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ビタミン・カロチノイドの発酵
星野達雄
東大 2014・11・20
ビタミンの種類(13種)水溶性ビタミン
ビタミンB1ビタミンB2ビタミンB6ビタミンB12ニコチン酸パントテン酸葉酸ビオチンビタミンC
脂溶性ビタミン
ビタミンAビタミンDビタミンEビタミンK
水溶性ビタミン
ビタミンB1 補酵素 TPPビタミンB2 補酵素 FMN,FAD
ビタミンB6 補酵素 PDPビタミンB12 補酵素 アデノシルCob
ニコチン酸 補酵素 NAD,NADP
パントテン酸 CoA 脂肪酸合成など
葉酸 補酵素 C1基の転移
ビオチン 補酵素 CO2転移
ビタミンC 水酸化に関与(OH-Pro)
脂溶性ビタミン
ビタミンA 抗酸化ビタミン、ロドプシンビタミンD Caの吸収ビタミンE 抗酸化ビタミンビタミンK 補酵素(血液凝固因子)
Caの吸収に関与
ビタミンの薬理効果A E B1 B2 B6 B12 C
しみ ●
にきび ● ●
口内炎 ● ●
疲れ目 ● ●
目の乾燥 ●
肩こり ● ●
手足のしびれ ● ● ● ●
腰痛 ● ●
冷え性 ●
ピロロキノリンキノン(PQQ)• 新たなビタミン発見!!? サプリメントとして発売
PQQの概要
• Coenzyme concerning redox cyclingidentified in 1979
• Water‐soluble compound (reddish brown powder)
DistributionIn• daily foods and beverages• In human tissues, organs and human milk
BioPQQ and Three Pillars to Brain Health
• The Revolution has Begun!– BioPQQ can help you see improvements in the short term and protect your brain in the long term. Here are the three ways BioPQQ has revolutionized brain health.
• Grow – Nerve Growth Factor• Energize – Increasing Mitochondria• Protect – Antioxidant
(三菱瓦斯化学)
Vitamin B12
シアノコバラミン
コバラミンの種類
• OHコバラミン 光に不安定
• CH3コバラミン 光に不安定
• Deoxyadenosylコバラミン 光に不安定
CNコバラミン 室温で光に安定
工業生産するときは、全てCNコバラミンとして回収している。
ビタミンB12発酵菌
始原菌、細菌、放線菌によって生合成される。
酵母、糸状菌、植物、動物には生合成能はない。
– Streptomyces olivaceus (グルコース:8.5mg・L)– Propionibacterium freudenreichii
(グルコース:25mg・L)– P. shermanii (グルコース: 39mg・L)– Pseudomonas denitrificans
(ビートモラセス: 59mg・L)– Corynebacterium (パラフィン: 2.3mg・L)
P. denitrificansを用いた例• ビートモラセス(100g)、酵母エキス(2g)、5,
6-ジメチルベンズイミダゾール(25mg)/Lのほ
か、無機塩を含む培地を用いる。生産性:59mg・L。
• ビートモラセスに含まれているベタインが重要な役割を果たしている。
– ベタインの役割については十分理解されていない
生合成に関与する遺伝子(30)は既にクローニングされている。
ビタミンB2(リボフラビン)
ビタミンB2(リボフラビン)
ビタミンB2(リボフラビン)生産菌
Ashbya gossypii (BASF) 5-6 g/lCandida flaeri (Coors) 7.5 g/lCandida famata 20 g/lBacillus subtilis 4.5 g/l
(recombinant, Russia) Corynebacterium ammoniagenes 17.4 g/l
(recombinant, Kyowa)
ribA ribG
ribTribH
ribB ribA
DSM社のB.subtilis組換え体によるB2発酵
B. subtilisではオペロンをなしている
(E.coliは、4カ所に分散)
Bacillus subtilisのリボフラビンオペロン
ribT ribH ribA ribB ribGribO
転写物
rib C (Repressor gene)によって発現はコントロールされている
リボフラビンオペロンの改変
• 元のプロモーターを、強力なプロモーターと2カ所交換
• プラスミド上にオペロンを挿入
• 染色体上に組み込み
• 薬剤選択圧によるコピー数の増大
B2オペロン 耐性遺伝子 B2オペロン
組み換え
B2 耐性 B2 耐性 B2
コピー数増大による薬剤耐性強化B2オペロン数の上昇B2生産の増大
培養液(48時間後)
20 m
ビタミンC
L-Sorbose
2KGAD-Glucose
Vitamin C
D-Sorbitol
Diacetone-L-sorbose
Diacetone-2KGA
CH2OHHCOH
HOCHHCOHHCOHCH2OH
COOHC=O
HOCHHCOH
HOCHCH2OH
CH2OHC=O
HOCHHCOH
HOCHCH2OH
O=CHOCHOCHC
HOCHCH2OH
O
CHOHCOH
HOCHHCOHHCOHCH2OH
標準ルート
中国ルート
合成
合成
合成
合成
合成
現在使われているビタミンCの製造方法
ビタミンCの直接発酵方法
ビタミンCの合成能
• ヒトは、アスコルビン酸を生体内で合成できない。
– その必要量をすべて食事などによって外部から摂取する必要がある。
• 多くの動物は、アスコルビン酸を生合成できる。
• 体内で合成できないのは、モルモットや霊長類の一部(人間を含む)など一部だけである。
動物におけるビタミンC生合成
Glucose
D-グルクロン酸
L-グロン酸
L-グロノラクトン
ビタミンC
植物のビタミンC生合成
9酵素反応
ビタミンCの微生物生産
微生物:3段階動物: 9段階植物: 9段階
ビオチン
ビオチン発酵の歴史
1960年代
ピメリン酸などの前駆体の添加がビオチン生産に有効であることを発見。
Bacillus sphaericus 0.8-1.1 μg/ml1970年代
ビオチン拮抗物質耐性変異株が取得さ
れ利用されるようになった。
ビオチン拮抗物質(アシドマイシン、5-(2-チエニル)n-吉草酸)耐性株株分離
ビオチン発酵の歴史つづき
1980年代
遺伝子操作による菌株育種が行われた。
E. coli K-12 100-970 mg/LSerratia marcescens 1g/LBacillus sphaericus 48mg/L
ビオチンオペロン
Bacillus subtilis 168
Escherichia coli K-12
ビオチンによる強いフィードバックコントロール
B D F A W
B F C D
A
ビオチン発酵の課題
デチオビオチンに硫黄原子を導入する最終反
応はビオチン合成酵素によって触媒され、生合
成上の律速反応となっている。その反応機構
は未だ不明の点が多い。
DTBからビオチンへの反応系
NADPH、フラボドキシン、フラボドキシン還元酵素、鉄イオンが必要
ビタミンB6(ピリドキシン)CHO ピリドキサールCH2NH2 ピリドキサミン
ビタミンB6発酵
• 用途:医薬用原料、飼料添加物用原料、食品添加物に利用される。
• 生産:現在微生物発酵によるビタミンB6生産は行われていない。化学的プロセスで年間約3,500トンのピリドキシンが生産されている。
リゾビウムにおけるビタミンB6
生産とその生合成に関する研究
ビタミンB6生産菌の分離
分離
1,590の細菌
28℃で培養
生産培地の寒天ブ
ロックに植菌
ビタミンB6生産
B6検定培地に乗せる。
ビタミンB6定量 - 28℃で17時間間培養
49の土壌試料の懸濁液
28℃で培養10 g/mlのシクロヘキシミド入り栄養寒天
スクリーニング結果
Number of bacteria (%)D
iam
eter
of h
alo
(mm
)
20 ~ 25
25 ~ 30
20 <
30 >
41.6
30
24
4.4%
0 20 40 60 80 100
液体培養
< 0.01 mg/L
< 1 mg/L
> 1 mg/L
根粒菌におけるビタミンB6生産
Rhizobium strain Vitamin B6 (mg/l)
R. meliloti IFO 14782R. meliloti IAM 12035R. huakii IFO 15243R. huakii IFO 15244R. leguminosarum strain 28-21R. leguminosarum IFO 13337R. leguminosarum IFO 13338R. leguminosarum IFO 14168R. leguminosarum IFO 14778R. leguminosarum IFO 14784R. leguminosarum IFO 14785R. leguminosarum IFO 14994R. leguminosarum IFO 14995R. tropici IFO 15247R. galegae IFO 14965R. loti IFO 13336R. loti IFO 14779
513
200
23005
1020239811
ビタミンB6の微生物生合成経路まとめ
Gram+菌
4PHT
AHP
E4P
4PE
P.P.
PNP
Pyridoxine
Glucose 6PGlucose
PYR
DXP
G3P
ED
GcolAD
PdxRSerC
PdxA
PdxP
Dxs
YaaD, YaaE
6PG
Eda
PdxJ
Gram-菌
Vitamin B6 Biosynthesis
カロチノイド
カロチノイド
• 植物・藻類・光合成細菌の光合成
• 動物の視覚(プロビタミンA)
• 色彩(花、果物、野菜、動物、魚、卵黄など)
• 抗酸化作用
• 現在約750種類のカロチノイドが単離・構造決定されている。炭素40からなる分子が一番多く存在。
卵黄色はコントロール可能
主なカロチノイド生産菌
生産菌株 カロチノイドカビ・酵母Blakeslea trispora β-カロチンPhaffia rhodozyma アスタキサンチン
微細藻類Haematococcus pulvialis アスタキサンチンDunaliella salina β-カロチン
β-カロチン
ゼアキサンチンカンタキサンチン
アスタキサンチン
E B IY
Z
Z
W
W Z
WZ
WZ
W
Z
W
リコピン
Dunaliella salina の培養βカロチンの生産
塩濃度:20-30%強い光が必要宮古ファーム
アスタキサンチン
富士フィルム