA
Py-NA
内部標準(Py-DHBA) Py-DA Py-NA
Δ2
244246248
250252
Δ2Δ2
274
276278
280
282
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内部標準法
測定物質と類似で測定対象物以外の分離可能な試料を内部標準物質として標準試料と未知試料の両方に添加し、内部標準物質と標準試料の信号強度比と濃度の関係から検量線を作成する。この検量線から未知試料中の濃度を定量。
0 1 2 3 4 5
内部標準とのスペクトル強度比
0.5
1.0
1.5
2.0
標準物質(pmol)内部標準
標準物質
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<Py誘導体成分の質量数>
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<微量試料分析用のナノLCによる1000倍高感度化の試み>
コンベンショナル4.0~4.6mmFlow 1.0ml/min
ナノフロー0.03~0.075mmFlow 200nl/min
カラム内径ESIESI--MSMSのチップのチップ
NanoLCシステム
グラジエントポンプ
低流量送液ポンプ
廃液へ
ミキサ
分析カラムへ
溶離液A
溶離液B10方バルブ
(a) Loop 1に導入 (b) バルブを切り替え、Loop2に導入
バルブ切り替え
分析カラムへ
グラジエントポンプから
低流量送液
ポンプから
Loop1
Loop2
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DHBA-Py誘導体のLC分離後のMSスペクトル
M/z
%in
tensi
ty
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Dopamine標準曲線の範囲:0.15~5pmol
1
1
2
2
3
3
4
4
5
5
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in vivo μウエーブ照射
脳組織中代謝酵素の瞬間不活化
脳摘出&凍結
凍結切片
凍結乾燥切片上の
部位①~⑨に質量
差1のPy標識試薬
9種(Py0~Py8)を
載せて反応する。
標識物の固相抽出・部分精製Dopamine, Dopa, NA, Gly, GABA,SeretoninのPy標識体
LC/MS分析による9箇所同時一斉検出
1
6 5
432
78 9
抽出(高効率簡便回収法)
超複雑系モデルの動物組織
動物脳
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110201-2 (T14.2/#622) DA
標識試薬 Py0 2 4 6 8
ナノLC/MSスペクトルデータ
250.0 254.4 258.8 263.2 267.6 272.0m/z
0
4728.0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% In
tens
ity
(1) Spec #622 * [BP = 245.0, 43216]
258.0918
257.1377
253.1242
268.9655
260.0978
264.1111
259.0952
261.9692266.9775
255.0789269.0190262.9595257.0939 261.0968250.1150 259.1347 265.1086262.1029 269.9660
253.0257 263.8785 269.0519256.1338
Py 試薬の種類 脳部位Py0 線条体 (10 nlx2)Py2 線条体 (10 nl)Py4 脳梁 (10 nl)Py6 脳弓+線条体 (10 nl)Py8 大脳皮質 (10 nl)
0.5 mm 0.5 mm
0.040 mm厚
容積=0.010μl
レーザーで切り出した測定用脳切片のサイズ
暫定図9
最終ゴール:脳内2次元濃度地図作製
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特許の名称 アミノ基含有非ペプチド化合物を高効率かつ高感度で多重定量する方法
出願番号 特願2011-080943出願日
2011年3月31日
特許番号
080943出願人国立大学法人福井大学
発明者 松川 茂、成田 和巳
概要 新規に合成した質量差1の同位体標識Py試薬9種(Py0,1,2,3,4,5,6,7,8の9種:数字は13CのPy試薬中の数を表す)を用いる低分子アミノ基含有化合物の分析方法である。血液や尿中の非ペプチド性のアミノ基含有化合物(カテコラミンやアミノ酸、ポリアミン)をPy誘導体化し、HPLCにより相互分離することにより含有する反応性化合物の一斉定量を実現する。更に、質量差のあるPy試薬を複数用いることで多サンプル中の含有アミンの全てを一度の分析で量的比較できる効率的方法を提供する、脳内の神経アミンの分布も分析可能。
申請中の福井大学の特許
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*福井大学:同位体標識試薬Py試薬の特徴
1.質量差1で9種、質量差2で5種の分析試料を一度に分析出来る(多重性)。
2.試薬は安定、保管方法が簡単(化学的安定性)。
3.ユニークな特性の反応生成物を与え固相抽出法としてイオン交換法が有効(前処理技術)。
4.高感度ナノLC/MSの完全自動分析に対応するシステムを開発した(高能率分析処理)。
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神経精神疾患・情動性障害の原因解明*脳内神経伝達アミン(L-Dopa, Dopamine, Noradrenaline,
Serotonine, Histamineなど)とアミノ酸(Glutamic Acid, Glycine, Alanine、Tryptophanなど) の分析。
血液、尿などの臨床医学・法医学検査試料*血液、尿、髄液、涙液、乳汁中の活性アミン、アミノ酸、覚醒剤、
麻薬及びその代謝物でアミノ基を保有する化合物が分析対象。
環境中・食品中のアミン化合物*微生物作用により生成されるアレルギー様食中毒の原因物質の
不揮発性腐敗アミンのHistamine, Tyramine, Spermidine,Spermine, Putrescine, Cadaverineの検出と定量
特許の利用範囲の例
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実用化に向けた課題
• 現在、脳内神経アミンの分析・定量についてpモルレベルでの検出が可能なところまで開発済み。しかし、脳内分布地図の作製の点が未解決である。
• 今後、動物脳について実験データを取得し、脳の病気における分布の変化を捉えることに適用していく場合の条件設定を行っていく。
• その他、ヒトや家畜の血液・尿・髄液・涙液及び食品などのアミノ酸や生理活性アミン・腐敗アミンの定量の実用化に向けて、検出の精度をサブフェントモルレベルまで向上できるよう技術を確立する必要もあり。
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企業への期待
• 安価なナノLC/MS分析装置については、この分野の新技術開発により克服できる。
• 2千万円未満の安価で高性能な質量分析機器製造技術を持つ企業との共同研究を希望。
• また、医療検査分野、法医学分析分野、食品安全分野への展開を考えている企業には、本技術の導入が有効と思われる。
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本技術に関する知的財産権
• 発明の名称 :アミノ基含有非ペプチド化合物を高
効率かつ高感度で多重定量する方法
• 出願番号 :特願2011-080943
• 出願人 :福井大学
• 発明者 :松川 茂、成田 和巳
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産学連携の経歴
●2010年-2012年 JST育成研究事業に採択
●2010年-2012年 関連企業と共同研究実施中
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お問い合わせ先
福井大学
総合戦略部門 研究推進課 高岡 勉
産学官連携本部 知的財産部
TEL 0776-27-9725
FAX 0776-27-9727
e-mail [email protected]