ビタミン・カロチノイドの発酵

星野達雄

東大 2014・11・20

ビタミンの種類（13種）水溶性ビタミン

ビタミンＢ１ビタミンＢ２ビタミンＢ６ビタミンＢ１２ニコチン酸パントテン酸葉酸ビオチンビタミンＣ

脂溶性ビタミン

ビタミンＡビタミンＤビタミンＥビタミンＫ

水溶性ビタミン

ビタミンＢ１ 補酵素 TPPビタミンＢ２ 補酵素 ＦＭＮ，ＦＡＤ

ビタミンＢ６ 補酵素 PDPビタミンＢ１２ 補酵素 アデノシルＣｏｂ

ニコチン酸 補酵素 ＮＡＤ，ＮＡＤＰ

パントテン酸 ＣｏＡ 脂肪酸合成など

葉酸 補酵素 Ｃ１基の転移

ビオチン 補酵素 ＣＯ２転移

ビタミンＣ 水酸化に関与（OH-Pro)

脂溶性ビタミン

ビタミンＡ 抗酸化ビタミン、ロドプシンビタミンＤ Ｃａの吸収ビタミンＥ 抗酸化ビタミンビタミンＫ 補酵素（血液凝固因子）

Ｃａの吸収に関与

ビタミンの薬理効果A E B1 B2 B6 B12 C

しみ ●

にきび ● ●

口内炎 ● ●

疲れ目 ● ●

目の乾燥 ●

肩こり ● ●

手足のしびれ ● ● ● ●

腰痛 ● ●

冷え性 ●

ピロロキノリンキノン（PQQ)• 新たなビタミン発見!!? サプリメントとして発売

PQQの概要

• Coenzyme concerning redox cyclingidentified in 1979

• Water‐soluble compound (reddish brown powder)

DistributionIn• daily foods and beverages• In human tissues, organs and human milk

BioPQQ and Three Pillars to Brain Health

• The Revolution has Begun!– BioPQQ can help you see improvements in the short term and protect your brain in the long term. Here are the three ways BioPQQ has revolutionized brain health.

• Grow – Nerve Growth Factor• Energize – Increasing Mitochondria• Protect – Antioxidant

（三菱瓦斯化学）

Vitamin B12

シアノコバラミン

コバラミンの種類

• ＯＨコバラミン 光に不安定

• ＣＨ３コバラミン 光に不安定

• Ｄｅｏｘｙａｄｅｎｏｓｙｌコバラミン 光に不安定

ＣＮコバラミン 室温で光に安定

工業生産するときは、全てＣＮコバラミンとして回収している。

ビタミンB12発酵菌

始原菌、細菌、放線菌によって生合成される。

酵母、糸状菌、植物、動物には生合成能はない。

– Streptomyces olivaceus (グルコース：８．５ｍｇ・L)– Propionibacterium freudenreichii

(グルコース：２５ｍｇ・L)– P. shermanii (グルコース： ３９ｍｇ・L)– Pseudomonas denitrificans

(ビートモラセス： ５９ｍｇ・L)– Corynebacterium (パラフィン： ２．３ｍｇ・L)

P. denitrificansを用いた例• ビートモラセス（１００ｇ）、酵母エキス（２ｇ）、５，

6－ジメチルベンズイミダゾール(25mｇ)/Ｌのほ

か、無機塩を含む培地を用いる。生産性：５９ｍｇ・Ｌ。

• ビートモラセスに含まれているベタインが重要な役割を果たしている。

– ベタインの役割については十分理解されていない

生合成に関与する遺伝子（３０）は既にクローニングされている。

ビタミンB2（リボフラビン）

ビタミンB2（リボフラビン）

ビタミンB2（リボフラビン）生産菌

Ashbya gossypii (BASF) 5－6 g/lCandida flaeri (Coors) 7.5 g/lCandida famata 20 g/lBacillus subtilis 4.5 g/l

(recombinant, Russia) Corynebacterium ammoniagenes 17.4 g/l

(recombinant, Kyowa)

ribA ribG

ribTribH

ribB ribA

ＤＳＭ社のB.subtilis組換え体によるＢ２発酵

B. subtilisではオペロンをなしている

（E.coliは、４カ所に分散）

Bacillus subtilisのリボフラビンオペロン

ribT ribH ribA ribB ribGribO

転写物

rib C (Repressor gene)によって発現はコントロールされている

リボフラビンオペロンの改変

• 元のプロモーターを、強力なプロモーターと２カ所交換

• プラスミド上にオペロンを挿入

• 染色体上に組み込み

• 薬剤選択圧によるコピー数の増大

Ｂ２オペロン 耐性遺伝子 Ｂ２オペロン

組み換え

Ｂ２ 耐性 Ｂ２ 耐性 Ｂ２

コピー数増大による薬剤耐性強化Ｂ２オペロン数の上昇Ｂ２生産の増大

培養液（４８時間後）

20 m

ビタミンC

L-Sorbose

2KGAD-Glucose

Vitamin C

D-Sorbitol

Diacetone-L-sorbose

Diacetone-2KGA

CH2OHHCOH

HOCHHCOHHCOHCH2OH

COOHC=O

HOCHHCOH

HOCHCH2OH

CH2OHC=O

HOCHHCOH

HOCHCH2OH

O=CHOCHOCHC

HOCHCH2OH

O

CHOHCOH

HOCHHCOHHCOHCH2OH

標準ルート

中国ルート

合成

合成

合成

合成

合成

現在使われているビタミンＣの製造方法

ビタミンＣの直接発酵方法

ビタミンＣの合成能

• ヒトは、アスコルビン酸を生体内で合成できない。

– その必要量をすべて食事などによって外部から摂取する必要がある。

• 多くの動物は、アスコルビン酸を生合成できる。

• 体内で合成できないのは、モルモットや霊長類の一部（人間を含む）など一部だけである。

動物におけるビタミンＣ生合成

Ｇｌｕｃｏｓｅ

D-グルクロン酸

L-グロン酸

L-グロノラクトン

ビタミンＣ

植物のビタミンＣ生合成

９酵素反応

ビタミンＣの微生物生産

微生物：３段階動物： ９段階植物： ９段階

ビオチン

ビオチン発酵の歴史

１９６０年代

ピメリン酸などの前駆体の添加がビオチン生産に有効であることを発見。

Bacillus sphaericus 0.8-1.1 μg/ml１９７０年代

ビオチン拮抗物質耐性変異株が取得さ

れ利用されるようになった。

ビオチン拮抗物質（アシドマイシン、５－（２－チエニル）n-吉草酸）耐性株株分離

ビオチン発酵の歴史つづき

１９８０年代

遺伝子操作による菌株育種が行われた。

E. coli K-12 100-970 ｍｇ/ＬＳｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ 1ｇ/ＬＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ ４８ｍｇ/Ｌ

ビオチンオペロン

Bacillus subtilis 168

Escherichia coli K-12

ビオチンによる強いフィードバックコントロール

Ｂ Ｄ Ｆ Ａ Ｗ

Ｂ Ｆ Ｃ Ｄ

Ａ

ビオチン発酵の課題

デチオビオチンに硫黄原子を導入する最終反

応はビオチン合成酵素によって触媒され、生合

成上の律速反応となっている。その反応機構

は未だ不明の点が多い。

ＤＴＢからビオチンへの反応系

ＮＡＤＰＨ、フラボドキシン、フラボドキシン還元酵素、鉄イオンが必要

ビタミンＢ６（ピリドキシン）ＣＨＯ ピリドキサールＣＨ２ＮＨ２ ピリドキサミン

ビタミンB6発酵

• 用途：医薬用原料、飼料添加物用原料、食品添加物に利用される。

• 生産：現在微生物発酵によるビタミンB6生産は行われていない。化学的プロセスで年間約3,500トンのピリドキシンが生産されている。

リゾビウムにおけるビタミンＢ６

生産とその生合成に関する研究

ビタミンB6生産菌の分離

分離

1,590の細菌

28℃で培養

生産培地の寒天ブ

ロックに植菌

ビタミンB6生産

Ｂ６検定培地に乗せる。

ビタミンB6定量 - 28℃で17時間間培養

49の土壌試料の懸濁液

28℃で培養10 g/mlのシクロヘキシミド入り栄養寒天

スクリーニング結果

Number of bacteria (%)D

iam

eter

of h

alo

(mm

)

20 ~ 25

25 ~ 30

20 <

30 >

41.6

30

24

4.4％

0 20 40 60 80 100

液体培養

< 0.01 mg/L

< 1 mg/L

> 1 mg/L

根粒菌におけるビタミンB6生産

Rhizobium strain Vitamin B6 (mg/l)

R. meliloti IFO 14782R. meliloti IAM 12035R. huakii IFO 15243R. huakii IFO 15244R. leguminosarum strain 28-21R. leguminosarum IFO 13337R. leguminosarum IFO 13338R. leguminosarum IFO 14168R. leguminosarum IFO 14778R. leguminosarum IFO 14784R. leguminosarum IFO 14785R. leguminosarum IFO 14994R. leguminosarum IFO 14995R. tropici IFO 15247R. galegae IFO 14965R. loti IFO 13336R. loti IFO 14779

513

200

23005

1020239811

ビタミンＢ６の微生物生合成経路まとめ

Ｇｒａｍ＋菌

4PHT

AHP

E4P

4PE

P.P.

PNP

Pyridoxine

Glucose 6PGlucose

PYR

DXP

G3P

ED

GcolAD

PdxRSerC

PdxA

PdxP

Dxs

YaaD, YaaE

6PG

Eda

PdxJ

Ｇｒａｍ－菌

Vitamin B6 Biosynthesis

カロチノイド

カロチノイド

• 植物・藻類・光合成細菌の光合成

• 動物の視覚（プロビタミンＡ）

• 色彩（花、果物、野菜、動物、魚、卵黄など）

• 抗酸化作用

• 現在約７５０種類のカロチノイドが単離・構造決定されている。炭素４０からなる分子が一番多く存在。

卵黄色はコントロール可能

主なカロチノイド生産菌

生産菌株 カロチノイドカビ・酵母Blakeslea trispora β-カロチンPhaffia rhodozyma アスタキサンチン

微細藻類Haematococcus pulvialis アスタキサンチンDunaliella salina β-カロチン

β-カロチン

ゼアキサンチンカンタキサンチン

アスタキサンチン

Ｅ Ｂ ＩＹ

Ｚ

Ｚ

Ｗ

Ｗ Ｚ

ＷＺ

ＷＺ

Ｗ

Ｚ

Ｗ

リコピン

Dunaliella salina の培養βカロチンの生産

塩濃度：２０－３０％強い光が必要宮古ファーム

アスタキサンチン

富士フィルム