マウスメッケル軟骨の発生過程におけるアポトーシスの役割

土居 孝資1, 2 山田 亨1, 2 佐々木 会1, 2 坂東 康彦1

﨑山 浩司1 鐘ヶ江晴秀2 須田 直人2 天野 修1§

1明海大学歯学部形態機能成育学講座 解剖学分野2明海大学歯学部形態機能成育学講座 歯科矯正学分野

要旨：メッケル軟骨は軟骨形成後，変性消失し一部が蝶下顎靱帯と耳小骨になることが知られている．発生における不要な組織の消失では，アポトーシスが大きな役割を担うと考えられている．本研究では，メッケル軟骨の発生から消失までの過程におけるアポトーシスの出現の時期と局在を組織化学的に検索し，さらに器官培養系と汎 caspase 阻害薬を用いたアポトーシス抑制実験により，メッケル軟骨におけるアポトーシスの役割を解明した．まず，最初に正常発生におけるアポトーシスを調べた．胎齢 12.0日齢（E12.0）のオトガイ孔予定域では，メッケル軟骨に分化する間葉凝集の周囲に多数のアポトーシスが見られた．E14.0の前方・中間部では，メッケル軟骨の下外側部の軟骨膜に多数のアポトーシスが見られた．E15.0の前方部では，外側の軟骨膜にアポトーシスが見られた．中間部では，軟骨小腔の拡大が認められたが，軟骨膜にはアポトーシスは見られず，周囲の下顎骨形成部に見られた．E16.0の中間部では，軟骨の肥大や基質の破壊が進み，より多くのアポトーシスが周囲の骨形成部に見られたが，メッケル軟骨と軟骨膜にはアポトーシスは見られなかった．新生仔（P0）の中間部および後方部では軟骨基質もほとんどなくなり，アポトーシスはほとんど見られなかった．次にマウス胎仔下顎の器官培養系を用いてアポトーシスの意義について検討した．汎 caspase 阻害薬である Z-VAD-fmk

を投与した実験群では，メッケル軟骨の軟骨膜にはアポトーシスは見られず，前方部，中間部の欠損および異所性の腺様組織が認められた．対照群ではメッケル軟骨周囲にアポトーシスが見られ，メッケル軟骨の形も正常であった．以上の結果より，アポトーシスは軟骨膜における軟骨芽細胞の分化と不要な組織の除去に関わり，メッケル軟骨の正常な形態形成に必須であることが示された．

索引用語：発生，メッケル軟骨，アポトーシス，マウス

Role of Apoptosis in Development of Mouse Meckel’s Cartilage

Takashi DOI1, 2, Tohru YAMADA1, 2, Au SASAKI1, 2,Yasuhiko BANDO1, Koji SAKIYAMA1, Haruhide KANEGAE2,

Naoto SUDA2 and Osamu AMANO1§

1Division of Anatomy, Department of Human Development and Fostering, Meikai University School of Dentistry2Division of Orthodontics, Department of Human Development and Fostering, Meikai University School of Dentistry

Abstract : After the chondrogenesis, Meckel’s cartilage degenerates and disappears, and some portions of them become audi-

tory ossicle and sphenomandibular ligament. It is generally thought that apoptosis play an important role in the disappearance of

the unnecessary tissues during development. In the present study, the period and the localization of apoptotic cells during the gen-

eration and disappearance of the Meckel’s cartilage was histochemically investigated. In addition, apoptosis-inhibition experiment

was performed to clarify the role of apoptosis in the development of Meckel’s cartilage using the organ culture system.

First, the localization of apoptotic cells during normal development was investigated. At embryonic 12th day（E12.0）, abundant

apoptotic cells were detected in the mesenchymal condensation that are differentiated into Meckel’s cartilage. At E14.0, apoptosis

was detected in the perichondrium of the anterior and intermediate portions of Meckel’s cartilage. At E15.0, apoptosis was de-

明海歯学（J Meikai Dent Med）42（2）, 75−86, 2013 75

緒 言

口腔を形成する第一鰓弓の神経堤細胞は，象牙芽細胞や歯周組織をはじめメッケル軟骨を含む頭部間葉系組織に分化する1, 2）．脊椎動物では，系統発生上，ハ虫類まではメッケル軟骨が下顎の骨格系を形成し，メッケル軟骨の背後端は関節骨となり方形骨との間で関節（古顎関節）を形成する3−5）．哺乳類であるヒトにおいては，下顎骨の骨化点はメッケル軟骨の外側近傍ではあるが直接に接触しない領域の間葉組織で膜性骨化により発生し6），メッケル軟骨は脊椎動物の胚の下顎で下顎骨の構造の形成に先立ち一時的な構造物として出現すため，メッケル軟骨が下顎の支持骨となることはない7）．しかし，Treacher Colins 症候群や Robin Sequence（Pierre-Robin

症候群）などの顎顔面形態異常を呈する先天性異常において，小下顎症などの症状が臨床上問題となるが，動物実験においては，下顎骨の形態異常はメッケル軟骨の形成不全などの異常を伴うことが最近の研究で分かってきた8）．メッケル軟骨は，下顎の発生においては仮設的な構造物であり，マウスでは胎齢 11日に下顎の中間領域で発生するが，出生前には消失し9），下顎骨の原基にはならない7）．一般の軟骨細胞は中胚葉由来であるのに対し，メッケル軟骨を形成する軟骨細胞は神経堤細胞から由来する．ヒトのメッケル軟骨の初期発生は，オトガイ孔付近で，間葉細胞の凝結，軟骨芽細胞の分化，そして軟骨基質の分泌および貯留として開始される．小さな軟骨性

の塊から前後に伸びるように成長し，前方端は愈合し，また緩く湾曲して次第に V 字型になる10）．メッケル軟骨の本体がほぼ完成すると，膜性骨化によって下顎骨が発生し，メッケル軟骨が変性・消失すると下顎骨がその場所を占めるが，下顎骨と場所が一致しない中間部や後部の一部は蝶下顎靱帯と耳小骨になる11, 12）．蝶下顎靱帯の発生は，軟骨基質の消失と軟骨細胞が線維芽細胞へ転換することにより起こると考えられている13）．この軟骨から靱帯への転換のメカニズムについては不明であるが，軟骨細胞の増殖に重要な EGF（epider-

mal growth factor）の関与が指摘されている12）．メッケル軟骨の消失の過程では，軟骨膜細胞の骨芽細胞への分化と外側での骨膜性の骨形成，軟骨細胞の肥大化，軟骨基質の石灰化，アルカリ性ホスファターゼ活性とⅩ型コラーゲンの発現，石灰化した軟骨基質の破軟骨細胞による吸収が生じる14）．この一連の過程は，軟骨内骨化における骨形成以前の過程と幾つかの点を除いてほぼ一致する．軟骨内骨化では，最初に軟骨細胞の活発な増殖が生じ，軟骨細胞は肥大化と共に周囲の石灰化した基質と骨化した骨膜により栄養補強路を阻まれて死滅し，それによって空いた軟骨小腔に骨芽細胞が侵入して骨形成を起こす15）．軟骨細胞の死滅ではアポトーシスが生じることが報告されている16）．メッケル軟骨の消失過程と軟骨内骨化では，上記のような共通点のほか，多くの組織化学的な相違点が報告されている．例えば，細胞外基質の制御に重要な metalloproteinase もメッケル軟骨と長骨原基の軟骨とで異なった分布を示すことも報告されている13）．軟骨内骨化の肥大軟骨細胞では，破骨細胞系細胞に発現している RANK のリガンドである

tected in lateral perichondrium of the anterior portion of Meckel’s cartilage. In the intermediate portion exhibiting the expansion of

the cartilage lacuna, however, apoptosis was hardly detectable in the perichondrium except for the surrounding mandibular forming

region. At E16.0, although the expansion of the cartilage lacuna, the destruction of the cartilaginous matrix and apoptosis induction

in a surrounding bone forming region become more pronounced, apoptotic cells were hardly detected in the cartilage and perichon-

drium in the intermediate portion. At postnatal 0 day（P0）, the cartilage matrix nearly disappeared and apoptosis was hardly dis-

cernible in the intermediate and posterior portions.

Secondly, the biological significance of apoptosis in Meckel’s cartilage was investigated using the organ culture system of the

embryonic mouse mandible. Treatment with pan-caspase inhibitor Z-VAD-fmk abrogated the apoptosis incidence in the perichon-

drium, and induced the loss of anterior and intermediate portions of Meckel’s cartilage, and produced the ectopic adenoid tissue. In

the control experiment, apoptotic cells were detected around the Meckel’s cartilage that showed a normal morphology. The present

study strongly suggest that apoptosis may be involved in the differentiation of chondroblasts in the perichondrium and elimination

of the unnecessary tissues, and indispensable for the normal development of Meckel’s cartilage.

Key words : development, Meckel’s cartilage, apoptosis, mouse

─────────────────────────────§別刷り請求先：天野 修，〒350-0283埼玉県坂戸市けやき台 1-1明海大学歯学部解剖学分野

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RANKL は骨芽細胞系細胞に発現して破骨細胞の分化や生存を増大するといわれているが，メッケル軟骨ではそれ以外の，未熟または成熟した軟骨細胞にも恒常的に発現している17）．発生における組織の消失過程では，手指の分離時のようにアポトーシスが大きな役割を担うと考えられている．例えば手指の発生では，水掻き状に広がる指骨原基の間の結合組織はアポトーシスにより消滅し，手指が分離する．また上記のように骨発生においても軟骨内骨化での軟骨細胞にアポトーシスが生じる16）．しかし，メッケル軟骨の発生において，軟骨細胞が線維芽細胞や骨芽細胞への転換（transformation）を起こすことの一連の研究があるが11），アポトーシスを詳細に調べた報告はほとんどなく，消失過程への関与についても分かっていない．そこで，本研究ではメッケル軟骨の発生から消失までの過程におけるアポトーシスの出現を組織化学的に検索することにより，その時期と局在を明らかにし，さらにメッケル軟骨の発生時期にアポトーシスを阻害薬を用いて抑制することにより，アポトーシスが組織発生に与える影響について形態学的に調べた．

実験材料および方法

1．実験動物妊娠 ddY マウス（日本 SLC，静岡）を用い，出生 0

日（P0）の新生児および膣垢が確認された日を胎齢 0

日（E0）とし，E12−16で 99.5％ Diethyl Ether（Wako，大阪）深麻酔下で妊娠マウスの頸椎脱臼を行い，子宮を取り出して，冷 Hanks 培地（ニッスイ，東京）に移し，実体顕微鏡下で胎仔を子宮から摘出して羊膜を剥離した．胎仔は Theiler の分類18）にしたがって，標準的な成長段階のものを選別した．また，本研究は明海大学歯学部動物倫理委員会の承認を得（承認番号 C 0716），妊娠マウスは明海大学歯学部動物実験管理規定に従って飼育し，実験期間中は固形試料を与え，水は自由摂取とさせた．

2．マウス胎仔の組織化学的染色胎仔の頭部を 4％ paraformaldehyd / 0.1 M phosphate

buffer（pH7.4, PB）中に 4℃で 5時間浸漬固定を行い，PB

で洗浄後，30％ sucrose/PB に 4℃で一晩浸漬した．その後，クリオスタットを用いて厚さ 10 μm の前頭断および水平断の連続凍結切片を作製した．切片は室温で乾燥後，0.3％ Triton X-100/0.1 M phosphate buffered saline

（pH7.4, PBS）中で 60分間処理し，PBS および蒸留水で

洗浄後，アポトーシスの検出法として，断片化した DNA

の 3’-OH 末端に terminal deoxynucleotidyl transferase により，biotin 標識 dNTP を特異的に結合させ標識するする TUNEL 法19）を用いた．また，TUNEL 法とともにヤギ抗ウサギ type II collagen ポリクロナール抗体免疫染色を用いた免疫組織化学との二重染色を行った．切片乾燥後，1％ proteinase K（Cosmo bio，東京）／PBS

で 1分間処理した．PBS で洗浄後，アポトーシスで断片化した DNA を Apop Tag-Plus apoptosis in situ Detec-

tion Kit（日本ケミコン，東京）で biotin 標識処理した．PBS にて洗浄後，一次抗体として，ヤギ抗ウサギ type II

collagen（1 : 1.000, Cosmo bio）および Fluorescein 標識streptavidin（Apop Tag-Plus apoptosis in situ Detection

Kit）の混合液を用い，室温で一晩反応させた．二次抗体には，Cy3標識ウサギ抗ヤギ IgG 抗体（1 : 500，日本ケミコン）を用いて，室温で 30分間反応させた．その後 PBS で洗浄し，水溶性封入剤で封入を行い，共焦点走査型レーザー顕微鏡（LSM510, Carl Zeiss Co, Ltd,

Jene, Germany）で観察した．

3．マウス胎仔下顎の器官培養器官培養には，第一鰓弓の下顎突起を摘出し，Tlowel

法の無血清培地を用いた方法20）に従って行った．マウスの胎齢 10日は人では 5週齢に相当するため21），E10.0の下顎突起を摘出し，37℃，湿度 100％，5％ CO2に調節されたインキュベーター内で，直径 5 mm, 0.8 mm 孔フィルター（Millipore, Bedford, MA, USA）に載せて BGJb

培地（GibcoBRL, Grand Island, NY, USA）中で培養を行った．

Caspase 阻害薬22）の Z-VAD-fmk（Cosmo bio）は培地中の終濃度 100 μM となるように，終濃度 1％ dimethyl

sulfoxide（DMSO, Cosmo bio）で希釈した23）．培養期間は 10日間とし，培養 4日目から 100 μM Z-VAD-fmk1x

10−7mol/1％ DMSO を培地中に加える群（Z-VAD-fmk

群），1％ DMSO を加える群（DMSO 群）およびこれらの試薬を加えない群（対照群）に分け，培地は隔日に交換した．少なくとも 1シャーレには 5個の培養片を含み，同じ実験を 3度繰り返した．培養を終えた各実験群の試料のうち，3個は全載標本

で Alcian Blue 染色を行い，残りは切片を作成した．前者は Burdi の方法24）に従って Alcian blue 10 mg/20％ 酢酸溶液で 24時間攪拌を行いながら，染色・固定した．脱水後 0.1％ calcium hydroxide 溶液で 2時間攪拌して組織を透明化し，実態顕微鏡で観察した．

メッケル軟骨におけるアポトーシスの役割 77

後者については，4％ paraformaldehyd/0.1 M PB 溶液で 4時間固定し，その後は通法に従ってパラフィン包埋し，前方から後方まで，厚さ 5 μm の前頭断連続切片を作製した．最初に Hematoxyline-eosin（H-E）染色を行って培養組織の状態を確認した後，前述の方法でTUNEL 法と type II collagen の免疫組織染色との二重染色と，一部の切片では上皮組織の確認のため，keratin

の免疫組織化学を行った．keratin 免疫組織化学染色では，一時抗体にヤギ抗ヒト keratin ポリクローナル抗体（1 : 500, Abcam, Cambridge, UK），二次抗体に biotin 標識ヤギ抗ウサギ IgG 抗体（1 : 500, DAKO, Glostrup, Den-

mark）を用い，peroxidase 標識 streptavidin（DAKO）と0.01％ H2O2/3,3’-diaminobenzidin tetrahydrochloride（同仁化学，熊本，DAB）溶液を用いて発色した．

結 果

1．マウスメッケル軟骨におけるアポトーシス記述にあたり，メッケル軟骨を，遠位端からオトガイ孔付近までを前方部（a），オトガイ孔から顎骨内までを中間部（b），蝶下顎靭帯に変わる部位を後方部（c），耳小骨になる部位を中耳部（d）に区分した（Fig 1）．

E12.0の前方部では，type II collagen 陽性のメッケル軟骨の形成は見られず，アポトーシス（TUNEL 陽性細胞）はメッケル軟骨予定域にはほとんど見られなかった（Fig 2a）．中間部では type II collagen 陽性の赤色に染ま

Fig 1 Schematic drawing of mouse Meckel’s cartilage indicatingthe terminology used to describe. The anterior portion（a）contrib-utes to form the madibular symphysis. The intermediate portion（b）disappears before birth. The posterior portion（c）transformsto the sphenomandibular ligament. The middle ear portion（d）un-dergoes endochondral ossification to form the auditory ossicles.

Fig 2 Double immunohistochemistry of type II collagen-positivecells（red）and TUNEL-positive apoptotic cells（green）in thefrontal sections of anterior（a）and intermediate（b）portions ofmouse Meckel’s cartilage at E12. Left margin of the frontal section（b）indicates the lateral side of the head. Many apoptotic cells sur-rounding the developing Meckel’s cartilage were recognized（b）.Note the absence of the apoptotic cells in the cartilage.Bars : 100 μm（a, b）

Fig 3 Double immunostaining of Type II Collagen（red）and TUNEL-positive apoptotic cells（green）in the inter-mediate portion of mouse Meckel’s cartilage at E13.0.Left margin of the frontal section indicates the lateral sideof the head. Apoptosis was not found in Meckel’s carti-lage with the type II collagen-immunoreactivity. Fewapoptotic cells（green）were found in the perichondrium.Bar : 100 μm

Fig 4 Double immunostaining of type II collagen（red）and TUNEL-positive apoptotic cells（green）in the anterior（a）and intermediate（b）portions of mouse Meckel’s cartilage at E14. Right margins of thefrontal sections（a, b）indicate the lateral side of the head. Many apop-totic cells were seen in the lateral perichondrium of Meckel’s cartilage（a, b）. No apoptotic cells were seen in the cartilage.Bars : 100 μm（a, b）

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るメッケル軟骨が見られ，メッケル軟骨の分化に伴い周囲に緑色に染まる，アポトーシスも多数みられた．しかし，メッケル軟骨の軟骨細胞自体にはアポトーシスは見られなかった（Fig 2b）．E13.0の中間部では，type II col-

lagen 陽性の成熟した軟骨組織は見られたが，内部および周囲にアポトーシスは見られなかった（Fig 3）．また，後方部では，メッケル軟骨はまだ発生していなかった．E14.0の前方部では，メッケル軟骨の下外側部の軟骨膜にアポトーシスが見られたが，軟骨細胞自体には，

アポトーシスは見られなかった（Fig 4a）．中間部では，前方部と同様にメッケル軟骨の下外側部の軟骨膜にアポトーシスが見られたが，軟骨自体には，アポトーシスは見られなかった（Fig 4b）．また，後方部でもメッケル軟骨の形成がみられたが，アポトーシスは見られなかった．E15.0の前方部では，前方部では，左右が癒合しているのが見られたが，軟骨内にも軟骨膜にもアポトーシスは見られなかった（Fig 5a）．結合部よりやや後方では，E14.0と同様に，外側の軟骨膜にアポトーシスが見

Fig 5 Double immunostaining of type II collagen（ red）and TUNEL-positive apoptotic cells（green）in anterior（a）and intermediate（b）portionsof mouse Meckel’s cartilage at E15.0. Right margins of the frontal section（a, b）indicate the lateral side of the head. Apoptotic cells（green）werefound in the lateral perichondrium of Meckel’s cartilage of anterior portion（a）, but not in the intermediate portion（b）. Osteogenesis accompanied bythe active apoptosis（arrows）was observed in the intermediate portion（b）.Bars : 100 μm（a−c）

Fig 6 Light micrographs of TUNEL-positiveapoptotic cells（green）of horizontal sectionof intermediate portion of mouse Meckel’scartilage at E15.0. Apoptotic cells were exclu-sively localized in the lateral perichondrium（arrows）. No apoptotic cells were seen in themedial perichondrium（arrowheads）.Bar : 100 μm

Fig 7 Double immunohistochemistry of type II collagen-positive cells（red）and TUNEL-positive apoptotic cells（green）inintermediate（a）, posterior（b）and middle ear（c）portions of mouse Meckel’s cartilage at E16.0. Right margins of the fron-tal sections（a, b）indicate the lateral side of the head. Degeneration of Meckel’s cartilage accompanied by the enlarged carti-laginous lacunae was observed in both intermediate（a）and posterior（b）portions. No apoptotic cells（green）were observedin the cartilage and perichondrium（a, b）. Many apoptotic cells were seen in osteogenic cells for mandibular formation（b）.Meckel’s cartilage forming malleus（*）and incus（**）in the middle ear portion（c）contained no apoptotic cells.Bars : 100 μm（a−c）

メッケル軟骨におけるアポトーシスの役割 79

Table 1 Apoptosis in Development of Mouse Meckel’s Cartilage.

Portion of Meckel’s cartilage E12 E13 E14 E15 E16 P0

Anterior P P

Intermediate P N P B B

Posterior P N N N N

Middle Ear P N NN NN

Background colors of the cell represent the condition of Meckel’scartilage

White（blank）: absentLight gray : matureDark gray : hypertrophic or DegeneratingBlack : endochondral ossification

Single alphabets represent the presence and localization of apop-totic cells

P : present in perichondriumB : present in bone forming area（not in Meckel’s cartilage）N : absent

Fig 8 Double immunohistochemistry of type II collagen-positivecells（red）and TUNEL-positive apoptotic cells（green）in theposterior portions（a, b）of mouse Meckel’s cartilage at P0. Theposterior potion of new bone mouse was transformed to spheno-mandibular ligament. No apoptotic cells were seen in the immatureligamental tissue（a）and ligament containing degenerated carti-laginous tissue（b）.Bars : 100 μm（a, b）

Fig 9 Alcian-blue staining of whole mount specimen（a）, double immunohistochemistry of type II collagen-positive（red）and TUNEL-positive apoptotic（green）cells in the frontal section（b）, and H-E staining of the frontalsection（c）of E10.0 mouse mandibles cultured for 10 days in the serum-free, BGJb medium. Apoptotic cells wereseen in the perichondrium of Meckel’s cartilage, similar to in vivo development.Bars : 100 μm（a−c）

Fig 10 Alcian-blue staining of whole mount specimen（a）, double immunohistochemistry of type II collagen-positive（red）and TUNEL-positive apoptotic（green）cells in the frontal section（b）, and H-E staining of the frontalsection（c）of E10.0 mouse mandibles cultured for 10 days in the serum-free, BGJb medium containing 1％ DMSO.No effect was recognized in morphogenesis of Meckel’s cartilage for the addition of DMSO into the culture medium.Bars : 100 μm（a−c）

80 土居孝資・山田 亨・佐々木 会ほか 明海歯学 42 2013

られたが，軟骨自体にアポトーシスは見られなかった（Fig 5b）．この時期，中間部付近に，切歯の歯胚がメッケル軟骨に接近するとともに，外側には膜性骨化による下顎骨の発生がみられるようになった．切歯歯胚と近接する部分に，軟骨小腔の拡大や基質の破壊が見られたが，アポトーシスは，軟骨内や軟骨に直接面する軟骨膜には殆ど見られず，わずかに離れた間葉組織に見られた．この部位は，膜内骨化が生じている部位と一致していた（Fig 5b）．水平断所見では，メッケル軟骨の軟骨形成は終了しており，前頭断の結果と同様に外側の軟骨膜にアポトーシスがみられ内側は見られなかった．また，軟骨自体にアポトーシスは見られなかった（Fig

6）．E16.0の中間部では，軟骨小腔の拡大や軟骨基質の破壊が進み，より多くのアポトーシスが骨形成部位に見られた．また，メッケル軟骨やその軟骨膜にはアポトーシスは見られなかった（Fig 7a）．後方部では，靭帯に変化する部分でわずかに軟骨としての形態を留めていた

が，軟骨膜に目立ったアポトーシスは見られなかった（Fig 7b）．最後部の耳小骨となる部分でも軟骨および軟骨膜にアポトーシスはほとんど見られなかった（Fig 7

c）．P0の中間部では，type II collagen に染まる基質もほとんどなくなっていた．周囲にはアポトーシスはほとんど見られなかった（Fig 8a）．後方部では，靭帯に変化する部分でわずかに軟骨としての形態を留めていたが，軟骨膜に目立ったアポトーシスは見られなかった（Fig

8b）．各発生段階におけるメッケル軟骨の状態とアポトーシスの有無，局在の関係を Table 1に示す．

2．下顎突起の器官培養におけるアポトーシスの阻害対照群の器官培養では，Alcian blue 染色により，青

く染まるメッケル軟骨の形も V 字型を呈しており正常であった（Fig 9a）．TUNEL 法によるアポトーシスの検出では，メッケル軟骨周囲にアポトーシスが見られ，正

Fig 11 Alcian-blue staining of whole mount specimen（a）, double immunohistochemistry of type II collagen-positive（red）andTUNEL-positive apoptotic（green）cells in the frontal section（b）, and H-E staining of the frontal section（c）of E10.0 mousemandibles cultured for 10 days in the serum-free, BGJb medium containing 100 μM Z-VAD-fmk solved in 1％ DMSO.Major part of Meckel’s cartilage except for the middle ear portion were defected（a）. No apoptotic cells were seen in bothperichondrium and chondrocytes in residual Meckel’s cartilage（b）. In distal portion of the madibular explants, loose connectivetissue-like structures were seen at the presumptive area of anterior, intermediate and posterior portions of Meckel’s cartilage（c）.Bars : 100 μm（a−c）

Fig 12 H-E staining（a）and keratin-immunohistochemistry（b）of frontal sections of cultured E10.0 mouse mandibles treatedwith caspase inhibitor, Z-VAD-fmk. Duct-like extrinsic structures underlining columnar epithelium with keratin-expression wereobserved（b）.Bars : 100 μm（a, b）

メッケル軟骨におけるアポトーシスの役割 81

常組織の前頭断とほぼ同様の結果が得られた（Fig 9b）．H-E 所見では硝子軟骨の周りは境界明瞭な軟骨芽細胞で覆われており，一般的な軟骨と同様の所見がみられた（Fig 9c）．DMSO 群における Alcian blue 染色所見では，対照群と同様に，メッケル軟骨の形は V 字型を呈していた（Fig 10a）．TUNEL 法によるアポトーシスの検出では，対照群と同様にメッケル軟骨の周囲にアポトーシスが見られ（Fig 10b），H-E 所見でも対照群と同様の所見がみられ（Fig 10c），DMSO がメッケル軟骨の発生に影響を与えないことが確認された．Z-VAD-fmk 投与群の Alcian blue 染色所見では，メッケル軟骨の前方部，中間部の欠損が見られた（Fig 11a）．二重染色所見では，type II collagen にそまる基質もほとんどなくなっており，周囲には，アポトーシスはほとんど見られなかった（Fig 11b）．また，メッケル軟骨欠損部の組織像においては，一部では未熟な軟骨様組織が見られた（Fig 12

c）．また，管腔構造を呈する腺様組織が見られたため（Fig 12d），抗 keratin 抗体を用いた免疫染色を行い，kera-

tin 陽性の上皮組織であることを確認した（Fig 12e）．

考 察

哺乳類のメッケル軟骨は，軟骨組織としては出生前には完全に消滅し，わずかに耳小骨と蝶下顎靱帯のみがその痕跡器官として残っている．基本的には哺乳類の顎では不要と思われるメッケル軟骨が下顎に発生する理由については，現在のところ系統発生的な現象であると考えられている．即ち，ハ虫類まではメッケル軟骨が下顎の原基であったが，哺乳類では，食性の変化に対応して新たに頭蓋骨と同じ膜性骨化により下顎骨が発生し，新しい顎関節を持つようになった為，メッケル軟骨は，耳小骨に転用される部分を除いて不要となったと説明されている25）．人体においても系統発生の痕跡と考えられて，出生までに発生し消失する器官はメッケル軟骨の他に脊索，前腎，中腎，ミュラー管，ウォルフ管，指間組織25）

などがある．哺乳類以外ではオタマジャクシがカエルになるときに尻尾がなくなるといった形態形成でも，組織・器官の消失が生じる26）．また，組織の一部では，発生過程でみられる神経回路網の形成の際に，シナプスの形成に関与しなかった余剰な神経細胞が大量に除去され27），胸腺でも T 細胞の成熟過程で多量の細胞死が生じる28）．口腔の組織発生においても，歯胚の分化29）や口蓋の癒合30）で不要な細胞や埋入した上皮細胞の消失が起こる．これらの消失機構の全てが明らかになっているわけではないが，ほとんどの消失過程でアポトーシスが重

要な役割を果たすと考えられている26−30）．アポトーシスの生理的役割は，上述したような発生過程で生じる余剰な細胞や老化した細胞，生体にとって有害となる癌細胞やウイルスに感染した細胞を排除する生体防御に強く関与している．しかし機能的な役割の不明なアポトーシスも未だ多く存在する26）．本研究では，マウス胎仔メッケル軟骨の発生から消失までの全過程において，1）発生最初期の間葉凝集から軟骨芽細胞の分化，および 2）軟骨形成後，変性開始前の外側軟骨膜，の 2

期に顕著なアポトーシスが認められた．軟骨膜は軟骨の付加成長において間葉細胞から軟骨芽細胞への分化が起こる場である31）．また，メッケル軟骨は形成後下顎の成長に伴って側方へ大きく広がることから32），特に側方の軟骨膜での付加成長が盛んであると考えられる．これらのことから，この時期におけるアポトーシスは活発な軟骨芽細胞の増殖・分化に関連して生じたことが示唆される．メッケル軟骨を形成する間葉細胞は後脳胞の菱脳から生じる神経堤に由来する33）．菱脳には 8 つの分節があり，第 1と第 2分節の神経堤細胞は第一鰓弓へ遊走し，メッケル軟骨のほか頭蓋骨や歯胚の原基となるが，第 3

と第 5分節の神経堤細胞は，鰓弓への遊走は起こらず，ほとんどはアポトーシスによって消滅する34）．TUNEL

法による解析結果では，軟骨細胞への分化後にはアポトーシスはほとんど認められなかったので，メッケル軟骨の一生においては，アポトーシスは軟骨芽細胞の分化期に最も強く関与し，軟骨細胞への分化後はほとんど関与しないと思われる．正常発生における TUNEL 陽性のアポトーシス細胞は軟骨基質に密接して存在するもののtype II collagen 陰性であることから，アポトーシスは軟骨細胞の分化段階では type II collagen を分泌を開始する以前の前軟骨形成細胞（prechondrogenic cell）から軟骨芽細胞に分化する初期段階で生じているものと考えられる35）．アポトーシスのシグナル伝達には Fas/Fas-ligand など

の細胞死シグナルと受容体を介する外因性経路と，DNA

損傷などにより誘導される p53の活性化とミトコンドリアからの cytochrome c の放出を介する，Bcl-2ファミリータンパク質により制御される内因性経路があり，両経路ともに caspase が中心的な役割を担っている36）．シグナルを受けてから上流で働くイニシエーターとして，外因性経路では caspase-8が，内因性経路では caspase-9

が働き，それらにより分解され活性化してエフェクターとして働く caspase-3などがある36）．本研究では，これ

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らの多種の caspase の阻害剤である Z-VAD-fmk を培地中に投与して下顎の器官培養を行ったところ，切片のTUNEL 法染色では軟骨膜のアポトーシスは認められず，全載標本の Alcian blue 染色では肉眼的に軟骨自体の部分的な欠損が生じた．欠損部の切片を解析すると，type II collagen には染まらない未熟な疎性結合組織が存在する部位や，管腔構造を呈する異所性の腺様組織が見られる部位があった．これらの結果から，caspase の阻害によりアポトーシスを抑制すると，メッケル軟骨の異形成や異所性組織の侵入が生じることが示された．これらの結果は間葉凝集や軟骨膜におけるアポトーシスがメッケル軟骨の正常な形成に必須であり，異常な組織の発生・侵入を阻止していると考えられる．肉眼的な軟骨欠損部で見られた type II collagen 陰性

の未分化な組織の存在は，正常発生において type II col-

lagen 分泌前の軟骨芽細胞にアポトーシスが生じていたことを考え合わせると，実験的なアポトーシス抑制により軟骨芽細胞の初期分化段階が阻害され，type II collagen

の分泌・貯留も阻害されて軟骨基質の正常な形成が障害されたものと推測される．軟骨の欠損が部分的であったことは正常発生におけるアポトーシスの局在がメッケル軟骨の全部分ではなく，限局的であったことによるものと考えられる．軟骨芽細胞の増殖・分化期のアポトーシスは，間葉凝集および軟骨膜における分化した軟骨芽細胞の数を減少させることに直接的に働いていると考えられるが，器官培養によるアポトーシス抑制実験では軟骨の過形成は認められなかったので，単純な細胞数を減らして組織の大きさを調節することが生物学的意義とは考えられない．アポトーシスに陥った細胞は核や細胞質が断片化し，アポトーシス小体を形成する37）．アポトーシス小体は一般的にはマクロファージなどの食細胞に貪食されて処理されるが38），基質の吸収が生じる以前の発生時期のメッケル軟骨付近にはマクロファージは存在しないので，アポトーシス小体は近隣の同種の細胞に貪食されているものと推測される．アポトーシス小体の貪食は種々の細胞間情報伝達機構として機能する場合があり，肝臓ではアポトーシス小体がマクロファージ系である Kupffer 細胞だけでなく，正常肝細胞や類洞内皮細胞にも貪食されることや39），歯胚のエナメル上皮で生じるアポトーシスでも近隣のエナメル芽細胞によってアポトーシス小体が貪食されることが報告されている40）．以上のことから，メッケル軟骨の軟骨芽細胞の分化においてもアポトーシスが分化の進行や同調に関して細胞間情報伝達機構として機

能していると推測される．器官培養実験ではアポトーシスのどの caspase が関与する経路が阻害されたものかが不明なので，実際のメッケル軟骨のアポトーシスのシグナル伝達経路については解明できなかった．しかし，欠失や変異によりアポトーシスを誘導する p53がメッケル軟骨の軟骨膜に見られるという報告があることから41），p53依存性の内部経路が関与することが示唆される．ところで，軟骨の肥大・基質吸収の過程においても軟骨細胞および軟骨膜にアポトーシスがほとんど認められなかったことから，本研究の仮説であったメッケル軟骨の消失過程におけるアポトーシスの関与については，ほとんど無いと考えられる．また，そのことはメッケル軟骨の軟骨細胞が基質吸収の最中やその後も細胞死に至らずに残存するか，非アポトーシス細胞死を生じることを示唆している．軟骨内骨化軟骨細胞に分化して以降消失に至るまでの過程でアポトーシスがほとんど見られないことは，メッケル軟骨の軟骨細胞に強いアポトーシス抑制シグナルが働いていることが示唆される．アポトーシスの主要なシグナルにおいて，Bcl-2はミトコンドリアの膜透過性を制御して cytochrome c やその他のアポトーシス誘導タンパク質の細胞質への放出を調節することによって，アポトーシスを制御している42）．生理的刺激および熱，重金属，アルコールなどの非生理的刺激によってアポトーシスが誘導されるが，同時に熱ショックタンパク質（Hsp）が誘導されてアポトーシスによる細胞死を強く抑制している43）．特に発生期に於いては Hsp27

が多様な組織に発現しており，アポトーシスを抑制するとともに細胞の増殖と分化を調節している44）．Hsp27はアポトソームの形成や caspase 3を抑制するほか，ミトコンドリアから放出される cytochrome c に直接働いてアポトーシスのシグナル伝達を阻害する45）．メッケル軟骨に於いては，発生から消失前までのほとんどの軟骨細胞に Hsp27の強い発現が認められることから46），メッケル軟骨の発生では理由は不明であるが Hsp27を介する強いアポトーシス抑制機構が働いているものと思われる．軟骨の肥大・基質吸収の後もアポトーシスに陥らなかった軟骨細胞の運命については，骨芽細胞や線維芽細胞へ transform するとの説がある．軟骨内骨化では肥大軟骨細胞はアルカリ性ホスファターゼや type X collagen

を発現し，骨化前にアポトーシスを起こすが10），メッケル軟骨の消失過程では肥大軟骨細胞は，軟骨基質が吸収されて軟骨小腔から解放されると，type II collagen の合

メッケル軟骨におけるアポトーシスの役割 83

成が終了した後に type I collagen を産生，分泌して骨細胞様細胞に transform し11），また EGF の作用により靱帯の線維芽細胞に変化すると報告されている．哺乳類におけるメッケル軟骨の意義について，下顎骨形成に関与しない不要な組織をみなされてきたが，メッケル軟骨と下顎骨形成の関係について，遺伝子改変動物を用いた実験により最近ようやく解明されつつある．Tgfbr2 47），ctgf 48），sox9 49），egfr 50），Shh 51）のミュータントマウスでは，いずれもメッケル軟骨と下顎骨の形態異常や小型化などの劣成長が両方に認められた．特に sox9

のミュータントマウスでは，メッケル軟骨および耳小骨，舌骨，茎状突起など鰓弓由来の軟骨及び軟骨性骨が完全に欠損し，下顎骨を含む頭蓋の膜性骨の小型化が認められた47）．また，タンパク質レベルで下顎に発現する因子を調べた実験では EGF52），TGF-β 47），HGF53）などが下顎骨とともにメッケル軟骨の形成に関与しており，これらの因子の異常は下顎骨とメッケル軟骨の両方に異常を起こす．これらの結果は，下顎骨の形態形成においてメッケル軟骨は下顎骨原基のガイドとなって重要な役割を果たすことが強く示唆される47）．メッケル軟骨は出生前に消失するために臨床医学の対象となることはほとんどないが，下顎骨の形態異常や劣成長は歯科医学的に重要視されてきた．Robin Sequence,

Treacher Collins 症候群，18トリソミー症候群，Cornerlia

de Lange 症候群の顎顔面領域における症候群では小下顎症を主徴とする症状を呈する54）．Treacher Collins 症候群は小顎症，小耳症，頬骨弓の低形成，大口症，下眼瞼の欠損などで特徴づけられる疾患で，神経堤細胞の異常が強く関与すると考えられている．疾患遺伝子であるtocf1は 1,411個のアミノ酸からなる treacle タンパク質をコードしている．患者の約 60％に tocf1の変異が認められる55）．マウスを用いた研究では tcof1は神経上皮および神経堤細胞に発現し，tcof1のミュータントマウスを解析した結果，メッケル軟骨を含むほとんど全ての神経堤由来組織に劣成長が認められた56）．その他の疾患に伴うメッケル軟骨の異常の有無はほとんど情報がないが，実験医学的な所見から推測すると，メッケル軟骨の異常を伴っている可能性がある．今回の研究では，汎 caspase 阻害薬の Z-VAD-fmk を

用いた実験により，メッケル軟骨の正常な発生には，アポトーシスが関与することが示唆されたが，オートファジーや壊死などの他の細胞死57）が関与している可能性は否定できない．また，TUNEL 法による DNA の切断の検出は，DNase の活性化を示唆するが，どの DNase が

関与しているかも不明である．今後各種阻害剤を用いてこれらの可能性や関与する DNase のタイプを検討することが必要と思われる．

結 論

マウスメッケル軟骨の発生から消失までの全過程において，アポトーシスは軟骨芽細胞の初期分化に関連して生じていることが明らかとなった．軟骨基質吸収消失に関わるアポトーシスは認められなかった．胎仔下顎の器官培養実験でアポトーシスを抑制すると，軟骨の異形成や異所性組織の侵入が認められた．以上のことから，アポトーシスは軟骨芽細胞の分化と不要な組織の除去に働き，メッケル軟骨の正常な発生・発育に必須であることがわかった．

本研究は科学研究費補助金（C）23592710および小貫基金の補助を受けた．

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（受付日：2013年 3月 21日 受理日：2013年 3月 25日）

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